Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Juliana Brambilla Carnielli Trindade.pdf: 2849315 bytes, checksum: 7616fcb4f5c5c1eb15d8ead21bf19870 (MD5) Previous issue date: 2011-04-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmaniose visceral (LV) é uma doença sistêmica, fatal se não tratada, causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania complexo donovani, o qual abriga a espécie L. (L.) chagasi. O tratamento da LV conta com poucas opções terapêuticas, incluindo os antimoniais pentavalentes, anfotericina B e a miltefosina. A miltefosina foi recentemente aprovada na Índia como a primeira droga de administração oral para o tratamento da LV. Os mecanismos de resistência à miltefosina estão sendo elucidados em linhagens experimentais de Leishmania spp. resistentes a esta droga. Entretanto, os mecanismos de resistência à miltefosina em isolados clínicos de Leishmania são pouco conhecidos. Neste estudo foi utilizada a técnica de eletroforese bidimensional acoplada à espectrometria de massas com o objetivo de destacar e identificar proteínas que são diferencialmente expressas entre formas promastigotas de isolados clínicos de L. (L.) chagasi sensíveis (S: S1 e S2) e resistentes (R: R1 e R2) à miltefosina, obtidos de pacientes com LV que participaram de um estudo clínico realizado no Brasil para avaliar a eficácia dessa droga. Os perfis protéicos obtidos dos isolados clínicos apresentaram em média 459 spots , correspondendo a 5,7% dos produtos gênicos preditos para Leishmania spp. A análise comparativa entre os perfis protéicos dos isolados clínicos S e R permitiu a detecção de 80 spots diferencialmente expressos. Desses, 18 spots foram encontrados exclusivamente no perfil do grupo S e apenas 1 no grupo R, enquanto 48 spots apresentaram diferença quantitativa na expressão protéica entre os grupos. Os demais spots foram encontrados em um único isolado (7 em S1, 3 em S2 e 2 em R1) ou em três isolados simultaneamente (1 em S1, S2 e R1). A análise desses spots por espectrometria de massas em sistema MALDI/TOF-TOF identificou 49 spots (61,3%), os quais correspondem a 32 proteínas distintas e 7 proteínas hipotéticas. Entre as proteínas identificadas, a peroxirredoxina (expressão aumentada em R) e uma cisteíno peptidase semelhante à calpaína (exclusiva do grupo S) foram destacadas por indicar que os isolados resistentes são menos susceptíveis ao processo de morte celular programada. Estes dados sugerem que estas proteínas podem estar relacionadas com o fenótipo resistência à miltefosina / Visceral leishmaniasis is a systemic disease that is fatal if untreated and is caused by the Leishmania donovani complex, which include the Leishmania (L.) chagasi. Visceral leishmaniasis treatment relies on a few chemotherapeutic drugs including Sb(V), amphotericin B and miltefosine. Miltefosine was recently approved as the first oral drug active against visceral leishmaniasis in India. Miltefosine resistance mechanisms are being elucidated in laboratory Leishmania spp. isolates but are less clear in clinical isolates. In this study, we used comparative two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry methodologies to highlight and identify proteins that are differentially expressed between miltefosine-sensitive (S: S1 and S2) and resistant (R: R1 and R2) L. (L.) chagasi isolates from kala-azar patients included in clinical trial in Brazil, in order to assess the effectiveness of this drug. We describe here a high-resolution proteome for L. (L.) chagasi promastigotes comprising an average of 459 spots, which corresponds to 5,7% of gene products predicted for Leishmania spp. Following comparison of the whole proteome profiles between sensitive and resistant L. (L.) chagasi clinical field strains, 80 differentially expressed spots were detected. Eighteen spots were found to be specific of a sensitive group and only one of a resistant group, while 48 spots changed in intensity between these groups. The others spots were present in a unique isolates (7 in S1, 3 in S2 and 2 in R1) or in three isolates simultaneously (1 in S1, S2 e R1). MALDI/TOF-TOF mass spectrometry allowed the identification of 49 spots (61,3%) corresponding to 32 distinct protein and 7 hypothetical proteins. Among the proteins identified, the comparative proteomics screen highlighted two proteins, peroxidoxin (overexpressed in R group) and calpain-like cisteína peptidase (exclusively detected in S), differentially expressed, suggesting that programmed cell death is reduced in resistant parasite. These data suggest that these proteins may be related to resistance phenotype to miltefosine

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Renata Monti Rocha.pdf: 1272962 bytes, checksum: 4d1bebef0b65d090fb6d7fe64d1b0b74 (MD5) Previous issue date: 2012-04-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A miltefosina tem sido utilizada com sucesso para o tratamento de LV na Índia, com um índice de cura de 94%. Entretanto, um ensaio clínico realizado pela primeira vez no Brasil demonstrou que cerca de 50% dos pacientes com LV apresentou falha após o tratamento. Uma hipótese para justificar a ocorrência de falha terapêutica em pacientes tratados no Brasil seria a ocorrência de sensibilidade variada à miltefosina entre os isolados de L. chagasi. A variação na sensibilidade à miltefosina tem sido relacionada a diferenças na capacidade de internalização da droga como resultado direto de um defeito na maquinaria de translocação presente na membrana celular da Leishmania, composta por pelo menos duas proteínas, LdMT, e sua subunidade β, LdRos3. Sendo assim, os objetivos desse estudo foram avaliar se há correlação entre a sensibilidade in vitro à miltefosina de isolados de L. chagasi com a resposta ao tratamento, e correlacionar a suscetibilidade à miltefosina com a expressão de proteínas relacionadas à sua maquinaria de translocação. Utilizando ensaios de infecção de macrófagos, os resultados obtidos mostraram que todos os isolados de pacientes curados após o tratamento foram sensíveis in vitro à miltefosina (CI50 2,6 - 7,94 μM), enquanto 10 dos 12 isolados de pacientes que apresentaram falha ao tratamento mostraram-se resistentes (CI50 > 15 μM). Os dois isolados que mostraram-se sensíveis antes do tratamento tornaram-se resistentes, mostrando a aquisição de resistência durante o tratamento. Esses dados sugerem que a falha de tratamento observada em pacientes portadores de LV no Brasil está relacionada a resistência do parasita à droga. Por outro lado, a análise da expressão gênica de proteínas responsáveis pela captação da miltefosina não mostrou diferença entre os isolados sensíveis e resistentes. Diante destes resultados acreditamos que o monitoramento da sensibilidade de isolados clínicos de Leishmania à miltefosina seja de grande relevância para predizer falha de tratamento. Além disso, considerando que testes in vitro de infecção de macrófagos são laboriosos e demorados, a busca de marcadores de resistência utilizando metodologias mais simples e rápidas é importante para facilitar esse monitoramento / The miltefosine has been used successfully for treatment of VL in India, with a cure rate of 94%. However, a clinical trial demonstrated that, in Brazil, about 50% of patients with VL failed after treatment. One hypothesis to explain the occurrence of therapeutic failure in patients treated in Brazil would be the occurrence of variable sensitivity to miltefosine among L. chagasi isolate. The variation in the sensitivity to miltefosine has been related to differences in the ability to internalize the drug as a direct result of a defect in the translocation machinery present in the cell membrane of Leishmania, comprising at least two proteins, LdMT and its β subunit, LdRos3. Therefore, the objectives of this study were to evaluate the correlation of in vitro sensitivity to miltefosine in L. chagasi isolates with the response to treatment, and correlate miltefosine susceptibility with the expression of proteins related to their translocation machinery. Using macrophage infection assays, our results showed that all strains obtained from patients cured after treatment were susceptible to miltefosine in vitro (IC50 2.6 - 7.94 mM), whereas 10 of 12 samples of patients who presented treatment failure were resistant (IC50> 15 mM). Those two isolates that were sensitive pre-treatment have become resistant, indicating the acquisition of resistance during the treatment. Therefore, these data suggest that the treatment failure observed in patients with VL in Brazil is related to parasite drug resistance. On the other hand, the analysis of gene expression of proteins responsible for miltefosine uptake showed no difference between sensitive and resistant isolates. Considering these results, we believe that monitoring the sensitivity of clinical isolates of Leishmania to miltefosine is highly relevant for predicting treatment failure. Moreover, since in vitro infection of macrophages used to evaluate the parasite sensitivity to the drug is laborious and time consuming, the search for drug resistance markers using simple and rapid methods is important to facilitate this monitoring.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DaniellaRAM.pdf: 825529 bytes, checksum: f26b539b2cb49d4dbd7f0f77cd978d11 (MD5) Previous issue date: 2006-12-05 / Control of human visceral leishmaniasis in endemic regions is hampered in part by the lack of knowledge with respect of the role reservoirs and vector. In addition, there is not yet an understanding of how non-symptomatic subclinical infection might influence the maintenance of infection in a particular locality. Of worrisome is the limited accessibility to medical care in places with emerging drug resistance. There is still no available protective vaccine either for humans or other reservoirs. Leishmania species are protozoa that express multiple antigens which are recognized by the vertebrate immune system. Since there is not one immunodominant epitope recognized by most hosts, strategies must be developed to optimize selection of antigens for prevention and immunodiagnosis. For this reason, we generated a cDNA library from the intracellular amastigote form of Leishmania chagasi, the causative agent of South American visceral leishmaniasis. We employed a two-step expression screen of the library to systematically identify T and T-dependent B cell antigens. The first step was aimed at identifying the largest possible number of clones producing an epitope-containing polypeptide with a pool of sera from Brazilians with documented visceral leishmaniasis. After removal of clones encoding heat shock proteins, positive clones underwent a second step screen for their ability to cause proliferation and IFN-γ responses of T cells from immune mice. Six unique clones were selected from the second screen for further analysis. The clones encoded part of the coding sequence of glutamine synthetase, transitional endoplasmic reticulum ATPase, elongation factor 1γ, kinesin K-39, repetitive protein A2, and a hypothetical conserved protein. Humans naturally infected with L. chagasi mounted both cellular and antibody responses to these protein Preparations containing multiple antigens may be optimal for immunodiagnosis and protective vaccines against Leishmania / O controle da Leishmaniose Visceral em regi?es end?micas ? em parte dificultado pela falta de conhecimento em rela??o ao papel dos reservat?rios e vetores, n?o havendo ainda vacina dispon?vel. Leishmania s.p s?o protozo?rios que expressam m?ltiplos ant?genos reconhecidos pelo sistema imune dos hospedeiros. Devido ? aus?ncia de um ep?topo imunodominante reconhecido pela maioria dos hospedeiros, estrat?gias para a identifica??o e sele??o de novos ant?genos para a preven??o e imunodiagn?stico. Nossa estrat?gia foi construir uma biblioteca de cDNA da forma amastigota da L. chagasi, com subseq?ente realizad??o de dupla varredura da biblioteca para sistematicamente identificar ant?genos espec?ficos de c?lulas T e B. A primeira etapa teve como objetivo a identifica??o do maior n?mero de clones produtores de pept?deos atrav?s da utiliza??o de um pool de soro de indiv?duos com Leishmaniose Visceral. Os clones codificadores de prote?nas de choque t?rmico foram removidos e os clones restantes foram submetidos ? segunda etapa da varredura, que consistiu na avali??o capacidade destes ant?genos em induzir estimula??o e prolifera??a de linf?citos T de camundongos resistentes ? infec??o por L. chagasi. Seis clones foram selecionados ap?s a segunda varredura. Os clones codificaram parte da seq??ncia da glutamina sintetase, ATPase do ret?culo endoplasm?tico, Fator de alongamento 1 γ, Kinesina K-39 prote?na repetitiva A2, e prote?na hipot?tica conservada. Indiv?duos naturalmente infectados com L. chagasi desenvolveram respostas imunes celular e humoral frente a essas prote?nas. Formula??es contendo m?ltiplos ant?genos podem servir como excelentes m?todos para imunodiagn?stico e vacina??o

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IraciDL_Dissert.pdf: 1259983 bytes, checksum: 9fb9c026a74636e1c8e0d88ea967084d (MD5) Previous issue date: 2009-08-07 / Visceral leishmaniasis h?s adapted in the past 20 years to periurban and urban areas, and in Natal, Rio Grande do Norte, it became endemic. Thid study aimed to evaluate the environmental and social aspectsof Leishmania chagasi infection and its epidemiologic transmission chain in an urban, periurban and rural area of Parnamirim-RN. A study with three sections was conducted: Section 1: Sectional study of the human and canine infection by L. chagasi and its environmental and social determinants. Section 2: Observational longitudinal cohort to evaluate the dynamics of the canine infection. Section 3: Longitudinal study to evaluate the behavior of Lu. Longipalpis vector and the seasonal factors related to its dynamics. To include in the study the hauses were randomly selected and georreferenciated. Montenegro skin test was done in the human population and blood samples were collected for anti-Leishmania antibody detection. The canine population was examinated for L. chagasi infection by RIFI, ELISA and ELISA for rK39. An entomologic surveillance was monthly done with CDC light trapsin 10 houses of each locality. Quantitative and qualitative analyses was done using STATISC 6.0. Probality and prediction maps were done using ArcGis 9.0 model. In the human population L. chagasi infection was associated with the area of the hause, age, sex, population densyti, vegetation, kind of the floor of thr hause, water and resides destiny. In the canine population L. chagasi infection was associated with the breed, size, time of living in the hause, presence of dogs in the neighborhood, presence of horses and donkeys in the neighborhood, vegetation, kind of the floor and walls of the hause. The human infection was associated with canine infction only when analyzed taking into account the locality. In the prospective study, serum conversion and antibody lost observed in 30,8% and 22% of the animals examined, respectively. The human infection rate by L. chagasi was 24,6%, by the presence of anti-Leishmania antibody and 38,6% by the Montenegro skin test. The canine infection rate 32,5% by the presence of anti-Leishmania antibody. The vector Lu longipalpis showed an atypical behavior. These results indicate that environmental and social factors are important variables associated with L. chagasi infection in humans and canines, with punctual association of thr last two. Control measures of the infection on the studied points are necessary, in the aim to reduce the endemic focus of the disease in the study area. This research was carried out in a multidisciplinary involving the categories of: doctor, biologist, veterinarian, statistical, pharmaceutical and biochemical / A leishmaniose visceral ? uma doen?a que nos ?ltimos 20 anos adaptou-se ?s ?reas periurbanas e urbanas, tornando-se end?mica na regi?o metropolitana de Natal, Rio Grande do Norte. Este estudo teve como objetivo avaliar os aspectos ambientais, sociais e a cadeia epidemiol?gica de transmiss?o por Leishmania chagasi em ?rea urbana, periurbana e rural do Munic?pio de Parnamirim-RN. Realizou-se um estudo com tr?s subestudos: Subestudo 1: Estudo Transversal da infec??o humana e seus determinantes socioambientais no ano de 2005. Subestudo 2: Estudo observacional longitudinal com coorte fixa para avaliar a din?mica da infec??o canina por L. chagasi no per?odo de 2005/2006. Subestudo 3: Estudo longitudinal para avaliar a fauna de flebotom?neos e a densidade de L. longipalpis associando aos fatores clim?ticos. Para inclus?o no estudo, os im?veis foram selecionados aleatoriamente e georreferenciados. Na popula??o humana desses im?veis, foi realizado teste de Montenegro e coleta de sangue para detec??o de anticorpos antileishmania. A popula??o canina foi examinada quanto ? infec??o por L. chagasi pelo m?todo de RIFI, ELISA EB e ELISA para rK39. Foi realizado monitoramento entomol?gico mensal com armadilhas CDC em 10 im?veis de cada localidade. Foi realizado an?lise quantitativa e qualitativa atrav?s do STATISC 6.0 e constru??o de mapas de predi??o e probabilidade atrav?s do modelo do ArcGis 9.0. Foi encontrada associa??o da infec??o humana por L. chagasi com a ?rea de resid?ncia, idade, sexo, densidade populacional, vegeta??o, tipo de piso do im?vel e destino de ?gua e dejetos. Na popula??o canina, foi observada associa??o da infec??o por L. chagasi quanto ? ra?a, ao porte, sintomas, tempo de moradia no im?vel, presen?a de c?es na vizinhan?a, presen?a de cavalos e jumentos na vizinhan?a, tipo de vegeta??o da ?rea. A infec??o humana estava relacionada com a infec??o canina apenas quando analisada considerando-se a localidade. No estudo prospectivo, foi observada soroconvers?o e perda de anticorpos em 30,8% e 22% dos animais examinados, respectivamente. A taxa de infec??o humana por Leishmania chagasi foi de 24,6%, quando avaliada pela presen?a de anticorpos antileishmania e de 38,6% quando avaliada pelo teste de Montenegro. A taxa de infec??o canina foi 32,5% quando avaliada pela presen?a de anticorpos antileishmania. O vetor Lu. longipalpis apresentou um comportamento at?pico. Os resultados indicam que fatores ambientais e sociais s?o importantes vari?veis associadas ? infec??o por L. chagasi em humanos e caninos, sendo as ?ltimas pontualmente associadas. Desta forma, s?o necess?rias medidas de controle da infec??o que enfoquem os pontos estudados, visando a n?o manuten??o da endemicidade na ?rea estudada. Esta pesquisa foi realizada de forma multidisciplinar envolvendo as categorias de: m?dico, bi?logo, veterin?rio, estat?stico, nutricionista e farmac?utico bioqu?mico

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RobertaVAC_DISSERT.pdf: 2111666 bytes, checksum: 5b317150d6db63bae04e852173ace9d2 (MD5) Previous issue date: 2009-12-14 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Visceral leishmaniosis caused by Leishmania chagasi, also known as calazar, presented, in the period from 1990 to 2005, tax of incidence in Brazil varying between 1 and 3 cases for 100 000 inhabitants. The Northeast region that up to the year of 2000 contributed with almost 90% of the registered cases is reducing his participation in the current decade, reaching 56% in 2005. Conventional leishmaniasis treatment is costly and it shows high toxicity, demanding more research for alternative treatments, with special interest in development of vaccines and diagnosis kits which include production of recombinant antigens by host cells. Escherichia coli has been the microorganism most studied and used as a host for recombinant protein production. Therefore, the aim of this work was to study the influence of induction on cellular growth and to verify the type of Leishmania chagasi antigens expression (intra or extracellular) during two recombinant E. coli clones (kmp11 and P36) cultivation in rotary incubator (shaker) using three different media (2xTY, TB, FASS+EL). For that, tests were carried out using conditions established in the literature for E. coli (37?C and 200 rpm) and media supplemented with antibiotics to guarantee that only competent cells grows. First, tests were carried out without induction in order to verify the two microorganisms kinetic behavior (growth and substrate consumption) in different media. Next, the induction was carried out through the addition of IPTG (1mM as final concentration), at the first hour of cultivation. It was observed that protein expression were intracellular for all clones and media tested, however the highest level of expression was clearly observed by the electrophoresis band density (intensity) for 2xTY medium and kmp11 protein. Although it contains the lowest substrate concentration, consequently, a reduced cellular concentration when compared to other media, it appeared that this medium and clone combination is the most indicated for recombinant protein production. Therefore, the objective of this work was achieved, since the interested proteins were produced. Consequently, this result motivates new studies for production optimization using different cultivation strategies / A leishmaniose visceral, causada pela esp?cie Leishmania chagasi, tamb?m conhecida como calazar, apresentou, no per?odo de 1990 a 2005, taxa de incid?ncia no Brasil variando entre 1 e 3 casos por 100 mil habitantes. A regi?o Nordeste, que at? o ano de 2000 contribuiu com quase 90% dos casos registrados, est? reduzindo sua participa??o na d?cada atual, chegando a 56% em 2005. O alto custo e toxicidade das drogas usadas no tratamento convencional dessa leishmaniose levaram a busca de tratamentos alternativos, com interesse especial na pesquisa e produ??o de ant?genos por microrganismos recombinantes para desenvolvimento de vacinas e kits de diagn?stico. A bact?ria Escherichia coli tem sido o microrganismo mais estudado e usado como hospedeiro para produ??o de prote?nas recombinantes. Nesse contexto, este trabalho tem como objetivo estudar a influ?ncia da indu??o no crescimento celular e a verifica??o do tipo de express?o (intra ou extracelular) de ant?genos de Leishmania chagasi atrav?s de cultivo de dois clones de E. coli recombinante (kmp11 e P36) em incubador rotativo (shaker) usando tr?s meios diferentes (2xTY, TB, FASS+EL). Para isso, foram realizados ensaios em condi??es estabelecidas na literatura para E. coli (37?C ? 200 rpm) e os meios suplementados com antibi?ticos para garantir somente o crescimento de c?lulas competentes. Na primeira etapa, foram realizados ensaios sem indu??o a fim de se verificar o comportamento cin?tico dos dois clones (crescimento e consumo de substrato) nos diferentes meios. Na segunda etapa, a indu??o foi realizada atrav?s da adi??o de IPTG (concentra??o final de 1mM), na primeira hora de cultivo. Foi observada que a express?o das prote?nas foi intracelular para todos os clones e meios testados, entretanto o maior n?vel foi verificado nitidamente pela densidade (intensidade) da banda nos g?is de eletroforese para o meio 2xTY e prote?na kmp11. Apesar de o meio 2xTY conter uma menor concentra??o de substratos, conseq?entemente, uma concentra??o celular reduzida quando comparada aos outros meios, pareceu que esta combina??o de meio e clone ? mais indicada para produ??o das prote?nas recombinantes testadas neste trabalho. O objetivo desse trabalho foi alcan?ado j? que a prote?na de interesse foi produzida. Conseq?entemente, este resultado motiva novos estudos para otimiza??o da produ??o usando diferentes estrat?gias de cultivo

A leishmaniose visceral causada por Leishmania infantum chagasi à caracterizada pela perda da habilidade do hospedeiro gerar uma resposta imunolÃgica eficaz. Neste estudo, foi investigado o papel da quimiocina CXCL10 no controle da infecÃÃo por L. infantum chagasi in vivo. Grupos de camundongos BALB/c foram tratados ou nÃo com CXCL10 (5 μg/kg) com 1, 3 e 7 dias de infecÃÃo e apÃs 1, 7 e 23 dias do tratamento, alguns parÃmetros foram avaliados: a carga parasitÃria, os nÃveis de IFN-, IL-4, TGF-β e IL-10, e as alteraÃÃes histopatolÃgicas no fÃgado. ApÃs 23 dias de tratamento, CXCL10 induziu, no baÃo, uma reduÃÃo expressiva no nÃmero de parasitos, quando comparado ao grupo controle. No fÃgado, a carga parasitÃria mostrou uma queda no grupo tratado, entre o 7 e 23 dia apÃs o tratamento. Entretanto, o efeito leishmanicida de CXCL10, neste trabalho, nÃo parece ser mediado por NO, uma vez que nÃo houve diferenÃa na produÃÃo de NO entre os grupos. IFN-γ foi induzida de maneira mais significativa no grupo tratado do que nos controles, e atingiu sua produÃÃo mÃxima (100 pg/mL) no 23 dia apÃs o tratamento, correlacionando-se com a queda da carga parasitÃria nos ÃrgÃos-alvo. IL-4 foi produzida em baixas concentraÃÃes, em ambos os grupos, embora os animais tratados com CXCL10 tenham mostrado nÃveis mais elevados do que os controles. Em relaÃÃo Ãs citocinas antiinflamatÃrias, apÃs 23 dias do tratamento, os nÃveis de IL-10 nos animais tratados foram menores do que os do controle. A produÃÃo de TGF-β apÃs 7 dias do tratamento foi 2 vezes menor no grupo tratado quando comparado ao controle, e apÃs 23 dias do tratamento, essa citocina continuou com nÃveis mais baixos do que aqueles observados no controle. Na anÃlise histopatolÃgica do fÃgado apÃs o 1 dia do tratamento, foram encontrados, em ambos os grupos, mais granulomas imaturos (GI), do que infiltrados nÃo granulomatosos (NG) e alguns poucos granulomas maduros (GM) apenas no grupo tratado. ApÃs 7 dias do tratamento, a quantidade de infiltrados NG estava menor e os GI ainda foram os mais encontrados, em ambos os grupos, alÃm disso, foi observado um pequeno aumento de GM no grupo tratado. Em resumo, diante dos resultados encontrados, à possÃvel sugerir um importante papel leishmanicida de CXCL10 em camundongos BALB/c infectados por L. infantum chagasi, que parece ser mediado por uma expressiva produÃÃo de IFN-g e supressÃo das citocinas imunorreguladoras, IL-10 e TGF-β, abrindo a hipÃtese se isto nÃo estaria associado a uma diminuiÃÃo na frequÃncia de cÃlulas T regulatÃrias, induzida por CXCL10, nesses animais. / Visceral leishmaniasis caused by Leishmania infantum chagasi is characterized by the loss of the ability of host to generate an effective immune response. In this study it was investigated the role of CXCL10 chemokine in controlling L. infantum chagasi infection in vivo. Groups of BALB/c mice were treated or not with recombinant CXCL10 chemokine (5 μg/kg) with 1, 3 and 7 days of infection and after 1, 7 and 23 days of treatment, some parameters were evaluated: parasite load, levels of IFN-g, IL-4, TGF-β and IL-10, and the histopathological alterations in the liver. After 23 days of treatment, CXCL10 induced in the spleen a significant reduction on the number of parasites as compared to control group. In the liver, parasite load decreased in treated group between the 7th and 23th day post treatment. However, the antileishmanial effect of CXCL10, in this work, does not seem to be mediated by NO, since there was no difference in the NO production among the groups. IFN-γ was induced most significantly in treated group than in controls, and reached its maximum production (100 pg/mL) on day 23 after treatment, correlating with the reduction in parasite burden in target organs. IL-4 was produced in low doses, in both groups, although treated animals had shown higher levels than control group. Regarding to anti-inflammatory cytokines, after the 23th day of treatment, IL-10 levels in treated animals were smaller than in control group. Production of TGF-β after 7 days of treatment was 2 times lower in treated group when compared to control, and after the 23th day of treatment, this cytokine remained with lower levels than those observed in control. In the histopathological analysis of the liver after the 1st day of treatment, were found in both groups more immature granulomas (GI) than non-granulomatous infiltrate (NG), and some few mature granulomas (GM) were only observed in treated group. After 7 days of treatment, the amount of NG infiltrates was lower, and GI were still the most frequent in both groups, besides a slight increase of GM was observed in treated group. In summary, at the light of the found results, it is possible to suggest an important leishmanicidal role to CXCL10 in BALB/c mice infected by L. infantum chagasi, which seems to be mediated by a significant IFN-g production, and suppression of immunoregulatory cytokines, IL-10 and TGF-β, opening the hypothesis that this would be associated to a decrease in the frequency of regulatory T cells induced by CXCL10 in these animals.

Parasitas da família trypanosomatidae como dos generos Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas e Rhynchoidomona infectam insetos e Phytomonas parasitam plantas. O T. cruzi e L. (L.) chagasi, agentes etiológicos respectivamente da doença de Chagas e da leishmaniose visceral (LV) também fazem parte desta família. Pela similaridade entre estes parasitos alguns estudos tem utilizado os tripanosomatídeos não patogênicos como fonte alternativa de antígenos para o imunodiagnóstico da doença de Chagas e da leishmaniose. Com o objetivo de identificar moléculas em tripanosomatídeos não patogênicos que reagem com anticorpos anti T. cruzi e anti- Leishmania sp, foram utilizados dois preparados antigênicos: a fração excretada-secretada (ES) e o extrato total obtido por digestão química (ET) de L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata e C. luciliae, sempre comparados com o T. cruzi e a L. (L.) chagasi. A reatividade diferencial entre anticorpos anti T. cruzi e anti L. (L.) chagasi levou à escolha da L. seymouri, único parasito no qual a fração ES mostrou significativas diferenças de reatividade, a C. deanei apresentou dados semelhantes. Anticorpos presentes em casos de LV reagem, por ELISA, tanto com ES como com ET de L. seymouri, no entanto casos de leishmaniose tegumentar e a maioria dos chagásicos não apresentaram reação com a fração ES deste parasito, apesar de reagirem com o antígeno ET. O ELISA mostrou que os anticorpos anti L. (L.) chagasi reagem mais com proteínas contidas no ES e menos com carboidrato, ao contrário a baixa reatividade dos anticorpos anti T. cruzi para o ES são preferencialmente contra carboidratos. Quando as frações de ES e ET foram analisados por Immunobloting o anti- L. (L.) chagasi não reagiu com nenhuma banda por esta metodologia, ao contrário anticorpos anti- T. cruzi apresentaram intensa reação com bandas na região de 29-36kDa do ET de L. seymouri, que foram identificadas como sendo moléculas de proteínas e de carboidratos (66-97kDa) para o ES. A utilização de soros policlonais monoespecíficos mostra que ES e ET possuem epítopos compartilhados e a quantificação deste compartilhando foi calculado utilizando anticorpos monoespecíficos eluídos de ES ou ET. Estes resultados mostraram que a identificação de moléculas reativas de L. seymouri por anticorpos presentes em chagásicos e leishmanióticos sp depende da metodologia empregada versus preparado antigênico. A superioridade das moléculas contidas no parasito de L. seymouri foi adicionalmente evidenciada quando 25,5% das amostras de soros de VL que apresentavam baixa reatividade para o ET de L. chagasi, Abs 492nm menores que 0.99 e média e SD de 0,56 ? 0,18 apresentavam alta reatividade para o ET de L. seymouri (p<0,01) com média e SD de 1,51 ? 0,35. Estes dados nos indicam que uma caracterização mais profunda das moléculas presentes na L. seymouri é de vital importância se for empregada no imunodiagnóstico das doenças de Chagas e leishmaniose. / Parasites of Trypanosomatidae family as Crithidia, Blastocrithidia, Leptomonas, Hepertomonas and Rhynchoidomonas infect insects and Phytomonas parasitize plants. T. cruzi and L. (L.) chagasi the etiological agents of Chagas disease and Leishmaniasis (VL) respectively, belong to this family. The similarity between these parasites led few studies to use non-pathogenic trypanosomatids as an alternative source of antigens for Chagas\' disease and leishmaniasis immunodiagnosis. With the aim of identifying molecules in nonpathogenic trypanosomatids that react with anti T. cruzi and anti-Leishmania antibodies, two antigenic preparations were employed: the excreted-secreted molecules (ES) and total extract obtained by chemical digestion (ET) of L. seymouri, C. deanei, C. fasciculata and C. luciliae, and compared with T. cruzi and a L. (L.) chagasi. ES fraction of L. seymouri was the unique that showed differences in reactivity when tested with anti T. cruzi and anti L. (L.) chagasi antibodies, evaluation with C. deanei showed similar data. ELISA performed with L. seymouri ES and ET antigens reacted with all VL cases, however tegumentar leishmaniasis and Chagas disease cases showed no reaction with the ES fraction, although they react with ET antigen. The ELISA revealed that anti L. (L.) chagasi antibodies react with proteins contained in ES and less with carbohydrate, unlike the low reactivity of anti T. cruzi with ES were mainly against carbohydrates. When ES and ET were analyzed by immunoblotting the anti L. (L.) chagasi antibodies did not react with any bands, unlike antibodies to T. cruzi showed intense reaction with 29-36kDa protein bands of L. seymouri ET and carbohydrate bands ES (66-97kDa). The use of monospecific polyclonal sera showed that ES and ET share epitopes and these data was calculated using monospecific antibodies eluted from ES or ET antigens. These results show that the identification of L. seymouri molecules reactive by chagasic and leishmaniotic sp cases depends on the methodology employed versus antigenic preparation. The superiority of L. seymouri reactivity was further evidenced when 25.5% of VL sera that showed low reactivity to L. chagasi ET (Abs 492nm < 0.99 and smaller than average and SD of 0.56 +/- 0.18) showed high reactivity to ET L. seymouri (p <0.01) with mean and SD of 1.51 +/- 0.35. These data indicate that a more thorough characterization of molecules present in L. seymouri is of vital importance if used in Chagas disease and leishmaniasis immunodiagnosis.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Elisa M R Azevedo.pdf: 722969 bytes, checksum: 9e335992daabd50fc7361968e93df415 (MD5) Previous issue date: 2009-08-13 / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a chronic zoonosis caused by a protozoan called Leishmania (Leishmania) chagasi and has as vectors, the sandflies Lutzomyia longipalpis and Lutzomyia cruzi. The domestic dog is the most important reservoir in urban areas considering the zoonotic disease form and is responsible for maintaining the parasite in endemic foci. Aiming to assist the Superintendent of Policies for Comprehensive Health Care / Health State Department of Goiás (Spais / SES-GO) and the Department of Zoonosis Control from Goiânia (GO-DCZ) in epidemiological surveillance of the disease, this work investigated possible cases of CVL by using laboratory analysis. For this study, dogs seen at the Veterinary Hospital, School of Veterinary Medicine, Federal University of Goiás (HV / EV / UFG) with clinical suspicion of disease and symptomatic and asymptomatic dogs captured by DCZ-GO were analyzed. A total of 214 dogs were evaluated, and classified into three groups. Group 1 (GI): 33 dogs from DCZ with at least three clinical signs suggestive of LVC, Group 2 (GII): 141 clinically healthy dogs from DCZ and Group 3 (GIII): 40 dogs seen at the HV / EV / UFG with clinical suspicion of LVC. The frequency of animals classified as positive with different methods of diagnosis used in this study were: 5.6% (n = 12) in ELISA test, 9.35% (n = 20) in IFAT, 2.80% (n = 6) in the direct parasitological examination of skin imprints; 2.34% (n = 5) in direct parasitological examination of lymphonode, and 3.17% (n = 7) in PCR reactions of both the genderspecific protocol and the L. chagasi-specific. Considering the results and the conditions of the present study, it is concluded that there is casuistry in CVL series of symptomatic or asymptomatic dogs clinically attended in the city of Goiânia. The occurrence of Leishmania chagasi bearer dogs captured in the municipality of Goiânia were detected and the symptoms frequently observed in illness dogs carriers of L. chagasi in Goiânia are: conjunctivitis, lymphadenopathy, skin changes, cachexia and onychogryphosis. / A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose crônica causada por um protozoário denominado Leishmania (Leishmania) chagasi e possui como vetores, os flebotomíneos Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi. O cão doméstico é o reservatório mais importante nos meios urbanos, sendo responsável pela manutenção do parasita nos focos endêmicos. Este trabalho investigou laboratorialmente possíveis casos de LVC. Nesta investigação utilizou-se cães atendidos no Hospital Veterinário da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás (HV/EV/UFG) com suspeita clínica da doença e cães errantes sintomáticos e assintomáticos capturados pelo DCZ-GO. Nestes locais foram atendidos 214 cães, classificados em três grupos. Grupo 1 (G1): 33 cães do DCZ com no mínimo três sinais clínicos sugestivos para LVC; Grupo 2 (G2): 141 cães do DCZ clinicamente hígidos e Grupo 3 (G3): 40 cães atendidos no HV/EV/UFG com suspeita clínica de LVC. A frequência de animais classificados como positivos, aos diferentes métodos de diagnóstico empregados neste estudo foram: 5,6% (n=12) pelo ELISA-teste; 9,35% (n=20) à RIFI; 2,80% (n=6) ao exame parasitológico direto de imprints de pele; 2,34% (n=5) ao exame parasitológico direto de linfonodo; e 3,17% (n=7) para as reações de PCR. Este trabalho é pioneiro na investigação da Leishmaniose Visceral Canina no município de Goiânia, Goiás. Outros trabalhos devem ser conduzidos continuadamente, visando à investigação sistemática da doença neste e em outros municípios do estado.Considerando os resultados alcançados e as condições em que foi realizado o presente estudo, conclui-se que há casuística de LVC para cães sintomáticos ou assintomáticos, os quais buscam atendimento clínico-ambulatorial na cidade de Goiânia; existe ocorrência de portador de infecção por Leishmania chagasi entre cães vadios capturados no município de Goiânia; os testes de diagnóstico ELISA e RIFI apresentam resultados apenas moderadamente concordantes para o diagnóstico sorológico da LVC; os exames parasitológicos e PCR conduzidos a partir de amostras de pele e linfonodo apresentam resultados equivalentes para o diagnóstico da LVC.

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Costa de Carvalho.pdf: 1454881 bytes, checksum: 831238c6d9864b9fca7efc9ba6164541 (MD5) Previous issue date: 2007-09-25 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The municipal district of Raposa located in the State of Maranhão, Brazil, is an endemic area of human and canine visceral leishmaniasis. Dogs are considered to be the principal Leishmania chagasi reservoir in this location. The objective of this study was to examine the relative levels of parasitic DNA in different tissues of infected dogs and their association with clinical signs of Leishmaniasis. We initiated this study by collecting blood samples from 233 distinct dogs that were analyzed by means of serological diagnosis. Of all examined dogs, 69 were positive in the anti-Leishmania ELISA. According to technical reasons only 27 of the Leishmania infected dogs could be recaptured and studied. The animals were classified according to their clinical signs in asymptomatics (10 animals), oligosymptomatics (8 animals) and polysymptomatics (9 animals) groups. A quantitative PCR method was developed and established in order to examine the parasitic load in blood, bone marrow, lymph node, spleen and skin. The parasite could be detected in lymph nodes of all animals analyzed (100%). The tissue with the highest parasitic load was lymph nodes followed by spleen, blood, bone marrow and skin. Comparing all analyzed tissues, the lymph nodes presented the highest levels of parasitic DNA, without exception, regardless their symptoms classification. Contrary to various other studies, we have detected the lowest parasitic DNA concentration in skin tissues. The quantitative PCR assay established in this study was sensitive, fast and inexpensive for qualitative and quantitative analyses of the Leishmania chagasi DNA. The canine lymph node is the most frequently infected tissue, with greater levels of parasitic DNA, and may be considered a target tissue for leishmaniasis monitoring in dogs. / O município de Raposa (Maranhão, Brasil) é uma área endêmica de leishmaniose visceral humana e canina. Neste município, cães são considerados o principal reservatório de Leishmania chagasi. O objetivo deste estudo foi investigar a concentração do DNA parasitário em diferentes tecidos de cães infectados e sua associação com sinais clínicos de leishmaniose. Iniciamos este estudo com a coleta de sangue de 233 cães para diagnóstico sorológico da infecção. Dentre todos os cães examinados, 69 apresentaram anticorpos anti-Leishmania no teste ELISA. Destes, apenas 27 puderam ser recapturados e estudados. Os animais foram classificados de acordo com avaliação clínica em assintomáticos (n=10); oligossintomáticos (n=8) e polissintomáticos (n=9). A técnica de PCR quantitativa foi desenvolvida e padronizada para avaliar a concentração de DNA parasitário em sangue, medula, linfonodo, baço e pele. O parasito foi detectado em todas as amostras de linfonodo analisadas (100%). O tecido com os maiores níveis de DNA parasitário foi o linfonodo, seguido pelo baço, sangue, medula e pele. Comparando-se os tecidos analisados, o linfonodo foi o tecido com as maiores cargas parasitárias, sem exceção, entre animais assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos. Contrariamente a outros estudos, detectamos baixos níveis de DNA parasitário em amostras de pele. A PCR quantitativa padronizada neste estudo foi um método sensível, rápido e econômico para detectar e determinar os níveis de DNA parasitário de Leishmania chagasi. Em cães, o linfonodo é o tecido mais acometido pelo parasito e com maiores níveis de DNA, podendo ser considerado o sítio ideal para o monitoramento da leishmaniose canina.

Na América Central, em países como Honduras, El Salvador, Nicarágua e Costa Rica, tem sido descrito lesões cutâneas não ulceradas, designadas como leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCNU) causadas por Leishmania (L.) infantum chagasi. Em Honduras, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica são produzidas pelo mesmo agente etiológico, Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma área geográfica. A LCNU é a forma clínica mais comum, afetando principalmente crianças maiores de 5 anos e adultos jovens. A lesão é definida como uma pápula, nódulo indolor, não ulcerativo, eritematoso ou da cor da pele, na presença ou ausência de halo hipopigmentado. Tendo em vista que existe uma lacuna no conhecimento do padrão de resposta imunológica tecidual da leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, este trabalho visou avaliar a resposta imunológica inflamatória e regulatória in situ das lesões de pele. Foram utilizadas 20 biópsias de pele, com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. O estudo histopatológico foi avaliado em cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina (HE) e o padrão da resposta imune inflamatória e regulatória por meio da reação de imuno-histoquímica utilizando marcadores para linfócito T (CD4 e CD8), T regulatório (FoxP3), e antígenos intracelulares como: IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 e IFN-y. As alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme e caracterizadas por um infiltrado inflamatório linfohistiocitário de intensidade variável e associado à formação de granulomas epitelioides. Já as alterações histopatológicas identificadas na epiderme mostraram-se mais leves e correspondem a leve adelgaçamento, leve acantose e exocitose focal linfohistiocitária. Em 55% dos casos, o parasitismo mostrou-se discreto. A análise imuno-histoquímica das lesões cutâneas dos pacientes com LCNU mostrou no infiltrado inflamatório a presença de todos os marcadores utilizados neste estudo, em especial de linfócitos T CD8+ e CD4+, e das citocinas inflamatórias IFN-y e IL-6. A participação de células FoxP3+, TGF-beta+ e IL-10+ foi discreta, assim como das células IL-17+. Os dados mostram uma participação maior da resposta inflamatória na leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, capaz de controlar o parasitismo e consequentemente a evolução do tamanho da lesão; porém, embora mais discreta, a resposta imune regulatória pode ser responsável para manter um balanço na resposta imune celular evitando danos teciduais e levando a baixa persistência parasitária no tecido, necessária para a manutenção de uma imunidade protetora e duradoura / Honduras: evaluation of the inflammatory and regulatory immune response in situ in skin lesions [dissertation]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo\"; 2017. In Central America, in countries such as Honduras, El Salvador, Nicaragua and Costa Rica, non-ulcerated skin lesions, designated as non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis (NUCL) caused by Leishmania (L.) infantum chagasi, has been reported. In Honduras, visceral leishmaniasis and non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis are caused by the same etiologic agent, Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographical area. NUCL is the most common clinical form, affecting mainly children older than 5 years and young adults. The lesion is defined as a papule, painless nodule, non-ulcerative, erythematous or skin color, in the presence or absence of hypopigmented halo. Considering that, there is a gap in the knowledge of the tissue immune response pattern of non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, this study aimed to evaluate the in situ inflammatory and regulatory immune response of skin lesions. Twenty skin biopsies with a confirmed parasitological diagnosis by scraping of lesion stained by Giemsa and observed under an optical microscope were used. The histopathological study was evaluated in histological sections stained with hematoxylin and eosin (HE) and the inflammatory and regulatory immune response through the immunohistochemistry reaction using T lymphocyte (CD4 and CD8), regulatory T (FoxP3) markers, and intracellular antigens such as IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 and IFN-y. The most significant histopathological changes were observed in the dermis, and they were characterized by a lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensity and associated to the formation of epithelioid granulomas. On the other hand, the histopathological changes identified in the epidermis were lighter and correspond to mild thinning, mild acanthosis and focal lymphohistiocytic exocytosis. In 55% of the cases, the parasitism was discreet. The immunohistochemistry analysis of the cutaneous lesions of patients with NUCL showed in the inflammatory infiltrate the presence of all the markers used in this study, especially CD8+ and CD4+ T lymphocytes, and the inflammatory cytokines IFN-y and IL-6. The participation of FoxP3+, TGF-beta+ and IL-10+ cells was discrete, as well as IL-17+ cells. The data show a higher participation of the inflammatory response in non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, able to control the tissue parasitism and consequently the evolution of the lesion size; however, although discreet, the regulatory immune response may be responsible for maintaining a balance in the cellular immune response avoiding tissue damage and leading to low tissue parasitic persistence necessary for the maintenance of a protective and lasting immunity