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A systematic in vitro metabolism study of opioids using rat liver S9 fractions and mass spectrometry revealed CYP2D metabolism is impaired with ageSalmin, Sabrin Fuad 07 1900 (has links)
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Rôle et impact des protéines associées à la lame basale spécialisée dans l’attache gingivale et la maladie parodontaleFouillen, Aurélien 04 1900 (has links)
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Structural and Biochemical Characterization of VirB8 Protein in Type IV Secretion SystemsSharifahmadian, Mahzad 07 1900 (has links)
Secretion is the passage of macromolecules across cellular membranes. In bacteria, secretion is essential for virulence and survival. Gram-negative bacteria use specialized envelope-spanning multiprotein complexes to secrete macromolecules called type IV secretion system (T4SS). T4SSs mediate the secretion of monomeric proteins, multisubunit protein toxins and nucleoprotein complexes. Also, they contribute to the horizontal spread of plasmid-encoded antibiotic resistance genes. Consequently, they are potential targets for antivirulence drugs. Gram- negative bacteria have two membranes that the secretion complex spans. As a result, the T4SS consists of proteins inserted in the membranes and of soluble proteins that face into or out of the bacterial cell. The details of channel assembly and structure are not known, although recent advances have revealed the structure of the core secretion channel. VirB8 is an inner membrane protein of the complex that interacts with many other T4SS subunits and works as nucleation factor for T4SS channel assembly. Biophysical studies and NMR experiments in particular were conducted to characterize the structural aspects of VirB8 interactions. Dynamic regions of VirB8 during monomer-to-dimer transition were identified by NMR spectroscopy. X-ray crystal and NMR analyses revealed structural differences at the helical regions (α-1 and α-4) of wild-type VirB8 and its monomeric variant VirB8M102R. Fragment screening identified small molecules binding to the wild-type and monomeric variant. In silico docking analyses suggested that the surface groove in the VirB8 structure is important for effective binding of the small molecules. NMR experiments and biochemical assays demonstrated that the β-sheet domain (β1 in particular) is the binding interface of VirB8 for the interaction with VirB10. The identified interface has functional importance for T4SS-mediated conjugation. In addition, I used NMR spectroscopy to identify changes in the structure of VirB8 upon interaction with VirB5. Altogether, structural and biochemical studies on periplasmic and full length VirB8 enabled us to characterize the sequence of interactions between VirB8 and other VirB proteins during T4SS complex assembly and function. The results of this research may lead to an innovative strategy for the development of novel antimicrobial drugs. / La sécrétion est le passage de macromolécules à travers les membranes cellulaires. Chez les
bactéries, la sécrétion est essentielle pour la virulence et la survie. Les bactéries à Gramnégatif
utilisent le système de sécrétion de type IV (SST4) pour la sécrétion de toxines et de
nucléoprotéines. Les SST4 contribuent notamment à la propagation des gènes de résistance aux
antibiotiques. Pour cette raison, les composants du SST4 sont des cibles potentielles pour le
développement de médicaments antivirulence. Le SST4 est un complexe protéique qui s’étend
entre la double membrane de la bactérie à Gram-négatif. Les protéines qui le composent sont
insérées dans les membranes cellulaires ou solubles. Bien que la structure du pore central du
SST4 ait été résolue récemment, les détails de l'assemblage et la structure de ce complexe ne
sont pas connus. VirB8 est une protéine de la membrane interne qui interagit avec de
nombreuses autres sous-unités du SST4. Il s’agit d’un acteur central de l'assemblage du SST4.
Des études biophysiques, et notamment des expériences de RMN ont ainsi été réalisées pour
caractériser les aspects structuraux des interactions avec VirB8. Des regions dynamiques dans
la structure de VirB8 ont été identifiées par spectroscopie RMN lors de la transition entre la
forme monomérique et dimérique. Les analyses de cristallographie et de RMN ont révélé des
différences structurales dans les régions hélicoïdales (α1 et α4) de VirB8 wild-type et du variant
monomérique VirB8M102R. Le criblage de fragments a permis d’identifier de petites molécules
capables de se lier à VirB8 ainsi qu’au variant monomérique. Les analyses d’arrimage
moléculaire in silico suggèrent que la rainure de surface dans la structure VirB8 est importante
pour laliaison de ces petites molécules. Les expériences de RMN et les essais biochimiques
révèlent que le feuillet β (β1 en particulier) constitue l'interface d’interaction entre VirB8 et VirB10. Cette interface d’interaction est d’ailleurs importante pour la conjugaison du SST4. De
plus, j'ai identifié des changements dans la structure de VirB8 lors de l'interaction avec VirB5.
Les études sur la protéine VirB8 nous ont permis de caractériser la séquence d'événements
entre VirB8 et d'autres protéines VirB, régulant l'assemblage et la fonction du SST4.
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Études d'ingénierie du ribozyme VS de NeurosporaLacroix-Labonté, Julie 31 December 2015 (has links)
Les ribozymes sont des ARN catalytiques fréquemment exploités pour le
développement d’outils biochimiques et d’agents thérapeutiques. Ils sont particulièrement
intéressants pour effectuer l’inactivation de gènes, en permettant la dégradation d’ARNm ou
d’ARN viraux associés à des maladies. Les ribozymes les plus utilisés en ce moment pour le
développement d’agents thérapeutiques sont les ribozymes hammerhead et hairpin, qui
permettent la reconnaissance spécifique d’ARN simple brin par la formation de structures
secondaires stables. In vivo, la majorité des ARN adoptent des structures secondaires et
tertiaires complexes et les régions simples brins sont parfois difficiles d’accès. Il serait
intéressant de pouvoir cibler des ARN repliés et un motif d’ARN intéressant à cibler est la
tige-boucle d’ARN qui peut être importante dans le repliement global des ARN et pour
accomplir des fonctions biologiques.
Le ribozyme VS de Neurospora fait la reconnaissance de son substrat replié en tigeboucle
de façon spécifique par une interaction kissing-loop, mais il n’a jamais été exploité
pour faire la reconnaissance d’un ARN cible très différent de son substrat naturel. Le but des
travaux présentés dans cette thèse est de déterminer si le ribozyme VS possède l’adaptabilité
nécessaire pour l’ingénierie de ribozymes qui clivent des ARN cibles différents du substrat
naturel. Dans le cadre de cette thèse, le ribozyme VS a été modifié pour l’adapter à différents
substrats et des études de cinétiques ont été réalisées pour évaluer l’impact de ces
modifications sur l’activité de clivage du ribozyme. Dans un premier temps, le ribozyme a été
modifié pour faire la reconnaissance et le clivage de substrats possédant différentes longueurs
de tiges Ib. Le ribozyme a été adapté avec succès à ces substrats de différentes longueurs de
tige Ib, avec une activité qui est similaire à celle du ribozyme avec un substrat sans
modification. Dans un deuxième temps, c’est l’interaction kissing-loop I/V du ribozyme qui a
été substituée de façon rationnelle, dans le but de savoir si un ribozyme VS mutant peut
reconnaitre et cliver un substrat ayant une boucle différente de celle de son substrat naturel.
L’interaction kissing-loop I/V a été substituée pour les interactions kissing-loop TAR/TAR*
de l’ARN du VIH-1 et L22/L88 de l’ARN 23S de Deinococcus radiodurans. La réaction de
iii
clivage des ribozymes comportant ces nouvelles interactions kissing-loop est toujours
observée, mais avec une activité diminuée. Finalement, la sélection in vitro (SELEX) de
ribozymes a été effectuée pour permettre un clivage plus efficace d’un substrat mutant avec
une nouvelle boucle. Le SELEX a permis la sélection d’un ribozyme qui clive un substrat avec
une boucle terminale mutée pour celle de l’ARN TAR du VIH-1 et cela avec une activité de
clivage très efficace. L’ensemble de ces études démontre que le ribozyme VS peut être
modifié de diverses façons pour la reconnaissance spécifique de différents substrats, tout en
conservant une bonne activité de clivage. Ces résultats montrent le grand potentiel
d’ingénierie du ribozyme VS et sont prometteurs pour la poursuite d’études d’ingénierie du
ribozyme VS, en vue du clivage d’ARN cibles repliés en tige-boucle complètement différents
du substrat naturel du ribozyme VS. / Ribozymes are catalytic RNAs frequently exploited for the development of
biochemistry tools and therapeutic agents. They are particularly interesting in gene
inactivation strategies for the degradation of mRNA and viral RNA genome. Currently, the
most common ribozymes used in the development of therapeutic agents are the hammerhead
and hairpin ribozymes, which can specifically recognize and cleave target single-stranded
RNAs through the formation of stable secondary structures. In vivo, single-stranded RNAs
can be difficult to target because most RNA adopt complex secondary and tertiary structures.
It could be worthwhile to target folded RNA motifs, and an interesting target is the stem-loop
structure because stem-loops are important for the overall folding of RNA molecules and they
can perform important biological functions.
The Neurospora VS ribozyme recognizes its stem-loop folded substrate via a specific
kissing-loop interaction, but it has never been exploited for the recognition of target RNA very
different from its natural substrate. The goal of the work presented in this thesis is to
determine whether the VS ribozyme possesses the necessary adaptability for engineering
ribozymes that target RNAs different from its natural substrate. For this thesis, the VS
ribozyme was adapted for the recognition of different substrates and kinetic studies were
performed to evaluate the effect of these modifications on the cleavage activity. In a first
study, the VS ribozyme was modified to recognize and cleave substrates with different stem Ib
lengths. The VS ribozyme was successfully adapted to theses substrates of different lengths
with a cleavage activity similar to the unmodified ribozyme and substrate. In a second study,
the I/V kissing-loop interaction was substituted by rational design, in order to establish if the
VS ribozyme variants could recognize and cleave a substrate with a different loop than its
natural substrate. The I/V kissing-loop interaction was substituted for the HIV-1 TAR/TAR*
and the Deinococcus radiodurans RNA large rRNA subunit L22/L88 kissing-loop
interactions. The cleavage reaction was observed for the ribozymes with these new
interactions, but with reduced activity. Finally, in vitro selection (SELEX) was used to enable
more efficient cleavage of a mutant substrate with a new loop. SELEX experiments enabled
v
the selection of ribozyme variants that cleave a substrate with a terminal loop mutated to that
of the HIV-1 TAR RNA with a very efficient cleavage activity. All of the studies presented in
this thesis show that the VS ribozyme can be modified in various ways for the specific
recognition of different substrates, while maintaining efficient cleavage activity. These results
demonstrate the great potential of VS ribozyme engineering and are very promising for further
engineering studies of VS-derived ribozymes for the cleavage of stem-loop folded target RNA
completely different from its natural VS ribozyme substrate.
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Caractérisation de nouveaux modèles TDP-43/TDP-1 de Caenorhabditis elegans pour la maladie sclérose latérale amyotrophiqueDuhaime, Sarah 12 1900 (has links)
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative fatale caractérisée par une perte progressive et sélective des neurones moteurs. La SLA est incurable et il n’existe aucun traitement efficace pour les personnes atteintes de cette maladie. Environ 90% des cas sont sporadiques tandis que 10% sont familiaux, et les patients décèdent généralement deux à cinq ans après l'apparition des premiers symptômes. De nombreuses anomalies génétiques sont
associées à la SLA, incluant des mutations dans les protéines FUS, C9orf72, SOD-1 et TDP-43. Le laboratoire a développé un modèle transgénique de Caenorhabditis elegans surexprimant la protéine humaine mutante TDP-43(Q331K) dans les neurones moteurs GABAergiques. Nous avons également obtenu par mutagénèse et CRISPR-Cas9 des modèles physiologiquement représentatifs du nématode basés sur des mutations dans tdp-1, l'orthologue de TARDBP chez le C. elegans. L'objectif est de caractériser ces modèles et de déterminer s'ils peuvent récapituler certains aspects phénotypiques clés de la SLA, tels que des déficits moteurs et une neurodégénérescence dépendante de l'âge générant une paralysie. L’hypothèse est que le modèle TDP-1 pourra refléter plus précisément l’expression physiologique du gène dans la maladie humaine grâce à la mutation dans un gène endogène, l’absence de surexpression et l’expression ubiquitaire de la protéine TDP-1. Les résultats montrent que les modèles TDP-43/TDP-1 ont des déficits moteurs, une transmission synaptique altérée et une neurodégénérescence liée à l’âge. Cependant, seule la mutation dans TDP-43 semble avoir un effet sur la durée de vie. Ces modèles procurent différentes expressions physiologiques des protéines mutantes et donc, des phénotypes de niveaux d'intensité variables. Ils constitueront des outils utiles pour élucider de nouveaux mécanismes pathogéniques de la SLA ainsi que de bons candidats pour le criblage de médicaments et le développement de stratégies thérapeutiques. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease characterized by a progressive and selective loss of motor neurons. ALS is incurable and there are no effective treatments available for people living with the disease. About 90% of the cases are sporadic whereas 10% are familial, and patients usually die two to five years after symptom onset. Many gene defects are associated with ALS, including mutations in genes encoding FUS, C9orf72, SOD-1 and TDP-43 proteins. We have developed a transgenic Caenorhabditis elegans model expressing human mutant TDP-43(Q331K) in GABAergic motor neurons. We have also obtained by mutagenesis and CRISPR-Cas9 physiologically accurate models based on mutations in tdp-1, the C. elegans ortholog of TARDBP. Our objective is to characterize these models and determine if they can recapitulate key aspects of the disease such as motor deficits and age-dependent neurodegeneration causing paralysis. We believe that the TDP-1 model will reflect more precisely the physiological expression of the gene in the human disease because of its mutation in an endogenous gene, the absence of overexpression and ubiquitous protein expression. Our results show that both TDP-43 and TDP-1 models have motor deficits, synaptic transmission impairments
and age-dependent neurodegeneration. However, only the TDP-43 mutation seems to have an effect on lifespan. These models provide different physiological expression of mutant proteins and thus phenotypes of varying intensity levels. They will be useful tools to elucidate new pathogenic mechanisms of ALS as well as being good candidates for drug screening and developing therapeutic strategies.
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Évaluation des propriétés biologiques de sels de biguanidium : perturbation membranaire et applications dans le traitement du cancer du pancréasHébert, Audrey 08 1900 (has links)
La metformine, un médicament couramment utilisé pour le traitement du diabète de type II, fut récemment identifiée comme un composé ayant des propriétés anticancéreuses très intéressantes, notamment pour le cancer du pancréas. Toutefois, malgré les nombreuses expériences in vitro et sur des modèles murins qui ont confirmé cet effet, les essais cliniques sur les humains sont restés infructueux. Un des facteurs mis en cause pour expliquer ces résultats est la grande hydrophilie de la metformine, qui diminue sa biodisponibilité et limite son transport au travers des membranes cellulaires. Nous nous sommes donc intéressés à la synthèse de sels de biguanidium amphiphiles inspirés de la metformine qui se partitionnent plus facilement dans les bicouches phospholipidiques et qui possèdent de meilleures activités anticancéreuses.
Pour ce faire, nous avons tout d’abord étudié la perturbation des membranes par de simples alkylbiguanidium. Nous avons démontré que ces composés peuvent transporter des ions H+/OH- et dépolariser les membranes bactériennes, ce qui leur confère des propriétés antibactériennes et antifongiques. Afin de limiter l’hémolyse associée à ces composés, des sels de biguanidium substitués par le groupement phényléthynylbenzyle ont par la suite été synthétisés. La structure de ceux-ci leur permet de mieux se partitionner dans les membranes et s’accumuler dans les mitochondries, tout en diminuant la toxicité associée à une perturbation membranaire trop forte. Leur activité sur les cellules cancéreuses du pancréas est ainsi beaucoup plus importante que celle de la metformine, de même que leur capacité à inhiber la croissance de xénogreffes chez les souris. Ces résultats nous ont ensuite amené vers la synthèse d’une petite librairie de sels de biguanidium et l’étude de leurs activités anticancéreuses et antibactériennes. Les modifications structurales et les changements de contre-ion apportés à cette librairie ont permis d’obtenir des composés encore plus efficaces et surtout beaucoup plus sélectifs envers les cellules saines, ouvrant ainsi la porte à une nouvelle classe de médicaments anticancéreux à base de sels de biguanidium. / Metformin, a common drug used for the treatment of type II diabetes, has recently been
linked to interesting anticancer properties, notably on pancreatic cancer. Although there have
been many experiments in vitro and on murine models that have confirmed this effect, human
clinical trials featuring metformin have been unsuccessful. One of the reasons brought forward
to explain these results is the high hydrophilicity of metformin, which limits its bioavailability
and transport through cellular membranes. For this reason, we have been interested in the
synthesis of amphiphilic biguanidium salts inspired from metformin that can partition more
easily in phospholipid membranes and thus have better anticancer properties.
We first studied the membrane perturbation properties of simple alkylbiguanidium salts
and showed that these compounds can transport H+/OH- ions and depolarize bacterial
membranes, which in turn gives them antibacterial and antifungal properties. To limit the
hemolytic activity associated with these compounds, biguanidium salts substituted by the
phenylethynylbenzyl moiety were then synthesised. Their structure allows them to partition
more easily in membranes and accumulate in mitochondria, while lowering the toxicity
associated with high membrane perturbation. For those reasons, their activity on pancreatic
cancer cells is much higher than metformin, as is their inhibition of xenograft growth in mice.
These results encouraged us to synthesise a small library of biguanidium salts and study their
anticancer activity. The structural modifications and counter-anion variations brought to this
library have improved the efficiency of these compounds as well as their selectivity towards
healthy cells, thus opening the door to a new class of anticancer drugs based on biguanidium
salts.
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Structure et localisation du complexe ESX-3 dans les mycobactériesMorneau, Isabelle 08 1900 (has links)
Le système de sécrétion type VII (T7SS) présent chez les mycobactéries comporte cinq loci, nommés ESX-1 à ESX-5, chacun possédant leurs propres fonctions. Le système ESX-3, le plus conservé entre les espèces de mycobactéries, participe au transport du fer et à la sécrétion de protéines dont la protéine EsxH. EsxH interagit avec le système ESCRT dans le macrophage et contribue à la persistance de M. tuberculosis (Mtb) dans l’hôte. Afin de mieux comprendre le mécanisme du T7SS, nous avons surexprimé le locus ESX-3 de Mtb dans les organismes recombinants M. smegmatis et M. marinum. Nous avons purifié un coeur protéique partiel du complexe ESX-3 par chromatographie liquide de protéine rapide (FPLC) et déterminé différentes structures in vitro qui pourraient représenter son dynamisme par une analyse des particules individuelles. Nous avons localisé le complexe ESX-3 aux pôles chez M. marinum par microscopie de fluorescence (fLM) et microscopie super-résolution d’illumination de structure (SR-SIM). Finalement, nous avons reconstruit un modèle in vivo 3D de ce complexe en jumelant une technique de corrélation entre la microscopie par localisation photoactivée (PALM) et la tomographie électronique en conditions cryogéniques (cryo-ET). En jumelant nos structures in vitro et notre modèle in vivo, nous discutons d’un mécanisme possible du complexe ESX-3. Ces analyses pourront aussi supporter le criblage d’inhibiteurs potentiels pour traiter les infection mycobactériennes. / A novel, type VII secretion system (T7SS) was recently discovered in Mycobacteria. Five subsystems, called ESX-1 to ESX-5, have been identified, with the ESX-3 being the most conserved. The ESX-3 system is essential for growth and pathogenesis, and has been implicated in iron transport and secretion of effector proteins into the host. The secreted proteins are shown to prevent phagosome maturation by interacting with the ESCRT machinery of the macrophage. To characterize the structure and mechanism of secretion employed by the T7SS, we use the ESX-3 system from Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and recombinantly express it in M. smegmatis and M. marinum cells. By combining Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) and Single Particle electron microscopy analysis, we have reconstructed several in vitro models that contain at least three of the ESX-3 cluster proteins and may represent the dynamic nature of the core complex. Using fluorescent light microscopy (fLM) and super-resolution structure illumination microscopy (SR-SIM), we localized the ESX-3 complex to the lateral pole in M. marinum cells. We also used super-resolution photoactivated localization microscopy (PALM) in correlation with cryo-electron tomography (cryo-ET) of whole M. marinum cells to localize and reconstruct an in vivo 3D model of the ESX-3 secretion system. By combining the single particle reconstructions and the cryotomography data, we discuss a possible mechanism of ESX-3 secretion. Such analysis may support future inhibitor screens to prevent mycobacterial infections.
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Développement et validation d’une méthode de séparation et quantification des acides biliaires sériques par LC-MS/MS, profilage et comparaison avec la méthode enzymatique traditionnelleLapierre, Caroline 07 1900 (has links)
La cholestase intrahépatique de la grossesse (CIG) est la maladie du foie la plus répandue au cours de la grossesse. Elle est caractérisée par un prurit et est associée à une augmentation de la concentration des acides biliaires dans le sang, ce qui peut mener à un risque accru de conséquences périnatales indésirables, y compris un accouchement prématuré spontané et une augmentation des risques de mort de l’enfant à l’accouchement, entre autres. Le traitement médical de cette maladie repose actuellement sur l’acide ursodésoxycholique (UDCA) qui diminue le prurit et les anomalies biochimiques maternelles dans certains cas. Actuellement, le diagnostic de la CIG est posé suite à un test de quantification des acides biliaires sériques totaux par une méthode enzymatique.
Nous émettons l'hypothèse que certains profils d’acides biliaires permettraient d’évaluer le risque de complications chez les femmes atteintes de CIG. En analysant les profilages, il pourrait être possible de déterminer la ou les espèces responsables de ces complications et ainsi déterminer des sous-groupes de patientes plus à risque de complications ou qui répondraient mieux au traitement. De plus, nous pensons que le traitement à l’UDCA, étant lui-même un acide biliaire, pourrait interférer lors de la quantification des acides biliaires totaux sériques, particulièrement dans les cas les plus problématiques de CIG où de fortes doses de ce composé sont administrées. Si c’était le cas, cela ferait en sorte que les valeurs de référence pourraient être modifiées en fonction du traitement administré.
Le projet de recherche présenté vise au développement d’une méthode de quantification des acides biliaires sériques par la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS), qui permettrait un profilage des acides biliaires sériques chez les femmes enceintes atteintes de la CIG et qui permettrait également d’évaluer l’effet du traitement à l’UDCA sur ce profilage.
Une méthode de quantification des acides biliaires par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem a été développée et validée. Les surnageants obtenus par précipitation de protéines avec le méthanol ont été injectés sur le LC-MS/MS. La séparation est réalisée par chromatographie en phase inverse sur une colonne C18 de type interactions hydrophobes. Les transitions ioniques sur le spectromètre de masse ont été déterminées pour toutes les espèces d’acides biliaires au préalable et l’acide cholique deutéré, l’acide chénodésoxycholique deutéré ainsi que l’acide désoxycholique deutéré ont été utilisés comme standards internes. Quinze acides biliaires, y compris les acides biliaires conjugués et libres, ont été séparés et quantifiés par LC–MS/MS en utilisant l’ionisation par électro nébulisation (ESI) en mode ion négatif. La quantification a été réalisée en mode de surveillance de réactions multiples (MRM) avec des méthodes de courbes d'étalonnage externes. Les coefficients de corrélation des courbes standards pour tous les acides biliaires étaient supérieurs à 0,9966. La méthode développée a démontré une précision acceptable, avec une imprécision intra analyse inférieure à 3,2% pour toutes les espèces d’acide biliaire étudiées (pour des échantillons à 0,8 et 5 μg/mL) et une imprécision inter analyse inférieure à 15%. Une suppression d’ion moyenne de 8,2% a été observée, qui a été jugée acceptable. Une bonne corrélation a été obtenue entre la méthode LC-MS/MS et une méthode enzymatique (r=0,964).
En conclusion, une méthode fonctionnelle, efficace et rapide a été développée pour quantifier les acides biliaires sériques individuels et différents profils d’acides biliaires représentant une large gamme de concentrations ont été comparés. La comparaison des profilages d’acides biliaires suggère que les acides biliaires principaux responsables de l’augmentation de la concentration des acides biliaires totaux dans le sang pour des échantillons à une concentration de plus de 10 μmol/L sont l’acide cholique glyco-conjugué (GCA), l’acide cholique tauro-conjugué (TCA) ainsi que l’acide ursodésoxycholique glyco- conjugué (GUDCA). Cette nouvelle méthode validée, et les données préliminaires sur les profils d’acides biliaires dans les échantillons cliniques, permettront de lancer des analyses cliniques prospectives pour évaluer l’effet du traitement par l’UDCA sur les concentrations totales d’acides biliaires sériques et sur les profils d’acides biliaires individuels chez les patientes atteintes de la CIG. / Intrahepatic cholestasis of pregnancy (ICP) is the most common liver disease during pregnancy. It is characterized by pruritus and is associated with an increased concentration of bile acids in blood, which may lead to an increased risk of perinatal consequences, including spontaneous preterm delivery and an increased risk of death at birth, among others. The medical treatment of this disease currently relies on ursodeoxycholic acid (UDCA) which reduces pruritus and maternal biochemical abnormalities in some cases. Currently, the diagnosis of ICP is made using an enzymatic assay to measure total serum bile acids.
We hypothesize that profiling of the individual bile acids would make it possible to assess the risk of complications in women with ICP. By analyzing the bile acid profiles, it could be possible to determine which specie(s) is responsible for these complications and thus to distinguish subgroups of patients at higher risk of complications or who would respond better to treatment. In addition, we believe that UDCA treatment, being a bile acid itself, could interfere with the quantification of total serum bile acids, particularly in the most problematic cases of CIG where high doses of this compound are administered. If this was the case, it would mean that the reference values would need to be changed depending on the administered treatment.
The research project aims to develop and validate a method for quantifying bile acids in serum by liquid chromatography coupled to a tandem mass spectrometer (LC-MS/MS), which would allow profiling of serum bile acids in affected women and which would also make it possible later to evaluate the effects of UDCA treatment on this profiling.
A method for the quantification of bile acids by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry has been developed and validated. The supernatants obtained by precipitation of proteins with methanol were injected onto the LC-MS/MS. The separation was carried out using reversed-phase chromatography on a C18 hydrophobic interactions type column. Ionic transitions on the mass spectrometer were determined for all bile acids species beforehand and deuterated cholic acid, deuterated chenodeoxycholic acid and deuterated deoxycholic acid were used as internal standards. Fifteen bile acids, including conjugated and free bile acids, were separated and quantified by LC–MS/MS using electrospray ionization (ESI) in negative ion mode. Quantification was performed in multiple reaction monitoring (MRM) mode with external calibration curve methods. Correlation coefficients for standard curves for all bile acids were greater than 0.9966. The method developed showed acceptable precision, with intra-assay imprecision of less than 3.2% for all the bile acid species studied (for samples at 0.8 and 5 μg/mL) and inter-assay imprecision under 15%. An average ion suppression of 8.2% was observed, which was judged acceptable. Finally, a good correlation was obtained between the LC-MS/MS method and an enzymatic method (r = 0.964).
In conclusion, a functional, efficient and rapid method was developed to quantify the individual serum bile acids and different bile acids profiles representing a wide range of concentrations were compared. The comparison of the bile acid profiles suggests that the main bile acids responsible for the increase in total bile acids concentration in blood for samples at a concentration of more than 10 μmol/L are glycocholic acid (GCA), taurocholic acid (TCA), glycoursodeoxycholic acid (GUDCA). This new validated method, and the preliminary data on bile acid profiles in clinical samples, will allow us to initiate prospective clinical analyses to assess the effect of UDCA treatment on total bile acid concentrations and profiles in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy.
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Étude du rôle des miARN dans les pathologies vasculaires de l'oeilMénard, Catherine 12 1900 (has links)
Une des pathologies les plus répandues dans les pays développés est la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Elle se présente sous différentes formes dont la plus sévère est caractérisée par la présence de formation de néo-vascularisation provenant de la choroïde (CNV) migrant vers la rétine. Malheureusement, le diagnostic peut être seulement posé une fois que les symptômes apparaissent et que la vision est déjà affectée. Récemment, un vif engouement s’est porté sur les microARN (miARN), devenus des molécules d’intérêt pour le développement de biomarqueurs et représentant également un important potentiel thérapeutique. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’identification de miRNA dans un contexte de DMLA avec CNV permettrait de caractériser leurs rôles, tant au niveau de l’identification de biomarqueurs que de nouvelles cibles thérapeutiques.
Le premier objectif de notre projet était d’identifier chez l’humain une signature de miARN spécifique à la forme humide de la DMLA. Pour ce faire, nous avons réalisé un criblage des miARN dans l’humeur vitrée de patients. Nous avons observé une augmentation des niveaux de miR-146a et une diminution de miR-106b et miR-152 spécifique à la DMLA. Cette signature fut confirmée dans le plasma de cette même cohorte de patients. D’autre part, l’exploration de bases de données AMD Gene Consortium (AGC) et Ingenuity Pathway Analysis (IPA) a démontré une relation entre les miARN détectés et des mutations génétiques associées à la forme DMLA avec CNV. En effet, nous avons identifié un SNP (single-nucleotide polymorphism ou SNP) (rs1063320) dans un site de liaison de miR-152 du gène HLA-G. Le second objectif était d’explorer la possibilité d’utiliser, du point de vue thérapeutique, un des miARN identifiés au 1er objectif. Nous avons, tout d’abord, quantifié l’expression de miR-146a, miR-106b et miR152 dans un des modèles classiques de la DMLA avec CNV chez la souris (brûlures par laser). Le candidat retenu fut miR-106b, puisqu’en plus d’être impliqué dans l’angiogenèse, son expression dans le modèle animal reflétait de plus près celle obtenue chez les patients. Suite à ces résultats, nous avons: exploré A) le mécanisme influençant la diminution de l’expression de miR-106b et B) l’effet de sa surexpression sur l’angiogenèse. D’abord en A), nous avons observé une activation de la voie de PERK dans notre modèle animal de CNV induite par laser menant à une diminution de l’expression de MCM7 et du polycistron miR-106b~25. . Ensuite en B), nous avons pu observer l’effet anti-angiogénique de miR-106b sur la migration des cellules endothéliales in vitro et sur la formation de NV in vivo. L’action anti-angiogénique de miR-106b pourrait ainsi avoir un potentiel thérapeutique important sur la formation de la CNV dans la DMLA. / Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness worldwide affecting individuals over the age of 60. The neovascular form (NV AMD) is characterized by choroidal neovascularization (CNV) and is responsible for the majority of central vision impairment. Unfortunately, diagnostic of AMD can only be done after symptoms have appeared and loss of visual field occurred. Recently, there is a growing interest in microRNAs (miRNAs) for their eventual use in the development of new biomarkers or new therapeutic strategies. Our hypothesis is that wet AMD is associated with specific signature of several miRNAs that can be used as biomarkers for the disease. These miRNAs can be harnessed for therapeutic interventions.
Our first objective was to identify a specific signature of miRNAs for wet AMD by using non-biased microRNA arrays and individual TaqMan qPCRs. We profiled miRNAs in the vitreous humour and plasma of patients with NV AMD. We identified a disease-associated increase in miR-146a and a decrease in miR-106b and miR-152 in the vitreous humour, which was reproducible in plasma. Moreover, miR-146a/miR-106b ratios discriminated patients with NV AMD with an area under the Receiver Operating Characteristic curve (ROC AUC) of 0,977 in vitreous humour and 0,915 in plasma, suggesting potential for a blood-based diagnostic. Furthermore, using the AGC and IPA database, we mapped a NV AMD-associated single nucleotide polymorphism (SNP) (rs1063320) in a binding site for miR-152-3p in the HLA-G gene.
Our second objective was to explore the therapeutic potential of a specific miRNA (identified in objective 1). First, we explored the expression levels of miR-146a, miR-106b and miR-152 in the laser burn mouse model. We demonstrated that levels of miR-106b were significantly decreased in this mouse model of CNV. We divided this objective in two parts: Part A, explore mechanisms causing miR-106b downregulation and part B, study the therapeutic potential of miR-106b on the inhibition of angiogenesis and CNV formation. First, we showed that expression of the miR-106b-25 cluster is negatively regulated by the ER stress pathway of protein kinase RNA-like ER kinase (PERK) and a reduction in levels of MCM7, the host gene of miR-106b. �����Second, we demonstrated that therapeutic delivery of miR-106b to the retina with lentiviral vectors protects against aberrant retinal neovascularization in two distinct mouse models of pathological neo-vascularization. Results from this study suggest that miRNAs, such as miR-106b, have the potential to be used as multitarget therapeutics for conditions characterized by aberrant retinal neovascularization.
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Purification par affinité et marquage isotopique spécifique pour études d’ARN fonctionnelsDagenais, Pierre 11 1900 (has links)
Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de
l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles
que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une
technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules
d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés
majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements.
Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique
d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend
la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur
support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La
nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN
fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par
spectroscopie RMN. / The tridimensional structure of a given RNA molecule is closely linked to its cellular function. For this reason, it is crucial to study the structure of RNA molecules, such
as riboswitches, to characterize their mechanism of action. To do so, NMR spectroscopy is often used to gather structural data on RNA molecules in solution. However, this approach is limited by two main difficulties. First, the production of preparative quantities of natively folded and purified RNA molecules is a long and tedious process. To facilitate this step, our laboratory has developed an RNA-affinity purification method using an ARiBo tag. The second limiting step comes from the extensive signal overlap detected on NMR spectra of large RNA molecules. This overlap is proportional to the length of the RNA, which often prevents high-resolution structure determination of RNAs larger than 15 kDa. To solve this problem, specific isotopic labeling of RNAs can now be achieved. However, existing labeling protocols are expensive, require several weeks of laboratory manipulations and usually provide relatively low yields. This thesis provides an alternative strategy to achieve specific isotopic labeling of
RNA molecules, based on the ARiBo tag affinity purification technique. The protocol
includes the separation and the purification of isotopically labeled nucleotides, an
enzymatic ligation step performed on a solid support and the affinity purification of the
RNA of interest, without any sequence restriction. This new strategy is a fast and efficient
way to label functional RNAs isotopically and should facilitate NMR structure
determination of large RNAs.
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