La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates. In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays. Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.

Il existe un lien étroit entre la structure tridimensionnelle et la fonction cellulaire de l’ARN. Il est donc essentiel d’effectuer des études structurales de molécules d’ARN telles que les riborégulateurs afin de mieux caractériser leurs mécanismes d’action. Une technique de choix, permettant d’obtenir de l’information structurale sur les molécules d’ARN est la spectroscopie RMN. Cette technique est toutefois limitée par deux difficultés majeures. Premièrement, la préparation d’une quantité d’ARN nécessaire à ce type d’étude est un processus long et ardu. Afin de résoudre ce problème, notre laboratoire a développé une technique rapide de purification des ARN par affinité, utilisant une étiquette ARiBo. La deuxième difficulté provient du grand recouvrement des signaux présents sur les spectres RMN de molécules d’ARN. Ce recouvrement est proportionnel à la taille de la molécule étudiée, rendant la détermination de structures d’ARN de plus de 15 kDa extrêmement complexe. La solution émergeante à ce problème est le marquage isotopique spécifique des ARN. Cependant, les protocoles élaborées jusqu’à maintenant sont très coûteux, requièrent plusieurs semaines de manipulation en laboratoire et procurent de faibles rendements. Ce mémoire présente une nouvelle stratégie de marquage isotopique spécifique d’ARN fonctionnels basée sur la purification par affinité ARiBo. Cette approche comprend la séparation et la purification de nucléotides marqués, une ligation enzymatique sur support solide, ainsi que la purification d’ARN par affinité sans restriction de séquence. La nouvelle stratégie développée permet un marquage isotopique rapide et efficace d’ARN fonctionnels et devrait faciliter la détermination de structures d’ARN de grandes tailles par spectroscopie RMN. / The tridimensional structure of a given RNA molecule is closely linked to its cellular function. For this reason, it is crucial to study the structure of RNA molecules, such as riboswitches, to characterize their mechanism of action. To do so, NMR spectroscopy is often used to gather structural data on RNA molecules in solution. However, this approach is limited by two main difficulties. First, the production of preparative quantities of natively folded and purified RNA molecules is a long and tedious process. To facilitate this step, our laboratory has developed an RNA-affinity purification method using an ARiBo tag. The second limiting step comes from the extensive signal overlap detected on NMR spectra of large RNA molecules. This overlap is proportional to the length of the RNA, which often prevents high-resolution structure determination of RNAs larger than 15 kDa. To solve this problem, specific isotopic labeling of RNAs can now be achieved. However, existing labeling protocols are expensive, require several weeks of laboratory manipulations and usually provide relatively low yields. This thesis provides an alternative strategy to achieve specific isotopic labeling of RNA molecules, based on the ARiBo tag affinity purification technique. The protocol includes the separation and the purification of isotopically labeled nucleotides, an enzymatic ligation step performed on a solid support and the affinity purification of the RNA of interest, without any sequence restriction. This new strategy is a fast and efficient way to label functional RNAs isotopically and should facilitate NMR structure determination of large RNAs.

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN. / The regulation of gene expression is what allows our cells to adapt to their environment, to fight infections or, more generally, to express the appropriate level of proteins to meet a specific need. The microRNAs (miRNAs) are among the most important players in the regulation of gene expression. These small RNAs of 22 nucleotides are present in most multicellular species and are responsible for the direct control of more than 30% of protein-expressing genes in vertebrates. The miRNA lethal-7 (let-7) family consist of some of the most studied miRNAs and plays crucial roles in the cell. The appropriate regulation of the let-7 miRNAs level is essential for proper cellular development. The biogenesis of these miRNAs, from the primary transcript to their mature form is mainly regulated by Lin28, a highly-conserved pluripotent protein. This protein is composed of a cold shock domain (CSD) and two zinc-binding domains. These RNA-binding domains allow Lin28 to bind and inhibit the maturation of the let-7 miRNA. The objective of this thesis is to characterize the interaction between the Lin28 protein and the let-7g miRNA precursor to better understand the role of this protein in the inhibition of miARN biogenesis. Using biochemical and biophysical techniques, we first identified the main determinants of the interaction between Lin28 and the terminal loop of the precursor miRNA let-7g (TL-let-7g). We concluded that the C-terminal domain of Lin28, composed of a lysine-rich and arginine-rich motif in addition to two zinc-binding motifs, is sufficient to bind with high affinity a conserved guanine-rich bulge located on the TL-let-7g. In addition, because the sequence and RNA-binding specificity of this C-terminal domain are similar to those of the HIV protein NCp7, we defined this region as the NCp7-like domain of Lin28. Subsequently, we characterized the multimerization of three Lin28 proteins on the terminal loop of pre-let-7g. This study helped to reconcile apparent contradictions found in the current literature regarding the Lin28-binding sites on miRNA precursors. We identified three high-affinity binding sites on TL-let-7g that are bound in a stepwise manner by the three Lin28 proteins. As part of the formation of the multimeric complex, both RNA-binding domains of Lin28 play an important role. The CSD destabilizes the RNA and this exposes several binding sites, whereas the NCp7-like domain allows an orderly protein assembly and facilitates the initial binding of the protein. These results lead us to propose a new model for the interaction between Lin28 and pre-let-7g. In conclusion, these studies provide a better understanding of the molecular mechanisms involved in the post-transcriptional regulation of an important family of miRNAs and will help guide future projects in the expanding research area of miRNA biogenesis.

La scoliose est la déformation de la colonne vertébrale la plus répandue. Elle atteint 3 à 4% de la population pédiatrique et dans 85% des cas, aucune cause n’a été identifiée. Ces cas sont appelés idiopathiques et les symptômes apparaissent durant la puberté; d’où le terme de ‘scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA). Cette pathologie atteint le plus souvent les jeunes filles, en nombre et en sévérité. Ces dernières années, plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’élucider l’étiologie de cette pathologie. Celles-ci ont mis de l’avant différents facteurs génétiques, biochimiques, mécaniques, neurologiques, musculaires ou hormonaux. Plusieurs études ont rapporté des formes familiales de scoliose, soutenant la thèse d’une prédisposition génétique. Nous avons démontré que les patients souffrant de SIA présentent un défaut de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi et un taux élevé d’ostéopontine (OPN) circulante. En utilisant une approche de type ‘gène candidat’, nous avons montré que la protéine tyrosine phosphatase μ (PTPμ) régule l’activité du complexe d’intégrines α5/β1 (récepteur de l’OPN) via la protéine kinase PIPKIγ. Dans ce but, nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de biopsies de patients et de cas traumatiques comme sujets contrôles. Les biopsies osseuses de patients ont été obtenues lors de l’intervention chirurgicale à partir des vertèbres T3 à L4, selon les différentes procédures. Les biopsies issues de cas traumatiques proviennent d’autres types d’os (tibia, crête iliaque, fémur). Les profils d’expression du gène PTPRM (codant pour la protéine PTPμ) ont été étudiés par PCR quantitative (qPCR). Les taux de protéines PTPμ ont été analysés par immunoprécipitation suivi d’un western blot. Pour évaluer le rôle de cette protéine, nous avons bénéficié d’un modèle murin. Machida et al. ont démontré qu’il existe un taux plus élevé de scoliose parmi les souris C57Bl/6 bipèdes obtenues suite à l’amputation des membres supérieurs, sous anesthésie, cinq semaines après la naissance. Nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de la colonne ii vertébrale de souris C57Bl/6 bipèdes, délétées du gène PTPRM (souris dites ‘KO’), afin d’évaluer le niveau de signalisation cellulaire spécifique des protéines Gi par un test fonctionnel: la technique de spectroscopie cellulaire di-électrique (SCD). Selon nos données, 85% des souris bipédales ‘KO’ pour le géne PTPRM développent une scoliose (modérée à sévère) contre 55% des souris contrôles C57Bl6 bipèdes. De plus, les niveaux de PTPμ exprimée par les ostéoblastes de 34 patients SIA se trouvent diminués par comparaison à 17 sujets contrôles. Nos études de souris bipèdes ont montré que l’inactivation du gène PTPRM augmente l’incidence et la sévérité de la scoliose, sans pour autant affecter les taux circulant d’OPN ou l’expression de ses récepteurs. Par ailleurs, dans ce même contexte, nous avons remarqué une augmentation de l’interaction entre l’OPN et l’intégrine β1 en l’absence du gène PTPRM. Les cellules issues de ces souris bipèdes KO montrent une réduction dans leurs niveaux de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi après stimulation par l’OPN. Cette diminution est en grande partie récupérée après traitement des cellules par un siRNA spécifique de la protéine PIPK1γ, substrat de PTPμ qui favorise la fixation de ligands aux intégrines. Ces études apportent les premières indications que la perte d’expression de PTPμ est impliquée dans le développement de la SIA, en amplifiant probablement l’effet inhibiteur de l’OPN sur la signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi. Ces études permettent une meilleure compréhension de l’étiologie de la SIA. Elles pourraient avoir une contribution importante dans le développement futur de méthodes diagnostique et thérapeuthique dans le but d'arrete l’apparition et l’évolution de la maladie chez les enfants atteints. / Adolescent idiopathic scoliosis (AIS) is the most common form of scoliosis that affects 3-4% of the global pediatric population. In more than 85% of cases, no specific cause can be identified. Such cases are called idiopathic and occur mostly during adolescence. AIS affects mainly females in number and severity. Over the past years, many hypotheses were proposed to explain the etiology of AIS, including genetic, biochemical, mechanics, neurological, muscular and hormonal factors. Several studies have reported a high incidence of scoliosis in some families, which argues for a genetic cause of this disease. We demonstrated that AIS patients have a Gi protein signaling defect and exhibit high levels of circulating Osteopontin (OPN). The goal of this thesis is to identify the mechanisms regulating OPN signaling activity in AIS patients. We have used a candidate gene driven approach and discovered that protein tyrosine phosphatase μ (PTP μ) regulates α5β1 integrin (a known OPN receptor) through phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ). To achieve our goal, we have used primary osteoblast cell cultures derived from AIS patients and biopsies from control subjects. Bone specimens were obtained intraoperatively from vertebras (varying from T3 to L4 according to the surgical procedure performed) while with trauma cases used as non-scoliotic controls, bone specimens were obtained from other anatomical sites (tibia, femur or iliac crest). Expression profiles of the RPTPM gene (encoding for PTPμ) were studied by qPCR. On the other hand, PTPμ protein levels were determined by immunoprecipitation followed by western blot. To evaluate the role of this protein in AIS etiopathogenesis, we took advantage of an animal model exhibiting a higher scoliosis incidence when maintained in a bipedal state. [1], [2] Bipedal surgeries were performed on C57Bl/6 mice after weaning (5-weeks after birth) by amputation of the forelimbs and tail under anesthesia as reported by Oyama et al. (2006). [1] We used the same approach with PTPμ knockout mice and primary osteoblast culture were derived from the spine of these mice to assess Gi protein signaling through a functional assay termed Cellular Dielectric Spectroscopy (CDS). Bipedal PTPμ knockout mice develop scoliosis more often (85%) in number and severity, than control C57Bl/6 bipedal mice (55%). Interestingly, functional analysis of osteoblasts derived from PTPμ KO mice by CDS method showed a flaw in the transmission of Gi protein coupled receptor signaling similar to a specific AIS patient subgroup. Furthermore, the clinical relevance of PTPμ was strengthened by the fact that a decrease in the gene expression level of PTPμ was observed in 34 AIS patients when compared to 17 control subjects. Such a decrease was also confirmed at the protein level. We demonstrated that genetic deletion of PTPμ enhances the incidence and severity of scoliosis without affecting plasma levels of OPN or the expression of its receptors. In contrast, increased interaction of OPN with β1 integrin was noticed in cells depleted of PTPμ. Furthermore, reduction of Gi- protein coupled receptor GiPCR signaling by OPN was also enhanced in these cells, while their response to GiPCR stimulation was improved with siRNA of phosphatidylinositol-phosphate kinase type 1 gamma (PIPK1γ), a PTPμ substrate that favours ligand binding to integrins. These studies provide the first indication that the loss of PTPμ influences the nature of idiopathic scoliosis, possibly by amplifying the inhibitory effect of OPN on GiPCR signaling. This study allows a better understanding of AIS etiology and could have an impact for the future development of innovative diagnostic methods and eventual pharmacological approaches in order to prevent AIS and stop its progression in affected children.

Le tri et le transport efficace des hydrolases acides vers le lysosome jouent un rôle critique pour la fonction des cellules. Plus de 50 maladies humaines sont dues à des mutations des enzymes lysosomales, des protéines régulant des processus-clés du transport vers le lysosome ou des enzymes effectuant des modifications posttraductionnelles importantes pour la fonction du lysosome. L’objectif de cette thèse est d’identifier des protéines et des mécanismes permettant à la cellule de réguler le transport des enzymes vers le lysosome. Nous avons formulé l’hypothèse que des protéines mutées dans des maladies lysosomales et dont les fonctions étaient inconnues pouvaient jouer un rôle dans le transport vers le lysosome. Les céroïdes-lipofuscinoses neuronales forment une famille de maladies lysosomales rares mais sont aussi les maladies neurodégénératives infantiles les plus fréquentes. Plusieurs gènes impliqués dans les NCL encodent des protéines aux fonctions inconnues. Les travaux présentés dans cette thèse ont identifié la protéine « ceroid lipofuscinosis neuronal-5 » (CLN5) qui est localisée à l’endosome et au lysosome comme élément nécessaire au recrutement et à l’activation de rab7. Rab7 est une protéine Rab-clé qui contrôle le trafic à l’endosome tardif. Cette petite GTPase est impliquée dans le recrutement de retromer, un complexe protéique qui régule le trafic de l’endosome vers l’appareil de Golgi des récepteurs de tri lysosomal comme sortilin et le récepteur du mannose-6-phosphate. Dans les cellules où CLN5 est déplété, les récepteurs de tri lysosomal sont moins recyclés plus rapidement dégradés. En utilisant des expériences de photomarquage nous avons aussi pu démontrer que Rab7 est moins activées en l’absence de CLN5. Pour exécuter leur fonction les protéines rabs doivent être recrutée à la membrane et activées par l’échange d’une molécule de GDP pour une molécule de GTP. Le recrutement des Rabs à la membrane nécessite une modification posttraductionnelle lipidique pour être facilités. En utilisant un modèle de levures nous avons démontré que l’homologue de Rab7, Ypt7 est palmitoylée. Nous avons aussi démontré que la palmitoyltransférase Swif1 est nécessaire au recrutement de Ypt7 à la membrane. Nous avons aussi remarqué que les sous- unités de retromer chez la levure sont moins recrutées lorsque les palmitoyltransférases sont déplétées. Dans les cellules de mammifères nous avons démontré que Rab7 est également palmitoylé et que cette palmitoylation est possiblement effectuée par les palmitoyltransférases DHHC1 et DHHC8. La palmitoylation de Rab7 a lieu sur les cystéines en C-terminal qui sont nécessaires au recrutement membranaire et qui auparavant étaient uniquement décrites comme prénylées. En utilisant la méthode de « click chemistry » nous avons découvert que lorsque la prénylation de Rab7 est bloquée le niveau de palmitoylation augmente. Pour caractériser l’interaction entre CLN5 et Rab7 nous avons performé des expériences afin d’établir définitivement la topologie de cette protéine. Nous avons ainsi démontré que CLN5 est une protéine hautement glycosylée qui est initialement traduite en protéine transmembranaire et subséquemment clivée par un membre de la famille des peptidase de peptide signal (SPP). Cette protéine soluble peut alors possiblement interagir avec CLN3 qui est aussi palmitoylée pour recruter et activer Rab7. Nos études suggèrent pour la première fois que CLN5 pourrait être un recruteur et un activateur de Rab7 qui agirait avec la protéine CLN3 pour séquestrer Rab7 avec les autres récepteurs palmitoylés et permettre leur recyclage vers l’appareil de Golgi. / The proper sorting and trafficking of acid hydrolases plays a critical role in the normal function of cells. Over 50 known human diseases are caused by mutations of lysosomal enzymes, of proteins that regulate key processes of transport to the lysosome or of enzymes that perform posttranslational modifications which are important for the function of the lysosome. The main objective of this thesis is to identify proteins and mechanisms that allow the cell to regulate the transport of enzymes toward the lysosome. We formulated the hypothesis that proteins mutated in lysosomal diseases and that have no known functions could play a role in transport toward the lysosome. Neuronal ceroid-lipofuscinoses form a family of lysosomal storage disorders that are very rare but are also the most frequent infantile neurodegenerative diseases. The work presented in this thesis identified ceroid-lipofuscinosis neuronal-5 (CLN5), which is located at the late-endosomal/lysosomal compartment as a necessary element for the recruitment and activation of Rab7. Rab7 is an important GTPase that controls traffic from the late-endosome to the trans-Golgi network. Rab7 has been implicated in the recruitment of the retromer complex, which regulates retrograde transport of the lysosomal sorting receptor such as sortilin and the mannose-6-phosphate receptor. In the cells where CLN5 is depleted, the lysosomal sorting receptors are less recycled and degraded more rapidly. Using photolabelling assays we were also able to show that Rab7 is less activated in the absence of CLN5. To perform their function, Rab proteins have to be recruited to membranes and activated by the exchange of a GDP nucleotide for GTP. The recruitment of Rabs to membranes necessitates a lipidic posttranslational modification to raise the affinity. Using yeast as a model we demonstrated that the Rab7 homolog, Ypt7 is palmitoylated. We have also showed that the yeast palmitoyltransferase Swif1 is required for Ypt7 membrane recruitment. We have also observed that retromer subunits in yeast are less recruited when palmitoyltranferases are depleted. In mammals we have shown that Rab7 is also palmitoylated and that this palmitoylation may be done by palmitoyltransferases DHHC1 and DHHC8. The palmitoylation of Rab7 occurs on the C-terminal cysteines that are required for membrane recruitment and were previously only shown to be prenylated. By using Click chemistry we have discovered that when Rab7 prenylation is blocked the level of palmitoylation is augmented. To characterize the interaction of Rab7 and CLN5 we performed experiments to definitively establish the topology of this latter protein. Our results show that CLN5 is a heavily glycosylated protein that is initially translated as a type II transmembrane protein and subsequently cleaved by a member of the signal-peptide peptidase (SPP) family. This protein can then possibly interact with another member of the CLN family, CLN3 that is predicted to be palmitoylated to recruit and activate Rab7. Our studies establish for the first time that CLN5 is required for the recruitment and activation of Rab7 and may cooperate with the possibly palmitoylated protein CLN3 to sequester Rab7 in specific membrane domains with sorting receptors to allow their recycling toward the trans-Golgi network.

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293. / With the aim to express a protein of interest, the transfer of exogenous genetic material into host cells was established in early 70s with the development of genetic engineering. Approximately ten years later, insulin was the first human recombinant protein (r-protein) produced at large scale in Escherichia coli and commercialized. Challenges associated with the production of more complex and glycosylated r-proteins brought the pharmaceutical industry to develop mammalian expression platforms. Thus, the expressed r-proteins are correctly folded and biologically actives. As a means to transfer genetic materials of interest into mammalian cells, the synthetic vector polyethylenimine (PEI) is probably the most popular due to its efficacy, ease of use, cost-effectiveness and stability in solution. Consequently, PEI is largely employed for the production of r-proteins by large scale and extensively studied in the context of non-viral gene therapy. PEI is capable to efficiently condense plasmid DNA (expression vector containing the gene of interest) to form small nanoparticles termed polyplexes. The latter must circumvent several steps to deliver the gene of interest to the cell nucleus. When formed at the optimum conditions, polyplexes exhibit a net positive charge which can interact electrostatically with negatively charged heparan sulfate proteoglycans (HSPG) located at the cell surface. There are two major families of HSPG that are largely expressed at the surface of mammalian cells: the syndecans (4 members, SDC1-4) and the glypicans (6 members, GPC1-6). Although it is generally accepted that HSPG are involved in the binding of polyplexes, their individual role toward polyplex binding and the subsequent phases of gene transfer need to be confirmed. Following optimization of the mammalian CHO and HEK293 cells transfection conditions, we undertook an in-depth study of polyplexes uptake, internalization kinetics, as well as transgene expression kinetics with the aim to better understand the mechanisms underlying gene transfer. We observed several contrasting differences between the two cell lines and the type of PEI used. Our results presented as a scientific article, establish strong basis of the gene transfer process over-time. Every cell type possesses its own expression profile of HSPG which can display individual potency toward gene transfer. Indeed, a preliminary study conducted in our laboratory showed that SDC1 and SDC2 have distinct features with regard to gene transfer. While both are capable to bind polyplexes at the cell surface, the expression of SDC1 enhances polyplexes internalization whereas the expression of SDC2 drastically inhibits it. Furthermore, when SDC1 is expressed at the surface of HEK293 cells, the transfection efficiency is increased by twelve percent compared to control cells. By using the ability of SDC1 to mediate efficient internalization of polyplexes, we have studied the intracellular traffic of SDC1 / polyplexes complexes. Our conclusions lead to new insights concerning the path by which polyplexes can mediate efficient transfection. In the context of gene transfer, HSPG have been essentially studied in their entirety. Although the role of syndecans is the subject of some studies, that of glypicans is unexplored. Thanks to a series of chemical and enzymatic treatments leading to « loss of functions », the importance of sulfation as post-translational modification, the effect of HS chains and of glypicans on the attachment, internalization of polyplexes as well as transgene expression were investigated in CHO and HEK293 cells. Taken together, our observations indicate clearly that the role of HSPG should be investigated individually instead of collectively. Consequently, the individual potency of each HSPG member regarding gene transfer remains to be defined. We demonstrated that, in fact, the transient expression of some HSPG in CHO cells have a beneficial effect on polyplexes uptake while others have a negative effect. Unfortunately, this method did not allow concluding about their effect on transfection efficacy. However, when present in the culture medium, the extracellular domain of HSPG decreases transfection efficacy of CHO cells without inducing polyplexes dissociation. Strangely, when each HSPG is stably expressed in CHO cells, only subtle modulations of the gene expression level were observed. This study contributed to a better understanding of the mechanisms underlying PEI mediated gene transfer in CHO and HEK293 cells and clarify the role of HSPG in gene transfer.

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La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance. / Phosphorylation is a reversible post-translational modification that modulates protein activity, and can impart conformational changes and affect translocation of their protein substrates. Kinases and phosphatases are responsible for the dynamic of changes in protein phosphorylation and act in a coordinated manner. Abnormal activation or misregulation of kinase activity can lead to the development of cancers and metabolic disorders. Tyrosine kinase receptor (RTK) associated signaling pathways are often implicated in numerous diseases and the further understanding of mechanisms affecting their regulation is necessary to determine their activity and effects anticipated on their substrates. In this context, the primary objective of this thesis is to study the phosphorylation events arising from the activation of the insulin receptor (InR) following stimulation of drosophila S2 cells with insulin. The phosphorylation cascade triggered after InR activation is conserved in mammals. In order to study the phosphoproteome of drosophila S2 cells, we enriched phosphopeptides on titanium dioxide (TiO2) stationary phase prior to their separation by liquid chromatography (LC) and ion mobility (FAIMS) mass spectrometry (MS). Phosphopeptides were then analysed by tandem MS at high resolution. We first compared the benefits of FAIMS to conventional LC-MS, and observed a 50% increase in the number of identified phosphopeptides when using ion mobility. FAIMS enables the separation of phosphoisomers that are typically unresolved by LC, enabling high confidence assignment of modification sites via distinct MS/MS spectra. This approach was used to profile phosphorylation changes taking place between control and insulin-treated drosophila cells and enabled the identification of 32 phosphopeptides (out of 2 660 quantified) showing differential regulation. Interestingly, 50% of the regulated targets have a CK2 consensus site. These preliminary experiments were followed-up by RNAi mediated inhibition of CK2 and revealed that 6 phosphoproteins (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 and mu2) were positively modulated after insulin stimulation and negatively regulated after CK2 RNAi treatment. Using in vitro kinase assay, we identified 29 direct CK2 targets, of which 15 were correlated with results from the CK2 RNAi experiment. We demonstrated specifically that the su(var)205 (S15) is regulated by insulin and is a direct CK2 target based on RNAi and kinase assays. Our phosphoproteomics data also highlighted the presence of isomeric phosphopeptides, several of which could be distinguished using FAIMS. We developed two algorithms to determine the occurrence of phosphoisomers in large scale studies. The first algorithm based on differences in retention times between isomers identified 64 candidates in mouse and rat phosphoproteome datasets corresponding to less than 1% of all identified phosphopeptides. We also identified 117 isomer candidates in drosophila using a targeted LC-MS/MS approach with inclusion lists. The second algorithm is based on the presence of characteristic fragment ions present in MS/MS spectra of co-eluting or partially resolved species and allowed the identification of 23 isomeric pairs. The ability to distinguish phosphoisomers in large-scale phosphoproteome datasets is of significance to correlate phosphorylation events taking place on specific residues with biological activities.