Le marquage protéique par fluorescence est une méthode de choix permettant d’étudier l’évolution des protéines depuis leur synthèse cellulaire jusqu’à leur dégradation, en plus de rendre possible leur localisation ainsi que la visualisation des interactions entre protéines. De cet intérêt certain ont découlé différentes techniques de marquage, dont celle présentement développée dans le groupe Keillor. Le principe de celle-ci repose sur la réaction entre deux maléimides portés par un fluorogène et une séquence peptidique cible, laquelle contient deux résidus cystéines séparés par une distance appropriée. Suite à cette double addition de thiols du peptide sur les maléimides du fluorogène, la fluorescence latente de ce dernier est régénérée, menant au marquage covalent de la protéine d’intérêt. Afin d’optimiser la spécificité et la sensibilité de cette méthode de marquage, la synthèse de nouveaux fluorogènes et l’étude de l’efficacité de quench de la fluorescence par les maléimides est présentement en cours dans les laboratoires du groupe Keillor. / The fluorescent labelling of proteins is a powerful approach for following the dynamic process of their cellular synthesis and degradation, in addition to determining their localization and protein-protein interactions. We have developed a ‘small molecule’-based labelling technique that is complementary to existing methods. Our fluorogenic approach relies on the use of dimaleimide fluorogens that react with a target peptide sequence that presents appropriately spaced, solvent-exposed Cys residues. The thiol addition reaction between target sequence and dimaleimide fluorogen restores the latent fluorescence of the latter and results in the covalent fluorescent labelling of the protein of interest. Synthesis of new fluorogens and quench efficiency studies are presently taking place in the Keillor group laboratory in order to optimize the specificity and sensitivity of the labelling method.

Naïvement perçu, le processus d’évolution est une succession d’événements de duplication et de mutations graduelles dans le génome qui mènent à des changements dans les fonctions et les interactions du protéome. La famille des hydrolases de guanosine triphosphate (GTPases) similaire à Ras constitue un bon modèle de travail afin de comprendre ce phénomène fondamental, car cette famille de protéines contient un nombre limité d’éléments qui diffèrent en fonctionnalité et en interactions. Globalement, nous désirons comprendre comment les mutations singulières au niveau des GTPases affectent la morphologie des cellules ainsi que leur degré d’impact sur les populations asynchrones. Mon travail de maîtrise vise à classifier de manière significative différents phénotypes de la levure Saccaromyces cerevisiae via l’analyse de plusieurs critères morphologiques de souches exprimant des GTPases mutées et natives. Notre approche à base de microscopie et d’analyses bioinformatique des images DIC (microscopie d’interférence différentielle de contraste) permet de distinguer les phénotypes propres aux cellules natives et aux mutants. L’emploi de cette méthode a permis une détection automatisée et une caractérisation des phénotypes mutants associés à la sur-expression de GTPases constitutivement actives. Les mutants de GTPases constitutivement actifs Cdc42 Q61L, Rho5 Q91H, Ras1 Q68L et Rsr1 G12V ont été analysés avec succès. En effet, l’implémentation de différents algorithmes de partitionnement, permet d’analyser des données qui combinent les mesures morphologiques de population native et mutantes. Nos résultats démontrent que l’algorithme Fuzzy C-Means performe un partitionnement efficace des cellules natives ou mutantes, où les différents types de cellules sont classifiés en fonction de plusieurs facteurs de formes cellulaires obtenus à partir des images DIC. Cette analyse démontre que les mutations Cdc42 Q61L, Rho5 Q91H, Ras1 Q68L et Rsr1 G12V induisent respectivement des phénotypes amorphe, allongé, rond et large qui sont représentés par des vecteurs de facteurs de forme distincts. Ces distinctions sont observées avec différentes proportions (morphologie mutante / morphologie native) dans les populations de mutants. Le développement de nouvelles méthodes automatisées d’analyse morphologique des cellules natives et mutantes s’avère extrêmement utile pour l’étude de la famille des GTPases ainsi que des résidus spécifiques qui dictent leurs fonctions et réseau d’interaction. Nous pouvons maintenant envisager de produire des mutants de GTPases qui inversent leur fonction en ciblant des résidus divergents. La substitution fonctionnelle est ensuite détectée au niveau morphologique grâce à notre nouvelle stratégie quantitative. Ce type d’analyse peut également être transposé à d’autres familles de protéines et contribuer de manière significative au domaine de la biologie évolutive. / Evolution is a gradual process that gives rise to changes in the form of mutations that are reflected at the protein level. We propose that evolution of new pathways occurs by switching binding partners, hence creating new functions. The different functions encountered in a given family of related proteins have emerged from a common ancestor that has been duplicated and mutated to become implicated in new interactions and to gain new functions. In this study, we will use native and constitutive active mutant variants of the Ras-like family of small GTPases as working model, to explore such gene duplications, followed by neo / sub-functionalization. The reason for choosing this family resides in the fact that it is a defined set of proteins with well known functions that are mediated through multiple protein-protein interactions. The aim of this master is to perform a classification of budding yeast phenotypes using different approaches in order to statistically determine at which level of the population these constitutively active mutations are capable to affect cell morphology. Working with a subset of the Ras-like small GTPases family, we recently developed an approach to catalogue and classify these proteins based on multiple physical and chemical criteria. Using microscopic and bioinformatics methods, we characterized phenotypes associated with over-expression of the native small GTPases of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, showing that an established classification is not very clear. We are interested to investigate how point mutations in small GTPases can affect the cell morphology and their level of impact on asynchronous population. We want to establish a method to determine and quantify mutant and wild type-like phenotypes on these populations using Differential interference contrast microscopy (DIC) images only. As for the first aim of this study, we hypothesize that clustering algorithms can partition mutant cells from wild type cells based on cell shape factor measurements. To prove this hypothesis, we proposed to implement different clustering algorithms to analyze datasets which combines measurements from wild type and respective mutant populations. We created constitutively active forms of these small GTPases and used Cdc42, Rho5, Ras1 and Rsr1 to validate our results. We observed that Cdc42 Q61L, Rho5 Q91H, Ras1 Q68L and Rsr1 G12V mutations induced characteristic amorphous, clumped/elongated, rounded and discrete large phenotypes respectively. This classification allowed us to define a phenotypical classification related to functions. Phenotype classification of the small GTPases has been confirmed using shape factor formulas accompanied with bioinformatics approaches. These approaches which involved different clustering methods allowed an automated quantitative characterization of the phenotypes of up to 7293 mutant cells. Sequence alignment of Cdc42 and Rho5 showed 46.1% identity as well as 62.6% for Ras1 and Rsr1 allowing the identification of diverged residues potentially involved in specific functions and protein-protein interactions. Directed mutagenesis and substitution of these sites from one gene to another have been performed in some positions to test for specificity and involvement in morphology changes. In parallel, interactions observed for native and constitutively active mutants Cdc42 and Rho5 will be assayed with protein-fragment complementation assay (PCA). This will enable us to determine whether a high correlation exists between functions switches and binding partner’s switches. We propose to expand this approach to the whole Ras-like small GTPases family and monitor protein-protein interactions and functions at a network scale. This research will confirm whether enrichment or depletion of residues in specific sites induces a switch of function due to switching binding partners. Understanding the mechanism underlying such correlation is important to gain insight in the biological mechanisms underlying the Ras-like small GTPases and other proteins evolution. Such knowledge is of fundamental importance in biomedical and pharmaceutical fields, since Ras-like small GTPases represent important targets for therapeutic interventions and for the evolutionary biology field.

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase de classe I qui fait montre d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-biphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-biphosphate (FBP), du sorbose-1,6-biphosphate et du psicose-1,6-biphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution de la structure native et en complexe avec le DHAP, a respectivement 1.87 et 1.92 Å de résolution. Ces mêmes structures ont permis de se représenter plus clairement le site actif de l'enzyme en général, et les résidus catalytiques en particulier. Le trempage des cristaux de TBP aldolase dans une solution saturante de DHAP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire iminium, ainsi que sa géométrie particulière en atteste. Des expériences d'échange de proton, entreprises afin d'évaluer le stéréoisomérisme du transfert de proton catalytique, ont également permis de faire une intéressante découverte : la TBP aldolase ne peut déprotoner le coté pro-R du C3 du DHAP, mais peut le protonner. Ce résultat, ainsi que la comparaison de la structure du complexe TBP aldolase-DHAP avec la structure du complexe FBP aldolase de muscle de lapin- DHAP, pointe vers un isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP. De plus, la résolution de ces deux structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières. / Tagatose-1,6-biphosphate aldolase from Streptococcus pyogenes is a class I aldolase that shows a lack of stereospecificity that is rare in enzymes in general, and in aldolases in particular. This aldolase catalyzes the reversible cleavage of tagatose-1,6-biphosphate (TBP), fructose-1,6-biphosphate (FBP), sorbose-1,6-biphosphate and psicose-1,6-biphosphate, four stereoisomers, in dihydroxyacetone phosphate and glyceraldehyde-3-phosphate (DHAP). In order to understand its mechanism, a structural study of TBP aldolase from S. pyogenes, one of the most versatile and virulent human pathogen, was initiated and high resolution crystallographic structures of native and DHAP-liganded TBP aldolase were solved. These structures allowed us to gain informations regarding active site residues implicated in catalysis and that give rise to the apparent lack of specificity. Soaking of TBP aldolase crystals in saturating DHAP solution specifically trapped the iminium intermediate, as demonstrated by its geometry. Furthermore, proton transfer studies uncovered an interesting phenomenon: TBP aldolase from S. pyogenes is unable to detritiate pro-R labelled hydrogen position at C3 of DHAP, yet it is able to tritiate both the pro-R and the pro-S position. These results, taken together with the superposition of the DHAP-TBP aldolase with the DHAP-FBP aldolase from rabbit muscle, suggest a cis-trans isomerism about the Schiff base C2-C3 bond. The resolution of both the native and the liganded structure also proved useful in identifying three very mobile regions in the protein. This trend could be linked to the putative metabolic sensor and genetic expression regulator role of LacD.1 in S. pyogenes. X-rays crystallography and traditional enzymatic kinetics allowed us to gain insights into the catalytic mechanism and others structural properties of this important metabolic enzyme.

La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels. Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine. Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides. Mots clés: Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity. Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides. To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.

La sécrétion des protéines est un processus essentiel à la vie. Chez les eucaryotes, les protéines sécrétées transitent dans le réticulum endoplasmique par le pore de translocation. Le translocon est composé de trois sous-unités fondamentales nommées Sec61α, β et γ chez les mammifères, ou Sec61p, Sbh1p et Sss1p chez les levures. Tandis que le rôle des sous-unités α et γ est bien connu, celui de la sous-unité β demeure énigmatique. Plusieurs phénotypes distincts sont associés à cette protéine dans différents organismes, mais le haut niveau de conservation de séquence suggère plutôt une fonction universelle conservée. Récemment, Feng et al. (2007) ont montré que le domaine transmembranaire (TMD) de Sbh1p était suffisant pour complémenter plusieurs phénotypes associés à la délétion du gène chez Saccharomyces cerevisiae, suggérant un rôle important de cette région. L’objectif de mon projet de recherche consiste à étudier la fonction biologique de la sous-unité β du translocon et de son TMD chez Schizosaccharomyces pombe. Dans cette levure, j’ai découvert que le gène sbh1+ n’était pas essentiel à la viabilité à 30oC, mais qu’il était requis pour la croissance à basse température. La délétion de sbh1+ entraîne une sensibilité aux stress de la paroi cellulaire et une diminution de la sécrétion des protéines à 23oC. La surexpression de Sbh1p diminue elle aussi la sécrétion des protéines et altère la morphologie cellulaire. Ces phénotypes sont distincts de ceux observés chez S. cerevisiae, où la délétion des deux paralogues de Sec61β entraîne une sensibilité à haute température plutôt qu’à basse température. Malgré cela, les homologues de Sec61β de S. pombe et de S. cerevisiae sont tout deux capables de complémenter la thermosensibilité respective de chaque levure. La complémentation est possible même avec l’homologue humain de Sec61β, indiquant la conservation d’une fonction de Sec61β de la levure à l’homme. Remarquablement, le TMD de Sec61β de S. pombe, de S. cerevisiae et de l’humain sont suffisants pour complémenter la délétion génomique autant chez la levure à fission que chez la levure à bourgeons. Globalement, ces observations indiquent que le TMD de Sec61β exerce une fonction cellulaire conservée à travers les espèces. / Protein secretion is an essential biological process. In eukaryotes, secreted proteins transit into the endoplasmic reticulum through the translocon pore. The core of the translocation channel is composed of three subunits called Sec61α, β and γ in mammals, or Sec61p, Sbh1p and Sss1p in yeasts. While the role of the α and γ subunit is well understood, the function of the β subunit remains ill-defined. Although numerous species-specific phenotypes have been reported for this protein, the striking sequence conservation among species argue in favour of a universal role. Recently, Feng et al. (2007) reported the surprising finding that the transmembrane domain (TMD) of Sbh1p was sufficient to complement different functions of the entire protein in Saccharomyces cerevisiae, suggesting an important role for this region. The aim of my project was to explore the biological function of the translocon β subunit and its TMD in Schizosaccharomyces pombe. In this yeast, we found that the sbh1+ gene is unessential for viability at 30oC, but is required for growth at low temperature. Knockout of sbh1+ results in sensitivity to cell-wall stress and reduced protein secretion at 23oC. Overexpression of Sbh1p also diminishes protein secretion and results in an elongated cell shape. These phenotypes contrast with those observed S. cerevisiae, as deletion of both Sec61β paralogs in this yeast results in heat sensitivity instead of cold sensitivity. Nevertheless, Sec61β homologs from both S. pombe and S. cerevisiae complement the respective temperature sensitivity of either yeast. This functional complementation can also be accomplished by the human homolog of the translocon β subunit, indicating that a fundamental function of Sec61β is conserved from yeast to human. Remarkably, the TMD of Sec61β homologs from S. pombe, S. cerevisiae and human are sufficient to complement the gene knockout in both fission and budding yeasts. Together, these observations indicate that the TMD of Sec61β exerts a cellular function that is conserved across species.

La plupart des molécules d’ARN doivent se replier en structure tertiaire complexe afin d’accomplir leurs fonctions biologiques. Cependant, les déterminants d’une chaîne de polynucléotides qui sont nécessaires à son repliement et à ses interactions avec d’autres éléments sont essentiellement inconnus. L’établissement des relations structure-fonction dans les grandes molécules d’ARN passe inévitablement par l’analyse de chaque élément de leur structure de façon individuelle et en contexte avec d’autres éléments. À l’image d’une construction d’immeuble, une structure d’ARN est composée d’unités répétitives assemblées de façon spécifique. Les motifs récurrents d’ARN sont des arrangements de nucléotides retrouvés à différents endroits d’une structure tertiaire et possèdent des conformations identiques ou très similaires. Ainsi, une des étapes nécessaires à la compréhension de la structure et de la fonction des molécules d’ARN consiste à identifier de façon systématique les motifs récurrents et d’en effectuer une analyse comparative afin d’établir la séquence consensus. L’analyse de tous les cas d’empaquetage de doubles hélices dans la structure du ribosome a permis l’identification d’un nouvel arrangement nommé motif d’empaquetage le long du sillon (AGPM) (along-groove packing motif). Ce motif est retrouvé à 14 endroits dans la structure du ribosome de même qu’entre l’ARN ribosomique 23S et les molécules d’ARN de transfert liées aux sites ribosomaux P et E. Le motif se forme par l’empaquetage de deux doubles hélices via leur sillon mineur. Le squelette sucre-phosphate d’une hélice voyage le long du sillon mineur de l’autre hélice et vice versa. Dans chacune des hélices, la région de contact comprend quatre paires de bases. L’empaquetage le plus serré est retrouvé au centre de l’arrangement où l’on retrouve souvent une paire de bases GU dans une hélice interagissant avec une paire de bases Watson-Crick (WC) dans l’autre hélice. Même si la présence des paires de bases centrales GU versus WC au centre du motif augmente sa stabilité, d’autres alternatives existent pour différents représentants du motif. L’analyse comparative de trois librairies combinatoires de gènes d’AGPM, où les paires de bases centrales ont été variées de manière complètement aléatoire, a montré que le contexte structural influence l’étendue de la variabilité des séquences de nucléotides formant les paires de bases centrales. Le fait que l’identité des paires de bases centrales puisse varier suggérait la présence d’autres déterminants responsables au maintien de l’intégrité du motif. L’analyse de tous les contacts entre les hélices a révélé qu’en dehors du centre du motif, les interactions entre les squelettes sucre-phosphate s’effectuent via trois contacts ribose-ribose. Pour chacun de ces contacts, les riboses des nucléotides qui interagissent ensemble doivent adopter des positions particulières afin d’éviter qu’ils entrent en collision. Nous montrons que la position de ces riboses est modulée par des conformations spécifiques des paires de bases auxquelles ils appartiennent. Finalement, un autre motif récurrent identifié à l’intérieur même de la structure de trois cas d’AGPM a été nommé « adenosine-wedge ». Son analyse a révélé que ce dernier est lui-même composé d’un autre arrangement, nommé motif triangle-NAG (NAG-triangle). Nous montrons que le motif « adenosine-wedge » représente un arrangement complexe d’ARN composé de quatre éléments répétitifs, c’est-à-dire des motifs AGPM, « hook-turn », « A-minor » et triangle-NAG. Ceci illustre clairement l’arrangement hiérarchique des structures d’ARN qui peut aussi être observé pour d’autres motifs d’ARN. D’un point de vue plus global, mes résultats enrichissent notre compréhension générale du rôle des différents types d’interactions tertiaires dans la formation des molécules d’ARN complexes. / Most RNA molecules have to adopt a complex tertiary structure to accomplish their biological functions. However, the important determinants of a polynucleotide chain that are required for its proper folding and its interactions with other elements are essentially unknown. The establishment of structure-function relationships in large RNA molecules goes inevitably through the analysis of each element of their structure separately and in context with other elements. Like a building, an RNA structure is built of repetitive pieces that are glued together in a specific way. These repetitive elements, instead of being bricks, are recurrent motifs. Recurrent RNA motifs are arrangements of nucleotides found in different parts of a tertiary structure and have identical or very similar conformations. Thus, a necessary step toward the understanding of RNA structure and function consists in the systematic identification of recurrent motifs, followed by their comparative analysis and establishment of their sequence consensus. The analysis of all instances of helical packing within the ribosome structure led to the identification of a new structural arrangement, named the along-groove packing motif (AGPM), which is found in 14 places of the ribosome structure as well as between the 23S ribosomal RNA and the transfer RNA molecules bound to the P and E sites. The motif is formed by the packing of two double helices via their minor grooves. The sugar-phosphate backbone of one helix goes along the minor groove of the other helix and vice versa. In each helix, the contact region includes four base pairs. The closest packing occurs in the center where one can often see a GU base pair packed against a WC base pair. While the presence of the central base pairs GU versus WC in the core of the motif enhances its stability, other alternatives are also present among available structures of the motif. A comparative analysis of three different combinatorial gene libraries of AGPM, in which the central base pairs were fully randomized, shows that the structural context influences the scope of nucleotide sequence variability of the central base pairs. The fact that the identity of the central base pairs can vary suggested that there are other determinants responsible of the motif’s integrity. Analysis of all other inter-helix contacts has shown that outside the center of the motif the interactions between backbones are made via three ribose-ribose contacts. Within each of these contacts, the riboses of the nucleotides that are in touch adopt particular positions in order to provide for collision-free interactions between them. We show that the position of these riboses is modulated by the specific base pair conformation in which it belongs. Finally, another recurrent arrangement that occurs within the structure of three cases of AGPM was identified and called the adenosine-wedge. Analysis has shown that the latter motif is itself composed of a smaller arrangement, called the NAG-triangle motif. We show that the adenosine-wedge motif represents a complex RNA arrangement composed of four repetitive elements, AGPM, the hook-turn, the A-minor and the NAG-triangle, which clearly illustrates the hierarchical organisation of the structure that could also occur in other RNA motifs as well. Altogether, my results enrich our general understanding of the role of different types of tertiary interactions in the formation of large RNA molecules.

Résumé La ribonucléase P (RNase P) est une ribonucléoprotéine omniprésente dans tous les règnes du vivant, elle est responsable de la maturation en 5’ des précurseurs des ARNs de transfert (ARNts) et quelques autres petits ARNs. L’enzyme est composée d'une sous unité catalytique d'ARN (ARN-P) et d'une ou de plusieurs protéines selon les espèces. Chez les eucaryotes, l’activité de la RNase P cytoplasmique est distincte de celles des organelles (mitochondrie et chloroplaste). Chez la plupart des espèces, les ARN-P sont constituées de plusieurs éléments structuraux secondaires critiques conservés au cours de l’évolution. En revanche, au niveau de la structure, une réduction forte été observé dans la plupart des mtARN-Ps. Le nombre de protéines composant la RNase P est extrêmement variable : une chez les bactéries, environ quatre chez les archéobactéries, et dix chez la forme cytoplasmique des eucaryotes. Cet aspect est peu connu pour les formes mitochondriales. Dans la plupart des cas, l’identification de la mtRNase P est le résultat de longues procédures de purification comprenant plusieurs étapes dans le but de réduire au minimum le nombre de protéines requises pour l’activité (exemple de la levure et A. nidulans). Cela mène régulièrement à la perte de l’activité et de l’intégrité des complexes ribonucléo-protéiques natifs. Dans ce travail, par l’utilisation de la technique de BN-PAGE, nous avons développé une procédure d’enrichissement de l’activité RNase P mitochondriale native, donnant un rendement raisonnable. Les fractions enrichies capables de cette activité enzymatique ont été analysées par LC/MS/MS et les résultats montrent que l’holoenzyme de la RNase P de chacune des fractions contient un nombre de protéines beaucoup plus grand que ce qui était connue. Nous suggérons une liste de protéines (principalement hypothétiques) qui accompagnent l’activité de la RNase P. IV De plus, la question de la localisation de la mtRNase P de A. nidulans a été étudiée, selon nos résultats, la majorité de la mtRNase P est attachée á la membrane interne de la mitochondrie. Sa solubilisation se fait par l’utilisation de différents types de détergent. Ces derniers permettent l’obtention d’un spectre de complexes de la RNase P de différentes tailles. / Abstract RNase P is a ribonucleo-protein complex (an RNA enzyme or ribozyme) that cleaves 5’ leader sequences of precursor tRNAs and a few other small RNAs. It occurs in all three domains of life, Bacteria, Archaea and Eukarya, with the latter containing distinct nuclear and organellar (mitochondrial or plastid) activities. In most instances, the complex contains a single, well-conserved RNA subunit that carries the active center of the enzyme. Yet, compare to bacterial and nuclear P RNA, most mtP RNAs are structurally highly reduced. The number of P proteins is highly variable: one in Bacteria, about four in Archaea, and ten in the cytoplasmic form of Eukarya. Much less is known in the case of mitochondria. MtRNase P is usually purified by using numerous separation steps that include unphysiological conditions, leading to complexes having a minimum number of subunits (e.g., in yeast and Aspergillus nidulans), that often loose their activity. Here, using BN PAGE, we have developed an enrichment procedure for A. nidulans mtRNase P that avoids some of the most disruptive conditions. The protein composition of active fractions was identified with LC/MS/MS, indicating that the RNase P holoenzyme is much larger than previously thought. Finally, the question of mtRNase P localization within mitochondria was investigated, by tracing its RNA subunit by RT PCR. We found that mtRNase P of A. nidulans is a predominantly membrane-attached enzyme; it is in part solubilized by detergents such as digitonin and Triton.

Le marquage protéique par fluorescence est une méthode de choix permettant d’étudier l’évolution des protéines depuis leur synthèse cellulaire jusqu’à leur dégradation, en plus de rendre possible leur localisation ainsi que la visualisation des interactions entre protéines. De cet intérêt certain ont découlé différentes techniques de marquage, dont celle présentement développée dans le groupe Keillor. Le principe de celle-ci repose sur la réaction entre deux maléimides portés par un fluorogène et une séquence peptidique cible, laquelle contient deux résidus cystéines séparés par une distance appropriée. Suite à cette double addition de thiols du peptide sur les maléimides du fluorogène, la fluorescence latente de ce dernier est régénérée, menant au marquage covalent de la protéine d’intérêt. Afin d’optimiser la spécificité et la sensibilité de cette méthode de marquage, la synthèse de nouveaux fluorogènes et l’étude de l’efficacité de quench de la fluorescence par les maléimides est présentement en cours dans les laboratoires du groupe Keillor. / The fluorescent labelling of proteins is a powerful approach for following the dynamic process of their cellular synthesis and degradation, in addition to determining their localization and protein-protein interactions. We have developed a ‘small molecule’-based labelling technique that is complementary to existing methods. Our fluorogenic approach relies on the use of dimaleimide fluorogens that react with a target peptide sequence that presents appropriately spaced, solvent-exposed Cys residues. The thiol addition reaction between target sequence and dimaleimide fluorogen restores the latent fluorescence of the latter and results in the covalent fluorescent labelling of the protein of interest. Synthesis of new fluorogens and quench efficiency studies are presently taking place in the Keillor group laboratory in order to optimize the specificity and sensitivity of the labelling method.

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est définie comme une courbure de la colonne vertébrale supérieure à 10 degrés, qui est de cause inconnue et qui affecte de façon prépondérante les adolescents. Des études précédentes sur des modèles murins ont démontré une inactivation partielle du gène Pitx1. Cette inactivation partielle provoque une déformation spinale sévère lors du développement des souris Pitx1+/-, ce qui est grandement similaire au phénotype de la SIA. En se basant sur ces observations, nous postulons que la perte de fonction de Pitx1 pourrait avoir un rôle dans la SIA et pourrait être régulée par des mécanismes moléculaires spécifiques. En effet, des études faites sur l’expression de Pitx1 révèlent une perte de son expression dans les ostéoblastes dérivés de patients SIA au niveau de l’ARNm. Nous émettons l’hypothèse que la perte de Pitx1 dans la SIA pourrait être déclenchée par des facteurs hypoxiques puisqu’il est connu que Pitx1 est réprimé par l’hypoxie et que HIF-2 alpha est surexprimés dans les ostéoblastes des patients SIA même dans des conditions normoxiques. De plus, nous avons découvert une mutation dans le domaine ODD des HIF-1 alpha chez certains patients SIA (3,1%). Une fonction connue de ce domaine est de stabiliser et d’augmenter l’activité transcriptionnelle de HIF-1 alpha dans des conditions normoxiques. Nous avons confirmé, par la technique EMSA, l’existence d’un élément de réponse fonctionnel à l’hypoxie au niveau du promoteur de Pitx1. Cependant, des co-transfections avec des vecteurs d’expression pour HIF-1 alpha et HIF-2 alpha, en présence de leur sous-unité beta ARNT, ont conduit à une activation du promoteur de Pitx1 dans la lignée cellulaire MG-63 ainsi que dans les ostéoblastes des sujets contrôles. Il est intéressant de constater qu’aucune activité du promoteur de Pitx1 dans les ostéoblastes SIA n’a été observée, même après la co-expression de HIF-2 alpha et ARNT, confirmant le fait que l’expression de Pitx1 est abrogée dans la SIA. Dans l’ensemble, nos résultats démontrent un rôle important de Pitx1 dans la SIA et une possible régulation par des facteurs hypoxiques. / Adolescent Idiopathic Scoliosis is a lateral curvature of the spine greater than 10 degrees, with an unknown cause, affecting primarily adolescents. Previous mouse model studies showed that partial inactivation of Pitx1 gene resulted in the development of severe spinal deformities in Pitx1 +/- mice, which is strikingly similar to the AIS phenotype. Based on this observation, we postulated that loss of Pitx1 function might have a role in AIS and could be regulated through specific molecular mechanisms. Indeed, expression studies revealed a loss of Pitx1 expression in osteoblasts derived from AIS patients, at the mRNA level. We hypothesized that the loss of Pitx1 in AIS could be triggered by hypoxic factors, since Pitx1 is known to be repressed by hypoxia and that HIF-2 alpha was up regulated in AIS osteoblasts even under normoxic conditions. Also, we found a mutation in the ODD domain of HIF-1 alpha in some AIS patients (3.1%), which is known to stabilize and enhance HIF-1 alpha transcriptional activity in normoxic conditions. We confirmed through EMSA the existence of a functional hypoxia response element on Pitx1 promoter. However, co-transfection assays with HIF-1 alpha and HIF-2 alpha expression vectors in the presence of their beta subunit ARNT led to the activation of Pitx1 promoter in human osteoblast cell line MG-63 cells and osteoblasts from control subjects. Interestingly, no Pitx1 promoter activity was observed in AIS osteoblasts, even after the co expression of HIF2 alpha and ARNT, consolidating the fact that Pitx1 expression is abrogated in AIS. Taken together, our findings show an important role for Pitx1 in AIS and hypoxic factors could be one of its regulators.

Les protéines sont les macromolécules les plus polyvalentes de la cellule. Elles jouent un rôle fondamental dans la majorité des processus biologiques à travers la formation de complexes multi-protéiques. Durant la transcription, une multitude de facteurs sont impliquées dans le contrôle de l’activité des complexes ARN polymérases. Notre laboratoire s’est intéressé au réseau d’interaction de la machinerie de transcription des ARN polymérases nucléaires, dans le but de mieux comprendre leurs mécanismes de régulation. Pour ce faire, une procédure protéomique comprenant la purification de complexes protéiques par affinité couplée à la spectrométrie de masse et à l’analyse bioinformatique a été développée. La méthode de purification TAP (Tandem Affinity Purification) a été adaptée pour permettre la purification de complexes protéiques solubles assemblés in vivo à partir de cellules humaines. L’objectif de mon projet de maîtrise était de purifier le complexe de l’ARN Pol I ainsi que de poursuivre l’expansion du réseau d’interactions protéine-protéine de la machinerie de transcription de l’ARN Pol II humaine. À l’aide des protéines POLR1E, TWISTNB, POLR2E, PFDN4, MBD2, XPA, CAND1 et PDCD5 étiquetées (TAP-tag) exprimées dans des lignées cellulaires ECR-293, plusieurs complexes protéiques solubles ont été purifiés et analysés par spectrométrie de masse. Les interactions protéiques ont été triées et validées bioinformatiquement pour donner en final une liste d’interactions ayant un haut degré de confiance à partir de laquelle des réseaux d’interactions protéine-protéine ont été créés. Le réseau créé au cours de ce projet connecte plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle tels que les ARN Pol I, II et III, les complexes RPAP3/R2TP/prefoldin-like, TRiC/CCT, Mi-2/NuRD et des facteurs de transcription et de réparation de l’ADN. Ce type d’analyse nous a permis d’identifier et de caractériser de nouveaux régulateurs de la machinerie de transcription de l’ARN Pol I et II et de mieux comprendre son fonctionnement. / Proteins are the most versatile macromolecules of the cell. They play a fundamental role in the majority of biological processes through the formation of multiprotein complexes. During transcription, a multitude of factors are involved in the control of activity of RNA polymerases. Our laboratory was interested in defining the nuclear RNA polymerases transcription machinery interaction network to better understand their regulatory mechanisms. To do so, a proteomic procedure that allows affinity purification of protein complexes coupled to mass spectrometry and computational data analysis was developed. The tandem affinity purification procedure has been adapted for the purification of soluble protein complexes as they likely exist in live mammalian cells. The aim of my master project was to purify the RNA Pol I complex as well as to further pursue the expansion of the protein-protein interaction network of the human RNA Pol II transcription machinery. By using POLR1E, TWISTNB, POLR2E, PFDN4, MBD2, XPA, CAND1 and PDCD5 TAP – tagged proteins expressed in EcR-293 cell lines, multiple soluble protein complexes were purified and analyzed by mass spectrometry. Protein interactions have been sorted and validated computationally. High-confidence dataset of interactions were used to build the protein-protein interaction networks. The network created for this project connects several components of the transcriptional machinery such as RNA Pol I, II and III, RPAP3/R2TP/prefoldin-like, TRiC/CTC, Mi-2/NuRD complexes and DNA repair and transcription factors. This type of analysis allowed us to identify and characterize new regulators of RNA Pol I and II transcription machinery and to better understand its functioning.