La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

Les plantes doivent assurer la protection de trois génomes localisés dans le noyau, les chloroplastes et les mitochondries. Si les mécanismes assurant la réparation de l’ADN nucléaire sont relativement bien compris, il n’en va pas de même pour celui des chloroplastes et des mitochondries. Or il est important de bien comprendre ces mécanismes puisque des dommages à l’ADN non ou mal réparés peuvent entraîner des réarrangements dans les génomes. Chez les plantes, de tels réarrangements dans l’ADN mitochondrial ou dans l’ADN chloroplastique peuvent conduire à une perte de vigueur ou à un ralentissement de la croissance. Récemment, notre laboratoire a identifié une famille de protéines, les Whirly, dont les membres se localisent au niveau des mitochondries et des chloroplastes. Ces protéines forment des tétramères qui lient l’ADN monocaténaire et qui accomplissent de nombreuses fonctions associées au métabolisme de l’ADN. Chez Arabidopsis, deux de ces protéines ont été associées au maintien de la stabilité du génome du chloroplaste. On ignore cependant si ces protéines sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Notre étude chez Arabidopsis démontre que des cassures bicaténaires de l’ADN sont prises en charge dans les mitochondries et les chloroplastes par une voie de réparation dépendant de très courtes séquences répétées (de cinq à cinquante paires de bases) d’ADN. Nous avons également montré que les protéines Whirly modulent cette voie de réparation. Plus précisément, leur rôle serait de promouvoir une réparation fidèle de l’ADN en empêchant la formation de réarrangements dans les génomes de ces organites. Pour comprendre comment les protéines Whirly sont impliquées dans ce processus, nous avons élucidé la structure cristalline d’un complexe Whirly-ADN. Nous avons ainsi pu montrer que les Whirly lient et protègent l’ADN monocaténaire sans spécificité de séquence. La liaison de l’ADN s’effectue entre les feuillets β de sous-unités contiguës du tétramère. Cette configuration maintient l’ADN sous une forme monocaténaire et empêche son appariement avec des acides nucléiques de séquence complémentaire. Ainsi, les protéines Whirly peuvent empêcher la formation de réarrangements et favoriser une réparation fidèle de l’ADN. Nous avons également montré que, lors de la liaison de très longues séquences d’ADN, les protéines Whirly peuvent s’agencer en superstructures d’hexamères de tétramères, formant ainsi des particules sphériques de douze nanomètres de diamètre. En particulier, nous avons pu démontrer l’importance d’un résidu lysine conservé chez les Whirly de plantes dans le maintien de la stabilité de ces superstructures, dans la liaison coopérative de l’ADN, ainsi que dans la réparation de l’ADN chez Arabidopsis. Globalement, notre étude amène de nouvelles connaissances quant aux mécanismes de réparation de l’ADN dans les organites de plantes ainsi que le rôle des protéines Whirly dans ce processus. / Plants must protect the integrity of three genomes located respectively in the nucleus, the chloroplasts and the mitochondria. Although DNA repair mechanisms in the nucleus are the subject of multiple studies, little attention has been paid to DNA repair mechanisms in chloroplasts and mitochondria. This is unfortunate since mutations in the chloroplast or the mitochondrial genome can lead to altered plant growth and development. Our laboratory has identified a new family of proteins, the Whirlies, whose members are located in plant mitochondria and chloroplasts. These proteins form tetramers that bind single-stranded DNA and play various roles associated with DNA metabolism. In Arabidopsis, two Whirly proteins maintain chloroplast genome stability. Whether or not these proteins are involved in DNA repair has so far not been investigated. Our studies in Arabidopsis demonstrate that DNA double-strand breaks are repaired in both mitochondria and chloroplasts through a microhomology-mediated repair pathway and indicate that Whirly proteins affect this pathway. In particular, the role of Whirly proteins would be to promote accurate repair of organelle DNA by preventing the repair of DNA double-strand breaks by the microhomology-dependant pathway. To understand how Whirly proteins mediate this function, we solved the crystal structure of Whirly-DNA complexes. These structures show that Whirly proteins bind single-stranded DNA with low sequence specificity. The DNA is maintained in an extended conformation between the β-sheets of adjacent protomers, thus preventing spurious annealing with a complementary strand. In turn, this prevents formation of DNA rearrangements and favors accurate DNA repair. We also show that upon binding long ssDNA sequences, Whirly proteins assemble into higher order structures, or hexamers of tetramers, thus forming spherical particles of twelve nanometers in diameter. We also demonstrate that a lysine residue conserved among plant Whirly proteins is important for the stability of these higher order structures as well as for cooperative binding to DNA and for DNA repair. Overall, our study elucidates some of the mechanisms of DNA repair in plant organelles as well as the roles of Whirly proteins in this process.

La dihyrofolate réductase de type II R67 (DHFR R67) est une enzyme bactérienne encodée par un plasmide donc aisément transmissible. Elle catalyse la réaction de réduction du dihydrofolate (DHF) en tétrahydrofolate (THFA) essentiel pour la prolifération cellulaire. La DHFR R67 est une enzyme qui dépend du cofacteur NADPH. La DHFR R67 est différente, structurellement et génétiquement, de l’enzyme DHFR chromosomale présente chez tous les organismes et elle est résistante au triméthoprime (TMP) qui est largement utilisé dans les traitements antibactériens chez l’Homme. Aucun inhibiteur sélectif contre la DHFR R67 n’est actuellement répertorié. Le but de cette étude a été d’identifier des molécules qui pourront inhiber la DHFR R67 sélectivement, sans affecter la DHFR humaine (DHFRh). La vérification de la qualité des essais enzymatiques en conditions déterminées pour le criblage d’inhibiteurs sur plusieurs lectrices à plaques a identifié des appareils appropriés pour l’analyse. L’étude de l’activité enzymatique de la DHFR R67 et de la DHFRh en présence des solvants organiques et liquides ioniques (LIs), comme des co-solvants pour le criblage rationnel d’inhibiteurs, a montré que certains LIs peuvent servir de milieu alternatif pour les essais enzymatiques. Le criblage rationnel basé sur l’approche du design d’un inhibiteur à partir de petites molécules, a révélé des molécules primaires qui inhibent la DHFR R67 de façon faible, mais sélective. Le test des composés biologiquement actifs qui comprennent des petits fragments, a montré l’augmentation de l’affinité entre la DHFR R67 et les composés testés. Trois composés ont été déterminés comme des inhibiteurs sélectifs prometteurs pour la DHFR R67. / Type II R-plasmid encoded dihyrofolate reductase (DHFR), R67 DHFR is a bacterial enzyme that catalyzes the reduction of dihydrofolate (DHF) to tetrahydrofolate (THFA) which is essential for cell proliferation. R67 DHFR is an enzyme that depends on the cofactor NADPH as the hydride donor. R67 DHFR is distinct, structurally and genetically, from E. coli chromosomal DHFR (DHFR Ec) and it provides drug resistance to the widely-administered antibiotic trimethoprim (TMP). No selective inhibitor against R67 DHFR exists currently. The goal of this study was to discover molecules that can selectively inhibit R67 DHFR, without affecting human DHFR (hDHFR). Verification of the quality of enzyme assays under defined conditions for inhibitor screening on plate readers found several appropriate instruments for analysis. The study of the enzymatic activity of R67 DHFR and hDHFR in the presence of organic solvents and ionic liquids (ILs), as co-solvents for rational screening of inhibitors, showed that ILs can provide alternative media for enzymatic assays. Rational screening based on the approach of fragment-based drug design, revealed primary molecules that inhibited DHFR R67 weakly, but selectively. The testing of more complex compounds with known biological activities gave ligands with increased affinity for R67 DHFR. Three compounds were identified as promising selective inhibitors for R67 DHFR.

Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend difficile de lui trouver un substitut. Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes durant la conservation en séquestrant les protéines BSP. Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1 bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5 × 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine. L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver les spermatozoïdes des mammifères. / Skim milk is being used as a protective agent for mammalian semen conservation over half a century. Recently, there has been increased interest in developing extenders free of animal products. However, it is difficult to find suitable component in order to replace milk as an extender, because the mechanisms by which milk protect sperm against cooling and freezing damages during the storage is unknown. The Binder of SPerm (BSP) proteins are the major proteins of bull seminal plasma and they are harmful during sperm storage. In fact, sperm would be in contact with a large quantity of BSP proteins that induce a continuous cholesterol and phospholipids efflux from the sperm membrane during storage. When bull sperm is diluted with an extender containing egg yolk, another compound frequently used in extender, the low-density lipoproteins (LDL) present in the egg yolk prevent the binding of the BSP proteins to the sperm membrane, thus, preventing the lipid efflux from the sperm membrane induced by the BSP proteins. Our hypothesis was that milk proteins would protect sperm during storage by binding BSP proteins. First, we demonstrated by gel filtration that bovine BSP proteins could bind the milk proteins. Skim milk was fractionated into three fractions: F1 (alpha-lactalbumin and beta- lactoglobulin, the major whey proteins and kappa-casein), F2 (mainly caseins and all other milk proteins in small amounts) and F3 (salts, sugars and small peptides). Bovine BSP1 and BSP5 have more affinity for F1 as compared to BSP3 and all the BSP proteins have affinity for F2. We confirmed the interaction between bovine BSP proteins and milk proteins by isothermal titration calorimetry. The binding of BSP1 to casein micelles is characterized by an affinity constant (Ka) of 3.5 × 10^5 M-1 and of a stoichiometric parameter for the association (n) of 4.5 BSP1 per casein. The association between BSP1 and alpha-lactalbumin (one of the major whey proteins) is characterized by a Ka of 2.4 × 10^5 M-1 and a “n” value of 0.8. These results support our contention that milk can protect sperm by preventing the BSP proteins’ binding to the sperm membrane attributable to a protein : protein interaction, while egg yolk sperm protection is attributable to a protein : lipoprotein interaction. Second, our studies showed that the homologous BSP proteins found in the boar, stallion and ram seminal plasma can bind the milk proteins. These results indicate that the mechanism of sperm protection by milk in these species should be similar to the one in bovine species. Third, we characterized the interaction between bovine BSP1 protein and LDL from hen’s egg yolk. The binding was characterized by a Ka of 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 and a « n » value of 104 BSP1 per LDL particle. Our results indicated that there is difference between the mechanism of sperm protection by milk and egg yolk. We believe that the results presented in this thesis may help to create new extenders free of animal product for mammal sperm preservation in liquid or frozen state.

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins. / The vasopressin type 2 receptor (V2R) plays an important role in water homeostasis. Mainly expressed in the collecting ducts of the kidney, V2R activation by the antidiuretic hormone arginine-vasopressin (AVP) leads to water reabsorption, resulting in a decrease urine output. More than 200 mutations in the V2R gene have been link to the aetiology of the congenital form of nephrogenic diabetes insipidus (cNDI), resulting from a receptor loss-of-function. In contrast, three recently identified mutations have been shown to cause a gain-of-function of the V2R leading to the nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis (NSIAD). The work presented herein is focussed on a better understanding of the molecular determinants leading to the loss- or gain -of-function of V2R mutants. More than 50% of missense mutations affecting the V2R were shown to hamper the receptor’s ability to adopt its native conformation and to cause its intracellular retention by the endoplasmic reticulum quality control system. We thus looked at the role of N-glycosylation and calnexin (Cnx) in the maturation process of mutant V2R, and their importance for receptor rescue by pharmacological chaperones (PC). Our results have shown that N-glycosylation is required for Cnx binding to the receptors and that the duration of this interaction is correlated to the severity of the misfolded state of the mutant. The importance of N-glycosylation and to sugar-mediated interactions in the maturation process of a given V2R mutant was found to be an intrinsic property, as it had no significant repercussion on the mild phenotype-associated Y128S mutant, while it completely abolished maturation of the W164S mutant, associated with a severe phenotype. Moreover, we have shown that pharmacological chaperoning can occur at different steps during the maturation process, according to the mutant studied. These mutant-specific differences indicate that the biosynthetic processing of mutant V2R is highly influenced by the nature of the mutation itself and could partially explain the variations in the clinical outcome severity among NDI-causing mutant V2Rs. Although a functionality rescue of W164S and Y128S mutants was obtained upon exposure to PC, it is not the case for all V2R mutants with a maturation defect. The V88M-V2R was found affected both in its maturation and its affinity toward AVP. In this case, and despite a significant increase in maturation and cell surface expression, the PC treatment led to a further loss in the receptor’s affinity for AVP, preventing its activation at physiological AVP concentrations. The R137C and R137L mutants are endowed with a high constitutive activity leading to NSIAD. Stunningly, substitution of this arginine by histidine (R137H) was associated with cNDI. These three mutant V2R were found to share many characteristics, of which a compromised maturation and elevated spontaneous desensitization. The only difference between these mutants relies on their constitutive activity levels. The PC used in our studies is also an inverse agonist, but failed to reduce the constitutive activity of the R137C/L mutants, entailing a ‘locked’ active conformation. Instead, the chaperoning property of the compound led to an increase in the number of constitutively active receptor at the cell surface. We have thus proposed the use of AVP as a treatment, as it was shown to cause receptor’s endocytosis without promoting their activation, leading to a reduced active receptor number at the cell surface. We have identified a new gain-of-function mutation affecting the V2R, the first not involving arginine 137. The F229V substitution was shown to confer high constitutive activity to the receptor, but unlike the two other NSIAD-causing mutants, it does not undergo elevated spontaneous desensitization. The observation that inverse agonists are efficient at inhibiting the constitutive activity of the F229V mutant is an important discovery since the unfruitful attempts obtained with the other constitutively active mutants led some investigators to the erroneous conclusion that inverse agonists were not useful for the treatment of NSIAD. Taken together, these findings underline the ‘individuality’ of V2R mutants and the importance of their functional characterization in order to bring personalized therapeutic strategies for patients with cNDI or NSIAD, and to develop new therapeutics adapted to the patients’ needs.

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.

Le ribozyme VS de Neurospora catalyse des réactions de clivage et de ligation d’un lien phosphodiester spécifique essentielles à son cycle de réplication. Il est formé de six régions hélicales (I à VI), qui se divisent en deux domaines, soit le substrat (SLI) et le domaine catalytique (tiges II à VI). Ce dernier comprend deux jonctions à trois voies qui permettent de reconnaître le substrat en tige-boucle de façon spécifique. Ce mode de reconnaissance unique pourrait être exploité pour cibler des ARN repliés pour diverses applications. Bien que le ribozyme VS ait été caractérisé biochimiquement de façon exhaustive, aucune structure à haute résolution du ribozyme complet n’a encore été publiée, ce qui limite la compréhension des mécanismes inhérents à son fonctionnement. Précédemment, une approche de divide-and-conquer a été initiée afin d’étudier la structure des sous-domaines importants du ribozyme VS par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) mais doit être complétée. Dans le cadre de cette thèse, les structures de la boucle A730 et des jonctions III-IV-V et II-III-VI ont été déterminées par spectroscopie RMN hétéronucléaire. De plus, une approche de spectroscopie RMN a été développée pour la localisation des ions divalents, tandis que diverses approches de marquage isotopique ont été implémentées pour l’étude d’ARN de plus grandes tailles. Les structures RMN de la boucle A730 et des deux jonctions à trois voies révèlent que ces sous-domaines sont bien définis, qu’ils sont formés de plusieurs éléments structuraux récurrents (U-turn, S-turn, triplets de bases et empilement coaxial) et qu’ils contiennent plusieurs sites de liaison de métaux. En outre, un modèle du site actif du ribozyme VS a été construit sur la base des similarités identifiées entre les sites actifs des ribozymes VS et hairpin. Dans l’ensemble, ces études contribuent de façon significative à la compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS. De plus, elles permettront de construire un modèle à haute résolution du ribozyme VS tout en favorisant de futures études d’ingénierie. / The Neurospora VS ribozyme catalyzes the cleavage and the ligation of a specific phosphodiester bond, which is essential for its replication cycle. It is formed of six helical regions (I to VI) that are divided in two domains: the substrate (SLI) and the catalytic domain (stems II-VI). The latter contains two three-way junctions that allow recognition of the stem-loop substrate in a specific manner. This unique mode of substrate recognition could be exploited to target folded RNAs for diverse applications. Even though the VS ribozyme has been extensively characterized biochemically, no high-resolution structure of the complete ribozyme has been published yet and this limits our mechanistic understanding. A divide-and-conquer approach was previously initiated to study the structure of the important subdomains of the VS ribozyme by nuclear magnetic resonance (NMR), but this approach needs to be completed. In this thesis, the structures of the A730 loop, the III-IV-V junction and the II-III-VI junction were determined by heteronuclear NMR spectroscopy. Moreover, a unique NMR approach was developed for localizing divalent metal ions, whereas several isotope-labeling strategies were implemented to facilitate the study or large RNA molecules. The NMR structures of the A730 loop and the two three-way junctions reveal that these subdomains are well defined, that they are formed by several recurrent structural elements (U-turn and S-turn motifs, base triples and coaxial stacking) and that they contain several metal-binding sites. Interestingly, structural similarities were identified between the VS and hairpin ribozymes, which allowed the modeling of the VS ribozyme active site. In summary, these studies significantly contribute to a better understanding of the global architecture of the VS ribozyme. In addition, they will allow the construction of a high-resolution model of the complete VS ribozyme and facilitate future engineering studies.

La tagatose-1,6-biphosphate aldolase de Streptococcus pyogenes est une aldolase qui fait preuve d'un remarquable manque de spécificité vis à vis de ses substrats. En effet, elle catalyse le clivage réversible du tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), mais également du fructose-1,6-bisphosphate (FBP), du sorbose-1,6-bisphosphate et du psicose-1,6-bisphosphate, quatre stéréoisomères, en dihydroxyacétone phosphate (DHAP) et en glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P). Aldolase de classe I, qui donc catalyse sa réaction en formant un intermédiaire covalent obligatoire, ou base de Schiff, avec son susbtrat, la TBP aldolase de S. pyogenes partage 14 % d’identité avec l’enzyme modèle de cette famille, la FBP aldolase de muscle de mammifère. Bien que le mécanime catalytique de la FBP aldolase des mammifères ait été examiné en détails et qu’il soit approprié d’en tirer des renseignements quant à celui de la TBP aldolase, le manque singulier de stéréospécificité de cette dernière tant dans le sens du clivage que celui de la condensation n’est toujours pas éclairci. Afin de mettre à jour les caractéristiques du mécanisme enzymatique, une étude structurale de la TBP aldolase de S. pyogenes, un pathogène humain extrêmement versatile, a été entreprise. Elle a permis la résolution des structures de l’enzyme native et mutée, en complexe avec des subtrats et des inhibiteurs compétitifs, à des résolutions comprises entre 1.8 Å et 2.5 Å. Le trempage des cristaux de TBP aldolase native et mutante dans une solution saturante de FBP ou TBP a en outre permis de piéger un authentique intermédiaire covalent lié à la Lys205, la lysine catalytique. La determination des profils pH de la TBP aldolase native et mutée, entreprise afin d'évaluer l’influence du pH sur la réaction de clivage du FBP et TBP et ìdentifier le(s) résidu(s) impliqué(s), en conjonction avec les données structurales apportées par la cristallographie, ont permis d’identifier sans équivoque Glu163 comme résidu responsable du clivage. En effet, le mode de liaison sensiblement différent des ligands utilisés selon la stéréochimie en leur C3 et C4 permet à Glu163, équivalent à Glu187 dans la FBP aldolase de classe I, d’abstraire le proton sur l’hydroxyle du C4 et ainsi d’amorcer le clivage du lien C3-C4. L’étude du mécanimse inverse, celui de la condensation, grâce par exemple à la structure de l’enzyme native en complexe avec ses substrats à trois carbones le DHAP et le G3P, a en outre permis d’identifier un isomérisme du substrat G3P comme possible cause de la synthèse des isomères en C4 par cette enzyme. Ce résultat, ainsi que la decouverte d’un possible isomérisme cis-trans autour du lien C2-C3 de la base de Schiff formée avec le DHAP, identifié précedemment, permet de cerner presque complètement les particularités du mécanisme de cette enzyme et d’expliquer comment elle est capable de synthétiser les quatres stéréoisomères 3(S/R), 4(S/R). De plus, la résolution de ces structures a permis de mettre en évidence trois régions très mobiles de la protéine, ce qui pourrait être relié au rôle postulé de son isozyme chez S. pyogenes dans la régulation de l’expression génétique et de la virulence de la bactérie. Enfin, la résolution de la structure du mutant Lys229→Met de la FBP aldolase de muscle en complexe avec la forme cyclique du FBP, de même que des études cristallographiques sur le mutant équivalent Lys205→Met de la TBP aldolase de S. pyogenes et des expériences de calorimétrie ont permis d’identifier deux résidus particuliers, Ala31 et Asp33 chez la FBP aldolase, comme possible cause de la discrimination de cette enzyme contre les substrats 3(R) et 4(S), et ce par encombrement stérique des substrats cycliques. La cristallographie par rayons X et la cinétique enzymatique ont ainsi permis d'avancer dans l'élucidation du mécanisme et des propriétés structurales de cette enzyme aux caractéristiques particulières. / Tagatose-1,6-bisphosphate aldolase from Streptococcus pyogenes is a class I aldolase that shows a lack of stereospecificity that is rare in enzymes in general, and in aldolases in particular. This aldolase catalyzes the reversible cleavage of tagatose-1,6-bisphosphate (TBP), fructose-1,6-bisphosphate (FBP), sorbose-1,6-bisphosphate and psicose-1,6-bisphosphate, four stereoisomers, in dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P). A class I aldolase, the aldolase TBP S. pyogenes shares 14 % identity with the model enzyme of this family, mammalian FBP aldolase. Although the catalytic mechanism of the class I FBP aldolase has been examined in detail and it is appropriate to infer information as to the class I TBP aldolase, the singular lack of specificity of the latter enzyme both in the direction of cleavage and condensation is still not elucidated. To better comprehend the characteristics of the enzymatic mechanism, a structural study of the TBP aldolase of S. pyogenes, an extremely versatile human pathogen, has been undertaken. It has allowed the resolution of high resolution structures of the native and mutated enzyme in complex with subtrates and competitive inhibitors. These same structures allowed us to gain information as to the active site of the enzyme in general and the catalytic residues in particular. TBP aldolase native and mutated soaked in a saturated solution of FBP or TBP also trapped an iminium intermediate covalenty bound to Lys205, the Schiff base-forming lysine. The determination of the pH profiles of the native and mutated enzyme, carried out to assess the influence of pH on FBP and TBP cleavage and identify the residue(s) involved, in conjunction with the structural data provided by crystallography, identified unequivocally Glu163, corresponding to Glu187 in FBP aldolase, as the residue responsible for substrate cleavage. The substantially different binding mode of the ligands, according to the stereochemistry of their C3 and C4 carbons, indeed allows Glu163 to abstract the proton in C3-OH and thus initiate C3-C4 bond cleavage. The study of the inverse mechanism, the condensation one, using for instance the crystallographic structure of native TBP aldolase in complex with DHAP and G3P, its three carbons substrates, has led us to believe that a possible isomerism of the G3P substrate was the reason for the synthesis of both C4 isomers by this enzyme. This result, as well as the discovery of a possible cis-trans isomerism around the C2-C3 bond of the Schiff base formed with DHAP, identified previously, almost completely elucidated the features of this enzyme`s mechanism. In addition, these structures have highlighted three highly mobile regions of the protein, which may be related to the role of its isozyme in the regulation of gene expression and virulence in S. pyogenes. Lastly, the resolution of the structure of the FBP aldolase mutant Lys229 → Met in complex with the cyclic form of FBP, as well as crystallographic studies of the corresponding mutant in TBP aldolase, Lys205→Met and ITC experiments, allowed the identification of two particular residues, Ala31 and Asp33 in FBP aldolase, as responsible for this enzyme discrimination against 3(R) 4(S) substrates, by steric hindrance of the cyclic substrates. X-ray crystallography, enzyme kinetics and isothermal calorimetry thus enabled advances in the elucidation of the mechanism and structural properties of this enzyme with singular characteristics.

Dans cette thèse, l’impact du polymorphisme rs3846662 sur l’épissage alternatif de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A réductase (HMGCR) a été investigué in vivo, chez des patients atteints d’hypercholestérolémie familiale (HF) ou de maladie d’Alzheimer (MA). Le premier manuscrit adresse la problématique de la normalisation de la quantification relative des ARNm par PCR quantitative. Les découvertes présentées dans ce manuscrit nous ont permis de déterminer avec un haut niveau de confiance les gènes de référence à utiliser pour la quantification relative des niveaux d’ARNm de l’HMGCR dans des échantillons de sang (troisième manuscrit) et de tissus cérébraux post-mortem (quatrième manuscrit). Dans le deuxième manuscrit, nous démontrons grâce à l’emploi de trois cohortes de patients distinctes, soit la population canadienne française du Québec et les deux populations nord américaines « Alzheimer’s Disease Cooperative Study (ADCS) » et « Alzheimer’s Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) », que le génotype AA au locus rs3846662 confère à ces porteurs une protection considérable contre la MA. Les femmes porteuses de ce génotype voient leur risque de MA diminuer de près de 50% et l’âge d’apparition de leurs premiers symptômes retarder de 3.6 ans. Les porteurs de l’allèle à risque APOE4 voient pour leur part leurs niveaux de plaques séniles et dégénérescences neurofibrillaires diminuer significativement en présence du génotype AA. Enfin, les individus atteints de déficit cognitif léger et porteurs à la fois de l’allèle APOE4 et du génotype protecteur AA voient leur risque de convertir vers la MA chuter de 76 à 27%. Dans le troisième manuscrit, nous constatons que les individus atteints d’HF et porteurs du génotype AA ont, contrairement au modèle établi chez les gens normaux, des niveaux plus élevés de cholestérol total et de LDL-C avant traitement comparativement aux porteurs de l’allèle G. Le fait que cette association n’est observée que chez les non porteurs de l’APOE4 et que les femmes porteuses du génotype AA présentent à la fois une augmentation des niveaux d’ARNm totaux et une résistance aux traitements par statines, nous indique que ce génotype influencerait non seulement l’épissage alternatif, mais également la transcription de l’HMGCR. Comme une revue exhaustive de la littérature ne révèle aucune étude abondant dans ce sens, nos résultats suggèrent l’existence de joueurs encore inconnus qui viennent influencer la relation entre le génotype AA, l’épissage alternatif et les niveaux d’ARNm de l’HMGCR. Dans le quatrième manuscrit, l’absence d’associations entre le génotype AA et les niveaux d’ARNm Δ13 ou de protéines HMGCR nous suggère fortement que ce polymorphisme est non fonctionnel dans le SNC affecté par la MA. Une étude approfondie de la littérature nous a permis d’étayer cette hypothèse puisque les niveaux de HNRNPA1, la ribonucléoprotéine influencée par l’allèle au locus rs3846662, sont considérablement réduits dans la MA et le vieillissement. Il est donc proposé que les effets protecteurs contre la MA associés au génotype AA soient le résultat d’une action indirecte sur le processus physiopathologique. / In this thesis, the impact of rs3846662 polymorphism on the alternative splicing of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGCR) was investigated in vivo, in patients with familial hypercholesterolemia (FH) or Alzheimer disease (AD). The first manuscript addresses the issue of normalization in relative quantification of mRNA by quantitative PCR. The findings presented in this manuscript have allowed us to determine with a high level of certainty the appropriate reference genes to use for the relative quantification of HMGCR mRNA levels in blood samples (third manuscript) and postmortem brain tissues (fourth manuscript). In the second manuscript, we demonstrate through the use of three independent cohorts, namely the French Canadian population of Quebec and the two North American populations named "Alzheimer's Disease Cooperative Study (ADCS)" and "Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) ", that the AA genotype at locus rs3846662 confers significant protection against AD. Women carrying this genotype decrease their risk of AD by about 50%, and delay their age of onset of 3.6 years. For their part, individuals carrying both the APOE4 risk allele and the AA genotype have decreased levels of senile plaques and neurofibrillary tangles compared to individuals carrying both the APOE4 and HMGCR G alleles. Finally, individuals suffering from mild cognitive impairment and carrying both the APOE4 risk allele and the protective AA genotype see their risk of converting to AD drop from 76% to 27%. In the third manuscript, contrary to the model described in normal subjects, we discovered that individuals with FH carrying the AA genotype have higher levels of total cholesterol and LDL-C before treatment compared to the carriers of the G allele. This latter association is observed only in non-carriers of the APOE4 risk allele. Furthermore, women carrying the AA genotype have both an increase in total HMGCR mRNA levels and a decrease response to statin treatment. These results suggest the AA genotype has an impact not only on the alternative splicing, but also on the transcription of HMGCR. Since an exhaustive review of the literature has reveal no studies corroborating this hypothesis, our results suggest the existence of yet unknown players influencing the relationships between the AA genotype, alternative splicing and the mRNA levels of HMGCR. In the fourth manuscript, we uncovered no association between the AA genotype and Δ13 mRNA or HMGCR protein levels. This strongly suggests that the rs3846662 polymorphism is not functional in the CNS affected by AD. A thorough study of the literature enabled us to support this hypothesis since the levels of HNRNPA1, the ribonucleoprotein influenced by the allele status at rs3846662 locus, are significantly reduced in AD and aging. Accordingly, we propose that the protective effects of the AA genotype against AD may be mediated through indirect effects on the physiopathology of the disease.

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