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Comprendre comment l’expression des gènes est régulée spécifiquement dans chaque tissu et de manière dynamique au cours du temps demeure une étape centrale de notre compréhension de l’organogénèse. L’identification des éléments cis-régulateurs de la transcription de manière tissu-spécifique peut permettre de comprendre les règles logiques d’organisation du réseau de gènes régulateur et aussi d’identifier de nouveaux acteurs (facteurs de transcription notamment). L’analyse de marques de chromatine (H3K27ac et H3K4me3) spécifiquement dans les cardioblastes (104 cellules) au cours de la différentiation a permis l’identification en masse de régions cis-régulatrices de la transcription. Via une approche d’apprentissage, de nouvelles régions régulatrices spécifiques des cardiomyocytes ainsi que 2 nouveaux facteurs de transcription (bagpipe, hamlet) ont été identifiées. L’alignement multiple des régions régulatrices suggère que les régions associées à H3K27ac dans les cellules cardiaques durant ces étapes de l’organogénèse partagent une séquence consensus. Ces nouveaux éléments régulateurs viennent compléter le réseau de gène régulateur au cours des étapes tardives de la cardiogénèse. / Understanding how gene expression is spatio-temporally regulated remains a crucial step in our understanding of organogenesis. Identification of transciptional cis-regulatory elements in a tissu-specific manner could allow to understand logical rules leading regulatory network organisation and to identify new actors (in particular transcription factors). Analysis of chromatin marks (H3K27ac and H3K4me3) specifically in cardiac cells (104 cells) during differentiation allowed the identification of transcriptional cis-regulatory regions. Via a machine learning approach, new cardiac specific regulatory regions and two transcription factors (bagpipe and hamlet) have been identified. Multiple sequence alignment of regulatory regions suggests that regions associated to H3K27ac in cardiac cells during these steps of organogenesis share a consensus sequence. These new regulatory elements integrate and complete the gene regulatory network underlying late steps of cardiogenesis.

Les gènes Hox codent des facteurs de transcription à homéodomain (HD). Bien que ce dernier reconnaisse des séquences similaires in vitro, les protéines Hox achèvent des fonctions hautement spécifiques in vivo. Des séquences protéiques en dehors de l’HD influencent la spécificité d’action des protéines Hox par le recrutement de cofacteurs, dont le mieux caractérisé est Extradenticle (Exd) chez la drosophile. Des travaux récents au sein de notre équipe ont démontré la contribution fonctionnelle de trois motifs de AbdA, aussi bien dans des fonctions Exd-dépendantes qu’à des fonctions Exd-indépendantes. Mon travail de thèse a porté sur la caractérisation de la contribution des motifs protéiques de AbdA dans la sélection puis dans la régulation des gènes cibles en utilisant une approche combinée ChIPseq/RNAseq, dans un contexte Exd-indépendant. Le code ADN identifié nous a renseigné sur la présence d’inputs transcriptionnels additionnels. Ces derniers correspondant à des facteurs de transcription déjà connus, leur présence dans un complexe protéique avec AbdA a été démontrée par des analyses de spectrométrie de masse. Un second volet de mon travail de thèse a été l’identification de modifications post-traductionnelles pouvant rendre compte d’un mécanisme de régulation de l’activité des protéines Hox. Des analyses prédictives in silico, confirmées par des approches biochimiques et des analyses in vivo ont démontré la SUMOylation de AbdA. Ces résultats préliminaires posent les bases pour des travaux futures qui auront pour objectif d’identifier les résidus d’AbdA SUMOylés et d’élucider le rôle de cette modification dans la régulation de l’activité de la protéine AbdA. / Hox genes encode homeodomain-containing transcription factors (HD). Although the HD binds to similar DNA sequences in vitro, Hox proteins display a high functional specificity in vivo. Protein motifs outside of the HD influence Hox specificity through recruiting additional cofactors, with the best characterized being Extradenticle (Exd in Drosophila). Recent evidence from our group has uncovered the functional contribution of AbdA intrinsic motifs to AbdA Exd-dependent functions as well as AbdA Exd-independent functions. My PhD work has aimed to characterize the contribution of AbdA motifs to target gene selection and regulation using a combined approach of ChIPseq/RNAseq in an Exd-independent context. The DNA code identified provides us with new insights about additional transcriptional inputs from additional DNA-binding proteins lying in the vicinity of AbdA recognition sites. Mass spectrometry analysis establishes the occurrence of these additional DNA binding proteins in a multi-protein complex with AbdA. Deciphering the involvement of post-translational modifications in the regulation of Hox protein activity was another aspect of my PhD work. In silico predictive analysis, followed by biochemical approaches and in vivo assays reveal the potential for SUMOylation of AbdA as a potentially important regulatory component of AbdA activity. These preliminary results set the bases for further work aimed at identifying SUMOylated residues on AbdA and the functional relevance of such post-translational modification on AbdA activity regulation.

La méthylation de l'ADN est une marque épigénétique répressive impliquée dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Des hyperméthylations de promoteurs sont ainsi responsables de répressions transcriptionnelles de gènes suppresseurs de tumeurs dans les cancers. La méthylation de l'ADN serait capable d'induire une répression transcriptionnelle par la combinaison de deux mécanismes principaux : l'éloignement de facteurs de transcription activateurs, et le recrutement de protéines répressives liant spécifiquement l'ADN méthylé. MBD2 est une protéine de liaison à l'ADN méthylé capable de recruter les complexes répresseurs NuRD et SIN3A. ZBTB4 est capable de se lier à l'ADN méthylé in vitro et induit une répression de la transcription de plasmides méthylés lorsqu'elle est surexprimée. Son rôle de répresseur transcriptionnel dépendant de la méthylation de l'ADN reste toutefois peu documenté. Nous avons identifiés par RNAseq les modifications du transcriptome induites par une déplétion de MBD2 ou de ZBTB4. Les gènes surexprimés après déplétion de MBD2 ou ZBTB4 sont méthylés sur leur promoteur, et sont aussi surexprimés après traitement avec des agents déméthylants. Des résultats d'immuno-précipitations de chromatine réalisées contre les deux protéines endogènes montrent que la quasi-totalité des sites de fixation de MBD2 et qu'une partie des sites de fixations de ZBTB4 correspondent à des régions méthylés. Ces résultats confirment à l'échelle du génome que MBD2 endogène est bien un interprète majeur de la méthylation de l'ADN, et que ZBTB4 réprime bien la transcription de gènes méthylés. Nous avons aussi observé une redistribution importante de MBD2 sur le génome dans des modèles de progression tumorale. Nos résultats montrent que les gènes réprimés pendant la transformation oncogénique le sont en partie par MBD2. L'expression de certains de ces gènes peut être induite dans les lignées transformées par déplétion de MBD2 par siRNA / DNA methylation is an epigenetic mark that plays a role in many physiological and pathological processes. Indeed, silencing of tumor suppressor genes in cancer is frequently caused by promoter hypermethylations. Transcriptional repression induced by DNA methylation is likely caused by the combination of two mechanisms: the repulsion of activator transcription factors, and the recruitment of repressor proteins able to specifically recognize methylated DNA. MBD2 is a methyl DNA binding protein that cans recruits NuRD or SIN3A repressor complexes. ZBTB4 is able to bind methylated DNA in vitro, and can repress the transcription of methylated plasmids when overexpressed. Its methylationdependent transcriptional repressor function remains poorly documented. By RNAseq, we have identified transcriptomic modifications induced by the depletion of either MBD2 or ZBTB4. Genes up regulated after MBD2 or ZBTB4 depletion were methylated on their promoter, and were also up regulated after treatment with demethylating agents. Chromatin immunoprecipitations experiments against endogenous proteins showed that almost all MBD2 binding sites, and that a part of ZBTB4 binding sites, correspond to methylated DNA regions. These results confirmed at genome wide scale that endogenous MBD2 is a major reader of DNA methylation and that ZBTB4 does repress the transcription of methylated genes. We observed an important redistribution of MBD2 on the genome in models of tumor progression. Our results showed that MBD2 plays role in gene repressions occurring during oncogenic transformation. Some of those repressed genes can be re-expressed in transformed cell lines after depletion of MBD2 by siRNA

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