Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2151.pdf: 1524860 bytes, checksum: 6ed528476d44762b88988e6b1ca76146 (MD5) Previous issue date: 2004-08-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of the technology of animal cell culture for the expression of recombinant proteins has been gaining major interest within biotechnology due the obtation of recent efficient medicaments in the chronic diseases. In this work was utilized the recombinant lineage CHO-K1, denominate CHOZMD, anchorage-dependent. It is capable of expressing a disintegrin with antimetastics properties. Knowing the precedent of well performance of fixed bed bioreactors with utilization of microcarriers in large scale animals cells cultures. It was fixed as purpose of this work the definition of a method to prepare of inoculum to this bioreactor utilizing Cytoline 1 commercial macroporous microcarrier in spinner flask. The cultures realized in spinner flasks of 500 mL with Cytoline 1 microcarriers with DMEM medium in range of pH in 7.0 to 7.4. It showed that the electrostatic incompatibility between the cell and the microcarrier matrix composed of polyethylene and silica was responsible by decreased adhesion cell and, consequently, by intense cell death for firsts hours of experiments. In function this was necessary to utilize an inoculum with high cell concentration and a better pH medium control to reach satisfactory results in the culture. Following this strategy was possible to achieve highest maximum specific growth cell rate (μmáx) for the CHOZMD cell of 0.24d-1 while for wild CHO-K1 cell was obtained 0.36d-1, both comparable with other works encounter in the literature. The best value obtained of cell productivity with recombinant cell was of 6,096 cel/mL·h and for wild cell was of 10,596 cel/mL·h The lager concentrations of adherents cells on microcarriers were obtained in this experiments that utilized concentrated inoculums, in the case of recombinant cell was obtained 1.39·106 cel/mL and in the case with wild cell of 1.65·106 cel/mL. For the preparation of an inoculum for a fixed bed bioreactor when prepared in spinner with Cytoline 1 microcarrier recommend: adoption of an inoculum approximate of 2.0·106 cel/mL in exponential growth phase and with rigorous control of pH medium in 7.3. / O uso da tecnologia de cultivo de célula animal para a expressão de proteínas recombinantes vem ganhando interesse crescente dentro da biotecnologia em função da obtenção de novos medicamentos eficientes no tratamento de doenças crônicas. Neste trabalho foi utilizada a linhagem recombinante CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary), denominada CHOZMD, dependente de ancoramento. Capaz de expressar uma desintegrina com propriedades antimetastáticas. Conhecendo os precedentes de bom desempenho do biorreator de leito fixo com utilização de microcarregadores no cultivo de células animais em larga escala fixou-se como objetivo deste trabalho a definição de um método para preparo de inóculo para esse biorreator utilizando o microcarregador macroporoso comercial Cytoline 1 em frasco spinner. Os cultivos realizados em frasco spinner de 500 mL com microcarregadores Cytoline 1 em meio DMEM em pH variando entre 7,0 e 7,4 mostraram que a baixa compatibilidade entre a célula e a matriz do microcarregador composta de polietileno e sílica foi responsável pela baixa adesão celular. Em função disso foi necessário utilizar um inóculo com alta concentração celular e um melhor controle do pH do meio para alcançar resultados satisfatórios nos cultivos. Seguindo essa estratégia foi possível conseguir velocidades específicas máximas de crescimento celular (μmáx) para a célula CHOZMD de 0,24d-1 enquanto que para a célula CHO-K1 selvagem obteve-se 0,36d-1, ambas comparáveis as de outros trabalhos encontrados na literatura. O melhor valor obtido de produtividade celular com célula recombinante foi de 6.096 células/mL·h e para a célula selvagem foi de 10.569 células/mL·h. As maiores concentrações de células aderidas aos microcarregadores foram obtidas nos experimentos que utilizaram inóculos concentrados, no caso da célula recombinante obteve-se 1,39·106 células/mL e no caso com célula selvagem 1,65·106 células/mL. Para o preparo de um inóculo adequado para um biorreator de leito fixo quando preparado no spinner com microcarregador Cytoline 1 recomenda-se a adoção de um inóculo em torno de 2,0·106 células/mL na fase exponencial de crescimento e controle rigoroso do pH do meio em 7,3.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:33:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:54:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:07:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:54:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:07:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Endostatina, um fragmento do colágeno XVIII de 20 kDa, é um potente inibidor de angiogênese e crescimento tumoral. Foi previamente demonstrado que a administração contínua de endostatina em modelos animais melhorou a eficácia e potência da terapia antitumoral, comparada com a administração subcutânea diária por injeções de endostatina. A liberação contínua da proteína antiangiogênica endostatina para a circulação sistêmica poderia ser um tratamento antiangiogênico ideal. O sistema Theracyte é um sistema de membranas de politetrafluoretileno semi-permeáveis para macro-encapsulamento e implante de células geneticamente modificadas para liberação de proteínas terapêuticas in vivo e que não requer a imunossupressão do hospedeiro. Com a finalidade de demonstrar a utilidade deste sistema, células CHO expressando (his)6-met-endostatina foram injetadas em dispositivos de imunoisolamento Theracyte, que foram imediatamente implantados em camundongos imunodeficientes (SCID). Em outro modelo de implante de dispositivos de imunoisolamento, os dispositivos Theracyte foram implantados em animais e depois do tempo de cicatrização (17 dias), as células expressando endostatina foram injetadas dentro dos dispositivos. Níveis altos e constantes de endostatina de até 3,7 g/ml foram detectados no plasma durante os dois meses de duração do estudo em ambos os modelos de implante dos dispositivos de imunoisolamento. Níveis mais altos de endostatina (até 6,7 g/ml) foram detectados no plasma de animais implantados com o mesmo número de células livres. Análise histológica de cortes corados por hematoxilina/eosina dos dispositivos retirados dos animais mostraram que haviam células aparentemente viáveis dentro dos dispositivos. A análise imuno-histoquímica utilizando anticorpo anti-endostatina mostrou a existência de reação nas células dentro do dispositivo e também do lado de fora, demonstrando que a endostatina, secretada pelas células recombinantes confinadas, extravasou da membrana, atingindo os tecidos ao redor. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Ingeniero Civil en Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la gran demanda de proteínas recombinantes y en particular de anticuerpos para el uso terapéutico en humanos, se busca optimizar los cultivos celulares para obtener mayor producción de proteínas y menores costos de producción. Uno de los métodos utilizados en el mejoramiento de los cultivos es la ingeniería celular donde, mediante la inserción o eliminación de un gen, se modifican las vías metabólicas de las células. Las líneas celulares animales tienen la desventaja de que su metabolismo es incapaz de oxidar la glucosa completamente a CO2 y H2O. La mayor parte de la glucosa, es oxidada a piruvato y finalmente a lactato, el que tiene un impacto negativo en el crecimiento celular y en la producción de proteínas. El trabajo consistió en caracterizar los clones CHO MDHII y CHO PYC generados a partir de una línea celular CHO productora de IgG, que sobreexpresan los genes MDHII y PYC2 las cuales han mostrado mejorar la eficiencia del metabolismo en otras líneas celulares, produciendo menos lactato y aumentando el flujo de carbonos desde la glicólisis hacia el ciclo del TCA. Para ello fue necesario hacer una selección previa de clones, de tal forma de escoger a los que presentaran mayor productividad específica de IgG y mayor eficiencia metabólica, caracterizada por valores bajos de producción de lactato por glucosa consumida (ΔL/ΔG). Luego se procedió a realizar las curvas de crecimiento para los clones y las células CHO wild-type que se utilizó como control. Para la caracterización del metabolismo, se midió la glucosa consumida, la producción de lactato, IgG y amonio, y se calcularon las tasas de consumo y producción de los metabolitos. La caracterización de la expresión transcripcional se realizó mediante un PCR en tiempo real, para el que fue previamente necesario extraer el RNA de las muestras, seguida de la síntesis de cDNA. Los resultados mostraron una menor producción de biomasa y anticuerpo IgG en los clones en comparación al control CHO wild-type, debido a un aumento inesperado en la producción de este último. Por otro lado, sí fue posible demostrar una mayor eficiencia metabólica de los clones debido a la disminución en la producción de lactato, en el caso del clon CHO MDHII y a una menor diferencia entre las tasas de producción de lactato y consumo de glucosa, en el clon CHO PYC. Al comparar las eficiencias de ambos clones, las células CHO MDHII mostraron una mayor eficiencia metabólica lo que se debería a un mayor flujo de carbonos desde la glicólisis al ciclo del TCA. Se cree que el clon CHO PYC no mostró una mayor eficiencia metabólica debido a que se generaría una acumulación de malato que no podría ser procesada por la enzima MDHII en el ciclo del TCA. Los cálculos de productividad específica de IgG demostraron que la producción de proteína recombinante estaría asociada al crecimiento celular y se cree que el consumo de glutamina cumpliría un rol importante en la producción de biomasa e IgG debido a que se obtuvieron mayores concentraciones de amonio en las células con mayor densidad y producción de proteína. El análisis de la expresión transcripcional no permitió detectar diferencias en la amplificación de los genes MDHII y PYC2, principalmente debido a la variación en los resultados obtenidos y a que no fue posible amplificar un producto específico para el gen PYC2. Del trabajo se puede concluir que el clon CHO MDHII presentó una mayor eficiencia metabólica debido a la menor producción de lactato y exhibió mayor producción de biomasa e IgG que el clon CHO PYC. Para comprender mejor el comportamiento de estos clones, se debe llevar a cabo un estudio de los flujos en las vías metabólicas y buscar métodos de cultivo que optimicen el crecimiento celular y la producción de proteína, para obtener el máximo beneficio de los clones. Por otro lado, es importante que en el proceso de la selección de clones, la productividad de proteína recombinante de los clones se compare con una muestra control, de tal manera de verificar que estos presentan una mejora. Además se deben seleccionar los clones que presenten una mayor densidad celular y menor producción de lactato, ya que se ha visto que estas características mejoran la productividad.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / El cultivo de células animales ha cobrado gran importancia en la industria biotecnológica, dada su capacidad de producir proteínas recombinantes compatibles con su uso terapéutico en humanos. Este potencial ha motivado la búsqueda de estrategias para la optimización de los procesos cuyo objetivo es la síntesis de grandes cantidades de proteínas con aplicaciones biomédicas. Una de las estrategias utilizadas corresponde al cultivo en fuentes alternativas de carbono, tales como galactosa, las que al ser consumidas lentamente llevan a la obtención de un metabolismo más eficiente, con una reducción de la acumulación metabolitos inhibitorios tanto del crecimiento celular como de la síntesis del producto. Sin embargo, se ha observado que estos cultivos presentan baja velocidad de crecimiento por lo que es necesario suplementar estos medios con glucosa o realizar modificaciones al metabolismo celular de forma de obtener cultivos con mayores rendimientos. Para la obtención de una línea celular que presente un desempeño mejorado en cultivos con galactosa, se transfectaron células CHO de forma de sobre-expresar proteínas asociadas a pasos previamente reportados como limitantes del metabolismo de la galactosa, específicamente el transportador Slc2a8 y galactoquinasa Galk1. No se tuvieron resultados concluyentes con respecto a la sobre-expresión del transportador Slc2a8, debido a que el pool de clones obtenidos luego de la transfección no mantuvo su viabilidad durante tiempo suficiente para caracterizar su comportamiento en cultivo. Por otro lado, los resultados obtenidos mostraron que los clones seleccionados (CHO-Galk1) alcanzan mayor densidad celular en cultivos desarrollados en medio con glucosa y galactosa, además de ser capaces de crecer en un medio que sólo presenta galactosa, contrario a lo observado en la línea parental. Las células CHO-Galk1-2 presentan una mayor concentración de producto, llegando a sintetizar un 42% más de tPA que el control. El aumento más drástico de tasa de producción está asociado a la fase de crecimiento en galactosa. Los resultados obtenidos para el metabolismo de glucosa del clon CHO-Galk1-2 presentan diferencias con respecto al cultivo control, por lo que se plantea que la sobre-expresión de este gen puede tener efectos positivos en el metabolismo de glucosa. El análisis de flujos metabólicos permite observar un metabolismo eficiente, centrado en la producción de energía, asociado a un alto flujo en el ciclo del TCA, producción de biomasa y producto.

We have used Chinese hamster ovary (CHO)-human hybrid cells containing chromosomes 16, 18, X, and 21 to test the ability of human kinetochores to successfully bind to spindle microtubules and to be distributed to the daughter cells. We have established the intrinsic rate of non-disjunction among these human chromosomes noted above and compared these rates with those in cells presented with mitotic challenges such as taxol, nocodazole, and mitosis with unreplicated genomes (MUG). Cells were grown on culture slides, fixed and processed for immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization (FISH). Daughter pairs were identified by staining with anti-á-tubulin to identify midbodies. Human centromere DNA probes were used for FISH in order to test for the successful passage of human kinetochores to daughter cells during anaphase. Our data indicate that different human kinetochores vary in their ability to properly engage the spindle and to be successfully distributed. In addition, mitotic challenges have been shown to affect the rate of non-disjunction. The mechanism of this effect is not yet known.

Eleven nickel compounds representing a range of solubilities and biological activities were tested for toxicity, mutagenicity, and cytosolic and nuclear nickel uptake in AS52 cells. values ranging LC50 from 2-130 ug Ni/ml for particulates and 120-150 ug Ni/ml for the water soluble salts (NiCl2, NiS04, Ni(CH3C00)2) were determined. The Ni(OH)2, NiC03 , and nickel sulphides (Ni3S2 , Ni 7S6 , amorphous NiS) exhibited similar toxicities (LC50's of 2.0, 5.8, 4.1, 8.2, 4.1 ~g Ni/ml respectively), while the nickel oxides were less toxic and showed large variations between the black, Li 2Ni 8010 , and green NiO forms (LC50's of 18.1, 75, 130 ug Ni/ml). Concentrations reducing survival to the range 20-80% were tested for mutagenicity and degree of nickel uptake. Although nickel compounds have been reported to be only weak or equivocal mutagens, the results indicate a low but significant increase in mutation rate at the gpt locus induced by all the nickel compounds tested. The majority of compounds displayed nuclear to cytoplasmic nickel ratios of ≈ 1:4 to 1:2, though this was ≈ 1:20 for nickel salts. NiC03 appeared to be intermediate in behaviour with a ratio of ≈ 1:12. Comparison of the eleven compounds at the same toxicity level (LC50) showed a 75-fold difference in exposure levels but about a 10-fold difference in cytoplasmic and nuclear nickel levels. There appears to be a very good correspondence between previously reported dissolution half times (T50's) of the compounds tested and the cytosolic nickel levels at a given toxicity level. For the water-soluble salts, previous reports have shown that cellular distribution varies from that of particulates due to differences in the manner of uptake. The present work confirms this and suggests that the compounds can be divided into three classes: watersoluble salts producing very low nuclear levels and high cytosolic levels, inert nickel oxides (green NiO and lithium nickel oxide) with relatively low nuclear and cytosolic nickel levels, and the remaining compounds (the major class) with relatively high cytosolic levels and nuclear nickel levels. Overall , the data supports the N i eke 1-Ion Hypothesis which suggests that the Ni 2+ ion is the active agent in nickel toxicity and mutagenicity, and that, as a first approximation, its intracellular concentration is responsible for the observed effects, irrespective of the nickel compound. / Thesis / Master of Science (MS)

O projeto de novos materiais para aplicações tecnológicas em biomateriais e bioengenharia é altamente dependente de como as células aderem à superfície de um material. A adesão e crescimento em biomateriais depende de propriedades do substrato, tais como molhabilidade da superfície, a topografia e a composição química de superfície. O objetivo deste estudo foi investigar as interações de diversos materiais com culturas celulares de células epitelial CHO (Ovário de Hamster Chinês). Os materiais utilizados foram SU-8 2005 (elétron-resiste, Microchem), PDMS (Poli (dimetil siloxano), Down Corning), DLC (Diamond-like Carbon) e vidro foi utilizado como referência. Superfícies de vidro, SU-8, PDMS e DLC lisas (planas) e isentas de modificação ou tratamento específico foram avaliadas quanto ao cultivo de células CHO. Valores médios dos fatores de forma (Ff) de 450 células foram calculados para cada uma das culturas realizadas sobre os 4 substratos. Foram obtidos Ff próximos a 0,52 para o vidro, o SU-8 liso e o DLC, demonstrando um bom espraiamento das células nessas superfícies. A superfície de PDMS apresentou valor unitário para o fator de forma (Ff), que está relacionado a um baixo espraiamento das células. A energia de superfície (ES) obtida para o PDMS é compatível com o resultado de fator de forma (Ff), uma vez que o menor valor para ES é coerente com a baixa adesão celular, o que gerou células com elevado fator de forma (Ff). O SU-8 foi modificado por implantação iônica com uma dose de 1,2x1016 átomos/cm2 e a energia de implantação foi de 8 keV, como referência foi utilizada uma superfície lisa de SU-8 sem implantação. Os resultados mostraram que o número de células vivas por unidade de área foi superior na superfície de SU-8 com prata implantada, mostrando o bom desempenho da cultura nesse substrato. As superfícies de DLC modificadas por tratamento com plasma de oxigênio (DLC-O) e com plasma de hexafluoreto de enxofre (DLC-F) foram utilizadas para cultura celular, os resultados de três experimentos independentes de contagem de número de núcleos (marcados com DAPI) por unidade de área confirmaram os resultados obtidos através do teste de viabilidade (marcados com trypan blue). A superfície de DLC-O, apresentou um maior número de núcleos por unidade de área, quando comparado à superfície DLC-F, da mesma forma que nos resultados obtidos pelo teste de viabilidade. As energias de superfície para as amostras de DLC-F e DLC-O indicaram que a superfície DLC-O é mais hidrofílica do que a superfície DLC-F, que está coerente com o que é conhecido da literatura e com os resultados obtidos em nosso trabalho. Cultura de células CHO foram realizadas em superfícies litografadas com estruturas hexagonais periódicas com o parâmetro 2R (diâmetro do círculo inscrito) sendo 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. Estas superfícies foram caracterizadas por microscopia óptica de fluorescência com relação ao número de núcleos (marcados com o fluoróforo DAPI) por unidade de área, isto é, núcleos/mm2. Obteve-se histogramas com o número médio de núcleos por mm2 em três experimentos independentes, onde o número núcleos/mm2 foi consideravelmente maior para 80 µm. As superfícies contendo cavidades periódicas de 12 µm e 30 µm apresentaram dificuldade para as células CHO aderirem à superfície. Em uma outra etapa realizou-se culturas celulares em triplicata dos substratos com as superfícies 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As células em cada uma das superfícies foram analisadas por microscopia óptica (MO) para avaliação da viabilidade celular, utilizando marcador trypan blue. Obteve-se histogramas com os valores médios para o número de células vivas/mm2 para as culturas celulares que corrobora os resultados obtidos no histograma da cultura celular que tiveram os núcleos marcados pelo fluoróforo DAPI. Assim, fica confirmado o melhor desempenho da cultura celular no substrato 80 µm que apresentou o maior número de células vivas/mm2 As micrografias obtidas através de marcação por DAPI foram analisadas através da função de correlação com intuito de se entender como as células estavam organizadas. Isso foi feito para cada uma das superfícies litografadas, 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As superfícies dos substratos 80 µm apresentaram os menores valores de distâncias para primeiros e segundos vizinhos, ou seja, as células estão mais próximas umas das outras. As demais superfícies tendem a separar mais as células. Obteve-se também os valores de raio de aglomerado (rc), distância entre os aglomerados (dc) e o número de primeiros vizinhos (Np) através do ajuste da função de correlação. A análise de correlação mostrou com clareza o que não era evidenciado apenas visualizando-se as imagens. Ela mostra que as células, mesmo em SU-8 liso tem a forte tendência de formar aglomerados de células com raio de aproximadamente 45 µm. No caso de substratos lisos, células CHO apresentaram a melhor adesão na superfície do SU-8, seguido do DLC, enquanto que o PDMS foi a pior situação, devido à baixa molhabilidade do material. No caso de superfícies com microestrutura, SU-8 contendo microcavidades hexagonais de 12 e 30 µm mostraram ser as situações mais adversas para o crescimento de células CHO, provavelmente por causa da topografia das cavidades serem de menor tamanho quando comparadas ao tamanho das células CHO. Em vez disso, SU-8, contendo microcavidades hexagonais de 80 µm foi a superfície mais favorável para o crescimento de células CHO. / The design of new materials for technological applications in biomaterials and bioengineering is highly dependent on how the cells adhere to the material surface. The cells adhesion and growth on biomaterials depends on substrate properties such as surface wettability, topography and the chemical composition. The aim of this study was to investigate the interactions of various materials with cell cultures of epithelial cells CHO (Chinese Hamster Ovary). The materials used were SU-8 2005 (electron resists, Microchem), PDMS (poly (dimethyl siloxane), Dow Corning), DLC (Diamond-like Carbon) and glass was used as reference. Unmodified and flat surfaces of glass, SU-8, PDMS and DLC were evaluated for the culture of CHO cells. Form factor (Ff) values were calculated as average of 450 cells for each of the cultures performed on the four substrates. Ff close to 0.52 was obtained for flat surfaces of glass, SU-8 and DLC, showing a good cell spreading on these surfaces. The surface of PDMS presented a form factor (Ff) near unity, which is related to low spreading cell. The surface energy (ES) obtained for the PDMS is coherent with the Ff result, since the smallest value of ES is consistent with the low cell adhesion, which resulted in cells with a high Ff. The SU-8 was modified by ion implantation using a dose of 1.2x1016 atoms/cm2 and an implantation energy of 8 keV, unmodified flat SU-8 was used as a reference. The cell culture results showed that the number of live cells per unit area was greater in the SU-8 surface implanted with silver, showing a good performance in the culture substrate. The DLC surfaces modified by plasma treatment with oxygen (DLC-O) and sulfur hexafluoride (DLC-F) were used for cell culture. The results of three independent experiments, counting the number of nuclei (marked with DAPI) per unit area, confirmed the results obtained by the viability test (marked with trypan-blue). The surface of the DLC-O had higher number of nuclei per unit area when compared to the surface of the DLC-F, similarly to the results obtained for the viability test. The surface energies of the DLC-F and DLC-O samples indicated that the DLC-O surface is more hydrophilic than the DLC-F surface, which is consistent with results obtained with our work and with the literature. CHO cell culture were performed on surfaces with periodic hexagonal structures with the diameter of inscribed circle (2R) given by 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. These surfaces were characterized by fluorescence optical microscopy with respect to the number of nuclei (marked with fluorophore DAPI) per unit area, i.e. nuclei/mm2. Histograms were obtained for the average number of nuclei per mm2 in three independent experiments, where the substrate with periodic hexagonal structures with 2R = 80 µm presented considerably higher nuclei/mm2. Surfaces containing periodic cavities of 2R =12 µm and 30 µm were adverse for CHO cells adhesion. In another approach, cell culture were analyzed by light microscopy (LM) for evaluation of cell viability using trypan-blue marker. This was carried out in triplicate cell culture on substrates with surfaces 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. Histograms were generated for average number of living cells/mm2 for each substrate, which corroborates with the results obtained for the cell culture marked with fluorophore DAPI. Thus, it is confirmed the better performance of the cell culture on substrates with 2R = 80 µm, presenting the highest number of living cells/mm2. The micrographs obtained with cells marked with DAPI were analyzed through the correlation function with the aim of understanding how the cells were organized. This was performed for each of the lithographed surfaces 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also flat SU-8. The surfaces of the substrates with 2R = 80 µm had the lowest values for length between its neighbors, that is, the cells are closer to each other. The remaining surfaces tend to separate the cells. Also were obtained the cluster radius values (rc), the distance between the clusters (dc) and the number of nearest neighbors (Np) through the correlation function fitting. The correlation analysis clearly showed what was not possible to observe by viewing the images. It shows that the cells, even in flat SU-8, have a strong tendency to form clusters of cells within about 45 micrometers. In the case of flat substrates, CHO cells exhibited better adhesion to the surface of SU-8, followed by the DLC, while the PDMS was worse due to low wettability of the material. In the case of surfaces with microstructures, SU-8 containing hexagonal microstructures of 12 and 30 µm showed to be the most adverse conditions for the CHO cell growth, probably because of the topography of the cavities being smaller in size compared to the size of CHO cells. SU-8 with 80 µm hexagonal microstructures was more favorable surface for the growth of CHO cells.

O projeto de novos materiais para aplicações tecnológicas em biomateriais e bioengenharia é altamente dependente de como as células aderem à superfície de um material. A adesão e crescimento em biomateriais depende de propriedades do substrato, tais como molhabilidade da superfície, a topografia e a composição química de superfície. O objetivo deste estudo foi investigar as interações de diversos materiais com culturas celulares de células epitelial CHO (Ovário de Hamster Chinês). Os materiais utilizados foram SU-8 2005 (elétron-resiste, Microchem), PDMS (Poli (dimetil siloxano), Down Corning), DLC (Diamond-like Carbon) e vidro foi utilizado como referência. Superfícies de vidro, SU-8, PDMS e DLC lisas (planas) e isentas de modificação ou tratamento específico foram avaliadas quanto ao cultivo de células CHO. Valores médios dos fatores de forma (Ff) de 450 células foram calculados para cada uma das culturas realizadas sobre os 4 substratos. Foram obtidos Ff próximos a 0,52 para o vidro, o SU-8 liso e o DLC, demonstrando um bom espraiamento das células nessas superfícies. A superfície de PDMS apresentou valor unitário para o fator de forma (Ff), que está relacionado a um baixo espraiamento das células. A energia de superfície (ES) obtida para o PDMS é compatível com o resultado de fator de forma (Ff), uma vez que o menor valor para ES é coerente com a baixa adesão celular, o que gerou células com elevado fator de forma (Ff). O SU-8 foi modificado por implantação iônica com uma dose de 1,2x1016 átomos/cm2 e a energia de implantação foi de 8 keV, como referência foi utilizada uma superfície lisa de SU-8 sem implantação. Os resultados mostraram que o número de células vivas por unidade de área foi superior na superfície de SU-8 com prata implantada, mostrando o bom desempenho da cultura nesse substrato. As superfícies de DLC modificadas por tratamento com plasma de oxigênio (DLC-O) e com plasma de hexafluoreto de enxofre (DLC-F) foram utilizadas para cultura celular, os resultados de três experimentos independentes de contagem de número de núcleos (marcados com DAPI) por unidade de área confirmaram os resultados obtidos através do teste de viabilidade (marcados com trypan blue). A superfície de DLC-O, apresentou um maior número de núcleos por unidade de área, quando comparado à superfície DLC-F, da mesma forma que nos resultados obtidos pelo teste de viabilidade. As energias de superfície para as amostras de DLC-F e DLC-O indicaram que a superfície DLC-O é mais hidrofílica do que a superfície DLC-F, que está coerente com o que é conhecido da literatura e com os resultados obtidos em nosso trabalho. Cultura de células CHO foram realizadas em superfícies litografadas com estruturas hexagonais periódicas com o parâmetro 2R (diâmetro do círculo inscrito) sendo 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. Estas superfícies foram caracterizadas por microscopia óptica de fluorescência com relação ao número de núcleos (marcados com o fluoróforo DAPI) por unidade de área, isto é, núcleos/mm2. Obteve-se histogramas com o número médio de núcleos por mm2 em três experimentos independentes, onde o número núcleos/mm2 foi consideravelmente maior para 80 µm. As superfícies contendo cavidades periódicas de 12 µm e 30 µm apresentaram dificuldade para as células CHO aderirem à superfície. Em uma outra etapa realizou-se culturas celulares em triplicata dos substratos com as superfícies 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As células em cada uma das superfícies foram analisadas por microscopia óptica (MO) para avaliação da viabilidade celular, utilizando marcador trypan blue. Obteve-se histogramas com os valores médios para o número de células vivas/mm2 para as culturas celulares que corrobora os resultados obtidos no histograma da cultura celular que tiveram os núcleos marcados pelo fluoróforo DAPI. Assim, fica confirmado o melhor desempenho da cultura celular no substrato 80 µm que apresentou o maior número de células vivas/mm2 As micrografias obtidas através de marcação por DAPI foram analisadas através da função de correlação com intuito de se entender como as células estavam organizadas. Isso foi feito para cada uma das superfícies litografadas, 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As superfícies dos substratos 80 µm apresentaram os menores valores de distâncias para primeiros e segundos vizinhos, ou seja, as células estão mais próximas umas das outras. As demais superfícies tendem a separar mais as células. Obteve-se também os valores de raio de aglomerado (rc), distância entre os aglomerados (dc) e o número de primeiros vizinhos (Np) através do ajuste da função de correlação. A análise de correlação mostrou com clareza o que não era evidenciado apenas visualizando-se as imagens. Ela mostra que as células, mesmo em SU-8 liso tem a forte tendência de formar aglomerados de células com raio de aproximadamente 45 µm. No caso de substratos lisos, células CHO apresentaram a melhor adesão na superfície do SU-8, seguido do DLC, enquanto que o PDMS foi a pior situação, devido à baixa molhabilidade do material. No caso de superfícies com microestrutura, SU-8 contendo microcavidades hexagonais de 12 e 30 µm mostraram ser as situações mais adversas para o crescimento de células CHO, provavelmente por causa da topografia das cavidades serem de menor tamanho quando comparadas ao tamanho das células CHO. Em vez disso, SU-8, contendo microcavidades hexagonais de 80 µm foi a superfície mais favorável para o crescimento de células CHO. / The design of new materials for technological applications in biomaterials and bioengineering is highly dependent on how the cells adhere to the material surface. The cells adhesion and growth on biomaterials depends on substrate properties such as surface wettability, topography and the chemical composition. The aim of this study was to investigate the interactions of various materials with cell cultures of epithelial cells CHO (Chinese Hamster Ovary). The materials used were SU-8 2005 (electron resists, Microchem), PDMS (poly (dimethyl siloxane), Dow Corning), DLC (Diamond-like Carbon) and glass was used as reference. Unmodified and flat surfaces of glass, SU-8, PDMS and DLC were evaluated for the culture of CHO cells. Form factor (Ff) values were calculated as average of 450 cells for each of the cultures performed on the four substrates. Ff close to 0.52 was obtained for flat surfaces of glass, SU-8 and DLC, showing a good cell spreading on these surfaces. The surface of PDMS presented a form factor (Ff) near unity, which is related to low spreading cell. The surface energy (ES) obtained for the PDMS is coherent with the Ff result, since the smallest value of ES is consistent with the low cell adhesion, which resulted in cells with a high Ff. The SU-8 was modified by ion implantation using a dose of 1.2x1016 atoms/cm2 and an implantation energy of 8 keV, unmodified flat SU-8 was used as a reference. The cell culture results showed that the number of live cells per unit area was greater in the SU-8 surface implanted with silver, showing a good performance in the culture substrate. The DLC surfaces modified by plasma treatment with oxygen (DLC-O) and sulfur hexafluoride (DLC-F) were used for cell culture. The results of three independent experiments, counting the number of nuclei (marked with DAPI) per unit area, confirmed the results obtained by the viability test (marked with trypan-blue). The surface of the DLC-O had higher number of nuclei per unit area when compared to the surface of the DLC-F, similarly to the results obtained for the viability test. The surface energies of the DLC-F and DLC-O samples indicated that the DLC-O surface is more hydrophilic than the DLC-F surface, which is consistent with results obtained with our work and with the literature. CHO cell culture were performed on surfaces with periodic hexagonal structures with the diameter of inscribed circle (2R) given by 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. These surfaces were characterized by fluorescence optical microscopy with respect to the number of nuclei (marked with fluorophore DAPI) per unit area, i.e. nuclei/mm2. Histograms were obtained for the average number of nuclei per mm2 in three independent experiments, where the substrate with periodic hexagonal structures with 2R = 80 µm presented considerably higher nuclei/mm2. Surfaces containing periodic cavities of 2R =12 µm and 30 µm were adverse for CHO cells adhesion. In another approach, cell culture were analyzed by light microscopy (LM) for evaluation of cell viability using trypan-blue marker. This was carried out in triplicate cell culture on substrates with surfaces 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also on flat SU-8. Histograms were generated for average number of living cells/mm2 for each substrate, which corroborates with the results obtained for the cell culture marked with fluorophore DAPI. Thus, it is confirmed the better performance of the cell culture on substrates with 2R = 80 µm, presenting the highest number of living cells/mm2. The micrographs obtained with cells marked with DAPI were analyzed through the correlation function with the aim of understanding how the cells were organized. This was performed for each of the lithographed surfaces 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm and also flat SU-8. The surfaces of the substrates with 2R = 80 µm had the lowest values for length between its neighbors, that is, the cells are closer to each other. The remaining surfaces tend to separate the cells. Also were obtained the cluster radius values (rc), the distance between the clusters (dc) and the number of nearest neighbors (Np) through the correlation function fitting. The correlation analysis clearly showed what was not possible to observe by viewing the images. It shows that the cells, even in flat SU-8, have a strong tendency to form clusters of cells within about 45 micrometers. In the case of flat substrates, CHO cells exhibited better adhesion to the surface of SU-8, followed by the DLC, while the PDMS was worse due to low wettability of the material. In the case of surfaces with microstructures, SU-8 containing hexagonal microstructures of 12 and 30 µm showed to be the most adverse conditions for the CHO cell growth, probably because of the topography of the cavities being smaller in size compared to the size of CHO cells. SU-8 with 80 µm hexagonal microstructures was more favorable surface for the growth of CHO cells.