Orientador: Fabio Trindade Maranhão Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T06:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_StefanieCostaPinto_M.pdf: 23177514 bytes, checksum: 4171205441f1112d18413fd5eed95ac3 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A violaceína é um pigmento violeta extraído da bactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum. Diversos trabalhos atribuíram à violaceína diferentes atividades biológicas tais como bactericida, antiviral, fungicida e antitumoral. Os efeitos da violaceína também foram observados contra protozoários patogênicos, como Leishmania sp e Trypanossoma sp. Neste trabalho, avaliamos a atividade antimalárica da violaceína in vitro e in vivo contra Plasmodium humano e murino, respectivamente. Neste sentido, a violaceína se mostrou tão eficiente quanto o quinino em eliminar P. falciparum (3D7), mas três vezes menos eficiente que a cloroquina. Além disso, não encontramos diferença na sua atividade contra formas jovens e maduras, mostrando uma atuação similar nos diferentes estágios de desenvolvimento do parasita. Os experimentos in vivo utilizando camundongos infectados com PcchAS tratados por 11 dias consecutivos (0-10) revelaram uma potente atividade desta droga, inibindo o desenvolvimento parasitário em até 86% no pico da parasitemia. Também foi encontrado 60% de inibição quando o tratamento iniciou-se 5 dias após o estabelecimento da infecção. Quando administrada em animais infectados com uma cepa murina letal (PcchAJ), a violaceína protegeu 80% dos animais, em contraste à 100% de mortalidade dos animais não tratados. A comparação do ED50 demonstrou que a violaceína é tão eficiente quanto o artesunato e 2 vezes mais ativa que a cloroquina, sob as mesmas condições de tratamento. Finalmente, animais naive tratados com a violaceína durante 11 dias consecutivos não mostraram alterações na densidade de glóbulos vermelhos e no peso. Também não foi observado nenhum dano morfológico nos cortes histológicos. Coletivamente, estes resultados demonstram claramente o potencial antimalárico da violaceína e abre perspectivas para o entendimento dos mecanismos envolvidos na inibição parasitária por este composto. / Abstract: Violacein is a violet pigment extracted from the bacteria Gram-negative Chromobacterium violaceum. Growing bodies of evidences have implicated violacein as an antimicrobial, antifungal, antitumoral, and a moderate trypanocidal and leishmanial activity has also been observed. Herein, we evaluated the anti-malarial activity of violacein against murine and human-derived Plasmodium. Indeed, violacein showed to be efficient in killing P. falciparum (3D7 strain) as much as quinine, but 3 fold less pronounced than chloroquine. Moreover, this anti-Plasmodial activity detected was direct against both young and mature stages of this human parasite. In vivo experiments in P. c. chabaudi AS (PcchAS) infected mice treated during 10 consecutive days after infection (0-10) revealed a powerful activity of this drug, by inhibiting parasite burden up to 86%. Also, 60% of inhibition was noticed when violacein was administrated 5 days after infection establishment. When administrated in mice infected with a lethal strain of murine-derived Plasmodium (PcchAJ) violacein protected 80% of these mice, in contrast to 100% of mortality reported to the non-treated animals. ED50 comparisons demonstrated that violacein was efficient as much as artesunate and twice more active than chloroquine. Finally, naïve mice inject with violacein during 10 consecutive days did not display alterations on red blood cell density; weight and neither morphological damages were noticed in spleen and liver histological sections. Collectively, these data clearly demonstrated the anti-malarial effect of violacein and open perspectives to understating the mechanisms involved in killing this parasite by this compound. / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Yes / Bacterial quorum sensing has been implicated in a number of pathogenic bacterial processes, such as biofilm formation, making it a crucial target for developing materials with a novel antibiotic mode of action. This paper describes poly(N-isopropyl acrylamide) that has been covalently linked, at multiple chain ends, to homoserine lactone to give a highly branched polymer functionalized with a key messenger molecule implicated in QS. This novel functional material has shown promising anti-QS activity in a Chromobacterium violaceum assay.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Chromobacterium violaceum à uma bactÃria Gram-negativa, saprÃfita, nÃo patogÃnica e de vida livre. A anotaÃÃo do genoma dessa espÃcie revelou muitos genes codificando produtos com potenciais aplicaÃÃes em diversas Ãreas. Dentre esses produtos estÃo vÃrias quitinases, enzimas capazes de degradar quitina, um polissacarÃdeo de N-acetil-β-D-glucosamina presente na parede celular de muitos fungos e no exoesqueleto de insetos e crustÃceos. As quitinases sÃo de grande interesse biotecnolÃgico, podendo ser utilizadas para converter quitina em derivados Ãteis, e tambÃm para o controle de fungos e insetos que causam danos em culturas agrÃcolas. O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterizaÃÃo bioquÃmica, estrutural e biolÃgica de uma quitinase recombinante (CV1897), da famÃlia 19 das glicosil hidrolases, de C. violaceum ATCC 12472. A sequÃncia completa da ORF CV1897 (codificando CV1897PS+, com o peptÃdeo sinal nativo) foi amplificada por reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR) e clonada nos vetores pET302/NT-His e pPICZαA para expressÃo em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A sequÃncia parcial da ORF (rCV1897PS-, sem o peptÃdeo sinal nativo) foi expressa apenas em P. pastoris. Em E. coli, a rCV1897PS+ foi produzida principalmente em corpos de inclusÃo, de forma insolÃvel e inativa. Em P. pastoris, as proteÃnas (rCV1897PS+ e rCV1897PS-) foram secretadas para o meio de cultura de forma solÃvel e funcional. As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade em nÃquel imobilizado, com rendimentos de 1,8 mg/L (rCV1897PS+) e 2,1 mg/L (rCV1897PS-), sendo detectadas por eletroforese em gel de poliacrilamida na presenÃa de SDS (SDS-PAGE) como duas isoformas com massas moleculares diferentes (43,2 kDa e 51,4 kDa; 44 e 50 kDa, respectivamente). A quitinase recombinante (CV1897PS+) mostrou atividade Ãtima em Ph 5,0 e foi ativa quando tratada a temperaturas de atà 40 ÂC por 30 min. A Rcv1897 apresentou atividade quitinÃsica frente a quitina coloidal e glicol-quitina (em gel SDS-PAGE). Os espectros de dicroÃsmo circular revelaram que a estrutura da proteÃna possui predominantemente estrutura secundÃria do tipo α-hÃlice (37%), com 26% de fitas-β e 38% de estrutura desordenada. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna foi produzida na sua conformaÃÃo enovelada. A rCV1897PS+ inibiu a germinaÃÃo de conÃdios e o crescimento micelial dos fungos fitopatogÃnicos Penicillium herquei e Colletotrichum lindemuthianum. As quitinases rCV1897PS+ e rCV1897PS- em associaÃÃo com o fluconazol atuaram de forma sinÃrgica contra diferentes cepas da levedura patogÃnica Candida tropicalis. Os estudos bioquÃmicos, estruturais e biolÃgicos da rCV1897 poderÃo ser Ãteis para aplicaÃÃo biotecnolÃgica dessa enzima. / Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, saprophytic, non-pathogenic and free living bacterium. The annotation of the genome of this species revealed many genes encoding products with potential applications in many areas. Among these products are several chitinases, which are enzymes capable of degrading chitin, a polysaccharide of N-acetyl-β-D-glucosamine. Chitin is found in the cell wall of many fungi and in the exoskeleton of insects and crustaceans. Chitinases are of great biotechnological interest because these enzymes can be used to produce useful derivatives from chitin, and also to be exploited for the control of fungi and insects that cause damages in crops. This study aimed to carry out the biochemical, biological and structural characterization of a recombinant chitinase (CV1897) belonging to family GH19 from C. violaceum ATCC 12472. The complete sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP+, with the native signal peptide) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vectors pET302/NT-His and pPICZαA, for expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. The partial sequence of the ORF CV1897 (encoding CV1897SP-, without the native signal peptide) was expressed only in P. pastoris. In E. coli the rCV1897SP+ was mainly produced as insoluble inclusion bodies. In P. pastoris, the two versions of the protein (rCV1897PS+ and rCV1897PS-) were secreted into the culture medium, in their soluble and functional form. The enzymes were purified by affinity chromatography on immobilized nickel ions, with yields of 1.8 mg/L (rCV1897PS+) and 2.1 mg/L (rCV1897PS-), being detected by electrophoresis as two isoforms with different molecular weights. The recombinant chitinase (rCV1897PS+) showed optimal hydrolytic activity at pH 5.0 and was active after treatement at temperatures up to 40 ÂC for 30 min. The rCV1897 showed chitinolytic activity against colloidal chitin and glycol-chitin on SDS-PAGE. Circular dichroism spectra showed that the protein has predominantly α-helical arrangements (37%), also having 26% of β-strands and 38% disordered structure. The fluorescence spectra revealed that the protein was produced in their folded conformation. The rCV1897PS+ inhibited the conidial germination and mycelial growth of the phytopathogenic fungi Penicillium herquei and Colletotrichum lindemuthianum. Both rCV1897PS+ and rCV1897PS- in combination with fluconazole acted synergistically against different strains of the human pathogenic yeast Candida tropicalis. The biochemical, structural and biological studies of rCV1897 may be useful for biotechnological application of this enzyme.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2008 / Made available in DSpace on 2012-10-24T02:59:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 275389.pdf: 3136937 bytes, checksum: 8db60fa4cf0a2a81b42e9d06190468e5 (MD5) / Este trabalho teve por objetivo a obtenção de poli-hidroxialcanoatos (PHAs) biossintetizados por Chromobacterium violaceum, em diferentes condições de escala, concentração e variação de substrato, nutrientes limitantes e pH. Embora a produção de PHAs por C. violaceum tenha sido um dos motivos pelos quais este microrganismo tenha tido seu genoma completamente sequenciado por um consórcio envolvendo grupos de pesquisa de todo o país, não se tem conhecimento de nenhum estudo sistemático da produção desses poliésteres em escalas de laboratório e de bancada. As propriedades dos biopolímeros produzidos são consequência da sua composição molecular, que pode ser influenciada pelas condições de operação, assim como do(s) substrato(s) utilizado(s). Em particular, o grau de copolimerização é um parâmetro que pode interferir diretamente no tipo de aplicação do PHA produzido. Como a C. violaceum é capaz de produzir o homopolímero de poli-hidroxivalerato (PHV) e copolímeros PHBV, que incorporam unidades de 3-hidroxibutirato (3HB), isto é, P(3HB-co-3HV), este estudo concentrou seus esforços na obtenção de diferentes graus de incorporação de unidades de valerato no copolímero, visando características desejáveis para novas aplicações comerciais. Foram estudados os copolímeros de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) produzidos por C. violaceum em agitador orbital de laboratório e biorreator de 4 litros, a 30°C sob limitação de nitrogênio ou de fósforo, utilizando diferentes pH (6 e 7), concentrações de glicose (10, 20 e 30 g l-1) e concentração de propionato (0 e 10 mM). Os resultados demonstraram que a concentração de substrato, o pH e a adição de propionato afetam a quantidade total dos PHAs produzidos. Um acúmulo de 70% (g.g-1) foi obtido sob limitação de nitrogênio em agitador orbital a pH 7, 10 g l-1 de glicose e sem adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato aumentou a incorporação de unidades de valerato, mas diminuiu a quantidade de biomassa produzida. O controle do pH e da aeração nas condições de cultivo utilizando o biorreator aumentou a quantidade de biomassa formada, alcançando um máximo de 6,54 g l-1 sob limitação de fósforo, em pH 7, 20 g l-1 de glicose, sem a adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato às culturas realizadas em biorreator, contudo, não aumentou a incorporação de 3HV ao copolímero obtido, sugerindo que o controle do pH tem influência sobre a composição do PHBV acumulado. A caracterização dos polímeros extraídos dos cultivos em biorreator demonstrou que a incorporação de unidades de valerato ao polímero diminuiu a temperatura de fusão do material em relação ao PHB puro, ficando entre 174 e 178°C. A temperatura máxima de degradação do polímero também foi influenciada pelo percentual de unidades de valerato, ficando entre 302 e 312°C, cerca de 30°C acima da temperatura de degradação do PHB puro (278°C). A pureza dos copolímeros extraídos foi superior a 95%. As características físico-químicas analisadas destes biopolímeros (temperaturas de fusão, transição vítrea, degradação inicial, degradação total, grupos funcionais, incorporação de violaceína no biopolímero, diâmetro de poros das membranas formadas) sugerem que esses materiais podem ser utilizados para o desenvolvimento de novas aplicações nas áreas biotecnológica e biomédica como, por exemplo, na produção de novos arcabouços de engenharia de tecidos.Este trabalho teve por objetivo a obtenção de poli-hidroxialcanoatos (PHAs) biossintetizados por Chromobacterium violaceum, em diferentes condições de escala, concentração e variação de substrato, nutrientes limitantes e pH. Embora a produção de PHAs por C. violaceum tenha sido um dos motivos pelos quais este microrganismo tenha tido seu genoma completamente sequenciado por um consórcio envolvendo grupos de pesquisa de todo o país, não se tem conhecimento de nenhum estudo sistemático da produção desses poliésteres em escalas de laboratório e de bancada. As propriedades dos biopolímeros produzidos são consequência da sua composição molecular, que pode ser influenciada pelas condições de operação, assim como do(s) substrato(s) utilizado(s). Em particular, o grau de copolimerização é um parâmetro que pode interferir diretamente no tipo de aplicação do PHA produzido. Como a C. violaceum é capaz de produzir o homopolímero de poli-hidroxivalerato (PHV) e copolímeros PHBV, que incorporam unidades de 3-hidroxibutirato (3HB), isto é, P(3HB-co-3HV), este estudo concentrou seus esforços na obtenção de diferentes graus de incorporação de unidades de valerato no copolímero, visando características desejáveis para novas aplicações comerciais. Foram estudados os copolímeros de 3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato (PHBV) produzidos por C. violaceum em agitador orbital de laboratório e biorreator de 4 litros, a 30°C sob limitação de nitrogênio ou de fósforo, utilizando diferentes pH (6 e 7), concentrações de glicose (10, 20 e 30 g l-1) e concentração de propionato (0 e 10 mM). Os resultados demonstraram que a concentração de substrato, o pH e a adição de propionato afetam a quantidade total dos PHAs produzidos. Um acúmulo de 70% (g.g-1) foi obtido sob limitação de nitrogênio em agitador orbital a pH 7, 10 g l-1 de glicose e sem adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato aumentou a incorporação de unidades de valerato, mas diminuiu a quantidade de biomassa produzida. O controle do pH e da aeração nas condições de cultivo utilizando o biorreator aumentou a quantidade de biomassa formada, alcançando um máximo de 6,54 g l-1 sob limitação de fósforo, em pH 7, 20 g l-1 de glicose, sem a adição de propionato. A adição de 10 mM de propionato às culturas realizadas em biorreator, contudo, não aumentou a incorporação de 3HV ao copolímero obtido, sugerindo que o controle do pH tem influência sobre a composição do PHBV acumulado. A caracterização dos polímeros extraídos dos cultivos em biorreator demonstrou que a incorporação de unidades de valerato ao polímero diminuiu a temperatura de fusão do material em relação ao PHB puro, ficando entre 174 e 178°C. A temperatura máxima de degradação do polímero também foi influenciada pelo percentual de unidades de valerato, ficando entre 302 e 312°C, cerca de 30°C acima da temperatura de degradação do PHB puro (278°C). A pureza dos copolímeros extraídos foi superior a 95%. As características físico-químicas analisadas destes biopolímeros (temperaturas de fusão, transição vítrea, degradação inicial, degradação total, grupos funcionais, incorporação de violaceína no biopolímero, diâmetro de poros das membranas formadas) sugerem que esses materiais podem ser utilizados para o desenvolvimento de novas aplicações nas áreas biotecnológica e biomédica como, por exemplo, na produção de novos arcabouços de engenharia de tecidos.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:37:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 303348.pdf: 1152772 bytes, checksum: a3e38c1e81994d268ca4f9b7b93e6cae (MD5) / Os PHAS são um grupo de poliésteres acumulados sob a forma de grânulos intracelulares por inúmeras bactérias, como reserva de carbono e energia. Entre os PHAs mais estudados estão os polímeros de cadeia curta PHB e P(3HB-co-3HV). O conhecimento das vias bioquímicas e enzimas envolvidas na biossíntese e degradação dos PHAs podem auxiliar na implementação de estratégias para sua produção industrial a partir de substratos renováveis e de baixo custo. Isolados de Escherichia coli recombinante contendo os genes de biossíntese de PHAs são capazes de acumular até 90 % (m/m) de biomassa seca de biopolímero. Este trabalho teve como objetivo geral a produção de PHA por Escherichia coli recombinante contendo a PHA sintase de Chromobacterium violaceum e Cupriavdus necator, em presença de soro de queijo. Neste estudo, foi avaliada a capacidade de produção de PHA por três isolados de E. coli (DH5?, JM101 e DH10B), a especificidade da enzima PHA sintase de C. violaceum em E. coli recombinante na produção de P(3HB-co-3HV) em presença de ácido propiônico e a composição do meio de cultivo, através de técnica de planejamento experimental (DCCR), onde as variáveis de estudo foram a quantidade de soro de queijo e concentração de glicose na produção de PHA, concentração de ácido propiônico na incorporação de unidades de valerato e o efeito da adição de IPTG como indutor de expressão gênica. Os resultados mostraram comportamento diferenciado da PHA sintase de C. violaceum para cada um dos isolados de E. coli estudadas sobre a produção de PHB. A PHA sintase de C. violaceum quando inserida em E. coli e em presença de ácido propiônico é capaz de incorporar 8,83 mol % de unidades de 3HV. Uma produção de PHA igual a 0,43 g de MCS.L-1 foi observada, em meio contendo 37 % (v/v) de soro de queijo, 2 g.L-1 de glicose, 4 mmol.L-1 de ácido propiônico na ausência de IPTG. Conclui-se que é possível produzir PHA a partir de isolados JM101 de E. coli contendo os genes da PHA sintase de C. violaceum a partir de soro de queijo, na presença ou ausência de indutor (IPTG). / The PHAS is a group of polyesters accumulated in the form of intracellular granules by many bacteria as carbon and energy reserves. Among the most studied PHAs are the short-chain polymers PHB and P (3HB-co-3HV). The information of biochemical pathways and enzymes involved in biosynthesis and degradation of PHAs can support in the strategies implementation for industrial production across renewable and low cost substrates. Recombinant strains of Escherichia coli containing the genes of the PHAs biosynthesis, are able to accumulate up 90% (w/w) of dry biomass biopolymer. This study aimed at the production of PHA by recombinant E. coli containing the Chromobacterium violaceum and Cupriavidus necator PHA synthase in the presence of cheese whey. This study evaluated the capacity to production of PHA by three strains of E. coli (DH5á, DH10B and JM101), the specificity of the enzyme PHA synthase of C. violaceum in E. coli recombinant in the production of P (3HB-co-3HV) in presence of propionic acid and the composition of the culture media, through experimental planning technique (DCCR), where the variables were the amount of cheese whey and concentration of glucose in the production of PHA, propionic acid concentration on the incorporation of valerate units and the effect of the added IPTG to induce gene expression. The results showed different behavior of the PHA synthase of C. violaceum for each strains of E. coli studied on the production of PHB. The PHA synthase of C. violaceum when inserted into E. coli and in the presence of propionic acid is able to incorporate valerate units. (8.83 mol% of 3HV units). A production of PHA (0.43 gCDW.L-1) was observed in medium containing 37% (v/v of cheese whey, 2 g.L-1 glucose, 4 mmol.L-1 propionic acid and absence of IPTG. Concluded that it is possible to production of PHA across strains of E. coli recombinant containing the PHA synthase of C. violaceum.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2013-07-15T22:37:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 222131.pdf: 1388356 bytes, checksum: ec3e45feb5317df995c748f9a8eb33f4 (MD5) / Uma classe de polímeros bacterianos que se destaca pela proximidade de suas características com as de plásticos de origem petroquímica são os polihidroxialcanoatos (PHA's). PHA sintases são enzimas chave para a biossíntese destes polímeros. A PHA sintase de Chromobacterium violaceum, que é do tipo I, utiliza como substrato hidroxiacil-CoA (HA-CoA) de 3 a 5 carbonos, enquanto a PHA sintase do tipo II de Pseudomonas aeruginosa, utiliza HA-CoA contendo de 6 a 14 carbonos. Com o objetivo de modificar a especificidade da PHA sintase de C. violaceum, buscou-se determinar sítios específicos para mutação, por técnica de DNA recombinante, de maneira a torná-la capaz da biossíntese de copolímeros contendo HA's de cadeia curta e média. O conhecimento da estrutura terciária, e particularmente, do sítio ativo da proteína, é uma etapa importante para o estudo de possibilidades de mudança de sua especificidade. Com base neste propósito, o modelo teórico para a PHA sintase de C. violaceum foi obtido através das técnicas de modelagem por homologia, utilizando-se uma lipase gástrica humana como referência (Depositada no PDB, Protein Data Bank, com o código de acesso 1HLG). O modelo foi desenvolvido baseado no alinhamento entre as seqüências primárias da PHA sintase de C. violaceum e P. aeruginosa, e a lipase, e validado através do gráfico de Ramachandran, apresentando 94% e 96% dos resíduos modelados com ângulos espacialmente possíveis, respectivamente para C. violaceum e P. aeruginosa. A estrutura 3D resultante apresenta uma díade catalítica composta pelos aminoácidos C292 e H478. O aminoácido D448, proposto como uma base geral catalítica que ativa o grupamento 3-hidroxil do HB-CoA para formar o intermediário tioéster pode, na verdade, ter o papel de auxiliar no transporte do substrato e na estabilização do estado de transição. Não foi possível confirmar que este faz parte de uma tríade catalítica, conforme sugerido na literatura. Os resultados obtidos pela modelagem da estrutura serviram de base para a escolha de mutações sítio-específicas, testadas neste trabalho. O gene phaCCv do genoma da C. violaceum (ATCC12472) foi amplificado por PCR, utilizando-se um par de oligonucleotídios complementares às extremidades 3' e 5' do gene phaC contendo sítios de restrições apropriados à ligação ao vetor. O plasmídio pBHR69 continha, além do gene de resistência à ampicilina, os genes phaA e phaB, codificando para a b-cetotiolase e acetoacil-CoA redutase de R. eutropha, respectivamente. O produto de PCR foi purificado e ligado ao pBHR69 previamente digerido com SmaI/BamHI; uma alíquota da reação de ligação foi utilizada para transformar as células competentes DHa5TM-TR. Os transformantes foram selecionados através da utilização de meio agar LB contendo ampicilina. A sintase de C. violaceum clonada e expressa em E. coli produziu PHB, e a diferença na produção de PHB pela PHA sintase não mutada e nos mutantes sugere uma possível mudança na afinidade enzima-substrato.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 222778.pdf: 2018552 bytes, checksum: 791791fc4e4bd5e0be25e93e2147d9f2 (MD5) / Estudou-se o efeito da adição de suplementos (acetato e ácido oléico) ou inibidor do metabolismo do propionato (itaconato), visando estabelecer condições nas quais a houvesse maior incorporação de unidades de 3HV, ao copolímero. A quantificação e caracterização dos polímeros foram feitas por cromatografia gasosa. Os resultados obtidos mostraram que sob limitação de fosfato, na presença de glicose e propionato 15 mM, ocorreu a maior incorporação de unidades de 3HV ao copolímero. Nestas condições, observou-se uma produção de 33,6% de P[3HB-co-3HV] na biomassa (0,086 g. L-1), contendo 18,3 mol% de 3HV. Em condições similares, porém sob limitação de nitrogênio, obteve-se uma produção de 31,6% de P[3HB-co-3HV] na biomassa (0,25 g. L-1), contendo apenas 3,6 mol% de 3HV. A suplementação da cultura, com extrato de levedura, sob limitação de fosfato, na presença de propionato 10 mM aumentou a produção de biomassa (0,16 g. L-1), porém, teve efeito negativo sob a incorporação de 3HV ao copolímero. C. violaceum é capaz de produzir P[3HB-co3HV], mesmo sem adição de um precursor de 3HV, provavelmente a partir de intermediários do metabolismo de aminoácidos. Tanto a suplementação com acetato, quanto com itaconato e ácido oléico, não incrementaram a incorporação de 3HV ao copolímero. Os pHs das culturas, ao final dos cultivos, atingiram valores iguais a 6,0 e 5,0, sob limitação de nitrogênio e fosfato, respectivamente, sugerindo que o decréscimo do efeito tamponante do fosfato, seja responsável pela inibição do crescimento celular, sob limitação do fosfato. Através deste estudo, foram definidas condições de cultivo para C. violaceum que permitiram a produção de copolímero com elevado percentual molar de 3HV, o que confere ao polímero características bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5244_1.pdf: 1285875 bytes, checksum: 5de402e10c4ec2c9f263508fa2280a1d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos foram realizados com treze linhagens de Chromobacterium violaceum avaliando as características bioquímicas, a variabilidade genética e a produção de polihidroxialcanoato. Os isolados demonstraram maior crescimento no meio Luria Bertani, suplementado com glicose. Todos os isolados foram negativos para os testes de uréia, manitol, lactose e indol, e positivos para frutose, lisina, sacarose, glicose, catalase, gelatinase, motilidade e oxidase. Todas as linhagens demonstraram resistência aos antimicrobianos ampicilina e cefalotina. Observouse ainda, resistência para gentamicina e amicacina (UCP 1035-Ceará) e para imipenen, cloranfenicol e amicacina (UCP 1489-Pernambuco), evidenciando características fenotípicas distintas entre as treze linhagens. A variabilidade genética das linhagens de C. violaceum foi avaliada pelo índice de similaridade de Jaccard, utilizando-se o método UPGMA nas análises de agrupamento. Os índices de similaridade variaram de 0,17 a 0,35 para onze isolados, enquanto que, os isolados UCP 1462 e UCP 1463 apresentaram 100% de similaridade. O perfil de RAPD foi característico para cada linhagem, permitindo a formação de dois grupos indicando a variabilidade genética dos isolados analisados. A detecção da produção de polihidroxialcanoato foi realizada utilizando os corantes Nilo blue e verde malaquita, destacando-se a linhagem de C. violaceum UCP 1467, como maior produtora do biopolímero

Chromobacterium violaceum tem sido muito estudada a fim de explorar seu potencial biotecnológico, especialmente, a violaceína. Este trabalho teve por objetivo estabelecer estratégias para obtenção de mutantes. Linhagens mutantes foram obtidas por transposição com o mini-Tn5 e por recombinação homóloga (mutantes vioB e ubiB). O vioB em fase estacionária demonstrou ser mais resistente a UVC e aos sais metálicos FeCl2 e CdCl2. Com H2O2 não houve uma diferença significativa entre as taxas de sobrevivência exibidas pela linhagem vioB. Análise por microscopia demonstrou maior agregação das células do mutante vioB e uma maior formação de biofilme. O mutante ubiB apresentou crescimento deficiente na presença de 0.4 mg/mL de fenol. / Chromobacterium violaceum has been extensively studied for its biotechnological potential, especially what concerns violacein. In this work we have as goal to establish strategies for obtaining mutant strains. Mutant strains were obtained by transposition using mini-Tn5 and employing homologous recombination (mutant vioB and ubiB). vioB was shown to be more resistant in stationary phase to UVC and the metallic salts FeCl2 and CdCl2. With H2O2, there was no significant difference in survival rates exhibited by vioB. Microscopy analyses demonstrated a higher cell aggregation by the vioB mutant and a higher formation of biofilm. ubiB mutant presented growth defects in presence 0.4 mg/mL phenol.

Chromobacterium violaceum tem sido muito estudada a fim de explorar seu potencial biotecnológico, especialmente, a violaceína. Este trabalho teve por objetivo estabelecer estratégias para obtenção de mutantes. Linhagens mutantes foram obtidas por transposição com o mini-Tn5 e por recombinação homóloga (mutantes vioB e ubiB). O vioB em fase estacionária demonstrou ser mais resistente a UVC e aos sais metálicos FeCl2 e CdCl2. Com H2O2 não houve uma diferença significativa entre as taxas de sobrevivência exibidas pela linhagem vioB. Análise por microscopia demonstrou maior agregação das células do mutante vioB e uma maior formação de biofilme. O mutante ubiB apresentou crescimento deficiente na presença de 0.4 mg/mL de fenol. / Chromobacterium violaceum has been extensively studied for its biotechnological potential, especially what concerns violacein. In this work we have as goal to establish strategies for obtaining mutant strains. Mutant strains were obtained by transposition using mini-Tn5 and employing homologous recombination (mutant vioB and ubiB). vioB was shown to be more resistant in stationary phase to UVC and the metallic salts FeCl2 and CdCl2. With H2O2, there was no significant difference in survival rates exhibited by vioB. Microscopy analyses demonstrated a higher cell aggregation by the vioB mutant and a higher formation of biofilm. ubiB mutant presented growth defects in presence 0.4 mg/mL phenol.