La incidència de reaccions al·lèrgiques espontànies en el gos, com per exemple la dermatitis atòpica, sembla anar en augment. Malgrat que la gestió d’aquest tipus de malalties combina diverses estratègies depenent de l’etiologia particular de cada una, l’aproximació terapèutica més estesa és l’ús de glucocorticoides, que pot conduir a una gran varietat d’efectes adversos, especialment en tractaments crònics. Per tant, és important el desenvolupament de noves teràpies pel control eficaç de processos al·lèrgics i inflamatoris associats amb un gran número de malalties cutànies en el gos. En aquest sentit, estudis recents han mostrat l’existència de nous mediadors endògens lipídics (endocannabinodes) amb propietats antiinflamatòries i analgèsiques, com per exemple la palmitoiletanolamida (PEA). La PEA i el seu anàleg sintètic adelmidrol pertanyen a un grup d’amides d’àcids grassos anomenats aliamides, que són capaces d’actuar a través de la regulació negativa de la degranulació dels mastòcits (MCs). Malgrat que és ben coneguda la seva eficàcia farmacològica en malalties inflamatòries de la pell, el mecanisme d’acció d’aquesta família de compostos encara no estat del tot clar. Per entendre millor els efectes cel·lulars de les aliamides en els gossos, es van incubar mastòcits canins recent aïllats de biòpsies de pell amb sèrum ric en IgE i es van estimular amb anti-IgE canina. L’alliberació d’histamina, prostaglandina D2 (PGD2) i factor de necrosi tumoral alfa (TNFα) es va mesurar en presència i absència de concentracions creixents de PEA. Els resultats van mostrar una inhibició significativa de l’alliberació d’histamina, PGD2 i TNFα en presència de PEA, mostrant la capacitat d’aquesta aliamida per regular negativament l’activació dels MCs cutanis canins. Un cop observats els efectes de la PEA sobre els MCs, l’objectiu va ser la seva eficàcia sobre la reacció inflamatòria al·lèrgica cutània induïda en gossos hipersensibles a Ascaris suum. Per això es van induir la formació de pàpules a la pell dels gossos a través d’injeccions intradèrmiques d'extracte d'Ascaris, substància P i anti-IgE canina, abans i després de l’administració oral d’una única dosi de PEA de 3, 10 i 30 mg/kg. Els resultats van mostrar una reducció significativa en les àrees de la pàpules induïdes tant per antigen com per anti-IgE canina després de l’administració de PEA per les dues dosis més altes. Finalment, es va avaluar l'eficàcia del tractament tòpic amb adelmidrol (2%) durant 8 dies consecutius en les respostes inflamatòries primerenques i tardanes induïdes en gossos hipersensibles a Ascaris. Per això, es van induir la formació de pàpules a través de repetides injeccions intradèrmiques d'extracte d'antigen i es van obtenir dues biòpsies dels punts d’injecció per cada gos (tractament amb adelmidrol i tractament amb vehicle). Els resultats van mostrar una reducció significativa en les àrees de les pàpules induïdes per antigen al quart i setè dia de tractament amb adelmidrol, mentre que no es va observar cap efecte amb el tractament de vehicle. A més, es va avaluar el reclutament cel·lular de les biòpsies obtingudes després de 8 dies de tractament amb adelmdrol i vehicle. Els resultats van revelar una reducció significativa del número de mastòcits amb el tractament amb adelmidrol en comparació amb el tractament amb vehicle. Per tant, els nostres resultats van mostrar que els efectes antiinflamatoris de la PEA i adelmidrol observats en els gossos poden ser degut, almenys en part, a la seva capacitat per inhibir l'alliberament dels mediadors mastocitaris preformats i de nova síntesi, i reduir el nombre de MCs. En conclusió, la PEA i adelmidrol podrien constituir una nova estratègia terapèutica per al tractament de malalties al·lèrgiques inflamatòries de la pell en els animals de companyia. / The incidence of spontaneous allergic reactions in dogs, e.g. atopic dermatitis, appears to be increasing. Although management of this kind of diseases combines different interventions depending on the particular aetiology, the most widespread therapeutic approach still relies on glucocorticoids, which can lead to a variety of adverse effects, especially with chronic treatments. Therefore, it is important to develop new effective therapies for controlling allergic and inflammatory processes associated with a number of skin diseases in the dog. In this sense, recent studies have shown the existence of new endogenous lipid mediators (endocannabinoids) with anti-inflammatory and analgesic properties, e.g. palmitoylethanolamide (PEA). PEA and its synthetic analogue adelmidrol belong to a group of fatty acid amides called aliamides which are able to act through the downregulation of mast cell (MC) degranulation. Although its pharmacological efficacy is well known in skin inflammatory diseases, the mechanism of action of this family of compounds is still unclear. To better understand the cellular effects of aliamides in dogs, canine mast cells freshly isolated from skin biopsies were incubated with IgE-rich serum and were challenged with anti-canine IgE. Histamine, prostaglandin D2 (PGD2) and tumour necrosis factor-alpha (TNFα) release was measured in the presence and absence of increasing concentrations of PEA. The results showed a significant inhibition of histamine, PGD2 and TNFα release in the presence of PEA, showing the ability of this aliamide to down-modulate skin MC activation. Once observed PEA effects in canine MCs, the objective was to evaluate its efficacy on the cutaneous allergic inflammatory reaction induced in hypersensitive Ascaris suum dogs. Therefore, the formation of wheals was induced in dogs skin by intradermal injections of Ascaris extract, substance P and anti-canine IgE, before and after a single oral administration of PEA at doses of 3, 10 and 30 mg/kg. The results showed a significant reduction in wheal area induced by both antigen and anti-canine IgE challenge after PEA administration at two higher doses. Finally, the efficacy of topical adelmidrol treatment during 8 consecutive days was evaluated on induced early and late inflammatory responses in Ascaris hypersensitive dogs. Therefore, the formation of wheals was performed by repeated intradermal injections of antigen extract and two biopsies per dog were obtained from injection points (adelmidrol-treatment and vehicle-treatment). The results showed a significant reduction in the antigen-induced wheal areas after 4 and 7 days of adelmidrol treatment, whereas no effects were observed with vehicle treatment. Moreover, the cellular recruitment were analysed in biopsies obtained after 8 consecutive days of topical adelmidrol or vehicle treatment. The results revealed a significant decrease of mast cell number with adelmidrol treatment in comparison with vehicle treatment. Therefore, our findings showed that the anti-inflammatory effects of PEA and adelmidrol observed in dogs could be due, at least in part, to its ability to inhibit the release of both preformed and newly synthesised MCs mediators and to reduce the MCs cell numbers. In conclusion, PEA and adelmidrol might constitute a new therapeutic strategy for the treatment of allergic inflammatory skin diseases in companion animals.

El objetivo general de esta tesis consistió en el estudio, in vitro (baño de órganos y microelectrodos), de la fisiología del cuerpo esofágico (EB) y del esfínter esofágico inferior (LES) con tejido de dos especies, humana y porcina. Permitiendo: Estudiar los neurotransmisores y mecanismos que controlan las respuestas inducidas por la estimulación de las motoneuronas (MNs) inhibitorias y excitatorias del plexo mientérico (MP) en el esófago (LES y EB) humano y animal. El modelo porcino está considerado como un modelo animal homólogo, ya que ambas especies tienen muchas similitudes tanto funcionales como estructurales respecto al tracto gastrointestinal. El objetivo del primer estudio, fue evaluar el efecto de la estimulación selectiva de las MNs inhibitorias y excitatorias en el LES porcino a través de los receptores nAChRs, 5-HT3 y P2X. Se estudiaron tiras de LES circular, de cerdos adultos, en baño de órganos. Se compararon los efectos de la estimulación de las MNs mediante estimulación eléctrica de campo (EFS:26V, 0.3-20Hz); nicotina (1-300μΜ); 5-HT y 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) y α,β-meATP (1-100μΜ) en tres soluciones: Krebs estándar, solución no-adrenérgica no-nitrérgica no-purinérgica (NANNNP) y solución no-adrenérgica no-colinérgica (NANC). Los resultados sugieren mecanismos selectivos para estimular las vías motoras inhibitoria y excitatoria en el LES porcino. Las MNs inhibitorias se estimulan intensamente mediante los receptores nAChRs y no responden a la estimulación de los receptores 5-HT3 y P2X. Por contra, las MNs excitatorias se estimulan a través de los receptores 5-HT3 y P2X, la estimulación a través de los nAChRs es difícil causando una respuesta débil. El objetivo del segundo estudio, fue explorar los mecanismos mientéricos de control de la motilidad esofágica humana y el efecto de los neurotransmisores nitrérgicos y no-nitrérgicos, mediante tiras esofágicas circulares en baño de órganos y microelectrodos. Se compararon las respuestas obtenidas tras la EFS de las MNs entéricas ó a través de los receptores nAChRs en el cuerpo esofágico (EB) y en las regiones clasp y sling del LES. Los resultados muestran una especialización regional en la estimulación de las MNs entéricas en el esófago humano, con respuestas inhibitorias más intensas en las fibras clasp del LES y respuestas excitatorias colinérgicas más intensas en el EB. Las respuestas inhibitorias están desencadenadas principalmente por las MNs entéricas nitrérgicas que median los potenciales postunión inhibitorios (IJP) en el LES y en el EB, la relajación-on inducida por EFS en las zonas clasp y sling del LES y la latencia en el EB. También se encontró un papel menor para las purinas (a través de receptores P2Y1) y el VIP mediando parte de la relajación no-nitrérgica en la zona clasp del LES. El objetivo del tercer estudio, fue caracterizar los neurotransmisores implicados en el origen y modulación de las contracciones del músculo liso circular del EB porcino. Se estudiaron las respuestas al EFS de las MNs de las tiras de EB en baño de órganos y microelectrodos. Se caracterizó el efecto de los antagonistas de los neurotransmisores inhibitorios (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) y excitatorios (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) y gangliónicos (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM). Los resultados sugieren que el timing (latencia) y amplitud de las contracciones esofágicas están determinadas por un equilibrio de interacciones complejas entre las MNs inhibitorias y excitatorias. La latencia depende de la activación de las MNs inhibitorias liberando NO y una contribución purinérgica menor a través de receptores P2Y1, y de las MNs excitatorias liberando ACh. La amplitud depende de una contribución principal de las MNs excitatorias liberando ACh y taquiquininas, y también de las MNs inhibitorias liberando NO, ATP o una purina relacionada y neurotransmisores peptidérgicos actuando como fuertes moduladores de la transmisión neuroefectora excitatoria. / The aim of this Doctoral Thesis was to study, in vitro, the physiology of the esophageal body (EB) and the lower esophageal sphincter (LES) with tissue from human and porcine species. To do these we used organ baths and microelectrodes, which have allowed us: To study both the neurotransmitters and the mechanisms that control the responses induced by stimulation of inhibitory and excitatory motorneurons (MNs) of the myenteric plexus (MP) in the human and animal esophagus (LES and EB). The porcine model is considered as a homologous animal model to human, as both species have many functional and structural similarities regarding the gastrointestinal tract. The aim of the first study was to assess the effect of selective stimulation of inhibitory and excitatory MNs in porcine LES through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), 5-HT3 and P2X receptors. Circular LES strips from adult pigs were studied in organ baths. We compared the effects of stimulation of MNs by electrical field stimulation (EFS: 26V, 0.3-20Hz); nicotine (1-300μΜ; 5-HT and 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) and α,β-meATP (1-100μΜ) in standard Krebs solution, a non-adrenergic non-nitrergic non-purinergic (NANNNP) solution and a non-adrenergic non-cholinergic (NANC) solution. Our results suggest selective mechanisms for stimulation of intrinsic excitatory and inhibitory motor pathways in porcine LES. Inhibitory MNs are strongly stimulated by nAChRs and do not respond to stimulation of 5-HT3 and P2X receptors. By contrast, excitatory MNs are stimulated through 5-HT3 and P2X receptors, stimulation through nAChRs being difficult and causing a weak response. The aim of the second study was to explore the myenteric mechanisms of control of human esophageal motility and the effect of nitrergic and nonnitrergic neurotransmitters. Human circular esophageal strips were studied in organ baths and with microelectrodes. Responses following electrical field stimulation (EFS) of enteric motorneurons (MNs) or through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) were compared in the esophageal body (EB) and in clasp and sling regions in the lower esophageal sphincter (LES). Our study shows a regional specialization to stimulation of EMNs in the human esophagus, with stronger inhibitory responses in clasp LES fibers and stronger cholinergic excitatory responses in the EB. Inhibitory responses are mainly triggered by nitrergic enteric MNs mediating the inhibitory junction potentials (IJP) in the LES and EB, EFS on-relaxation in clasp and sling LES sides, and latency in the EB. We also found a minor role for purines (through P2Y1 receptors) and vasoactive intestinal peptide-mediating part of nonnitrergic clasp LES relaxation. The aim of the third study was to characterize the neurotransmitters involved in the origin and modulation of circular smooth muscle esophageal body (EB) contractions in the porcine esophagus. Responses of porcine EB strips to electrical stimulation of motorneurons (MNs) were assessed in organ baths and with microelectrodes. The effect of antagonists of inhibitory (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) and excitatory neurotransmitters (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) and of ganglionic neurotransmitters (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM) were characterized. Our results suggest that timing (latency) and amplitude of esophageal contractions are determined by a balance of complex interactions between excitatory and inhibitory MNs. Latency depends on the activation of inhibitory MNs releasing NO and a minor purinergic contribution through P2Y1 receptors, and excitatory MNs releasing ACh. Amplitude depends on a major contribution of excitatory MNs releasing ACh and tachykinins, and also on inhibitory MNs releasing NO, ATP or related purines, and peptidergic neurotransmitters acting as strong modulators of the excitatory neuroeffector transmission.

La neurotransmissió inhibitòria participa en el control de l’activitat motora del còlon. Els neurotransmissors inhibitoris hiperpolaritzen la membrana del múscul llis, generant un potencial d'unió inhibitori (”Inhibitory Junction Potential” IJP) que és la base electrofisiològica de la relaxació muscular. Així, l’adenosina trifosfat (ATP), l’òxid nítric (NO) i el sulfur d’hidrogen (H2S) són molècules de senyalització que poden exercir aquest control. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat valorar la participació de l’ATP, el NO i el H2S en la transmissió neuromuscular inhibitòria en el còlon humà i de rata. El hidrogensulfur de sodi (NaHS) va ser utilitzat com font de H2S. Els antagonistes específics dels receptors P2Y1 van inhibir completament el component purinèrgic de l’IJP en el còlon humà i de rata (rang de potència: MRS2500>MRS2279>MRS2179). El β-NAD va produir hiperpolarització i relaxació de la musculatura del còlon humà. Tanmateix, la relaxació no va ser bloquejada pels antagonistes P2Y1. En el còlon de rata es va observar que l’alliberament de neurotransmissors inhibitoris produïa la generació d’IJP espontanis i un potencial de membrana muscular hiperpolaritzat. Mitjançant MRS2500 es va posar de manifest que els receptors P2Y1 participaven en la gènesi dels IJP espontanis. El Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) va permetre establir que l'estat de hiperpolarització tònic del potencial de membrana era d'origen nitrèrgic. L’ús d’apamina, spadina i ODQ va permetre valorar la participació dels canals de potassi de baixa conductància activats per calci (SKCa), els canals de potassi relacionats amb TWIK tipus 1 (TREK1) i la via de la guanilat ciclasa (GC) sobre la neurotransmissió purinèrgica i nitrèrgica. L’apamina va bloquejar tots dos components amb diferents nivells d'afinitat. L’ODQ només va bloquejar la neurotransmissió nitrèrgica. D’altra banda, tot i posar de manifest la presència de canals TREK1 en el còlon de rata, la spadina, un blocador de TREK1, no va bloquejar cap dels components. L’expressió dels enzims de síntesi del H2S es va determinar immunohistoquímicament en l’epiteli, el múscul i les neurones del còlon de rata. A més, es va demostrar que el teixit de rata era capaç de produir enzimàticament H2S. Tot i que en alguns casos es van observar efectes no específics dels inhibidors dels enzims de síntesi del H2S, aquestos van produir despolarització de les cèl·lules musculars i un increment de l’activitat mecànica del còlon. En segments de còlon de rata, el NaHS administrat per serosa va causar un efecte dual sobre els patrons de motilitat. El NaHS va inhibir les contraccions d'alta amplitud, mentre que va incrementar les contraccions de baixa amplitud. El NaHS va inhibir els potencials d'unió excitador i va hiperpolaritzar el múscul. Tanmateix, l’H2S no va alterar el marcapassos colònic situat a nivell del plexe submucós. El NaHS via luminal no va modificar la motilitat del còlon. La neurotransmissió purinèrgica al còlon humà i de rata es produeix a través del receptor P2Y1. L’ATP i el NO són alliberats per les neurones inhibitòries del plexe mientèric i tenen funcions complementàries en el còlon. D'una banda, l’ATP exerceix una acció fàsica sobre el potencial de membrana i l’activitat mecànica, mentre que el NO té una acció tònica. Ambdues respostes nitrèrgica i purinèrgica son en part sensibles a apamina, suggerint que els canals SKCa poden esta involucrats en les dues vies. El NO exerceix el seu efecte sobre el potencial de membrana a través de l’activació de la via de GC però no activa els canals TREK1. El H2S és produït i alliberat endògenament en el còlon de rata i pot actuar com una molècula de senyalització amb acció moduladora sobre la motilitat colònica. El seu mecanisme d’acció implica una inhibició de la neurotransmissió colinèrgica i hiperpolarització muscular. / Inhibitory neuromuscular transmission is involved in the control of colonic motility. Inhibitory neurotransmitters cause membrane hyperpolarization of smooth muscle, that is, an inhibitory junction potential (IJP) which is the electrophysiological basis of muscle relaxation. Thus, adenosine triphosphate (ATP), nitric oxide (NO) and hydrogen sulphide (H2S) are signalling molecules which can exert this control. The aim of this thesis was to evaluate the role of ATP, NO and H2S in inhibitory neuromuscular transmission in the rat and human colon. Sodium hydrosulphide (NaHS) was used as the source of H2S. Specific P2Y1 receptor antagonists completely inhibited the purinergic component of the IJP in the human and rat colon (potency range: MRS2500> MRS2279> MRS2179). β-NAD produced smooth muscle hyperpolarization and relaxation in the human colon. However, the relaxation was not blocked by P2Y1 antagonists. In the rat colon, it was observed that the release of inhibitory neurotransmitters produced both spontaneous IJP and a sustained muscle hyperpolarization. MRS2500 revealed that P2Y1 receptors were responsible for spontaneous IJP. Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) allowed us to establish that the tonic state of muscle hyperpolarization was nitrergic in origin. Apamin, spadin and ODQ were used to assess the involvement of small-conductance calcium-activated potassium channels (SKCa), TWIK-related potassium channels 1 (TREK1) and the guanylate cyclase (GC) pathway on purinergic and nitrergic neuromuscular transmission. Apamin blocked both components with a different relative sensitivity. ODQ only blocked nitrergic neuromuscular transmission. Furthermore, even though the presence of TREK1 channels was revealed in rat colon, none of the components was blocked by spadin, an effective TREK1 channel inhibitor. The expression of H2S-producing enzymes was determined by immunohistochemistry in the epithelium, muscle and nerve cells in the rat colon. In addition, it was demonstrated that the rat tissue was able to enzymatically produce H2S. Although in some cases the effects of H2S-producing enzymes inhibitors were not specific, they caused muscle depolarization and an increase in colonic mechanical activity. In segments of rat colon, NaHS caused a dual effect on motility patterns when administered via serosa. NaHS inhibited propulsive contractions whereas it caused an increase in the amplitude of ripples. NaHS inhibited cholinergic excitatory junction potentials and hyperpolarized smooth muscle cells. However, NaHS did not modify the colonic pacemaker located at the level of the submucosal plexus. Luminal addition of NaHS did not modify motility patterns. Purinergic neurotransmission in the rat and human colon is mediated by P2Y1 receptors. ATP and NO are released by myenteric plexus inhibitory neurons and have complementary functions in the colon. I.e. ATP produces a phasic action on membrane potential and mechanical activity and NO has a tonic effect. Both purinergic and nitrergic responses are in part apamin sensitive suggesting a possible involvement of SKCa in both pathways. NO effects on membrane potential are produced by GC activation but TREK1 channels are not involved. In the rat colon, H2S is produced and released endogenously and it might be a signalling molecule modulating action on colonic motility. H2S mechanism of action involves inhibition of neurally mediated cholinergic responses and muscle hyperpolarization.

Tesi realitzada al Laboratori de Recerca Translacional de l’Institut Català d’Oncologia – IDIBELL. / La hiperactividad del EGFR (epidermal growth factor receptor) confiere mal pronóstico. El EGFR se encuentra sobreexpresado en distintos tipos de tumores, entre ellos el cáncer de colon, pulmón, páncreas y cabeza y cuello (HNSCC). Además la cooperación con otros miembros de la familia del EGFR podría ampliar esta lista a otras neoplasias. La inhibición del EGFR es una de las vías de investigación más activa contra el cáncer. La radioterapia consigue, en un elevado porcentaje de casos, una buena respuesta. Sin embargo, la existencia de células resistentes a la radiación reduce el control tumoral. Una de las causas de la radioresistencia es la hiperactividad del EGFR. En cáncer de cabeza y cuello, el bloqueo del EGFR con el anticuerpo monoclonal anti- EGFR cetuximab aumenta el control local y la supervivencia en pacientes tratados simultáneamente con radioterapia. Sin embargo, no todos los pacientes tratados con cetuximab y radiación se benefician del tratamiento, lo que sugiere que, independientemente de la expresión del EGFR, existen mecanismos de resistencia a la combinación. La ramificación de las vías de señalización que dependen del EGFR sugiere que la topografía de la resistencia puede ser variada y múltiple. Cuanto más arriba de la vía de transmisión de señales se sitúe el by-pass, mayor debería ser la resistencia debido a que un mayor número de funciones citoprotectoras se verían liberadas. Se han descrito distintas posibilidades de by-pass al bloqueo del EGFR. Una de las oncoproteínas que podría ejercer un by-pass proximal es SRC, cuya actividad se relaciona con la progresión tumoral tanto en fases avanzadas como en lesiones premalignas. Además, SRC y EGFR comparten vías de señalización que promueven la progresión de la célula tumoral. En conjunto estos hechos sugieren que la inhibición de SRC podría aumentar la potencia antitumoral de la combinación de radioterapia y cetuximab. En este proyecto se han evaluado los efectos del tratamiento concomitante con radioterapia, cetuximab y dasatinib, y mejorado los conocimientos de los mecanismos biológicos involucrados. También se ha determinado si el uso de inhibidores de SRC podía potenciar el efecto antitumoral de la combinación de radioterapia y cetuximab en tumores dependientes del EGFR. La adición de DST al cetuximab o al cetuximab y radioterapia tuvo un efecto contrario al esperado: produjo un mayor crecimiento de los tumores, un incremento de la angiogénesis y de la síntesis de ADN, un aumento de la fosforilación de las oncoproteínas RAS, ERK1/2, AKT y STAT3; una elevación de la secreción de VEGF, y una hiperactividad del metabolismo glucolítico. El tratamiento combinado con dasatinib e inhibidores de las quinasas JAK, HER2 y MET no inhibió el exceso de fosforilación de ERK inducido por dasatinib, una respuesta reactiva similar a la descrita con C225 y que sugiere la implicación de mecanismos de acción, comunes e independientes de JAK, HER2 y MET. Por el contrario el bloqueo de EGFR por el inhibidor tirosina quinasa AG1478 dio lugar a una inhibición completa de la fosforilación de ERK y AKT a pesar de la presencia de DST, indicando que la quinasa del EGFR está implicada en el efecto antagónico inducido por dasatinib. Por último, este trabajo contribuye a la idea que la combinación de terapias moleculares puede dar lugar a antagonismos, que pueden ponerse de manifiesto durante una investigación preclínica antes de ser evaluados en ensayos clínicos. / Aberrant epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling drives oncogenesis in many carcinomas, including head and neck squamous cell cancer (HNSCC). Irrespective of the mechanism of activation, EGFR overexpression is a major origin of resistance to cancer cell death—and a relevant cause of local failures after radiotherapy. The blockage of EGFR by the monoclonal antibody cetuximab in combination with radiotherapy has been shown to improve survival and local control in head and neck cancers. However, major responses are limited in part due to the robustness of signalling networking, which grants alternative routes to avoid blockage of EGFR. SRC-family kinases occupy a central position within the cell signal networking, which makes SRC a potential target in cancer treatment. In this project we evaluated the effects of the concomitant treatment with radiotherapy, cetuximab and dasatinib, and improved the knowledge of the biological mechanisms involved; to determine whether SRC inhibitors could potentiate the antitumor effects of radiotherapy and cetuximab combination in EGFR-dependent tumours. Unexpectedly, the addition of dasatinib to cetuximab or cetuximab and radiotherapy resulted in an antagonistic effect which was characterized by increased tumour growth; an increase in the angiogenesis and DNA synthesis; association with the inhibition of SRC; an increase in cell signalling involving phosphorylation of RAS, ERK1/2, AKT and STAT3 oncoproteins; elevation of VEGF secretion and hyperactivity of glycolytic metabolism. Also, the simultaneous blockade of SRC and JAK kinases, HER2 or MET, induced a similar reaction to that described with cetuximab suggesting the involvement of mechanisms of action, common and independent, of JAK, HER2 and MET. Conversely, blocking EGFR with the tyrosine kinase inhibitor AG1478 resulted in a complete inhibition of ERK and AKT phosphorylation, despite the presence of dasatinib, indicating that the EGFR kinase is involved in the induced antagonistic effect of dasatinib. Finally, this project contributes to the idea that the combination of molecular therapies can result in antagonism, which may become perceptible during a preclinical research before being evaluated in clinical trials.

Las variables clínicas en pacientes sometidos a cirugía cardíaca(CCA) se asocian con el pronóstico a corto y largo plazo en términos de mortalidad y morbilidad. Se han estudiado variables postoperatorias, aunque también variables pre- e intraoperatorias habituales, realizándose 5 líneas de investigación: paciente cirrótico, Acute Kidney Injury(AKI), cociente Presión parcial de oxígeno arterial/ Fracción inspirada de oxígeno (PaO2/FIO2), niveles de lactato arterial(LA), y el Índice de Masa Corporal(IMC). En el paciente cirrótico sometido a CCA la presión venosa central inicial es un factor independiente asociado a mortalidad hospitalaria, mientras que un SAPS III elevado y el volumen de orina menor en las primeras 24h fueron predictores de mortalidad a largo plazo. El MELD score(sensibilidad(S):85.7%;especificidad(E):83.7%) y el SAPS III(S:83.3%;E:64.9%)tienen el mejor poder predictivo a corto y a largo plazo respectivamente en esta población. La supervivencia global en toda la muestra(n=59) fue peor según el grado de hepatopatía (82.4% para Child A, 47.6% para Child B y 33.3% para Child C;P=0.001). Las características asociados a la fisiopatología del paciente cirrótico deben tenerse en especial consideración a la hora de someter estos pacientes a CCA. El desarrollo de AKI en el período postoperatorio tuvo una incidencia del 14%. Identificamos un mayor tiempo de circulación extracorpórea(CEC), una mayor necesidad de drogas vasoactivas y un mayor LA a las 24h tras ingresar en UCI como predictores de AKI. Una peor supervivencia se asoció a un mayor grado de AKI según la escala RIFLE modificada:74.9% para el subgrupo Risk,42.9% para el Injury, y 22.3% para el Failure(P<0.001) (seguimiento medio de 6.9±4.3años), siendo estos dos últimos asociados de manera independiente a una mayor mortalidad. El desarrollo de estrategias para la prevención de los factores de riesgo es básico para mejorar no tan sólo la incidencia de AKI, sino los resultados de la CCA en general. El cociente PaO2/FIO2 puede ser útil para la identificación de pacientes de CCA con mal pronóstico en el postoperatorio inmediato. Valores más bajos a las 3h tras el ingreso en UCI son los más útiles en términos de predicción de mortalidad. Asimismo hay una mayor mortalidad intra-UCI y complicaciones respiratorias con PaO2/FIO2<241 a las 3h. También se asoció a una peor supervivencia intrahospitalaria en comparación con PaO2/FIO2>241 a las 3h (88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% IC:1.293–1.786;P=0.004). El LA elevado(>3.0mmol•L-1)es frecuente en el postoperatorio de CCA y su elevación se asocia a mal pronóstico. La presencia de un LA>3.0mmol•L-1 fue un predictor para mortalidad hospitalaria(OR:1.468; 95% IC:1.239–1.739;P<0.001) y para la mortalidad a largo plazo(HR:1.511;95% IC:1.251–1.825;P<0.001). El antecedente de un infarto de miocardio(IAM) reciente y sufrir un mayor tiempo de CEC fueron predictores de un LA. El patrón dinámico del LA fue similar en supervivientes y no supervivientes pero con mayores valores en no supervivientes(ANOVA de medidas repetidas, P<0.001). Asimismo, el área bajo la curva objetivó mayores niveles de LA en los no supervivientes(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). Nuestros resultados objetivan una dinámica parecida de la curva de LA entre supervivientes y no supervivientes con mayores valores en estos últimos, lo cual podría sugerir un mecanismo similar del LA pero con una mayor producción en los no supervivientes. Aquellos pacientes que presentaron un LA>3.0mmol•L-1 y su pico se objetivó a las 24h tuvieron peor supervivencia(79.1%vs.86.7–89.2%;P=0.03)comparados con aquellos que presentaron su pico al ingreso, a las 6h o a las 12h durante el postoperatorio. La obesidad influencia de manera notable la estratificación y planificación de la CCA. Algunos estudios han objetivado mejores resultados en la población obesa en comparación con la población con IMC normal respecto a la mortalidad y supervivencia. Tras ajustar las variables preoperatorias e intraoperatorias mediante propensity score, una peor oxigenación y mejor estado nutricional, reflejados por una peor PaO2/FiO2 y unos niveles más elevados de albúmina, fue observado en pacientes con IMC elevado. Los pacientes obesos mostraron mayor riesgo para IAM peroperatorio(OR:1.768;95% CI:1.035-3.022;P=0.037)y sepsis(OR:1.489;95% CI:1.282-1.997;P=0.005). No hubo diferencias en la mortalidad hospitalaria entre grupos, aunque los pacientes con sobrepeso mostraron una mejor supervivencia al año comparados con la población normal(91.2%vs.87.6%;P=0.029). A pesar de ello, nuestros resultados no apoyan el concepto obesity paradox, que puede ser el resultado de sesgos en los diferentes estudios publicados. La mejoría del estudio pronóstico de variables en el postoperatorio inmediato las convierte en herramientas a pie de cama que ayudan al clínico en la toma de decisiones e influyen en la supervivencia de sus pacientes. Sin lugar a dudas, una mejor precisión pronóstica conlleva una mejoría en establecer el grado de vigilancia y cuidados que requiere cada paciente, y en consecuencia, los recursos destinados. La mayor precisión en el pronóstico a largo plazo tiene obvias e importantes ventajas, tanto desde el punto de vista clínico del paciente a nivel individual como desde el punto de vista sanitario y social. / The clinical variables in patients undergoing cardiac surgery(CS) are associated with prognosis in the short and long-term scenario in terms of mortality and morbidity. Five main areas of research are discussed: cirrhosis, Acute Kidney Injury(AKI), ratio of arterial partial pressure/oxygen fraction of inspired oxygen(PaO2/FIO2), arterial blood lactate levels(LA) and Body Mass Index(BMI). In the cirrhotic patient undergoing CS central venous pressure was an independent factor associated with hospital mortality, whereas a high SAPS III and lower urine volume during the first 24h were predictors of long-term mortality. The MELD score (sensitivity(S):85.7%;specificity(E):83.7%)and SAPS III(S:83.3%;E: 64.9%)showed the best predictive power in the short and long term scenarios, respectively. Overall survival(n=59)was worse with the degree of liver disease(82.4% for Child A, 47.6% for Child B and 33.3% for Child C;P=0.001). The pathophysiology associated with cirrhosis should be taken into account when referring these patients to CS. The development of AKI in the postoperative period was 14%. We identify a longer cardiopulmonary bypass time(CPB), a greater need for vasoactive drugs and greater LA at 24h after ICU admission as predictors of AKI. Worse survival was associated with a greater degree of AKI according to the modified RIFLE scale: 74.9% for the Risk group, 42.9% for the Injury group, and 22.3% for the Failure group(P<0.001)(mean follow up 6.9±4.3years). The latter two were independently associated with increased mortality. Developing strategies for the prevention of AKI is essential to improve their incidence and also the survival after CS. The PaO2/FIO2 can be useful for identifying patients with poor prognosis in the immediate postoperative period. Lower values at 3h after admission to ICU are most useful in terms of prediction of mortality. There was also a greater intra-ICU mortality and respiratory complications with PaO2/FIO2<241 at this time. It was also associated with worse in-hospital survival compared with PaO2/FIO2>241(88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% CI:1293-1786;P=0.004). A higher LA(>3.0mmol•L-1)is associated with poor prognosis after CS. The presence of an LA>3.0mmol•L-1 was a predictor of hospital mortality(OR:1.468;95% CI:1.239-1.739;P<0.001)and for long-term mortality(HR:1.511;95% CI:1251-1825;P<0.001). A history of recent myocardial infarction(AMI)and a longer CPB time were predictors of higher LA. The dynamic pattern of LA was similar in survivors and non-survivors but with higher values in non-survivors(repeated measures ANOVA,P<0.001). Also, the area under the curve was higher in non-survivors(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). This might suggest a similar pathophysiology for LA but higher production in non-survivors. Those patients who had LA>3.0mmol•L-1 and its peak was at 24h after ICU admission had worse survival(79.1%vs.86.7-89.2%;P=0.03)compared with those who had their peak on admission, at 6 or 12 h postoperatively. Obesity influences significantly stratification risk of CS. However, some studies have showed better survival in the obese population compared to normal BMI population. After adjusting for confounding factors using propensity score, a worse oxygenation and better nutritional status, reflected by a lower PaO2/FiO2 and higher albumin levels, was showed in patients with higher BMI. Obese patients showed increased risk for perioperative AMI(OR:1.768;95% CI:1035-3022;P=0.037)and sepsis (OR:1.489;95% CI:1282-1997;P=0.005). There was no difference in hospital mortality between groups, although overweight patients showed better survival at one year compared to the normal population (91.2%vs.87.6%;P=0.029). However, our results do not support the obesity paradox, which may be the result of bias in different published studies. The improvement of the knowledge of clinical variables in the immediate postoperative period becomes a tool to help physicians in making decisions and influencing the survival of the patients who undergo CS. Undoubtedly, better prognostic accuracy implies an improvement in establishing the degree of resources by each patient. Indeed more accurate long-term prognosis has obvious and important advantages, both from the clinical and social point of view.

La microscopia de fuerza atómica (AFM) permite estudiar las superficies de materiales biológicos a escala nanométrica y obtener imágenes de elevada resolución de la topografía de la muestra. En este trabajo, la utilización de esta poderosa técnica ha permitido observar, caracterizar y explorar tanto la superficie celular como la estructura del biofilm que forman distintas cepas de Candida albicans, las cuales presentan mutaciones por deleción en genes que codifican por proteínas con un dominio denominado CFEM (Common in several Fungal Extracelular Membrane), que podrían estar implicadas en la formación, desarrollo y/o mantenimiento de la estructura del biofilm en C. albicans. De este modo, se han podido realizar diversos estudios en los que se ha evaluado la rugosidad de las superficies celulares y de los biofilms, parámetro que nos ayuda a caracterizar una superficie; se ha observado la formación, estructura y complejidad de los diferentes biofilms obtenidos; explorado la influencia de diferentes tipos de sustrato en la formación de biofilms y se han analizado las fuerzas de adhesión de las distintas cepas de C. albicans estudiadas ante diversos sustratos, recubiertos con una película formada por componentes de la saliva, mediante la técnica de AFM de espectroscopia de fuerza. Por otro lado, con el fin de estudiar la eficacia de distintos tipos de luz láser de gran aplicación en el tratamiento endodóntico y evaluar el efecto de la terapia fotodinámica en la eliminación de microorganismos, la microscopia de fuerza atómica ha sido de gran utilidad para analizar las lesiones producidas sobre la superficie celular de Enterococcus faecalis tratados con luz láser y terapia fotodinámica, tanto en suspensiones celulares como formando biofilms, mediante la visualización de cambios en la morfología celular y análisis de la rugosidad de superficie. Los estudios realizados aplicando la técnica de AFM han revelado como la falta de expresión de proteínas CFEM por C. albicans puede afectar a la estructura y organización del biofilm, y se ha podido evaluar la influencia positiva de distintos tipos de superficies sobre la adhesión celular. Además, los resultados obtenidos han demostrado un enfoque práctico de la técnica de AFM para examinar alteraciones sustanciales en la superficie celular de E. faecalis, tanto en suspensiones celulares como en biofilms formados por este microorganismo, inducidas después de los tratamientos con luz láser y terapia fotodinámica. El estudio llevado a cabo indica que estos tratamientos podrían ser eficaces en la eliminación de biofilms, erradicación de células persistentes y descontaminación de superficies orales. / The atomic force microscopy (AFM) allows to study several properties of biological surfaces at the nanoscale and also to obtain high resolution images of the sample’s topography. In this work, the use of this powerful technique has allowed us to observe, characterize and explore both the cell surface and biofilm structure forming of different strains of Candida albicans, in which deletion mutations occur in genes encoding proteins with a domain named CFEM (Common in several Fungal Extracellular Membrane). Thus, it was possible to perform various studies that have evaluated the surface roughness parameter, which helped us to characterize cellular and biofilm surfaces; have observed the formation, structure and complexity of the different biofilms obtained; explored the influence of different types of substrate in the formation of biofilms and analyzed the adhesion forces of different strains of C. albicans to various substrates studied by the technique of AFM Force Spectroscopy. Furthermore, in order to study the effectiveness of various types of laser lights of wide application in endodontic treatment and to evaluate the effect of photodynamic therapy in the eradication of microorganisms, atomic force microscopy has been useful for analyzing lesions produced on the cell surface of Enterococcus faecalis treated by laser lights and photodynamic therapy, both cell suspensions as biofilms, by visualizing changes in cell morphology and analysis of surface roughness. Studies using AFM revealed that the lack of CFEM protein expression by C albicans can affect the structure and organization of the biofilm, and we assessed the positive influence of different types of surfaces on cell adhesion. Moreover, the results obtained have shown a practical approach of AFM to examine substantial alterations in cell surface of E. faecalis, both cell suspensions and biofilms formed by this microorganism, induced after treatment with laser light and photodynamic therapy. The study carried out indicated that these treatments could be effective in removing biofilms, persistent cells eradication and decontamination of oral surfaces.

Tesi realitzada a l'Hospital Universitari Mútua Terrassa / El carcinoma broncogénico (CB) representa la primera causa de mortalidad por cáncer en ambos sexos en los países desarrollados. La evaluación prequirúrgica del mediastino es esencial para definir el pronóstico y guiar el tratamiento de estos pacientes. Las guías para la estadificación ganglionar mediastínica preoperatoria de la European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) recomiendan una exploración con certificación cito-histológica, ya sea con técnicas endoscópicas de punción guiada por ecografía o mediante una exploración quirúrgica del mediastino, en las siguientes situaciones: cuando la tomografía computerizada detecta ganglios mediastínicos de tamaño patológico, en tumores de localización central o cuando la tomografía por emisión de positrones (PET) muestra una hipercaptación mediastínica o hiliar. Así mismo, estas guías recomiendan la exploración y biopsia de, como mínimo, las siguientes estaciones ganglionares mediastínicas: paratraqueales inferiores derechas e izquierdas, y subcarínica, cuyo estudio puede llevarse a cabo mediante técnicas de punción eco-endoscópicas. Cuando no se dispone de estas técnicas o su resultado es negativo, debe realizarse una exploración quirúrgica del mediastino (principalmente una mediastinoscopia cervical estándar), por presentar un mayor valor predictivo negativo. En el caso de los tumores izquierdos también se recomienda explorar las estaciones ganglionares paraórtica y subaórtica, que no son accesibles a través de las técnicas de punción eco-endoscópica. Para llevar a cabo su exploración es necesaria una técnica quirúrgica como la mediastinotomía paraesternal izquierda, la mediastinoscopia cervical extendida (MCE) o la videotoracoscopia izquierda. La MCE permite explorar las estaciones paraórtica y subaórtica, utilizando la misma incisión cervical realizada para la mediastinoscopia cervical estándar, y por lo tanto, la vía transcervical permite una exploración completa del mediastino superior y de la ventana aorto-pulmonar. Los objetivos de la presente tesis, que se basa en dos artículos publicados y relacionados entre sí, son: evaluar los valores de estadificación obtenidos tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico de evaluación ganglionar mediastínica basado en las guías de estadificación de la ESTS, evaluar la rentabilidad de la MCE en la estadificación del CB izquierdo y, finalmente, evaluar la supervivencia de aquellos pacientes intervenidos quirúrgicamente con afectación ganglionar mediastínica insospechada N2p. El primer trabajo es un estudio retrospectivo (1998-2010) de 221 MCE de estadificación realizadas en pacientes con CB izquierdo. Se analizó la precisión diagnóstica de la técnica y del protocolo en 2 períodos: 1998-2003 con MCE sistemática y 2004-2010 con PET sistemática y MCE selectiva. Los resultados obtenidos mostraron que la MCE posee una elevada precisión diagnóstica (sensibilidad: 0.67; valor predictivo negativo: 0.94; exactitud diagnóstica: 0.95) para la detección clínica de N2. Su uso selectivo permite reducir la MCE en cerca del 30 % de los pacientes con sin disminuir el valor predictivo negativo del protocolo en ambos períodos. El segundo trabajo es un estudio retrospectivo (2004-2010) de 540 pacientes estadificados y operados siguiendo las guías de la ESTS. Se analizaron los valores de estadificación y la supervivencia del subgrupo de pacientes con resultado final N2p. Los resultados obtenidos mostraron que tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico basado en las guías de la ESTS se consigue unos valores de estadificación elevados (valor predictivo negativo: 0.91) con una baja tasa de falsos negativos (5.5%). Los pacientes con resultado final N2p insospechado presentan una mejor supervivencia (supervivencia a los 5 años del 40%) que la esperada en comparación con la observada en los pacientes quirúrgicos de la base de datos de la International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) utilizada para la 7ª edición de la clasificación TNM. En conclusión, las guías de la ESTS deben implementarse en la práctica clínica a la luz de los buenos resultados de estadificación y supervivencia. / Preoperative mediastinal staging is essential to predict prognosis and to guide treatment in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). The European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) guidelines for preoperative mediastinal nodal staging recommend tissue confirmation when computed tomography shows enlarged nodes, in central tumors or when positron emission tomography (PET) shows an increased mediastinal or hilar uptake. The recommendation is to explore the right and left inferior paratracheal, and subcarinal stations. In left-sided tumors, the exploration of subaortic and paraortic nodal stations is also recommended. This can be done by extended cervical mediastinoscopy (ECM). This thesis is based on two published and related articles, the objectives of which are: to evaluate the staging values after applying a preoperative mediastinal staging protocol according to the ESTS guidelines, to evaluate the accuracy of ECM for staging left-sided NSCLC and to evaluate the survival of surgically treated patients with unsuspected mediastinal pathological (p) N2 disease. The first publication is a retrospective study that includes 221 ECM for staging left NSCLC. The accuracy of the technique and of the protocol were calculated in two periods: 1998-2003 with systematic ECM and 2004-2010 with systematic PET and selective ECM. The results of this study show a high diagnostic accuracy of ECM (sensitivity: 0.67; negative predictive value: 0.94; accuracy: 0.95). Its selective indication allows reducing ECM in near 30% of the patients without reducing the negative predictive value of the protocol. The second publication is a retrospective study (2004-2010) including 540 patients staged and operated following the ESTS guidelines. The results of this study show that after applying the ESTS guidelines, high staging values (negative predictive value: 0.91) and low false negative rate (5.5%) are observed. Survival rate in patients with unsuspected pN2 disease was higher (5-year survival rate of 40%) than expected, compared with survival of surgical patients with pN2 of the International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) database used to inform the 7th edition of TNM classification. Therefore, the ESTS guidelines on preoperative mediastinal nodal staging should be used in clinical practice.

El riesgo de infección en cualquier ser humano depende, por un lado, de la intensidad de la exposición a microorganismos potencialmente patógenos y, por el otro, de la integridad de los mecanismos de defensa del huésped, incluidas las barreras anatómicas, la inmunidad humoral y la mediada por células. El estado de salud y la condición premórbida del paciente representan factores de riesgo adicionales al generar defectos cualitativos o cuantitativos en el funcionamiento de la respuesta inmune que pueden aumentar el riesgo de padecer diferentes tipos de infecciones. Ejemplo de ello son la diabetes mellitus o las enfermedades hepática, cardíaca o renal crónicas. Los pacientes con neoplasias son un ejemplo paradigmático, pues tienen un riesgo aumentado de infección debido a diferentes motivos: el daño a las barreras anatómicas es común después de la quimio o radioterapia o luego de procedimientos invasivos como son, por ejemplo, catéteres endovenosos o cirugías; además, la propia malignidad subyacente o las intervenciones terapéuticas inmunosupresoras (quimioterapia, corticosteroides y la radioterapia) son responsables de defectos inmunes. Por todo lo expuesto esta población de pacientes puede englobarse en el término inmunodeprimido. Los inmunodeprimidos son un problema relevante de salud, debido al aumento de su prevalencia, y también por el alto consumo de recursos que suponen. Los pacientes inmunodeprimidos tienen mayor riesgo de enfermar y, consecuentemente, de requerir ingreso en las Unidades de Cuidados Intensivos (UCI). Dos de esas poblaciones, especialmente relevantes por el aumento de su incidencia y por sus potenciales complicaciones son los pacientes hemato-oncológicos y los pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Cada vez con mayor frecuencia observamos en nuestra actividad diaria en UCI la necesidad de asistir a estos pacientes. Los pacientes hospitalizados tienen riesgo de desarrollar infecciones nosocomiales. Estas infecciones son relevantes por su potencial gravedad y el elevado coste que generan, sobre todo en el ámbito de la UCI. Una particularidad de estas infecciones es que, con frecuencia, son debidas a microorganismos multirresistentes (MMR), ya que el ingreso a estas unidades condiciona un cambio de la microflora endógena de los pacientes, provocando colonización por gérmenes del ámbito hospitalario, con una sensibilidad a antibióticos diferente. Existe la sensación que los pacientes inmunodeprimidos críticos tienen un riesgo aumentado de presentar infecciones nosocomiales por MMR, así como de una peor evolución cuando las presentan. Sin embargo, hay pocos estudios que hayan analizado esta circunstancia. Esto resulta de interés pues serviría para elaborar guías y protocolos con la intención de determinar la mejor estrategia de uso de antibióticos, y establecer los factores potencialmente modificables para mejorar el pronóstico. Por este motivo se planteó el desarrollo de esta Tesis Doctoral. En ella se incluyen dos trabajos que tienen como principales objetivos evaluar y comparar pacientes críticos con neoplasias malignas (hematológicas y nohematológicas) con aquellos sin neoplasia en términos de adquisición de MMR, infecciones y mortalidad (Artículo 1); y evaluar y comparar pacientes críticos infectados por el VIH con aquellos sin esta infección en los mismos términos (Artículo 2). Para ello se realizó un estudio observacional, prospectivo de cohortes de pacientes ingresados en una UCI médica de ocho camas para adultos en un hospital universitario de 700 camas durante un período de 35 meses. Se obtuvieron frotis de fosas nasales, de faringe y de recto, y se recogieron cultivos de secreciones respiratorias dentro de las 48 h del ingreso y tres veces por semana a partir de entonces. Además se obtuvieron otros cultivos según se considerara necesario por el médico tratante. Se recogieron también variables clínicas cuantitativas y cualitativas que se consideraron de importancia, como factores de riesgo o pronóstico, además de las escalas de gravedad al ingreso y durante la estancia en UCI. Se utilizó un análisis de regresión logística multivariante para evaluar la mortalidad en la UCI. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación Clínica del Hospital Clínic de Barcelona. Los principales resultados de ambos estudios demuestran que ambas poblaciones de pacientes críticos inmunodeprimidos (hemato-oncológicos o infectados por VIH) no parecen tener un mayor riesgo de adquisición de microorganismos resistentes o infecciones durante su estancia en UCI. Además, el pronóstico de su estancia en UCI no se relaciona con la adquisición de estos agentes patógenos o las infecciones adquiridas intra-UCI, ni tampoco con tener o no infección por VIH, sino a la gravedad de la enfermedad al ingreso y a la condición de tener una neoplasia hematológica.

Tesi realitzada a l'Hospital Universitari Mútua Terrassa / Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) was identified more than 30 years ago. The challenges for the clinicians and Human Immunodeficiency Virus (HIV)-infected individuals have changed over the years. Nowadays, viral replication is suppressed with Antiretroviral Therapy (ART). ART prevents AIDS related complications and decreases morbidity and mortality in HIV-infected subjects. However, mortality rates among HIV-infected individuals remain 3-15 times higher than those observed in the general population. The excess of mortality observed among HIV-infected subjects can be partly attributed to HIV-related illnesses. However, more than half of the deaths observed among HIV-infected patients treated with ART are due to co-morbid disorders related to aging. It is nowadays considered that HIV-infected patients are aging prematurely. Multiple hypotheses have been made to explain this premature aging. Chronic systemic inflammation, reduced vascular endothelial reactivity, increased endovascular hypercoagulability and immune activation have been suggested as possible mechanisms. These processes are more prevalent in HIV-infected patients (treated and non-treated) than in the general population. Therefore, HIV-infected patients are prone to develop age-related diseases or co-morbidities. Among these co-morbidities, HIV-infected patients present increased cardiovascular risk, more prevalence of traditional cardiovascular risk factors and early onset of the atherosclerotic disease. However, the underlying mechanisms are not known yet. HIV-infection has been suggested as a potential contributor to atherosclerosis. Given the unique effects of HIV on the immune system, it is plausible to consider that HIV infection itself could be involved in atherosclerosis. The link between both may be the result of a generalized increase in the activity of the inflammatory pathways, especially the cytokine network. It is possible that these alterations in the inflammatory system may modulate the risk of atherosclerosis in HIV-infected individuals. These alterations may be caused by DNA sequence variants and/or by changes in the expression patterns of inflammatory pathway genes induced by the HIV-infection or by ART. The purpose of this study was to investigate the possible association between genetic variants and gene expression of genes involved in inflammation and cardiovascular risk measures in a cohort of HIV-infected subjects. The associations identified between genetic variants in the studied genes and CVR measures were modest. This suggests that SNPs may play a minor role and not be the underlying cause of the increased CVR observed in HIV-infected individuals. HIV-related CVD is probably influenced by non-genetic factors such as traditional CVR factors, the HIV-virus itself and by ART. The gene expression of the investigated genes is altered in HIV-related atherosclerotic disease. The findings regarding 5-LO pathway are the most relevant of this study. This part of the inflammatory pathway is important in the metabolism of lipids, which is closely related to atherosclerosis. To our knowledge this is the first study describing the implication of the 5-LO pathway in HIV-related atherosclerosis. Genetic variants in two key genes of this pathway (ALOX5 and ALOX5AP) were associated with HIV-related atherosclerosis. Although no differences were found in their gene expression, ART introduction reduced ALOX5AP gene expression levels, but not to the levels observed in uninfected controls justifying the importance of early ART initiation. Importantly, the 5-LO pathway interlinks lipid metabolism and inflammation and it is altered in HIV-infection. Thus, 5-LO pathway dysfunction may be critical in HIV-related atherosclerosis development. In summary, the findings reported in this thesis show that there is an intricate relationship among HIV-infection, antiretroviral treatment, atherosclerotic disease and the inflammatory pathway.

La carn de pollastre és una de les carns més consumides a tot el món. Per tal d’ampliar els canals de distribució de la carn fresca i els seus derivats, la indústria alimentària ha desenvolupat mètodes de conservació per tal d’allargar-ne la seva vida útil i que permetin mantenir les propietats i la qualitat del producte original. L’envasament en atmosfera modificada (EAM), juntament amb les temperatures de refrigeració, s'ha convertit en el mètode d'envasament més utilitzat per conservar la carn d'aus de corral. Consisteix en envasar l’aliment i modificar-ne l'atmosfera que l'envolta per un altre gas tal com el nitrogen (N2), l’oxigen (O2), el diòxid de carboni (CO2) o una mescla entre ells. El seu èxit recau essencialment sobre la concentració de CO2 present en l'atmosfera. El CO2 té la propietat de dissoldre’s en l'aigua i en el greix dels aliments. Quan això succeeix, tenen lloc una sèrie d’alteracions a nivell intracel·lular que afecten el metabolisme d'alguns dels microorganismes alteradors més comuns, disminuint-ne el seu desenvolupament, i també l'acció d'alguns enzims responsables de les reaccions de degradació més habituals en aliments. No obstant això, l'ús d'altes concentracions de CO2 s'ha vist limitat degut al col·lapse dels envasos que produeix. Aquesta tesi s’ha enfocat per a millorar la tècnica d’EAM tradicional. La primera fase del treball ha consistit a provar l'ús d'altes concentracions de CO2 per a conservar la carn de pollastre fresca, saturant prèviament la carn amb CO2 pur. Amb aquest pretractament es pretenia reduir o fins i tot evitar el col·lapse de l'envàs, esdevenint una oportunitat per a reduir el volums dels envasos i millorar, per tant, l'eficiència en el procés d’envasament i de transport dels productes. La segona etapa del projecte ha consistit en combinar l’EAM amb l’alta pressió hidrostàtica (APH). L’APH és una de les tecnologies més prometedores per a reemplaçar els tractaments tèrmics com la pasteurització o fins i tot l'esterilització. No obstant això, els elevats nivells de pressió necessaris per aconseguir la total inactivació de microorganismes ha limitat el seu ús i aplicació en la indústria alimentària. L'objectiu principal de la combinació de l’EAM i la APH ha estat reduir la pressió del tractament sense comprometre la inactivació microbiana. Diversos experiments s'han dut a terme per tal d’avaluar l'efecte sinèrgic entre les dues tecnologies i per a determinar la concentració òptima de CO2 i la pressió necessària per aconseguir una major inactivació de microorganismes patògens i alteradors de la carn d’au. Els resultats obtinguts van demostrar que quan la carn fresca de pollastre va ser envasada amb CO2 pur abans del seu envasat definitiu amb atmosfera modificada, el col·lapse dels envasos es va reduir significativament en comparació amb les mostres directament envasades amb atmosfera modificada. La seva vida útil també va augmentar degut a que una major quantitat de CO2 disponible a l’espai de cap ofereix millor protecció de l’aliment i un efecte bacteriostàtic més durador. Quan es van dur a terme els pretractaments de saturació, els envasos es van poder omplir amb més producte sense comprometre la seguretat de l’aliment ni el col·lapse de l’envàs. Pel que fa a la combinació d'atmosferes de CO2 amb APH, es va poder demostrar l’existència de l’efecte sinèrgic d'aquesta combinació en la reducció i la inactivació d'alguns dels microorganismes alteradors i patògens més habituals en els productes càrnics avícoles. Un cop es van desenvolupar els models de predicció de la reducció microbiana produïda per la combinació de CO2 i d'alta pressió, l’atmosfera de 50% CO2 equilibrada amb N2 i la pressió de 250 MPa durant 10 min a temperatura ambient va ser considerat el més òptim, tenint en compte condicions menys extremes i reducció microbiana produïda. Aquest tractament es va aplicar a pit de pollastre frescs i es va comparar amb mostres envasades en aire i pressuritzades i mostres no pressuritzat. La vida útil del pit de pollastre envasat amb atmosfera modificada i tractat amb pressió va ser de 26 dies, mentre que les mostres tractades amb aire i pressió només van arribar a 15 dies sota condicions microbianes acceptables. Encara que es van detectar algunes alteracions fisicoquímiques de la carn pressuritzada pel que fa al seu color superficial i a la capacitat de retenció d'aigua, un cop aquesta va ser cuita no es van trobar diferències sensorials entre els tractaments comparats. La dissolució forçada del gas provocada per l'alta pressió també es va estudiar mitjançant la quantificació de l'embòlia gasosa produïda en salsitxes de carn d'au. Els resultats suggereixen que quan s'apliquen pressions més altes, el gas que envolta l'aliment penetra a l'interior de la cèl·lula en un nivell més profund i per això la seva extracció durant el procés de descompressió és més complicat, mantenint-se dissolt en l’aliment. Addicionalment, al reduir la velocitat de descompressió, una major quantitat del gas es va mantenir dissolt en el producte, oferint una millor preservació del l’aliment quan es tractava de CO2. Els resultats experimentals obtinguts han demostrat que la conservació de la carn d'au es pot millorar mitjançant l'ús d'atmosferes riques amb CO2 aplicades individualment com un tractament de saturació previ al envasat convencional amb atmosfera modificada, o en combinació amb l’APH. Els treballs exposats en aquesta Tesi demostren noves maneres de conservar els productes càrnics avícoles donant noves perspectives en aquest camp d’investigació que donen l’oportunitat de produir productes càrnics frescos més segurs i duradors. / La carne de pollo es una de las carnes más consumidas en todo el mundo. Para ampliar los canales de distribución de la carne fresca y sus derivados, la industria alimentaria ha desarrollado métodos de conservación para alargar su vida útil y que permitan mantener las propiedades y la calidad del producto original. El envasado en atmósfera modificada (EAM), junto con las temperaturas de refrigeración, se ha convertido en el método de envasado más utilizado para conservar la carne de aves de corral. Consiste en envasar el alimento y modificar la atmósfera que lo rodea por otro gas tal como el nitrógeno (N2), el oxígeno (O2), el dióxido de carbono (CO2) o una mezcla entre ellos. Su éxito recae esencialmente sobre la concentración de CO2 presente en la atmósfera. El CO2 tiene la propiedad de disolverse en el agua y en la grasa de los alimentos. Cuando esto sucede, tienen lugar una serie de alteraciones a nivel intracelular que afectan el metabolismo de algunos de los microorganismos alteradores más comunes, disminuyendo su desarrollo, y también la acción de algunas enzimas responsables de las reacciones de degradación más habituales en alimentos. Sin embargo, el uso de altas concentraciones de CO2 se ha visto limitado debido al colapso de los envases que produce. Esta tesis se ha enfocado para mejorar la técnica de EAM tradicional. La primera fase del trabajo ha consistido en probar el uso de altas concentraciones de CO2 para conservar la carne de pollo fresca, saturando previamente la carne con CO2 puro. Con este pretratamiento se pretendía reducir o incluso evitar el colapso del envase, convirtiéndose en una oportunidad para reducir el volúmenes de los envases y mejorar, por lo tanto, la eficiencia en el proceso de envasado y de transporte de los productos. La segunda etapa del proyecto ha consistido en combinar la EAM con la alta presión hidrostática (APH). La APH es una de las tecnologías más prometedoras para reemplazar los tratamientos térmicos como la pasteurización o incluso la esterilización. Sin embargo, los elevados niveles de presión necesarios para conseguir la total inactivación de microorganismos han limitado su uso y aplicación en la industria alimentaria. El objetivo principal de la combinación de la EAM y la APH ha sido reducir la presión del tratamiento sin comprometer la inactivación microbiana. Varios experimentos se han llevado a cabo para evaluar el efecto sinérgico entre las dos tecnologías y para determinar la concentración óptima de CO2 y la presión necesaria para conseguir una mayor inactivación de microorganismos patógenos y alteradores de la carne de ave. Los resultados obtenidos demostraron que cuando la carne fresca de pollo fue envasada con CO2 puro antes de su envasado definitivo con atmósfera modificada, el colapso de los envases se redujo significativamente en comparación con las muestras directamente envasadas con atmósfera modificada. Su vida útil también aumentó, debido a que una mayor cantidad de CO2 disponible en el espacio de cabeza ofrece mejor protección del alimento y un efecto bacteriostático más duradero. Cuando se llevaron a cabo los pretratamientos de saturación, los envases se pudieron llenar con más producto sin comprometer la seguridad del alimento ni el colapso del envase. En cuanto a la combinación de atmósferas de CO2 con APH, se pudo demostrar la existencia del efecto sinérgico de esta combinación en la reducción y la inactivación de algunos de los microorganismos alteradores y patógenos más habituales en los productos cárnicos avícolas. Una vez se desarrollaron los modelos de predicción de la reducción microbiana producida por la combinación de CO2 y de alta presión, la atmósfera de 50% CO2 equilibrada con N2 y la presión de 250 MPa durante 10 min a temperatura ambiente fue considerado el más óptimo, teniendo en cuenta condiciones menos extremas y reducción microbiana producida. Este tratamiento se aplicó a pechuga de pollo fresca y se comparó con muestras envasadas en aire y presurizadas y muestras no presurizadas. La vida útil de la pechuga de pollo envasada con atmósfera modificada y tratada con presión fue de 26 días, mientras que las muestras tratadas con aire y presión sólo llegaron a 15 días bajo condiciones microbianas aceptables. Aunque se detectaron algunas alteraciones fisicoquímicas de la carne presurizada en cuanto a su color superficial y a la capacidad de retención de agua, una vez ésta fue cocinada no se encontraron diferencias sensoriales entre los tratamientos comparados. La disolución forzada del gas provocada por la alta presión también se estudió mediante la cuantificación de la embolia gaseosa producida en salchichas de carne de ave. Los resultados sugieren que cuando se aplican presiones más altas, el gas que rodea el alimento penetra en el interior de la célula a niveles más profundos y por ello su extracción durante el proceso de descompresión es más complicada, manteniéndose disuelto en el alimento. Adicionalmente, al reducir la velocidad de descompresión, una mayor cantidad del gas se mantuvo disuelto en el producto, ofreciendo una mejor preservación del alimento cuando se trataba de CO2. Los resultados experimentales obtenidos han demostrado que la conservación de la carne de ave se puede mejorar mediante el uso de atmósferas ricas con CO2 aplicadas individualmente como un tratamiento de saturación previo al envasado convencional con atmósfera modificada, o en combinación con la APH. Los trabajos expuestos en esta Tesis demuestran nuevas maneras de conservar los productos cárnicos avícolas dando nuevas perspectivas en este campo de investigación que dan la oportunidad de producir productos cárnicos frescos más seguros y duraderos. / Chicken meat is one of the most consumed meats in all over the world. In order to extend fresh poultry meat and meat products distribution, the food industry has developed preservation methods in order to prolong their shelf-life while the quality properties of the original product remain undamaged. Modified atmosphere packaging (MAP) together with refrigeration temperatures has become the most used packaging method to preserve poultry meat. It consists of packaging a food product and modifies the atmosphere that surrounds it for other gas such as nitrogen (N2), oxygen (O2), carbon dioxide (CO2) or a mixture among them. Its success remains basically on the concentration of CO2 used in the atmosphere. CO2 has the property to dissolve in the water and fat of the product. When that happens, some intracellular alterations take place, affecting the metabolism of some of the most common spoilage microorganisms, reducing their growth, and also the action of some enzymes responsible of food degradation reactions. However, the use of high concentrations of CO2 has been limited due to package collapse that it produces. This Thesis was focused to improve the traditional MAP technique. The first stage of the work consisted in testing the use of high CO2 concentrations to preserve fresh chicken meat, previously saturating the meat with pure CO2. With this pre-treatment we expected to reduce or even avoid package collapse, presenting a chance to reduce package volumes and therefore improve package and transport efficiency. The second stage of the project was to combine MAP with high hydrostatic pressure (HHP). HHP is one of the most promising technologies to replace heat treatments like pasteurization or even sterilization. However, high pressure levels required to achieve microbial inactivation has limited its use and implementation in food industries. The main objective of combining both technologies MAP and HHP was to reduce the pressure of the treatment without compromising microbial inactivation. Several experiments were carried, assessing the synergistic effect between both technologies and determining the optimal concentration of CO2 and pressure level to achieve a greater inactivation of the most common spoilage and pathogenic microorganisms of poultry meat. When fresh chicken meat was packaged with pure CO2 before its final package with modified atmosphere, the collapse of the packages was significantly decreased in comparison with the samples directly packaged with modified atmosphere. Also, its shelf-life was increased, as a greater amount of CO2 offered a longer bacteriostatic effect over microbial population. When saturation pre-treatments were carried out, package-productfilling volumes were successfully increased without compromising the safety of the product and the packaging collapse. Related to the combination of CO2 atmospheres with HHP, the synergistic effect of this combination on the reduction and inactivation of some of the most common spoilage and pathogenic bacteria of poultry products was demonstrated. After developing predictive models of the microbial reduction produced by the combination of CO2 atmosphere concentrations and high pressure treatments, an optimal treatment of 50% CO2 balanced with N2 and a pressure of 250 MPa during 10 min at room temperature was suggested for its attractive and non-extreme conditions. This was applied to fresh chicken breasts and was compared to air-pressurized and non-pressurized samples. A shelf-life of 26 days was achieved on MAP and HHP treated samples, while air-pressurized samples only achieved 15 days under acceptable microbial conditions. Although some physicochemical differences were detected in pressurized meat with respect to surface color and water holding capacity, once the meat was cooked no sensory differences were found among treatments. The forced dissolution of the gas produced by high pressure was also studied by quantifying the gaseous embolism produced by pressurizing poultry sausages. Results suggested that when higher pressures were applied, the gas surrounding the food penetrates inside the cell at a deeper levels and its extraction with pressure release was harder, keeping it dissolved. By slowing down the pressure release speed, a greater amount of the gas remained dissolved into the product, offering a better preservation of the food when this gas was CO2. The experimental results obtained have demonstrated that poultry meat preservation can be improved by the use of high-concentration CO2 atmospheres applied alone as a previous saturation treatment or in combination with high hydrostatic pressure. The work exposed on this Thesis demonstrates new ways to preserve poultry meat products, giving new prospects on meat science researc