Los receptores Toll-like (TLRs), en particular los que se encuentran en vesículas intracelulares de origen endosomal (TLR3, TLR7 y TLR9), están involucrados en la respuesta innata antivírica. La unión a sus respectivos ligandos conduce a la activación de cascadas intracelulares que resultan en una producción de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α) y antivirales (interferones de tipo I). Existe muy poca información sobre la distribución celular y tisular de estos receptores en la especie porcina así como su regulación en condiciones normales o de infección. En el primer estudio de la presente tesis se valoró la distribución tisular de los TLRs endosomales en pulmón y tejidos linfoides primarios y secundarios de cerdos sanos de distintas edades. El marcaje del TLR9 se realizó con un anticuerpo comercial con reactividad específica para el porcino. En cambio, en el caso de TLR3 y TLR7 los anticuerpos se dirigían a las moléculas humanas pero, supuestamente, poseían reactividad cruzada con las moléculas de origen porcino. Los resultados obtenidos permitieron valorar la distribución del TLR9 en los distintos tejidos examinados, pero no la de los TLR3 y TLR7 ya que el uso de los anticuerpos dirigidos frente a estos dos últimos receptores no produjo resultados satisfactorios. Así, el marcaje obtenido con el anticuerpo anti-TLR3 fue muy variable en función del tejido utilizado; es decir, en algunos órganos como el pulmón, tonsila o linfonodos parecía ser específico, pero en otros como en el hígado, producía un intenso color de fondo inespecífico. Por el contrario, sí hubo un marcaje específico para el TLR9 que reveló una expresión constitutiva de dicho receptor en células de la periferia de los folículos linfoides de los linfonodos, la tonsila y las placas de Peyer, (células de tipo epitelial, dendríticas, macrófagos o linfocitos) un hecho que sugería que este receptor probablemente puede jugar un papel importante en la activación el sistema inmunitario de los cerdos a partir de las 3 semanas de vida. El segundo estudio de esta tesis consistió en determinar la variación de la expresión de TLR3, TLR7 y TLR9 a lo largo del tiempo en una población de células presentadoras de antígeno. La población de estudio elegida fue la de macrófagos alveolares porcinos (PAMs). Los resultados de la cinética de expresión mediante citometría de flujo nos mostró que estas células presentaban una expresión basal elevada de TLR3 y TLR9 pero no de TLR7. Una de las explicaciones posibles para este marcaje basal señalaría a la necesaria manipulación de estas células antes de ser congeladas como responsable de esta expresión. Por otra parte, es difícil conocer con exactitud el ambiente en el cual se encontraban los PAMs en el pulmón antes de ser recogidos (concentración de interleuquinas, quimioquinas, otras moléculas, etc). Dado que los animales donantes estaban sanos, no presentaban ningún tipo de lesión pulmonar y eran libres de los patógenos víricos comunes del cerdo (circovirus porcino de tipo 2, influenza A y virus del PRRS entre otros) la causa de esta elevada expresión no está clara. En cuanto a la expresión de TLR7, apenas se pudo detectar una expresión basal en los PAMs utilizados. Para el tercer estudio de esta tesis se buscó un modelo de infección con un virus RNA que pudiera influir en la regulación de estos TLRs y además pudiera añadir nuevos conocimientos respecto a la inmunopatogenia de dicha infección. En el campo de las enfermedades infecciosas del porcino, una de las mayores incógnitas inmunológicas del momento la encontramos en la infección con el virus del PRRS. Los resultados de este estudio demostraron que dos cepas del mismo genotipo del virus del PRRS causaban una regulación diferente del TLR3 y del patrón de citoquinas pro-inflamatorias. En concreto, en los estudios de citometría de flujo, la cepa 3262 al inducir la expresión de TLR3 en PAMs, sobre todo a dosis elevadas (m.o.i=1), activaría la producción de TNF-α+; en cambio, la cepa 3267 o la cepa vacunal DV activaron TLR3 con menor intensidad y no inducirían TNF-α; sugiriendo en definitiva, que la regulación del patrón de citoquinas antivirales o pro-inflamatorias en los macrófagos dependería del tipo de cepa utilizada. Resulta interesante señalar que a pesar de las diferencias observadas en la citometría de flujo respecto el porcentaje de células que expresaban TLR3 y en la intensidad de su expresión según el tipo de virus utilizado, la expresión relativa del mRNA no parecía modificarse. Estas diferencias resultan interesantes y apuntan a que distintas cepas de campo de genotipo europeo podrían ejercer un efecto regulador de diferente intensidad sobre moléculas inhibitorias de la cascada de señalización de los TLRs. Además esta regulación parece depender de diferentes factores tales como: la cepa vírica, el tiempo de infección y la dosis infectiva inicial. Nuestros resultados pueden ser útiles para abrir y conducir una nueva línea de investigaciones orientadas hacia el área de la inmunidad innata frente al virus del PRRS. / Toll-like receptors (TLRs), particularly those found within intracellular vesicles of endosomal origin (TLR3, TLR7 and TLR9), are involved in the innate antiviral responses. Binding of those receptors to their respective ligands leads to the activation of intracellular cascades resulting in the release of pro-inflammatory cytokines (TNF-α) and antiviral (type I) interferons. The knowledge on the distribution of those receptors in porcine organs, tissues and cells and its regulation in physiological states or in infection is scarce. In the first study of the present thesis the distribution of endosomal TLRs in lung and primary and secondary lymphoid tissues of healthy pigs of different ages was assessed. Labeling of TLR9 was performed using a commercial antibody with specific reactivity for the porcine TLR9. For TLR3 and TLR7 the antibodies used in the study were directed to human molecules but they were supposed to cross-react with the porcine counterpart molecules. The results allowed the assessment of the distribution of TLR9 in the different tissues examined, but not that of TLR3 and TLR7 since the use of antibodies directed against the latter two receptors did not yield satisfactory results. Thus, labeling obtained with the anti-TLR3 antibody was highly variable depending on the tissue examined, that is, in some organs such as lungs, tonsils or lymph nodes labeling was apparently specific but in others, as in the liver, the se of that antibody resulted in an intense non-specific background. By contrast, TLR9 labeling was specific and revealed a constitutive expression of this receptor in cells of the periphery of lymphoid follicles of lymph nodes, tonsils and Peyer's patches (epithelial cells, dendritic cells, macrophages or lymphocytes) a fact suggesting that this receptor can probably play an important role in activating the immune system of pigs of 3 week-old piglets. The second study of this thesis was aimed to determine the variation of the expression of TLR3, TLR7 and TLR9 over time in a population of antigen-presenting cells. Porcine alveolar macrophages (PAMs) were used for this purpose. The results of the kinetics of expression as assessed by flow cytometry showed that PAMs had a high basal expression of TLR3 and TLR9 but not of TLR7. A possible explanation for this basal labeling could point to the unavoidable manipulation of PAMs needed for their collection. Moreover, it is difficult to know precisely the environmental conditions in which PAMs were in the lungs before being collected (concentration of interleukins, chemokines, presence of other molecules, etc.). Since PAM donors were healthy, showed no lung lesions and were demonstrated to be free of common viral pathogens of pigs (porcine circovirus type 2, influenza A and PRRS virus among others) the cause of this elevated expression remains unclear. As for TLR7, basal expression in the PAMs used was low or nil. The third study of the present thesis aimed to a model of infection with an RNA virus that might influence the regulation of these TLRs and also could add new knowledge regarding the pathogenesis of the infection. In the field of infectious diseases of swine, one of most interesting models of RNA virus infections is PRRS virus for which immunopathogenesis is largely understood. The results of this study showed that two strains of the same genotype of PRRS virus resulted in a different regulation of TLR3 and in a different pattern of pro-inflammatory cytokines. Specifically, in flow cytometry experiments, strain 3262, induced the expression of TLR3 in PAMs, particularly at high multiplicities of infection (m.o.i = 1) and triggered the production of TNF-α+ whereas strain 3267 or the vaccine strain DV resulted in lower TLR3 expression and did not induce TNF-α, suggesting ultimately that the regulation of the antiviral or pro-inflammatory cytokine patterns in macrophages depends on the strain used. Interestingly, despite the differences observed in flow cytometry for TLR3, the relative mRNA expression did not apparently change under different circumstances. This was an interesting observation that suggests that different field strains of genotype I PRRSV might exert a regulatory effect of different intensity on inhibitory molecules of the signaling cascade of TLRs. Furthermore, this regulation seems to depend on various factors such as the viral strain, the time of infection and the multiplicity of infection. Our results may be useful as a basis for further studies in the area of innate immunity against PRRS virus.

La utilización de antimicrobianos, de forma metafiláxica, para mantener la salud de los animales en las granjas de producción, puede ser problemático en un futuro próximo, debido a las altas tasas de resistencias que se están observando. Esta situación obliga a replantearse medidas alternativas, las más habituales basadas en el uso de prebióticos, probióticos o la combinación de ambos (simbióticos). El objetivo principal de este trabajo ha sido el de seleccionar cepas de diferentes especies del género Bacteroides para ser utilizadas en conejos como probiótico. El género Bacteroides constituye uno de los principales componentes de la microbiota intestinal de los mamíferos (hasta 1011 UFC/g heces, en humanos). Degradan moléculas complejas, especialmente carbohidratos, y juegan un papel importante en el control de la colonización del tracto digestivo por parte de patógenos; también, en algún caso, pueden actuar como patógenos oportunistas. Están implicados además en la maduración del sistema inmunitario asociado a la mucosa intestinal. Los Bacteroides spp. podrían tener actividad probiótica por dos mecanismos diferentes: bien produciendo sustancias inhibidoras del crecimiento de otros componentes de la microbiota intestinal (bacteriocinas, metabolitos secundarios…), bien estimulando al sistema inmune, incrementando las defensas de forma inespecífica (inmuno-moduladores). Basándonos en la colección de Bacteroides spp. del CReSA, en este trabajo se han realizado estudios in vitro para seleccionar cepas, con ausencia de características negativas y presencia de características positivas, que pudieran utilizarse en estudios in vivo, en gazapos durante la fase de lactación, y poder analizar su rol como posible probiótico. La presencia de resistencias a determinados antibióticos, especialmente de marcadores transferibles, ha sido la característica más restrictiva a la hora de seleccionar las cepas a analizar in vivo. Después de seleccionar cuatro cepas, se procedió al estudio in vivo, en una granja comercial, examinando el efecto sobre la microbiota intestinal y diferentes parámetros inmunitarios. De los resultados obtenidos podemos inferir que algunas de las cepas probadas pueden ser candidatos para el desarrollo de un probiótico para conejo. / The metaphylactic use of antimicrobials to maintain the health of animals in food production farms can be problematic in the near future, due to the high rate of resistances observed. This situation forces to looking for alternative measures, the most common based on the use of prebiotics, probiotics or a combination of both (symbiotic). The main objective of this work was to select strains of different species of the Bacteroides genus that could be used as probiotic in rabbits. Bacteroides genus is one of the main components of the mammalian intestinal microbiota (1011 CFU/g feces, in humans). These bacteria degrade complex molecules, especially carbohydrates, and play an important role in the control of the colonization of the digestive tract by pathogens; but, in some cases, they can act as opportunistic pathogens. Furthermore, they are involved in the maturation of the immune system associated with intestinal mucosa. The Bacteroides spp. could have probiotic activity in two different ways: producing inhibitory substances against other components of intestinal microbiota (bacteriocins, secondary metabolites…) or stimulating the immune system, increasing the nonspecific defenses of host (immune-modulators). Using the collection of Bacteroides spp. of CReSA, in this work different in vitro studies were conducted to select strains, looking for the absence of negative characteristics and the presence of positive characteristics, to be used for the in vivo studies on rabbits during the lactation period and to analyze their role as probiotic. The presence of resistances against antimicrobials, especially when transferable markers were present, was the most restrictive characteristic for the selection of the strains that were analyzed in vivo. After the selection of four strains, the in vivo study on a commercial farm was conducted, examining the effect on the intestinal microbiota and on different immune parameters. By the analysis of the obtained results can be inferred that some of the tested strains may be candidates for the development of probiotics for rabbit.

La afasia se define como un déficit en la comunicación verbal resultante de un daño cerebral adquirido. Dicho déficit puede presentarse como una dificultad en su forma expresiva, receptiva o de manera simultánea. Dentro de las principales condiciones neurológicas capaces de producir esta alteración del lenguaje, se resalta a los Accidentes Vasculares Cerebrales (AVC) como etiología más frecuente. La depresión es el trastorno emocional más frecuente tras un AVC, mayoritariamente en afasia de predominio expresivo, y este trastorno limita potencialmente la participación y recuperación del paciente ante su rehabilitación. Actualmente, en el marco de la rehabilitación logopédica, los factores de intensidad y precocidad juegan un papel relevante ante el planteamiento de un diseño óptimo de intervención. Objetivo. Determinar la influencia de la variable sintomatología depresiva a lo largo de tratamiento logopédico en pacientes con distintas tipologías de afasia. Asimismo, se pretende investigar los posibles efectos de la intensidad en rehabilitación sobre la mejoría funcional del lenguaje. Por último, observar si la duración del tratamiento es un elemento determinante ante el avance de la terapia. Material y Método. La muestra definitiva, de un total de 115 primeras visitas realizadas, está constituida por 14 pacientes. Se han utilizado el Test de valoración del lenguaje Boston, para valorar la intensidad y tipología de trastorno afásico, y el Inventario de Depresión de Beck (BDI) como indicador de la presencia/ausencia y severidad del trastorno afectivo. Adicionalmente, se administra una prueba subjetiva, mediante escala visual analógica (VAS), sobre la intensidad de la terapia. El sistema estadístico utilizado para el análisis de datos ha sido el SPSS versión 19.0. Resultados. Los resultados apuntan que los pacientes con afasia que presentan una alteración afectiva, obtienen resultados inferiores en la recuperación del lenguaje en comparación a los pacientes con afasia sin alteración afectiva o con sintomatología leve. Las funciones lingüísticas de denominación, escritura y lectura, son las que se hayan más afectadas y pueden presentar un peor pronóstico. Los pacientes con depresión post ictus (DPI) no reducen su sintomatología depresiva de forma significativa al realizar un tratamiento logopédico no intensivo. Una vez finalizado el tratamiento logopédico, los pacientes con afasia y sintomatología depresiva leve, moderada o grave o sin depresión que han realizado un tratamiento no intensivo, obtienen resultados favorables respecto al grupo que ha realizado un tratamiento intensivo. Los resultados señalan que los pacientes con afasias motoras presentan una mayor tolerancia ante una intervención logopédica intensiva respecto a los pacientes con afasias globales. Conclusiones. Ante el factor de la DPI, se plantea realizar una intervención endógena y ambiental con el fin de obtener mejoras sustanciales en el proceso de recuperación de las funciones lingüísticas. Un tratamiento superior a los seis meses y realizado de manera no intensiva favorece la recuperación de lenguaje en pacientes con afasia y DPI. El factor de la intensidad en rehabilitación logopédica respecto a la reducción de sintomatología depresiva, debe servir como punto de partida para futuras investigaciones. / Aphasia is defined as impairment in verbal communication resulting from an acquired brain injury. This impairment may present itself as a difficulty in its expressive, receptive or simultaneous form. Among the main neurological conditions that can produce this change in language, Cerebrovascular Accidents (CVA) are highlighted as the most common etiology. Depression is the most common emotional disorder after suffering a stroke, mostly in predominantly expressive aphasias, and this disorder severely limits participation and patient recovery in his/her rehabilitation. Currently/Nowadays, in the context of speech therapy rehabilitation intensity factors and precocity play an important role facing the approach of an optimal design of intervention. AIM. To determine the influence of the depressive symptomatology variable over speech therapy in patients with different types of aphasia. As well, to investigate the possible effects of the intensity of rehabilitation on language’s functional improvement. Finally, observe if the duration of treatment is a key factor to the progress of therapy. Materials and Method. The final sample, after a total of 115 first visits, consists of 14 patients. The Boston Diagnostic Aphasia Examination (BDAE) was used to assess the intensity and typology of the aphasic disorder, and the Beck Depression Inventory (BDI) as an indicator of the presence / absence and severity of the mood disorder. Additionally, a subjective test is performed by Visual Analogue Scale (VAS) on the therapy’s intensity. The statistical framework for data analysis was SPSS version 19.0. Results. The results suggest that patients with aphasia that present an affective disorder obtain lower scores on language recovery in comparison to patients with aphasia without mood disorder or with a mild symptomatology. Linguistic functions of naming, reading and writing, are those that have been most affected and may have a worse prognosis. Patients with Post-Stroke Depression (PSD) do not reduce their depressive symptoms significantly after carrying out a non-intensive speech therapy. Once finished the speech therapy, patients with aphasia and mild, moderate or severe depressive symptomatology or without depression that have performed a non-intensive treatment, obtain favorable results compared to the group who has made an intensive treatment. The results indicate that patients with motor aphasia have a higher tolerance for intensive speech therapy compared to patients with global aphasia. Conclusions. Given the factor of PSD, it is proposed to perform an endogenous and environmental intervention in order to obtain substantial improvements in the recovery of language functions. Treatment for a period over 6 months and performed non-intensively promotes recovery of language in patients with aphasia and PSD. The intensity factor in speech rehabilitation regarding reducing depressive symptoms, could be used as a starting point for future research.

La presente tesis doctoral está motivada por el interés que los Estudios Sociales de la Ciencia y la Tecnología han mostrado por la participación pública y su papel en la 'democratización de la democracia' a través de la 'democratización de la ciencia y la tecnología'. El estudio forma parte del Proyecto 'Ciencia, Tecnología y Ciudadanía en las Sociedades del Conocimiento', cuyo objetivo es comprender la mutua transformación entre controversias tecno-científicas y controversias públicas. Concretamente, los objetivos de la tesis doctoral son: (1) Incrementar el conocimiento sobre la comprensión pública de las controversias tecno-científicas, (2) Conocer las estrategias que los ciudadanos despliegan para participar en debates públicos junto con expertos, (3) Incrementar la comprensión de los actores implicados en el control de la información públicamente disponible sobre las disputas. La pregunta de investigación es la siguiente: De qué manera las personas corrientes y los analistas sociales identifican y aceptan a determinados actores como miembros del público en la participación pública? Con esta pregunta en mente, se propone un acercamiento a la comprensión y producción de la participación pública que se inspira en la Sociología de la Capacidad Crítica, la Propuesta Cosmopolítica y la perspectiva performativa de Bruno Latour. A partir de este marco teórico se describe un método a través del cual las personas constituyen el público de un determinado asunto. Este método se denomina 'Regímenes de Participación Legítima' (RPL), una forma de conocimiento práctico que incluye un conjunto de principios dicotómicos de evaluación de participantes. La idea de RPL no es una categoría deductiva, sino una categoría que se desarrolla ex post facto, para nombrar un fenómeno presente en tres artículos ya publicados. La tesis doctoral se divide en cuatro capítulos. El capítulo 1 expone los objetivos, la pregunta de investigación y el marco teórico del estudio. El capítulo 2 incluye dos artículos centrados en la participación pública en controversias tecno-científicas. En el primer artículo (Sección 2.1.) se analizan datos provenientes de once grupos de discusión realizados en Cataluña en 2006. Mediante un análisis del contenido se explora lo que la gente quiere decir por 'ciudadanía' cuando hablan de 'participación ciudadana'. El segundo artículo (Sección 2.2.) se basa en el análisis de seis de los once grupos antes mencionados. En él se introduce una aproximación pragmática a los datos con la que se muestra que, en una situación comunicativa dada, los participantes del estudio usan categorías espaciales para identificar grupos relevantes. El capítulo 3 incluye un artículo enfocado en la forma como diferentes organizaciones usan la Web para participar en debates sobre el agua en España y definir los temas a tratar. El capítulo 4 discute los resultados más importantes de las secciones 2.1., 2.2. y 3.1. En este último capítulo se delinea la estructura de los RPL, se responde abiertamente a la pregunta de investigación y se resaltan las implicaciones de los RPL para la 'democratización de la ciencia y la tecnología'. Adicionalmente, se sugieren futuras vías de investigación. / The given PhD dissertation is motivated by the interest that Science and Technology Studies have shown in public participation and its role in the 'democratisation of democracy' through the 'democratisation of science and technology'. It was developed in connection with the R+D+i Project 'Science, Technology and Citizenship in Knowledge Societies', which main goal was to sheet light to the transformation of public controversies into techno-scientific controversies, and vice versa. More specifically, the objectives of this dissertation are: (1) Increasing knowledge about the public understanding of the techno-scientific controversies, (2) Getting to know the strategies that citizens deploy to participate in the public disputes together with scientists and technologists, and (3) Increasing understanding of the players involved in the control of publicly available information on the disputes. The research question is the following: How do ordinary people and social analysts identify and accept players with the right to take the part of the public in public participation? With this research question in mind, the author propose an approach to the understanding and shaping of public participation which is mainly inspired by the Sociology of Critical Capacity, the Cosmopolitical Proposal and performative approach of Bruno Latour. Drawing on this theoretical framework a particular method that ordinary people and social analysts use in the constitution of the public of an issue is described. Such a method is called 'Regime of Legitimate Participation' (RLP), a form of practical knowledge which includes a set of dichotomous principles of participant's evaluation. The RLP is not a deductive category applied to the data. Instead, it is an emergent category developed ex post facto, as a notion with which a phenomenon grasped by three published papers – although initially not addressed enough in them – can be named. This dissertation is divided into four chapters. Chapter 1 exposes the objectives, research question and theoretical framework of the PhD dissertation. Chapter 2 includes two papers concerned with the public understanding of citizen participation in techno-scientific controversies. In the first paper (Section 2.1.) the data come from a set of eleven focus groups carried out in Catalonian during 2006. A qualitative content analysis aims to explore what 'citizenship' means when people speak about 'citizen participation'. The second paper (Section 2.2.) is based on the analysis of six of the eleven focus groups mentioned above. It introduces a pragmatic approach to the data showing that, in a given communicative context, participants in our study use space labels in order to identify those groups whose activities are regarded as relevant by the speakers when they are talking about 'water problems'. Chapter 3 introduces a paper focused on the way different organisations exploit the Web with the aim to participate in the debates about water policy in Spain and to define the topics involved. Chapter 4 discusses the most important outcomes of the Sections 2.1., 2.2. and 3.1. In this final Chapter, the structure and operation of the RLP are outlined. The answer to the research question is then openly stated, and implications of the RLP for the 'democratisation' of science and technology come to the fore. Future lines of enquiry are suggested.

Cerca del 80% de los aceites y las grasas producidas mundialmente son aceites vegetales y el resto de origen animal. Dicha cantidad de ácidos grasos sirve como fuente para la producción de una serie de compuestos nuevos: diácidos o epóxidos de cadena larga o ácidos grasos omega-hidroxilados. Pseudomonas aeruginosa 42A2 es un bacilo gramnegativo que produce ácidos grasos trans-hidroxilados (HFA) a partir del ácido oleico cuando es cultivado en un medio mineral. Dichos HFA, los ácidos 10(S)-hidroxi-8(E)-octadecenoico ((10S)-HOME) y 7,10(S,S)-dihidroxi-8(E)-octadecenoico ((7S,10S)-DiHOME), son producidos a través de un sistema de aireación no dispersivo que permite una mayor oxigenación y homogeneidad del medio de cultivo en los que son producidos. Tanto es así que se han conseguido unos valores de productividad para estos HFA de 0.29 y 0.31 g•L-1•h-1, respectivamente. Éstos han sido purificados a unos niveles superiores del 91% para poder ser polimerizados y obtener estólidos, poliésteres de trans-HFA. Por medio de una búsqueda exhaustiva, se decidió que Novozym 435, lipasa B de Candida antarctica, era la lipasa ideal para realizar dicha polimerización in-vitro. En una primera aproximación, se sintetizaron estólidos a partir de (10S)-HOME en medio orgánico, n-hexano. Se optimizó las condiciones de reacción y el mayor rendimiento obtenido fue del 30%. Esta nueva generación de estólidos trans ha requerido unas nuevas técnicas analíticas. Estos poliésteres han sido analizados a través de MALDI-TOF-MS utilizando una matriz de DHB neutralizada con LiOH, ya que, el ion 7Li+ ayuda a estabilizar dichos compuestos y por ende obtener espectros de masas menos fragmentados. Dicha técnica estructural ha resultado ser más rápida y barata que una LC-MS convencional. Dímeros del derivado monohidroxilado fueron sintetizados. En una segunda aproximación, se sintetizaron estólidos a partir de (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME en medio libres de disolventes orgánicos usando Novozym 435. Rendimientos del 71 y del 94% de conversión, respectivamente, fueron obtenidos después de optimizar los medios de reacción. Estos estólidos fueron analizados por MALDI-TOF-MS con una matriz de DHB saturada en acetonitrilo para incrementar la sensibilidad de los oligómeros de mayor peso molecular. Mediante esta técnica se llevaron a detectar oligómeros de hasta 6 y 7 unidades monoméricas, respectivamente. Así mismo se usó la RMN para determinar la estructura de los compuestos analizados con gran éxito. Finalmente, se decidió sintetizar etil ésteres de los ácidos (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME debido a las propiedades aromáticas. Estos ésteres se sintetizaron en medio orgánico, cloroformo, y en un medio libre de disolventes con unos rendimientos totales, en ambos casos. Dichos etil ésteres fueron analizados por MALDI-TOF-MS y RMN para determinar su masa molecular y estructura, respectivamente. Finalmente, se realizó un estudio de diversas propiedades físico-químicas de estos compuestos obtenidos. La viscosidad y diversos parámetros calorimétricos obtenidos a partir de curvas DSC y TGA fueron determinados para saber de la naturaleza de esta nueva generación de ésteres. / About 80% of the oil and fats produced worldwide are vegetable oils and the rest are from animal origin. This amount of fatty acids is used as a source for producing new compounds: long chain diacids or epoxides or omega-hydroxylated fatty acids. Pseudomonas aeruginosa 42A2 is a gramnegative bacillus which produces hydroxy-fatty acids (HFA) when is cultivated in a mineral médium using oleic acid as carbon source. These HFA, 10(S)-hydroxy-8(E)-octadecenoic acid ((10S)-HOME) and 7,10(S,S)-dihidroxi-8(E)-octadecenoic acid ((7S,10S)-DiHOME), are produced with a non-dispersive aeration system that enhanced oxygenation and homogeneity of the culture media. The following volumetric productivity for these HFA were achieved: 0.29 y 0.31 g•l(-1)•h(-1), respectively. These HFA were purified with levels higher than 91% of purity for being later polymerizated and obtaining estolides, polyesters of HFA. For that purpose Novozym 435, lipase B from Candida antarctica, was chosen among other lipases to performance this enzymatic reaction. First of all, (10S)-HOME estolides were synthesized in organic media, n-hexane. Reaction conditions were optimized, reaching a 30% reaction yield. This new family of trans-estolides required adapted analytical techniques. These polyesters were analyzed with MALDI-TOF-MS using a DHB matrix neutralized with LiOH. 7Li+ ion stabilizes such compounds and less fragmented mass spectra were observed. This technique was less time-consuming than LC-MS. Dimers of the monohydroxylated compound were produced. Secondly, estolides from (10S)-HOME y (7S,10S)-DiHOME were synthesized in a solvent-free media using Novozym 435. Reaction yields of 71 and 94% were reached, respectively, after optimizing reaction media. These compounds were analyzed by MALDI-TOF-MS using a DHB matrix saturated in acetonitrile for detecting higher mass oligomers. This technique could detect oligomers composed of 6 and 7 monomeric units, respectively. Moreover, NMR were also used to determine the structure of these polyesters. Thirdly, trans-HFA ethyl esters were synthesized due to their aromatic properties. Such esters were produced in organic media, chloroform, and in a solvent-free media, in both cases with a total conversion. trans-HFA ethyl esters were analyzed by MALDI-TOF-MS and NMR for determing their molecular mass and structure, respectively. Finally, a physicochemical study of these compounds, estolides and ethyl ester, was carried out. Viscosity and some calorimetric parameters from DSC and TGA curves were determined.

Los datos acerca de las leishmaniosis y sus vectores, los flebotomos, en las Islas Baleares son escasos y focalizados. La tasa global de casos humanos (LH) se sitúa entre los 0,7-3,5 casos anuales/100.000 habitantes y la prevalencia de la leishmaniosis canina (LCan) varía entre el 0 y el 45%, dependiendo de la isla y de la población analizada. Se han identificado cinco especies de flebotomos en las islas, pero no se dispone de un estudio extensivo de su distribución y densidad. El objetivo general de esta tesis es profundizar en el conocimiento de la epidemiología de la leishmaniosis en Mallorca y Menorca, que presentan un grado de endemicidad diferente, ausente de Menorca y con una prevalencia elevada en Mallorca. La metodología ha variado en función de los objetivos específicos planteados. Para el estudio de la infección natural por leishmania de los vectores se ha aplicado una PCR-anidada y para analizar la utilidad de dicha técnica en estudios epidemiológicos se ha observado, además, el estado de digestión sanguínea de las hembras de flebotomos. La identificación de la especie de Leishmania se llevó a cabo mediante RFLP. Para obtener datos de la LCan se ha realizado una encuesta a los veterinarios de las Islas Baleares y un estudio serológico prospectivo a perros de la isla de Menorca. El estudio de los vectores, Phlebotomus perniciosus, se ha llevado a cabo mediante capturas con trampas adhesivas durante el periodo estival. Resultados:. El 38,7% de las hembras analizadas presentaron una PCR-anidada positiva para leishmania, variando entre el 0% y el 78% de acuerdo al grado de LH y y LCan en el área. Se observó un incremento significativo del riesgo de positividad en la PCR-anidada al incrementar el grado de digestión sanguínea (OR = 1,3; p = 0,025). El genotipado permitió identificar a L. infantum en todos los casos. El análisis retrospectivo de la LCan en las Islas Baleares permitió observar que el 50% de los veterinarios opinaba que la incidencia de la LCan no había sufrido cambios. Sin embargo, el 50% de los veterinarios de Menorca consideraban que la LCan había incrementado y el 100% consideraba que los nuevos casos diagnosticados eran autóctonos. El estudio serológico transversal, mostró una tasa de seroprevalencia del 24% en la isla, siendo del 31% en los perros locales sin antecedentes de desplazamientos a zonas endémicas. El estudio entomológico permitió detectar la presencia de Phlebotomus perniciosus, uno de los vectores de L. infantum en la región mediterránea. En Menorca se capturó entre 31–161 m, con una frecuencia del 56,8%, y en Mallorca entre 6-772 m, con una frecuencia de 69,4%. La densidad en Menorca disminuyó significativamente con respecto a un estudio anterior. El análisis estadístico en ambas islas permitió observar que P. perniciosus se localiza preferentemente alejada de los núcleos urbanos y que su presencia está además influenciada por la flora adyacente y el tipo de muro donde se colocan las trampas. Conclusiones: La PCR-anidada, en combinación con el análisis de la digestión sanguínea, se muestra útil para estudios epidemiológicos de las leishmaniosis. En Menorca se ha detectado un foco autóctono de LCan, cuya emergencia no parece estar relacionada con un aumento en la densidad de P. perniciosus, sino con la introducción continua de perros infectados con leishmaniosis. En ambas islas el vector se encuentra ampliamente distribuido, con el consecuente riesgo de transmisión de la leishmaniosis. En Mallorca hay una mayor probabilidad de encontrarlo a altitudes entre 51-150 m, en presencia de garriga, en los límites de poblaciones y entre éstas y en la proximidad de granjas de ovejas. / Data on leishmaniosis and its vectors (sandflies) in the Balearic Islands are scarce and focused. The overall rate of human leishmaniosis (HL) is 0.7-3.5 cases per year/100,000 inhabitants, and the prevalence of canine leishmaniosis (CanL) varies between 0 and 45%, depending on the island and the population tested. Five species of sandflies have been identified in the islands, but their distribution and density have not been extensively studied to date. Objective: To obtain a greater understanding of the epidemiology of leishmaniosis in Majorca and Minorca, which show different degrees of endemicity. Results: In the application of a nested-PCR (n-PCR) to determine leishmania parasitism, 38.7% of analysed female sandflies tested positive, ranging from 0% to 78% according to the presence of CanL and HL. The probability of a positive n-PCR increased significantly with the degree of blood digestion (P=0.025 OR=1.3). Genotyping (RFLP) allowed Leishmania infantum identification in all cases. In response to a questionnaire on CanL trends, 50% of participating Balearic Island veterinarians thought its incidence had not changed overtime. However, in Minorca 50% of veterinarians considered CanL to be increasing, while 100% thought that the newly diagnosed cases were autochthonous. A cross-sectional serological study in Minorca showed an overall seroprevalence rate of 24%, or 31% in local dogs with no history of having travelled to endemic areas. The entomological study employing sticky traps in Minorca and Mallorca confirmed the presence of Phlebotomus perniciosus, vector of L. infantum. In Minorca, it was captured with a frequency of 56.8% at 31-161 m.a.s.l. and in Majorca of 69.4% at 6-772 m.a.s.l. The density in Minorca was significantly lower compared to a previous study. The statistical analysis of both islands showed that P. perniciosus is mainly located far from urban settlements, and its presence is also influenced by the type of adjacent flora and wall construction. Conclusions: n-PCR coupled with blood digestion analysis is a useful technique for epidemiological studies of leishmaniosis. The emergence and establishment of an autochthonous focus of CanL in Minorca is apparently related with the continuous introduction of leishmaniosis-infected dogs rather than an increase in P. perniciosus density. The vector was found throughout both islands, with the consequent risk of leishmaniosis transmission. In Majorca, P. perniciosus is most likely found at altitudes of 51-150 m.s.a.l., in garrigue vegetation, between and at the edge of settlements, and in the proximity of sheep farms.

The complex voluntary motor behavior of higher primates is often regarded as a consequence of the development of sophisticated and adaptive perceptual and motor systems. Theoretical and behavioral investigations suggest that the control of motor acts involves a sequence of neural operations that select, plan and execute a movement. The visuomotor system integrates visual and proprioceptive signals to exert control on visually-guided actions, which generally allows to efficient localization of the stimuli and generation of the appropriate motor commands. Although the last two decades have witnessed a considerable progress on the understanding of the neural basis of visuomotor control, the shortage of the literature assessing directly this process boost the necessity of developing new spatio-temporal frameworks of how this process might work. The present dissertation is focused on providing strong insights about the neural and behavioral aspects subserving the use of spatio-temporal information through vision and proprioception to accomplish accurate goal-directed actions. This dissertation encloses five different studies to shed some light on these issues, by combining neuroimaging and psychophysical tools. These empirical data are presented in Chapters 3 to 7, in the form of five articles. Two studies (Chapters 3 and 4) addressed object localization in reaching, by investigating the neural and behavioral mechanisms by which the integration of visual motion affects the execution of hand movements. We demonstrate that visual illusory percepts affect the hand trajectory toward a misperceived object, in a form that casts some doubts on the suitability of feedback circuits to sustain early motion-position interaction. Two other independent studies (Chapter 5 and 6) focused on the coding of hand location, by examining how the use of proprioception and the felt position of the arm influenced our temporal and spatial accuracy in interception. We uncover an increase in the weighting of proprioceptive signals when intercepting objects under poor visual conditions. In addition, the study of Chapter 6 reveals that proprioceptive cues of the hand location completely adapted to induced displacements of the visual input of the hand. The last study (Chapter 7) dealt with the online monitoring of a reaching movement. We have indentified a causal structure/function relationship between deficits in online motor control and the induction of inhibitory plastic changes over the medial intraparietal sulcus, suggesting this area as the neural locus in charge of the ability to update a motor command. We have found anatomical differences in white matter parietofrontal pathways responsible for the individual differences in the impairment of the online motor control. Taken together, the research presented here strengthens the idea that our visuomotor system acts as a coordinated system that efficiently encodes relevant spatial and temporal features at different neural levels to ascertain a precise reaching behavior. Moreover, the combination of the sensory inputs that provide this information seems to depend on the reliability of the sensory source. I hope the work presented here will encourage the reader to explore deeper in the many aspects of this part of the brain still unrevealed. / El complejo comportamiento motor voluntario de los primates superiores a menudo se considera como una consecuencia del desarrollo de complejos y adaptativos sistemas perceptuales y motores. Estudios teóricos y conductuales sugieren que el control de los actos motores implica una secuencia de operaciones neuronales que seleccionan, planifican y ejecutan un movimiento. El sistema visomotor integra señales visuales y propioceptivas para ejercer control sobre las acciones guiadas visualmente, permitiendo la localización eficiente de los estímulos y la generación de las órdenes motoras apropiadas. Aunque las dos últimas décadas fueron testigo de un progreso considerable en la comprensión de las bases neuronales del control visomotor, la escasez de bibliografía abordando directamente este proceso impulsa la necesidad de desarrollar nuevos marcos espacio-temporales de cómo podría funcionar el control visomotor. Esta tesis se centra en proporcionar conocimientos robustos sobre los aspectos neurales y conductuales que promueven el uso de información espacio-temporal a través de la visión y la propiocepción, con el fin de realizar certeras acciones dirigidas a objetos. Esta tesis encierra cinco estudios diferentes para arrojar luz sobre estas cuestiones, mediante la combinación de psicofísica y técnicas de neuroimagen. Los datos empíricos se presentan en los capítulos 3 a 7, en forma de cinco artículos. Dos estudios (Capítulos 3 y 4) abordan la localización de objetos en acciones para alcanzarlos, mediante la investigación de los mecanismos neurales y conductuales por los que la integración de movimiento visual afecta la ejecución de movimientos manuales. Demostramos que las percepciones ilusorias visuales afectan la trayectoria de la mano hacia un objeto erróneamente percibido, y también cuestionan la idoneidad de los circuitos ‘feedback’ para explicar la temprana interacción movimiento-posición. Otros dos estudios independientes (Capítulos 5 y 6) se centran en la codificación de la posición de la mano, mediante el examen de como el uso de la propiocepción y la posición sentida del brazo influenciaron nuestra precisión temporal y espacial interceptando un objeto. Descubrimos un aumento en la ponderación de las señales propioceptivas al interceptar objetos bajo pobres condiciones visuales. Además, el estudio del Capítulo 6 revela que las señales propioceptivas de la ubicación de la mano se adaptaron completamente a desplazamientos inducidos de la información visual de la misma. El último estudio (Capítulo 7) se ocupó de la monitorización ‘online’ de un movimiento, mediante la identificación de una relación causal estructura/función entre los déficits en el control motor y la inhibición del surco intraparietal medial, lo que sugiere este área como la zona responsable de la capacidad de actualizar un comando motor. También identificamos diferencias anatómicas en los tractos parietofrontales de materia blanca causantes de las diferencias individuales en el deterioro del control motor. En conjunto, la investigación presentada aquí refuerza la idea de que nuestro sistema visomotor actúa como un sistema coordinado que codifica de manera eficiente las características espaciales y temporales correspondientes a diferentes niveles neuronales para conseguir un preciso comportamiento motor. Además, la combinación de las vías sensoriales que proporcionan esta información parece depender de la fiabilidad de la fuente sensorial. Espero que el trabajo aquí presentado anime al lector a explorar más profundamente en los diversos aspectos de esta parte del cerebro todavía no revelados.

Introducció: Històricament, encara que la presència d’alteracions cognitives en l’esclerosi múltiple (EM) ja va ser descrita per Charcot a finals del segle XIX, no ha estat fins fa pocs anys que ha cobrat especial rellevància. S’estima una freqüència del 40-60% de disfunció cognitiva en la població general que pateix aquesta malaltia i, més recentment, d’aproximadament el 27-57%, en pacients amb síndromes neurològics aïllats (SNA), segons diferents criteris de referència. Els objectius del present treball van ésser: avaluar i caracteritzar el perfil neuropsicològic d’una mostra de pacients amb SNA, comparat amb subjectes sans, mitjançant una bateria extensa de proves, identificar els instruments de mesura cognitiva més sensibles per detectar alteració, estudiar la relació entre les variables cognitives, clíniques i de ressonància magnètica (RM), descriure els canvis neuropsicològics presents en aquests pacients al cap d’un any, i identificar els factors basals que poden predir millor la conversió a EM als cinc anys de seguiment. Mètode: Es van incloure pacients amb SNA atesos al nostre centre, durant els anys 2002 i 2004, que van decidir participar en aquest estudi, de forma consecutiva. Es van recollir les dades sociodemogràfiques i clíniques, entre els tres i cinc mesos després de l’esdeveniment Es va administrar una bateria extensa de proves neuropsicològiques i qüestionaris per avaluar les funcions cognitives i l’estat d’ànim, a més d’estudis de RM. A efectes d’aquest treball, es va considerar com error en una prova determinada, si la puntuació es trobava per sota del percentil 5. Així mateix, es va definir la presència d’alteració cognitiva com l’errada en més de tres proves del total de la bateria. Es van calcular els estimadors de sensibilitat i especificitat dels instruments d’avaluació neuropsicològica, segons la nostra definició d’alteració cognitiva. Es van crear també set dominis cognitius, a partir de les proves emprades, i es va establir com a punt de tall si el 20% de les proves que conferien un domini en particular estaven alterades. Al cap d’un any, els pacients van repetir les proves neuropsicològiques. Es va realitzar un anàlisi de supervivència de la nostra població de pacients amb SNA, tenint en compte les variables clíniques, cognitives i de neuroimatge. Resultats: En el moment basal, 53 pacients amb SNA van decidir participar en aquest estudi (70% dones; edat mitjana, 31 anys; 55% amb bandes oligoclonals positives; el 63% amb almenys un criteri de Barkhof). No es van observar diferències estadísticament significatives entre els casos i els vint-i-quatre controls en les dades sociodemogràfiques i en les variables d’estat d’ànim; però, es van trobar diferències en velocitat motora (test de Finger Tapping en mà dominant [p=0,008]) i en la discriminació de formes del California Computerized Assessment Package (CALCAP) [p=0,017]. Si bé, un major percentatge de pacients va presentar alteració cognitiva (8/ 53 [15%]) comparat amb els controls (2/ 24 [8,3%]), aquesta diferència no va estar significativa. El CALCAP, el Trail Making Test (TMT) i el Wisconsin Card Sorting Test (WCST) es van presentar com les proves diagnòstiques amb més probabilitat de classificar correctament als nostres subjectes. Malgrat això, la combinació del Symbol Digit Modalities Test (SDMT) i del TMT va ser millor en relació a la sensibilitat/ especificitat i temps d’administració dels test. Els pacients amb dèficit cognitiu van obtenir pitjors puntuacions en atenció i velocitat de processament de la informació (p=0,001), memòria (p=0,020), llenguatge (p=0,033) i funcionament executiu (p=0,000), comparats amb els pacients preservats. No vam observar relació entre la presència d’alteració cognitiva i la RM patológica, tant pel que fa als paràmetres convencionals (criteris de Barkhof, atròfia) com no convencionals (espectroscòpia i transferència de magnetització). Als dotze mesos, va existir una clara millora de l’estat d’ànim i en la major part de les variables cognitives dels 46 pacients amb SNA revaluats; probablement, per l’efecte de pràctica. Als 60 mesos, 32/ 53 (60%) dels pacients amb SNA van desenvolupar una EM segons els criteris de McDonald. En un model de regressió de Cox, l’alteració cognitiva definida com l’errada en ≥3 o >3 test no va ésser predictiva de conversió; en canvi, sí que ho va ser la presència de 1-2 i 3-4 criteris de Barkhof. Conclusió: La prevalença d’alteració cognitiva es va estimar una mica inferior, al voltant del 15% (8/ 53), en la nostra sèrie de pacients amb SNA, en comparació amb altres treballs publicats. Les funcions cognitives que es van trobar alterades van ser l’atenció i velocitat de processament de la informació, memòria, llenguatge i funcions executives. El SDMT i el TMT van proporcionar una millor combinació entre sensibilitat/ especificitat i temps d’administració dels test. L’alteració cognitiva en el moment basal no va ser predictiva de conversió a EM i no vam observar relació entre el dèficit cognitiu i paràmetres de RM. / Introducción: Históricamente, aunque la presencia de alteraciones cognitivas en la esclerosis múltiple (EM) ya fue descrita por Charcot a finales del siglo XIX, no ha sido hasta hace pocos años que ha cobrado especial relevancia, estimándose una frecuencia del 40-60% de disfunción cognitiva en la población general que padece esta enfermedad y, más recientemente, de aproximadamente el 27-57%, en pacientes con síndromes neurológicos aislados (SNA), según diferentes criterios de referencia. Los objetivos del presente trabajo fueron: evaluar y caracterizar el perfil neuropsicológico de una muestra de pacientes con SNA, comparado con sujetos sanos, mediante una batería extensa de pruebas, identificar los instrumentos de medida cognitiva más sensibles para detectar alteración, estudiar la relación entre las variables cognitivas, clínicas y de resonancia magnética (RM),describir los cambios neuropsicológicos presentes en estos pacientes al cabo de un año, e identificar los factores basales que pueden predecir mejor la conversión a EM a los cinco años de seguimiento. Método: Se incluyeron pacientes con SNA atendidos en nuestro centro, durante los años 2002 y 2004, que decidieron participar en este estudio, de forma consecutiva. Se recogieron los datos sociodemográficos y clínicos, entre los tres y cinco meses después del evento. Se les administró una batería extensa de pruebas neuropsicológicas y cuestionarios para evaluar las funciones cognitivas y el estado de ánimo, además de estudios de RM. A efectos del presente trabajo, se consideró como fallo en una prueba determinada, si la puntuación se hallaba por debajo del percentil cinco. Asimismo, se definió la presencia de alteración cognitiva como el fallo en más de tres pruebas del total de la batería. Se calcularon los estimadores de sensibilidad y especificidad de los instrumentos de evaluación neuropsicológica, según nuestra definición de alteración cognitiva. Se crearon también siete dominios cognitivos, a partir de las pruebas utilizadas, y se estableció como punto de corte si el 20% de las pruebas que conferían un dominio en particular estaban alteradas. Al cabo de un año, los pacientes repitieron las pruebas neuropsicológicas. Se realizó un análisis de supervivencia de nuestra población de pacientes con SNA, teniendo en cuenta las variables clínicas, cognitivas y de neuroimagen, al cabo de cinco años de seguimiento. Resultados: En el momento basal, 53 pacientes con SNA decidieron participar en este estudio (70% mujeres; edad media, 31 años; 55% con bandas oligoclonales positivas; 63% con al menos un criterio de Barkhof). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los casos y 24 controles en los datos sociodemográficos y en las variables de estado de ánimo; sin embargo, se hallaron diferencias en velocidad motora (test de Finger Tapping en mano dominante [p=0,008]) y en la discriminación de formas del California Computerized Assessment Package (CALCAP) [p=0,017]. Si bien, un mayor porcentaje de pacientes presentó alteración cognitiva (8/ 53 [15%]) comparado con los controles (2/ 24 [8.3%]), esta diferencia no resultó ser significativa. El CALCAP, el Trail Making Test y el Wisconsin Card Sorting Test (WCST) se presentaron como las pruebas diagnósticas con mayor probabilidad de clasificar correctamente a nuestros sujetos. Sin embargo, la combinación del Symbol Digit Modalities Test (SDMT) y del TMT resultó mejor en cuanto a sensibilidad /especificidad y tiempo de administración de los test. Los pacientes con déficit cognitivo obtuvieron peores puntuaciones en atención y velocidad de procesamiento de la información (p=0,001), memoria (p=0,020), lenguaje (p=0,033) y funcionamiento ejecutivo (p=0,000), comparados con los pacientes preservados. No observamos relación entre la presencia de trastorno cognitivo y la RM patológica, tanto para parámetros convencionales (criterios de Barkhof, atrofia) como no convencionales (espectroscopia y transferencia de magnetización). A los doce meses, existió una clara mejora en el estado de ánimo y en la mayor parte de las variables cognitivas de los 46 pacientes con SNA re-evaluados; probablemente, por el efecto de práctica. A los 60 meses, 32/ 53 (60%) de los pacientes con SNA desarrollaron una EM según los criterios de McDonald. En un modelo de regresión de Cox, la alteración cognitiva definida por el fallo en ≥3 o en >3 test no resultó predictiva de conversión; en cambio, sí lo fueron la presencia de 1-2 y 3-4 criterios de Barkhof. Conclusión: La prevalencia de alteración cognitiva se estimó algo inferior, alrededor del 15% (8/ 53), en nuestra serie de pacientes con SNA, en comparación con otros trabajos publicados. Las funciones cognitivas que se hallaron alteradas fueron la atención y velocidad de procesamiento de la información, memoria, lenguaje y funciones ejecutivas. El SDMT y el TMT proporcionaron una mejor combinación entre sensibilidad /especificidad y tiempo de administración de los test. La presencia de déficit cognitivo en el momento basal no fue predictivo de la conversión a EM y no observamos relación entre déficit cognitivo y parámetros de RM. / Background: Although cognitive decline in patients with multiple sclerosis (MS) had been noted at the end of the nineteenth century by Charcot, interest in this aspect of the disease is more recent. Cognitive decline is estimated to be present in 40-60% of the overall MS population and, according to more recent studies, in 27-57% of patients with clinically isolated syndrome (CIS). For the most part, studies of cognition have used different neuropsychological tests and definitions of normality. The objectives of the present study were as follows: to assess and characterize the neuropsychological profile of a sample of patients with CIS in comparison with healthy subjects using an extensive battery of tests; to identify the most sensitive cognitive measures for detecting cognitive decline; to study the relationship between cognitive, clinical and magnetic resonance imaging (MRI) variables; to describe neuropsychological changes present in these patients after 1 year of follow-up; and to identify whether baseline cognitive abnormalities predict conversion to MS after 5 years of follow-up. Methods: The study included consecutive patients with CIS who attended our center between 2002 and 2004 and who agreed to participate. Sociodemographic and clinical data were collected between 3 and 5 months after the event. In addition to MRI studies, patients were administered an extensive battery of neuropsychological tests and questions to assess cognitive function and mood. Failure in a given test was taken to be a score below the fifth percentile and cognitive decline was defined as failure in more than three tests of the battery. Sensitivity and specificity of the neuropsychological assessment were calculated according to our definition of cognitive decline. Seven cognitive domains, with associated tests, were defined. Decline in a given domain was established if participants failed in 20% (or 1 in 5) of the tests pertaining to that domain. After 1 year, the patients repeated the neuropsychological tests. A survival analysis was performed in our patients with CIS, taking into account clinical, cognitive and imaging variables after 5 years of follow-up. Results: At baseline, 53 patients with CIS agreed to participate in the study (mean age, 31 years, 70% women, 55% positive for oligoclonal bands, and 63% with at least 1 Barkhof criterion). No statistically significant differences were detected between the cases and 24 controls for sociodemographic variables or measures of mood, although there were differences in motor speed (Finger Tapping test) in the dominant hand [p=0.008]) and forms discrimination in the California Computerized Assessment Package [CALCAP] (p=0.017). A greater percentage of patients showed cognitive decline (8/53 [15%]) compared to controls (2/24 [8.3%]), but this difference was not statistically significant. The CALCAP, Trail Making Test (TMT) and Wisconsin Card Sorting Test (WCST) were the diagnostic tests most likely to correctly classify subjects with cognitive decline. However, the combination of Symbol Digit Modalities Test and the TMT seems to provide the best balance in terms of sensitivity/specificity and administration time. Patients with cognitive decline obtained worse scores on attention and information processing speed (p=0.001), memory (p=0.020), language (p=0.033) and executive function (p=0.000), compared with patients whose cognitive function remained intact. A relationship between presence of cognitive decline and abnormal baseline MRI was not noted. No differences were seen for atrophy or magnetization transfer ratio or magnetic resonance spectroscopy variables. The majority of the 46 CIS patients reassessed at 12 months showed a clear improvement in mood and most of the cognitive variables, probably due to a practice effect. After 60 months, 32/53 (60%) of the CIS patients developed MS according to the McDonald criteria. Cognitive decline defined as failure in ≥3 or in >3 tests was not predictive of conversion in a Cox regression model, unlike presence of 1-2 and 3-4 Barkhof criteria, which were predictive. Conclusions: The prevalence of cognitive decline was found to be somewhat lower, around 15% (8/53), in our series of CIS patients compared to other published studies. The cognitive functions affected were attention and information processing speed, memory, language, and executive function. A combination of SDMT and TMT provided the best combination between sensitivity and specificity and administration time of the tests. Presence of cognitive decline at baseline was not predictive of conversion to MS and not relationship between cognitive deficit and MR abnormalities was seen.

Este trabajo identifica a HERC2 como una proteína que se une a p53 y modula su actividad transcripcional mediante la regulación de su oligomerización. En una primera etapa, implementamos un sistema de geles en gradiente Tris-acetato que permitió el análisis de proteínas gigantes como HERC2 y otras de menor tamaño (hasta de 10 kDa) en un solo gel de electroforesis. Después, estudiamos el papel de HERC2 en la regulación de p53, mapeando los dominios involucrados en la interacción, evaluando los niveles de expresión, actividad transcripcional, localización subcelular y oligomerización de p53 en ausencia de HERC2, para demostrar finalmente que la expresión ectópica del dominio CPH de HERC2 es suficiente para promover la oligomerización de p53 y aumentar su actividad. También se demostró que una mutación patológica de HERC2, que origina un cambio de aminoácido en la posición 594 causa la inestabilidad de la proteína, reduciendo casi por completo su expresión. Esta mutación causa una enfermedad con un fenotipo muy similar al síndrome de Angelman. Con los fibroblastos de individuos afectados por la mutación en HERC2, realizamos ensayos para estudiar la actividad transcripcional de p53 encontrándola reducida. Finalmente, demostramos que los ratones knockout para Herc2 son letales en homocigosis, demostrando que Herc2 es un gen esencial en el desarrollo embrionario de los ratones. / This work identifies HERC2 as a protein that binds to p53 and modulates its transcriptional activity by regulating its oligomerization. As a first step, we developed an electrophoretic analysis using Tris-acetate polyacrylamide gels to detect giant proteins such as HERC2 and other smaller proteins (down to 10 kDa) in the same electrophoresis gel. Then, we found that HERC2 interacted with p53 and identified the domains involved in the interaction. Also, we evaluated the levels of expression, transcriptional activity, subcellular localization and oligomerization of p53 when HERC2 was depleted, to finally demonstrate that ectopic expression of HERC2 (CPH domain) was sufficient to promote the oligomerization of p53 and increase its activity. Also, we demonstrated that a HERC2 pathological mutation, which causes an amino acid change at position 594, induced the instability of the protein and reduced its expression. This mutation causes a disease similar to Angelman syndrome. Fibroblasts affected by the mutation in HERC2 have the transcriptional activity of p53 reduced. Finally, we showed that Herc2 knockout mice are lethal in homozygous, demonstrating that Herc2 is an essential gene in the embryonic development of mice.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb quists subcorticals, també anomenada MLC, és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel•lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. En la present tesi s’han generat i estudiat diferents models animals i cel•lulars per a l’estudi de la malaltia. En primer lloc, s’ha generat i s’ha caracteritzat un model de ratolí knock-out per a Mlc1. Gràcies a aquest model s’ha observat que la proteïna MLC1 és únicament astrocitària i que la proteïna GlialCAM no es independent de MLC1, ja que en absència d’aquesta es troba deslocalitzada en el cerebel. També s’ha pogut descriure per primer cop la implicació del canal de Cl- ClC-2 en la fisiopatologia, ja que els seus nivells de proteïna disminuixen en el cerebel i el canal es troba gairebé inactiu en els oligodendròcits de l’animal knock-out. Les característiques fenotípiques que presenta el model de ratolí equivalen a les característiques observades en els pacients en fases inicials de la malaltia, ja que l’animal tot i que mostra presència de vacuoles no presenta deteriorament motor i macrocefàlia aparent. També s’ha generat un model de peix zebra knock-out per a zmlc1. Aquest model presenta avantatges respecte el ratolí, com per exemple el baix cost o l’aplicació de tècniques genètiques a gran escala. Aquest model ha permés observar de nou que realment GlialCAM necessita a MLC1 per a la seva correcta localització. També s’ha observat que l’ortòleg zGlialCAMa conserva la seva funció de entre espécies ja que també es capaç de modificar les corrents de ClC-2. Aquests resultats obtinguts amb els models s’han pogut comparar amb el cervell d’una pacient. Aquest cervell demostra que MLC1 és necessària per a la correcta localització de GlialCAM en la regió del cerebel. Per altra banda, s’han desenvolupat diferents models cel•lulars. Primerament s’han estudiat els astròcits del ratolí knock-out. Aquestes cel•lules mancades de MLC1 també presenten vacuoles per tot el citoplasma, però no mostren canvis en la localització ni en els nivells de proteïna de GlialCAM i ClC-2. Aquest fet juntament amb altres estudis del grup van fer pensar si la condició necessària per a que es veguessin afectades aquestes proteïnes estaria relacionada amb el procés del sifoneig de K+. Estudis realitzats en astròcits de rata demostren que en condicions d’un alt contingut de K+, com per exemple durant una alta activitat neuronal, GlialCAM i ClC-2 és localitzen juntament a les membranes cel•lular i ClC-2 canvia les seves propietat de canal. Paral•lelament, estudis realitzats en oligodendròcits de rata també demostren que aquest fet també succeix en aquest tipus cel•lular. / Megalencefalic leukoencephalopathy with subcortical cysts, also known as MLC, is a rare type of leukodystrophy. Currently still unknown pathophysiological mechanism of the disease, and therefore there is no effective treatment possible for patients. There are two genes involved in the MLC disease. Gene was first discovered was MLC1 and this encodes for a membrane protein with the same name. The second gene is called GLIALCAM and encodes for a transmembrane protein type I that also carries the same name. In our group is has been described that GlialCAM acts as a protein ß subunit of MLC1 because it is able to direct and concentrate in the cellular junctions. Moreover, GlialCAM also act as auxiliary subunit of CLC-2 Cl channel as it is capable of modifying the activation and rectification properties of the channel. In this work we have developed two different models to study the physiopathology. The results show that GlialCAM affected by the absence of MLC1. It has been also demonstrated that ClC-2 is implicated in the disease.These results were compared with a patient brian and has been shown that MLC1 is important for the correct location of GlialCAM in the cerbellum. Have also been developed a different cellular models. The results with this models show that GlialCAM and ClC-2 could have a functional role in the process of potassium siphoning.