HIP1R (Huntingtin interacting protein 1-related) a des rôles dans l’endocytose médiée par la clathrine, l’apoptose et la mitose. Elle induit l’assemblage de la clathrine, régule la polymérisation de l’actine, contribue au clivage de la caspase-9 et aide l’ancrage des chromosomes sur les microtubules lors de la métaphase. Les domaines protéiques responsables de ces contributions et les facteurs permettant à HIP1R de changer de rôle ne sont pas encore bien connus. Nous avons utilisé la technique du knock-down et nous avons réintroduit des versions mutées ou tronquées d’HIP1R pour caractériser ses rôles en modifiant ses liaisons avec ses partenaires. Les résultats indiqueraient qu’HIP1R participe principalement à l’internalisation des plaques de clathrine et qu’HIP1R n’induit pas l’activation de la caspase-3. Finalement, nous avons montré que la liaison d’HIP1R avec la clathrine lui confère son rôle lors de la mitose lui permettant ainsi de se localiser sur les microtubules pendant la métaphase.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est une barrière quasiment imperméable assurant la protection du cerveau. Elle limite très fortement le passage de diverses molécules au cerveau, dont les molécules thérapeutiques. Les cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECC), principal constituant de la BHE, présentent abondamment à leur surface plusieurs transporteurs dont le récepteur de la transferrine (RTf). Le RTf est un récepteur qui pourrait potentiellement permettre l’apport de molécules thérapeutiques au cerveau via le mécanisme de transcytose médiée par récepteur (TMR). L’objectif général de ce projet est de développer, caractériser et valider une approche pharmaceutique non virale et non invasive de ciblage thérapeutique à l’aide de fragment Fab d’anticorps monoclonaux visant la libération de molécules thérapeutiques dans le parenchyme cérébral. Tout d’abord, des essais in vitro et in vivo ont été entrepris afin d’évaluer le transport des fragments Fab au cerveau. Les fragments Fab, obtenus par digestion enzymatique à la papaïne, n’ont malheureusement été détectés ni in vitro ni in vivo. Puis, nous avons étudié l’internalisation in vitro et in vivo de micelles polyioniques (MP) conjugués à des fragments Fab’ et renfermant un analogue d’un pARNi fluorescent. A ce jour, les résultats obtenus in vivo avec les MP ne permettent pas d’envisager l’utilisation de ce vecteur comme usage thérapeutique dans le cas de thérapie ciblant le parenchyme cérébral, mais les MP s’avèrent être très prometteurs dans le cas de thérapie génique ciblant les CECC impliquées dans plusieurs maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux etc. / The blood-brain barrier (BBB) is an almost impermeable barrier protecting the brain. It greatly limits the passage of blood-borne molecules to the brain, including therapeutic molecules. Brain capillary endothelial cells (BCEC), forming the BBB, express transporters including the transferrin receptor (TfR) on their surface. The TfR is a receptor that could potentially allow the delivery of therapeutic molecules to the brain via receptor-mediated transcytosis (RMT). The main objective of this project is to develop, characterize and validate a non-viral noninvasive therapeutic targeting pharmaceutical approach with Fab fragments of monoclonal antibodies for the delivery of therapeutic molecules in the brain parenchyma. First, in vitro and in vivo experiments were done to assess the transport of Fab fragments into BCEC. Fab fragments, obtained by enzymatic digestion with papain, were detected neither in vitro nor in vivo. Then, we studied the internalization of polyion micelles (MP) conjugated to Fab' fragments and encapsulating an analog of a fluorescent siRNA in vitro and in vivo. The results obtained in vivo with MP conjugated with Fab’ fragments do not suggest penetration into the brain parenchyma, but are promising for gene therapy targeting BCEC to treat Alzheimer disease, multiple sclerosis or stroke.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Le marché des agents de livraison d'acides nucléiques est en pleine expansion et atteindra plus de cinq milliards de dollars en 2030. Ces agents, utilisés pour livrer de l'information génétique dans des cellules de mammifères, ont de nombreuses applications tant dans le domaine de la recherche fondamentale que thérapeutique. Parmi les différentes catégories d'agents de livraison, celle utilisant des vésicules extracellulaires (VE) pseudotypées par la glycoprotéine du virus de la stomatite vésiculaire (VSVG) s'est révélée prometteuse dans les dernières années. En effet, en combinaison avec un polymère cationique, ces particules (VE-VSVG) se sont montrées capables de livrer des acides nucléiques de type ADN et ARN dans différents types cellulaires. Malheureusement, les procédés de production actuels des VE-VSVG, impliquant l'utilisation de cellules HEK 293, sont difficiles à adapter à l'échelle industrielle notamment à cause de l'utilisation de cellules productrices adhérentes, de la présence de sérum dans le milieu de culture et de procédés de purification incomplets. Par conséquent, l'objectif de ces travaux de recherche a été de développer un procédé de fabrication des VE-VSVG, pouvant être plus facilement transposé à l'échelle industrielle. Cette thèse se divise en quatre chapitres. Le chapitre 1 constitue une revue de la littérature et fait un état des lieux des différentes méthodes de livraison d'acides nucléiques, ainsi que des procédés de production et de purification de particules biologiques pseudotypées par la protéine VSVG, incluant les VE-VSVG. Les trois chapitres suivants présentent les résultats obtenus au cours de ce doctorat. Le chapitre 2 regroupe les résultats d'une première publication dédiée à la mise en place d'un procédé de production de VE-VSVG par transfection transitoire de cellules HEK 293, cultivées en suspension sans sérum, ainsi que d'une méthode de purification, composée d'une phase de concentration par ultracentrifugation et d'une étape de séparation par chromatographie d'affinité. Le chapitre 3 présente les résultats d'une future publication, consacrée à l'analyse de l'effet de la production de VE-VSVG sur l'expression génique des cellules HEK 293, ainsi qu'à l'amélioration des rendements de production de ces particules, grâce à l'identification de différents gènes prometteurs au cours de cette étude transcriptomique. Finalement, le chapitre 4 regroupe des résultats consacrés à l'évaluation d'autres plateformes de fabrication (production et purification) des VE-VSVG. En conclusion, les nouvelles données et les procédés développés dans le cadre de cette thèse permettent d'améliorer significativement la production et la purification de cet agent de livraison d'acides nucléiques prometteur, dans un contexte industriel. / The market of nucleic acid delivery agents is growing rapidly and will reach more than $5 billion by 2030. These agents, used to deliver genetic information into mammalian cells, have numerous applications in both basic and therapeutic research. Among the different classes of delivery agents, the one using extracellular vesicles (EV) pseudotyped with the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) has shown promises in recent years. In combination with a cationic polymer, these particles (EV-VSVG) have been shown to be able to deliver DNA and RNA in different cell types. Unfortunately, current EV-VSVG production processes, involving the use of HEK 293 cells, are difficult to adapt to industrial scale, notably due to the use of adherent producer cells, the presence of serum in the culture medium and incomplete purification procedures. Therefore, the goal of this thesis was to develop a manufacturing process for EV-VSVG that could facilitate the transposition to industrial scale. This thesis is divided into four chapters. Chapter 1 is a review of the literature and presents an overview of the nucleic acid delivery methods, as well as processes for the production and purification of VSVG-pseudotyped biological particles, including EV-VSVG. The following three chapters present the results obtained during this Ph.D. Chapter 2 covers the results of a first publication dedicated to the development of a production process of EV-VSVG by transient transfection of HEK 293 suspension cells grown in serum-free media, as well as a purification method, composed of a concentration step by centrifugation and a separation step by affinity chromatography. Chapter 3 presents the results of a future publication, dedicated to the analysis of the effect of VSVG protein production on HEK 293 cell gene expressions, as well as to the improvement of those particles production yields, through the identification of various promising genes during this transcriptomic study. Finally, Chapter 4 brings together results devoted to the evaluation of alternative manufacturing platforms (production and purification) for EV-VSVG. In conclusion, the new data and processes developed in this thesis significantly improve the production and purification of this promising nucleic acid delivery agent, in an industrial context.

Le cancer carcinoïde est une maladie rare caractérisée par des tumeurs neuroendocrines résistantes aux agents chimiothérapeutiques occasionnant un traitement difficile de celles-ci. Notre laboratoire travaille sur l'enzyme poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) impliquée dans différentes voies de réparation de l'ADN. La grande efficacité de ces voies est une des raisons pouvant expliquer la résistance observée des tumeurs neuroendocrines. Le but de ce projet était de déterminer le rôle de la PARP-1 dans le traitement du cancer carcinoïde par chimiothérapie. Nous avons obtenu un effet de potentialisation de la streptozotocine caractérisé par un ralentissement de la croissance cellulaire et de la réparation des dommages lors de l'inhibition de la PARP-1. D'un autre côté, nous avons constaté que le «knock down» de la PARP-1 résulte en une diminution du volume tumoral in vivo. Nos résultats montrent donc que la PARP-1 peut devenir une cible thérapeutique dans le traitement du cancer carcinoïde.

Introduction : La glucuronidation a pour effet de rediriger l’élimination des acides biliaires (AB) vers l’urine. En état cholestatique, caractérisé par une interruption du flux biliaire, ce métabolisme pourrait représenter une cible pharmacologique car il peut être stimulé par certains agonistes de récepteurs nucléaires. Le rein exprime aussi toutes les protéines œuvrant cette voie biologique, donc, cet organe est suspecté comme étant un joueur prédominant dans l’homéostasie des AB lors de cholestase. Objectif 1 : Évaluer l’effet de la glucuronidation sur la toxicité des AB. Après avoir déterminé la toxicité différentielle des AB dans le modèle cellulaire hépatique HepG2 en utilisant des tests moléculaires classiques (mesure de l’activité de la caspase 3, évaluation de la nécrose et de l’apoptose par FACS et mesure de la prolifération cellulaire par MTS et BCA), nous avons démontré que la glucuronidation des AB diminuait leurs propriétés pro-nécrotique et pro-apoptotique, ainsi que leur toxicité générale. Objectif 2 : Caractériser la glucuronidation hépatique et rénale des AB. L’expression (protéine et ARNm) des UGT a été quantifiée dans le foie et le rein humain. Ensuite, les constantes cinétiques de la glucuronidation rénale et hépatique des AB ont été déterminées, ce qui a mené à l’exposition des propriétés allostériques de ces réactions. Objectif 3 : Caractériser la glucuronidation des AB effectuées par les membres de la famille des UGT2A. Des microsomes surexprimant soit l’UGT2A1, l’UGT2A2 ou l’UGT2A3 ont été utilisés en essais enzymatiques afin d’extrapoler leurs constantes cinétiques de la glucuronidation des AB. Les enzymes UGT2A1 et UGT2A2 ont démontrées une excellente activité de glucuronidation des AB. Conclusion : La glucuronidation des AB diminue leur toxicité et semble être effectuée par un complexe oligomérique. Le mécanisme enzymatique catalysant la glucuronidation des AB dans le foie et le rein présente des différences majeures, mais offre un rendement similaire en état physiologique normal. Cependant, le rein possède une meilleure capacité d’adaptation à une surcharge d’AB. En somme, les résultats présentés indiquent que la glucuronidation rénale et hépatique des AB est une cible thérapeutique pour le traitement de la cholestase, cependant, elle doit être mieux caractérisée afin d’être optimisée et utilisée. / Introduction: Glucuronidation redirect bile acids (BA) elimination toward the urine. During cholestasis, a condition characterized by a bile flow interruption, this metabolism may represent a pharmacological target, because it can be stimulated by numerous nuclear receptor agonists. The kidney also expresses all proteins involved in this biological pathway, therefore, this organ is suspected as a predominant player in BA homeostasis during cholestasis. Objective 1: Evaluate the effect of glucuronidation on BA toxicity. After determining the differential BAs toxicity in the selected liver model cell (HepG2) using molecular tests (caspase 3 activity measurement, necrosis and apoptosis evaluation by FACS and proliferation assessment using MTS reduction and total protein content evaluated by BCA), we have demonstrated that BA glucuronidation decreased their pro-necrotic and pro-apoptotic properties, and, therefore, their general toxicity. Objective 2: Characterizing the hepatic and renal BA glucuronidation. The expression (protein and mRNA) of various UGT was quantified in human liver and kidney. Then, the kinetic constants for BA glucuronidation in human kidney and liver extracts were determined, which led to the exposure of the allosteric properties of these reactions. Objective 3: Characterizing BA glucuronidation carried out by UGT2As. Microsomes over-expressing either UGT2A1, UGT2A2 or UGT2A3 have been used in enzyme assays to extrapolate the kinetic constants for BA glucuronidation by these enzymes. UGT2A1 and UGT2A2 Glucuronidation decreases BAs toxicity and seems to be performed by a oligomeric enzyme complex. Major differences have been observed between the liver and kidney enzymatic mechanism of BA glucuronidation, but they offers similar performance in normal physiological state. However, the kidney has a better ability to adapt to an overload of BA. In sum, the results presented in this thesis indicate that renal and hepatic BA glucuronidation is a therapeutic target for the treatment of cholestasis, however, it must be better characterized and optimized in order to be used.

Titre de l'écran-titre (visionné le 8 novembre 2023) / Problématique : Les acides biliaires (AB), métabolites hépatiques du cholestérol, peuvent subir une glucurono-conjugaison qui limite leurs effets cytotoxiques et pro-inflammatoires et facilite leur élimination. Nous croyons que d'exploiter ce mécanisme permettrait de diminuer le fardeau des AB dans les maladies cholestatiques auto-immunes (MCAI). Cependant, des enzymes β-glucuronidase (GUS) au niveau du microbiote intestinal ont la capacité de renverser la réaction de glucuronidation hépatique. Les objectifs de mon projet étaient donc de : i) valider et caractériser la contribution des GUS à la « re-toxification » des AB-G; ii) identifier les facteurs contrôlant cette activité; et iii) déterminer le potentiel de modulation. Méthode : Des essais enzymatiques in vitro mesurant l'activité GUS ont été réalisés en présence de 11 espèces d'AB-G avec : des contenus intestinaux et des selles murines, différentes GUS bactériennes recombinantes ainsi que des selles provenant de volontaires sains ou de patients avec MCAI. Nous avons mesuré l'activité GUS avant et après la consommation de poudre de bleuets lyophilisée (PBL) ou de framboises surgelées (FS) ainsi qu'en présence d'inhibiteurs GUS pharmacologiques précédemment identifiés. Résultats : Les AB-G sont efficacement déconjugués in vitro chez la souris et chez l'humain (avec ou sans MCAI). On observe une grande variabilité selon l'individu, selon l'espèce et selon le site de glucuronidation sur le squelette des AB. Pour la modulation, la supplémentation en PBL diminue de manière sexe-dépendante l'activité GUS tandis que la réponse à la consommation de FS est plus hétérogène. Les approches pharmacologiques ont confirmé une possible inhibition de l'activité GUS envers les AB-G. Conclusion : En illustrant la capacité des GUS du microbiote intestinale à réactiver les AB et en montrant le potentiel de modulation d'une approche pharmaco-nutritionnelle, nos résultats contribuent à établir l'activité GUS comme une nouvelle cible pour la détoxification des AB dans le traitement des MCAI. / Problematic: Bile acids (BAs), hepatic metabolites of cholesterol, can undergo glucuronide conjugation, which limits their cytotoxic and pro-inflammatory effects and increases their elimination. We believe that harnessing this mechanism could reduce the burden of BAs in autoimmune cholestatic diseases (ACD). However, β-glucuronidase (GUS) enzymes in the gut microbiota can reverse this hepatic glucuronidation. The objectives of my project were to: i) validate and characterize the contribution of GUS to the "re-toxification" of BA-G; ii) identify the factors controlling this activity; and iii) determine the potential for modulation. Method: In vitro enzymatic assays measuring GUS activity were performed in the presence of 11 species of BA-G, using murine intestinal contents and feces, various recombinant bacterial GUS enzymes, as well as stool samples from healthy volunteers or patients with ACD. We measured GUS activity before and after the consumption of freeze-dried blueberry powder (BBP) or frozen raspberries (FR), as well as in the presence of previously identified pharmacological inhibitors. Results: BA-Gs are efficiently deconjugated in vitro in both mice and humans (with or without ACD). There is a high variability, depending on species, the site of glucuronidation on the BA skeleton and between individual. Regarding modulations, BBP supplementation decreases GUS activity in a sex-dependent manner, while the response to FR consumption is more heterogeneous. Pharmacological approaches confirmed a possible inhibition of GUS activity towards BA-Gs. Conclusion: By illustrating the ability of gut microbiota GUS enzymes to reactivate BAs and demonstrating the modulation potential of a pharmaco-nutritional approach, our results contribute to establishing GUS activity as a new target for the detoxification of BAs in ACDs.

La mucoviscidose est une maladie héréditaire monogénique grave en rapport avec une mutation du gène codant pour la protéine CFTR et dont la morbidité est due principalement aux atteintes pulmonaires. La greffe pulmonaire développée depuis quelques années semble être la seule thérapie curative efficace. Toutefois, la rareté des greffons disponibles, justifie de développer d’autres thérapies comme la thérapie génique. Les pseudovirions de papillomavirus sont capables de transférer des gènes dans de nombreuses lignées cellulaires. Cependant, le tropisme naturel des papillomavirus est l’épithélium malpighien et ces pseudovirions sont peu efficaces pour les cellules de l’épithélium pulmonaire. Afin de modifier le tropisme de nos pseudocapsides de papillomavirus, la première étape de mon travail a été d’identifier de nouveaux motifs de ciblage pulmonaire. La technique de phage display a permis l’identification des motifs PHPNRAQ et VDRLQQK par sélection sur les cellules épithéliales bronchique IB3-1 et S9. / Cystic fibrosis is an autosomal recessive genetic disorder caused by mutations in the gene encoding the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein. Lung transplantation developed in recent years is the only effective curative treatment. However, due to the limitation in organ donors, it is necessary to develop other therapies such as gene therapy. Papillomavirus pseudovirions have the potential to deliver genes into different cells. However, the natural tropism of HPV is directed to the cervical epithelial cells and these pseudovirions have low transduction efficacy in pulmonary epithelial cells. The purpose of this thesis was to retarget and optimize the HPV-16 pseudovirions tropism to airway cells by insertion of short amino acid sequences within the major capsid protein L1.

Partout dans le monde, l’identification des personnes ou ménages bénéficiaires d’interventions sociales demeure un défi. Dans les pays où la majorité de la population travaille dans le secteur informel, vit d’une agriculture de subsistance et/ou vit sous le seuil de la pauvreté, le ciblage des personnes devant bénéficier d’une intervention fait appel à des méthodes différentes dont la vérification du revenu et la classification de la pauvreté sur base monétaire. En 2014, un projet-pilote intitulé Cadre commun des filets sociaux au Nord Mali (CCFS) a été mis en place au Mali. L’objectif de ce projet est d’identifier les populations en insécurité alimentaire et nutritionnelle et leur fournir une assistance (transferts monétaires, assistance alimentaire et prévention de la malnutrition pour les femmes enceintes et les enfants), particulièrement en périodes de soudure pastorale et agricole. La méthode de ciblage Household Economy Approach (HEA) est une des méthodes utilisées pour sélectionner les ménages bénéficiaires des transferts monétaires au Nord Mali. L’objectif de cette recherche est d’identifier les facteurs et le contexte qui influencent la mise en œuvre de la méthode HEA. Deux villages dans une commune agricole et deux sites de fraction dans une commune pastorale ont été choisis comme sites. Des entretiens (48 entretiens (12 effectués par l’étudiante et 36 par l’ONG de recherche)) et une collecte de 15 documents ont été réalisés. À l’aide des 23 facteurs du cadre d’analyse de la mise en œuvre de Durlak et Dupré (2008), une analyse thématique a été effectuée à l’aide du logiciel © QDA Miner. Les résultats démontrent que l’identification des ménages bénéficiaires des transferts monétaires au Nord Mali repose essentiellement sur le ciblage géographique et communautaire. Les facteurs qui influencent le processus de ciblage sont liés à la faible connaissance de la méthode HEA, à la lassitude et la faible motivation des personnes impliquées, à la gestion top down et au manque de transparence dans les processus décisionnels au niveau des structures organisationnelles, aux logiques de domination et relations de pouvoir au sein des communautés ainsi qu’aux enjeux liés au financement et aux rapports hégémoniques existants dans le monde de l’aide humanitaire et de l’aide publique au développement. La difficile coordination multisectorielle des acteurs de la protection sociale vient appuyer le besoin en recherches nouvelles sur la mise en place du régime social unifié (RSU) au Mali. / Around the world, the identification of people or households benefiting from social interventions remains a challenge. In countries where the majority of the population works in the informal sector, lives on subsistence agriculture and/or lives below the poverty line, targeting people who have to benefit from an intervention requires methods that are different from income verification and from the classification of poverty on a monetary basis. In 2014, an experimental project entitled Cadre commun des filets sociaux au Nord Mali (CCFS) was implemented in Mali. The objective of this project is to identify the populations who suffer from food and nutritional insecurity and provide them with assistance (cash transfers, food assistance and prevention of malnutrition for pregnant women and children), particularly during pastoral and agricultural lean periods. The Household Economy Approach (HEA) targeting method is one of the methods used to select beneficiary households for cash transfers in Northern Mali. The purpose of this research is to identify the factors and the context that influence the implementation of the HEA method. Two villages in an agricultural commune and two fractional sites in a pastoral commune were chosen as sites. Interviews (48 interviews (12 carried out by the student and 36 by research NGOs)) and a collection of 15 documents were conducted. Using the 23 factors in the Durlak and Dupré Implementation Analysis Framework (2008), a thematic analysis was conducted using the software © QDA Miner. The results show that the identification of households receiving cash transfers in Northern Mali is mainly based on geographical and community targeting. The factors that influence the targeting process are related to the low knowledge of the HEA method, to the weariness and low motivation of the people involved, to top down management and lack of transparency in the decision-making processes at the level of organizational structures, to the logic of domination and power relations within communities, and finally to the issues of funding and hegemonic relationships in the world of humanitarian aid and development cooperation. The difficult multisectoral coordination of social protection actors comes to support the need for new research on the establishment of a household registration system in Mali.

Ce travail a pour but d'optimiser la chimiothérapie du glioblastome à l'aide de nanocapsules lipidiques (LNC) chargées en ferrociphénol (FcdiOH), un composé organo-métallique anticancéreux innovant. Différentes voies d'administration ont été envisagées : la voie locale par stéréotaxie (convection-enhanced delivery ou CED) (60 μL de LNC, 0.36 mg de FcdiOH/rat), l'injection intra-carotidienne et l'injection intraveineuse (400 μL de LNC, 2.4 mg de FcdiOH/rat). Sur le modèle 9L orthotopique, l'efficacité antitumorale du principe actif s'est avérée être proportionnelle à la dose injectée. Le traitement local par CED d'une suspension iso-osmolaire de LNC-FcdiOH a augmenté significativement la survie des rats traités par rapport à celle du groupe témoin (médiane de 28.5 jours au lieu de 25 jours). Le recouvrement par de longues chaines de poly(éthylène glycol) (DSPE-mPEG2000) a permis aux LNC ainsi pégylées d'améliorer leur temps de circulation sanguine avec l'obtention d'une demi-vie 4 fois plus longue et d'une aire sous la courbe 1.65 fois plus étendue que celles des LNC classiques. Cela a entraîné l'éradication de la tumeur 9L sous-cutanée après une seule injection intraveineuse de DSPE-mPEG2000-LNC-FcdiOH, montrant l'efficacité du ciblage passif obtenu avec ces nanovecteurs. En parallèle, l'injection intra-carotidienne représente une voie d'administration prometteuse pour la délivrance de principes actifs dans le cerveau. En effet, le traitement intra-carotidien à l'aide des LNC pégylées a permis d'augmenter de 20% la survie des rats porteurs d'un gliosarcome 9L intracérébral (médiane de 30 jours). Enfin, l'incorporation de peptides NFL-TBS à la surface des LNC semble être une approche intéressante dans le cadre d'un ciblage actif, des études préliminaires ayant mis en évidence un rat survivant jusqu'à 44 jours.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.