A estabilidade térmica em função do pH para três formas da hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp), monitorada atraves de DSC, CD e absorção óptica, e estudada no presente trabalho. Estes estudos possibilitaram a determinação de parâmetros importantes do processo de desnaturação e dissociação da proteína oligomerica em pH ácido, neutro e alcalino. A HbGp se mostrou mais estável no pH ácido do que em pH neutro e alcalino. No meio alcalino a HbGp sofre dissociação oligomérica gerando subunidades tais como o dodecâmero, o trímero e o monômero. Além disso, as técnicas de DSC, dicroísmo circular (CD) e absorção óptica permitiram o monitoramento da desnaturação da estrutura protéica global, da estrutura secundária e do centro ativo da HbGp, em função da temperatura. Por DSC foi determinado que o mecanismo do processo de desnaturação térmica da HbGp é irreversível. As variações de entalpia calorimétrica, ΔHcal, e de van Hoff, ΔHvH, nas formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp são bem distintas, em todos os pHs estudados, indicando que o processo de desnaturação é bastante complexo, sugerindo que o pico de transição deve ser composto por varias transições. A ordem de estabilidade apresentada pela HbGp em termos dos valores de temperatura de transição (Tm) foi a seguinte: cianometa- > oxi- > meta- no intervalo de pH 5,0 a 8,0. Os valores de ΔHcal no pH 7,0 para a oxi-HbGp, meta-HbGp e cianometa-HbGp foram de 25 ± 4, 20 ± 2 e 56 ± 4 MJ/mol, respectivamente. Os valores de energia de ativação (Ea) obtidos no pH 7,0 para a oxi- e cianometa-HbGp foram de 673 ± 99 e 780 ± 105 KJ/mol, e no pH 8,0 de 897 ± 106 e 850 ± 201 KJ/mol, respectivamente. Esses valores de energia de ativação são condizentes com os reportados na literatura para outras hemoglobinas. Nos estudos realizados por CD a oxi-HbGp forma hemicromo no pH 6,0 e 7,0, em temperaturas superiores a 40 °C, e se dissocia em meio alcalino. A oxi-HbGp apresenta temperatura crítica (Tc) nas regiões das hélices-α e do grupo heme praticamente idêntica nos vários pHs estudados. A cianometa-HbGp possui maior quantidade de estrutura secundária do que a oxi-HbGp, e maiores valores de temperatura crítica (Tc), sendo bem mais estável que a oxi-HbGp, assim como o observado por DSC. Por absorção óptica o comportamento térmico da HbGp é similar ao do CD, sendo observado ainda, além da formação de hemicromo, a presença de espécies pentacoordenadas no pH neutro e alcalino. / The thermal stability as a function of the pH, for three forms of the extracellular giant hemoglobin of the annelid Glossoscolex paulistus (HbGp) was monitored by DSC, CD and optical absorption in the present work. These studies allowed the determination of important parameters characterizing the denaturation and dissociation at acid, neutral and alkaline pH values. HbGp was shown to be more stable in acid pH as compared to neutral and alkaline pH values. In alkaline medium, HbGp presents oligomeric dissociation generating smaller subunits such as the dodecamer, the trimer and the monomer. Besides that, the techniques of the DSC, circular dichroism (CD) and optical absorption spectroscopy allowed to monitor, respectively, the denaturation of the global protein structure, of the secondary structure and of the active center of the hemoglobin, as a function of the temperature. By DSC it was determined that the mechanism of the thermal denaturation of the HbGp is irreversible. The variations of calorimetric and van Hoff enthalpies, in the oxy- and cyanomet-HbGp forms, are quite different, for all studied pH values, indicating that the process of denaturation is complex, characterized by a transition peak composed by several contributions. The order of stability presented by the HbGp in terms of the transition temperature values (Tm) was the following: cyanomet-> oxy- for pH from 5.0 to 8.0. The values of ΔHcal at pH 7.0 for the oxy-HbGp, met-HbGp and cianomet-HbGp were 25 ± 4, 20 ± 2 and 56 ± 4 MJ/mol, respectively. The activation energy values (Ea) obtained at pH 7.0 for the oxy- and cyanomet-HbGp were 673 ± 99 and 780 ± 105 KJ/mol, and at pH 8.0 they were 897 ± 106 and 850 ± 201 KJ/mol, respectively. Those energy values are consistent with data reported in the literature for other hemoglobins. In the studies carried out by CD for oxy-HbGp formation of hemichrome was observed at pH 6.0 and 7.0, at temperatures above 40 °C. In alkaline medium the oligomeric dissociation is observed. Oxy-HbGp presents critical temperatures (Tc), which are practically identical in the spectral regions of the polypeptide and of the heme groups for all studied pH values. The cyanomet-HbGp own larger quantity of secondary structure than oxy-HbGp, and higher values of critical temperatures (Tc), being more stable than oxy-HbGp, in agreemente with DSC data. Optical absorption spectroscopy shows thermal behavior of HbGp similar to that observed by CD. Besides the formation of the hemichrome species upon heating, the presence of penta-coordinate species at neutral and alkaline pH values was observed.

O anestésico dissociativo Ketamina pertence à classe farmacológica dos antagonistas não competitivos de receptores de glutamato do tipo NMDA. Esta substância é utilizada em situações diversas que envolvem alívio da dor, terapêutica dos quadros depressivos e anestesia parenteral segura. Apresenta a característica de intensificar as experiências sensoriais. Por esta razão, seu consumo entre a população jovem vem crescendo, quadro este que se agrava levando em consideração que boa parte dos indivíduos que fazem uso de Ketamina é de poli usuários. Apresenta também a propriedade de atuar em outros receptores no sistema nervoso central, como: no bloqueio dos receptores colinérgicos muscarínicos, na inibição tônica GABAérgica e na liberação de dopamina. Pouco se sabe sobre as áreas neurais ativadas por seu uso, diante de contextos específicos. Sabe-se, no entanto, que uma delas é o córtex pré-frontal. Supõe-se também sua importância nos transtornos de ansiedade, já que antagonistas de receptores NMDA reduzem sua intensidade, particularmente quando injetados em estruturas que notadamente estão relacionadas à expressão do medo e ansiedade incondicionados, como a substância cinzenta periaquedutal do mesencéfalo. Sendo assim, sugere-se que os efeitos da Ketamina se estendam desde sua influência sobre sistemas encefálicos vinculados à modulação de aspectos da personalidade, cognição e memória, até àqueles vinculados ao prazer, humor, medo e ansiedade. Este trabalho tentou preencher algumas dessas lacunas analisando os efeitos do tratamento crônico de Ketamina em diferentes doses. Grupos independentes de ratos Wistar foram submetidos aos procedimentos de condicionamento ao lugar (3 compartimentos) a caixa claro-escura (2 compartimentos), para tentar estabelecer os efeitos reforçadores e aversivos da Ketamina.Para analisar alterações de cunho emocional geradas pelos tratamentos, foi utilizado o modelo labirinto circular elevado, associado à técnica de marcação imunohistoquímica da proteína Fos para identificar áreas neurais ativadas pela Ketamina no modelo de 3 compartimentos durante o teste. Sugerimos que a Ketamina em baixas doses apresenta a propriedade de induzir forte preferência condicionada ao contexto, este efeito parece depender do tipo de procedimento de escolhas não forçadas. Além disso, os efeitos reforçadores positivos da Ketamina apresentam um padrão dose-dependente, já que altas doses das substâncias produzem aversão e não preferência ao lugar de condicionamento. Em geral, uma mistura de efeitos reforçadores e aversivos foi notada neste trabalho. / The dissociative anesthetic Ketamine belongs to the pharmacological class of non-competitive antagonists of glutamate receptors of the NMDA type. This substance is thechosen onefor many situations involving the pain relief, depressive disorders treatment and safe parenteral anesthesia. It has the characteristic to intensify sensory experiences. Therefore, its consumption among young people is increasing; which will be worse considering that most of the individuals, who take ketamine, useother drugs as well.Ketamine also has the property of acting at other receptors in the central nervous system and the blockade of muscarinic cholinergic receptors of tonic GABAergic inhibition and release of dopamine. However, its influence on serotonergic mechanisms, action focus of most antidepressants, is not known. Nor certain neural areas activated by its use on specific contexts are clearly. It is known, however, that one of them is the prefrontal cortex. It is suspected its importance in anxiety disorders, since NMDA receptor antagonists reduce its intensity, particularly when injected into structures that are particularly related to the expression of unconditioned fear and anxiety, as the periaqueductal gray matter in the midbrain. Thus, this suggests that the effects of Ketamine extend from its influence on encephalic systems underlying the modulation aspects of personality and cognition and memory, to those linked to pleasure, humor, fear and anxiety. This project attempts to fill some of these gaps using independent groups of animals laboratory undergo a conditioned preference procedure by the place and a bright/dark test to try to establish the existence or not of reinforcing effects with the use of Ketamine. In order to identify the possible emotional nature of changes generated by the treatment, we will use the experimental model Preference Conditioned by the Place and the Hight Circular Labyrinth test, associated to immunostaining technique Fos protein. Our results suggest that, in low dosages, Ketamine presents the property of inducing a strong dependence conditioned to the context, this effect seems to depend on the type of procedure and not on the choices. Moreover, the positive reinforcing effects of Ketamine have a dose-dependent pattern, since high doses of the substances produce aversion and not preference to the place of conditioning. In general, a mixture of reinforcing and aversive effects was noted.

A forma ativa da vitamina B1, tiamina pirofosfato (TPP), é um cofator indispensável para certas enzimas que atuam no metabolismo de carboidratos e aminoácidos. Sua biossíntese se dá pela formação independente de suas partes componentes pirimidina e tiazol. Em procariotos a via de síntese para vitamina B1 já foi esclarecida, entretanto em eucariotos ainda existem ainda algumas lacunas a serem preenchidas. Em Arabidopsis thaliana a proteína Thi1 é possivelmente a responsável pela síntese do motivo tiazólico, uma vez que um composto relacionado a TPP foi encontrado em sua estrutura. Neste trabalho, Thi1 e seu mutante natural Thi1(A140V), o qual é responsável pela auxotrofia para tiamina numa linhagem mutante de A. thaliana, foram estudados com intuito de verificar a influência da mutação pontual na estrutura e na atividade de Thi1. As proteínas foram produzidas em E. coli e análises biofísicas usando anisotropia de fluorescência e Dicroísmo Circular (CD) mostraram diferenças consideráveis na estabilidade protéica. Estudos de desnaturação mostraram diferenças na temperatura de transição (Tm), de cerca de 4 ºC maior para Thi1, e na concentração de guanidina na qual metade das proteínas estavam desnaturadas, de 0,42 M para Thi1 e 0,24 M para Thi1(A140V). Os dados de anisotropia de fluorescência obtidos a partir da desnaturação térmica também confirmaram a maior instabilidade de Thi1(A140V) frente a Thi1. Para avaliar a presença e caracterizar o provável precursor de TPP em Thi1(A140V), foram também realizados ensaios de absorção, CD e infra-vermelho dos ligantes intrínsecos. Os resultados destas análises mostraram que as moléculas poderiam apresentar diferenças em seus grupos constituintes. Entretanto, os experimentos complementares de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1D 1H e 2D TOCSY) revelaram que as diferenças observadas nas amostras dos ligantes, provenientes de Thi1 e de Thi1(A140V), tratavam-se na verdade de diferenças nas proporções de quatro populações distintas de compostos, compondo um pool de ligantes. Na amostra proveniente de Thi1(A140V), a população dominante correspondeu à molécula de adenosina difosfato, ADP. Ainda, embora em ambas as amostras o ADT tenha sido encontrado, aquela derivada de Thi1(A140V) apresentou uma população significativamente menor deste composto. Concluindo, os resultados demonstraram que a mutação A140V levou a uma maior instabilidade conformacional em Thi1 e, além disso, a presença de quantidades reduzidas de ADT em Thi1(A140V) sugerem que esta alteração tenha contribuído de alguma forma para a redução de sua atividade. / The active form of vitamin B1, Thiamine pyrophosphate (TPP), is an indispensable cofactor for some enzymes that act on carbohydrates and amino acids metabolism. Its biosynthesis requires the independent formation of its compounds, pyrimidine and thiazole. In prokaryotes, the vitamin B1 biosynthetic way has already been elucidated, but in eukaryotes there are some gaps to be filled. In Arabidopsis thaliana, the Thi1 protein is possibly responsible for the synthesis of the thiazole moiety, since a related compound to TPP was found in its structure. In this work, we have investigated Thi1 and its natural mutant Thi1(A140V), which is responsible for the thiamin auxotrophy in A. thaliana mutant line, to identify the role this mutation plays in the structure and activity of Thi1. The proteins were produced in E. coli and the results of biophysical analysis using fluorescence and Circular Dichroism (CD) showed considerable differences in the protein stability. Thermal and chemical unfolding studies have shown a difference in the melting temperature (around 4 ºC higher for Thi1) and concentration of guanidine at which half of the protein had unfolded (0,42 M for Thi1 and 0,24 M for Thi1(A140V)). The fluorescence anisotropy data obtained from thermal unfolding showed Thi1(A140V) is more unstable compared to Thi1. We have also carried out tests of absorption, CD and infra-red to assess the presence and to characterize the possible precursor of TPP in Thi1 (A140V). The results showed that the ligants could have different compositions. However, complementary results from NMR (1D 1H e 2D TOCSY) revealed that the difference observed in the ligant samples from both proteins were actually related to the proportion of four distinct compound population, representing a ligant pool. In the sample from Thi1(A140V), the dominant population corresponded to ADP. Besides, although both samples contained ADT, it was significantly less abundant in that one derived from Thi1(A140V). Concluding, the results demonstrated that the A140V mutation leaded to a more unstable conformation of Thi1 and, additionally, the presence of smaller amounts of ADT in Thi1(A140V) suggests this change might have contributed to reducing its activity.

Uma nova lectina extraída da semente de Artocarpus integrifólia, denominada KM+ foi recentemente descrita. KM+ e haptotática para neutrófilos, promove a aglutinação de hemácias dos grupos A, B, 0, estimula a proliferação de linfócitos do baço de camundongos e liga-se em &#945 D-manose, &#945 metil manosidio e &#945 D-glicose. Esta lectina é composta por quatro monômeros, com peso molecular de 13.150 daltons cada, unidos por interações não covalentes. KM+ contem 1,8% de carboidratos e apresentou quatro isoformas com pontos isoelétricos entre 4,2 e 5,2. Este trabalho teve como objetivos estudar modificações estruturais de KM+ em função de parâmetros como temperatura, força iônica, pH, agentes desnaturantes, ligação com D-manose, monitoradas por dicroísmo circular (CD) e fluorescência. CD também foi utilizado para estimar o conteúdo de estrutura secundaria de KM+, utilizando-se dois programas descritos na literatura: SSE (Secondary Structure Estimation), que utiliza o método dos mínimos quadrados para a estimativa da estrutura secundaria e obtenção dos espectros básicos, baseados nos dados cristalográficos de proteínas de .estrutura resolvida; CCA (Convex Constraint Analisys) que utiliza o algoritmo simplex e a partir dos espectros de CD das proteínas de referencia calcula os espectros das componentes básicas. Para a estimativa das frações de estrutura secundária o segundo método utiliza o programa Lincomb. Os espectros de CD foram registrados no intervalo de 185 a 260 nm. O conteúdo em estrutura secundária, estimado pelo programa SSE foi: 0% de &#945-hélice, 41% de folha &#946, 27% de volta &#946 e 32,3 de estrutura desordenada; pelo programa CCA foi: 1% de &#945-hélice, 35% de folha &#946 anti-paralela, 21% de volta &#946 e/ou folha &#946 paralela, 15% de contribuições de aromáticos e/ou ligações dissulfeto, 28% de estrutura desordenada. Os desvios médios quadráticos para os programas SSE e CCA foram 12% e 1%, respectivamente. Portanto a lectina KM+ é principalmente constituída por estruturas tipo folha &#946 e tipo desordenada. A curva calculada pelo programa CCA foi mais bem estimada, pois tem o desvio médio quadrático 12 vezes menor que o do programa SSE. Este resultado, provavelmente ocorre devido aos seguintes fatores: (i) no programa CCA, o espectro da proteína a ser analisada e alinhado com os espectros das proteínas de referência, influenciando no calculo dos espectros básicos; (ii) maior número de proteínas com estrutura &#946 no grupo de referência do programa CCA. A estabilidade de KM+ em função da temperatura tem comportamento diferente em tampão sódio fosfato (PBS) daquele observado em água. Em PBS, quando a amostra esta a 70&#176C, a forma do espectro de CD mostrou-se consistente com um espectro de proteína desnaturada. Comumente, um espectro de proteína desnaturada caracteriza-se pela perda da estrutura secundaria predominante e aumento da estrutura desordenada. Em água, também a 70&#176C, na região da estrutura &#946 (216 nm) surge uma nova banda e na região da estrutura desordenada (195 nm) aparece uma banda com valores positivos mimetizando um espectro da estrutura &#945-hélice. Esta diferença de comportamento pode ser devida à força iônica. A desorganização promovida na molécula de KM+ por cloreto de guanidina foi típica de desnaturação. o máximo da emissão de fluorescência, da KM+ em PBS pH 7,2, foi a 328 nm, característico de resíduos de triptofano protegidos do solvente. Este máximo mudou para 340 nm em pH 10,5. Este resultado indica mudanças no ambiente químico do triptofano neste pH. O deslocamento para a região do vermelho indica, que em pH. os resíduos de triptofano estio em maior contato com o solvente. O número de sitios ligantes de D-manose J)a molécula de KM+, foi estimado pela supressão da fluorescência promovida pelo D-manose. Esta estimativa foi baseada na suposição de que todos os sítios ligantes de D-manose estivessem próximos aos resíduos de triptofano. A relação encontrada foi de 2 moles de D-manose/mol de KM+ / Recently a new lectin, KM+, isolated from Artocarpus integrifolia seeds was described. KM+ induces neutrophil migration, agglutination of human red blood cells, proliferation of mouse spleen cells and binding with monosacharides D-mannose, D-glicose and &#945-metil mannoside. This glycoprotein is composed of four monomers, assembled by non covalent bonds, has 500 aminoacids residues/mol, with a Molecular Weight of 52,000 Daltons and 1.8% of carbohydrates [27]. In this work structural changes of KM+ was studied as a function of temperature, pH, chemical denaturing agents as well as the binding with D-mannose. These changes were monitored by circular dichroism (CD) and fluorimetry. Circular Dichroism (CD) spectroscopy was used for the analysis of the secondary structure of KM+ in solution due do its capacity to indicate the presence and to estimate the proportion of &#945-helix, &#946-sheet, &#946-turn and unordered conformations. This measurent can be regarded as a function of the relative orientation of the chromophores responsible for their chiroptical activity. CD spectroscopy is also one of the methods of choice for monitorization of conformational changes in proteins as a function of solvents, pH, temperature, ionic strength and specific or non specific binding. Two programs which are in use for estimation of secondary structure: SSE, using the linear least squares method and CCA, using the simplex method, were evaluated in the present work. SSE uses a set of proteins with known X-ray data as the basis for evaluation while CCA uses only pure proteins experimental CD spectra. Fluorescence spectroscopy is very useful to monitore of protein conformational changes in solution due to the presence of intrinsic fluorophores. Fluorescence Measurements were performed at 25&#176C. Samples were excited at 280 nm and the emission was monitored in the range 290-450 nm. The maximum emission as a function of pH was at pH 7.0. The wavelength for maximum emission changed from 328 nm at pH 7.0 to 340 nm at pH 10.5. CD spectra were recorded over the range of 185 up to 260 nm. The Secondary structure content estimated by SSE program was: 0% &#945-helix, 41% &#946-sheet, 26% &#946-turn and 32% random with RMS of 12% and CCA program was: 1% &#945-helix, 35% antiparallel &#946-sheet, 21% &#946-turn and/or parallel B-sheet, 28% random, 15% aromatics contributions and dissulfide linkages with RMS of 1%. The fractions of secondary structure obtained when using CCA program were more consistent than those of SSE program. The simulation by CCA program was better probably due to its desconvolution of the spectral contribution of the common secondary structures using experimental CD curves of proteins. The stability of KM+, in PBS, as a function of temperature changes above 55&#176C but only at 70&#176C the shape of the CD spectrum is consistent with the loss of the native ordered secondary structure that should accompany protein unfolding. CD spectra of KM+ in water showed conformational changes as a function of temperature was not consistent with denaturated proteins. The unfolding of KM+ by GdnCl and SDS resulted in CD spectroscopic changes: consistent with the increased random structure and disappearance of beta sheet. Using the two denaturing agents together GdnCl and temperature, the denaturation was observed at lower decreased both GdnCl concentration and at lower temperature. The estimation of the number of binding sites for D-mannose was obtained through the fluorescence intensity decrease due to a quenching effect of D-mannose and showed that the stoichiometry of binding was 2 moles of D-mannoseimol of lectin

Este trabalho trata do estudo de complexos de rutênio contendo antiinflamatórios não-esteróides, com o objetivo de contribuir para ampliar as pesquisas na área de potenciais metalofármacos antitumorais. A partir de reações do precursor dimetálico [Ru2(O2CCH3)4Cl] com os fármacos carboxílicos sulindaco (HSulin) e diclofenaco de sódio (NaDiclofen) foram isolados, respectivamente, os correspondentes complexos [Ru2(Sulin)4Cl] e [Ru2(Diclofen)4Cl]. A reação entre o monômero [RuCl2(dmso)4] e o meloxicam (H2Melox) deu origem ao derivado misto [Ru(dmso)2(HMelox)2]. Os compostos foram caracterizados por meio de análise elementar, medidas de condutância molar, medidas de susceptibilidade magnética, espectroscopia de absorção eletrônica UV-VIS-IR, espectroscopia vibracional FTIR e Raman, e estudos de análise térmica (TG/DSC/MS). As interações da albumina de soro humana HSA, importante proteína do plasma, com os complexos obtidos, com o análogo [Ru2(IBP)4Cl] (HIBP = ibuprofeno) e também com os fármacos orgânicos não-complexados foram investigadas empregando-se dicroísmo circular, SDS-Page e fluorescência. A atividade antitumoral dos metalofármacos foi avaliada, através de ensaios com MTT, com base nos seus efeitos citotóxicos para a linhagem celular de leucemia humana K562. / This work describes the study of ruthenium complexes containing non-steroidal antiinflammatory drugs with the aim of helping to expand the research in the field of potential anticancer metallodrugs. Reactions of the [Ru2(O2CCH3)4Cl] dimetal complex with sulindac (HSulin) and sodium diclofenac (NaDiclofen) carboxylic drugs gave the correspondent complexes [Ru2(Sulin)4Cl] and [Ru2(Diclofen)4Cl], respectively. The reaction between the [RuCl2(dmso)4] monomer and the meloxicam drug (H2Melox) led to the mixed derivative [Ru(dmso)2(HMelox)2]. The compounds were characterized by elemental analysis, molar conductance measurements, magnetic susceptibility, UV-VIS-IR electronic absorption spectroscopy, Raman and FTIR vibrational spectroscopies and by studies of thermal analysis (TG / DSC / MS). The interactions of human serum albumin (HSA), the major plasma protein, with the obtained complexes, the analogous [Ru2(IBP)4Cl] (= HIBP ibuprofen) and also with the noncoordinated organic drugs have been investigated by circular dichroism, SDS-Page and fluorescence. The antitumor activity of the metallodrugs has been evaluated by MTT assays, on the basis of their cytotoxic effects on K562 human leukemia cell line.

A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas caracterizações. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as \"amarelinho\". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase, chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein. Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence spectroscopy.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2017-08-30T18:51:47Z No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T18:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Carla Lieko Della Torre.pdf: 1852525 bytes, checksum: db416b0a6fe4435a764893198350dbcc (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Enzymes of the xylanolytic complex, from microorganisms, have been an increasingly important biotechnological tool mainly in industrial processes that require high temperatures, such as in the baking industry, animal feed, textile, pulp and cellulose. Among the fungi producing thermostable enzymes, Thermomyces lanuginosus has been evidenced as a good producer of xylanases. In this context, xylanase from the recently isolated thermophilic fungus of the Paraná Atlantic Forest, T. lanuginosus, was purified, biochemically characterized, as well as a structureactivity correlation study of the enzyme was investigated through circular dichroism and fluorescence spectroscopy. Extracellular xylanase was purified after four steps of ion exchange chromatographic columns and molecular filtration. The purity and molecular mass (21.3 kDa) of the enzyme were determined by SDS-PAGE and MALDI-TOF/MS. The xylanase is highly specific to the beechwood xylan substrate and generated mainly xylobiose (X2) and xylotriose (X3), products characteristic of the action of endoxylanase. The enzyme was able to cleave the xylooligosaccharides xylotetraose and xylopentaose, except xylobiose and xylotriose. It exhibit higher activity at pH 6.5 and temperature of 75°C, with stability between pH 5.0-8.0 for 100 hours and thermostability between 40 and 75°C for 5 hours. The deconvolution of the circular dichroism spectrum (CD) enzyme revealed a secondary conformation rich in β-structures with transition midpoint temperature (Tm) of 73.0  0.2°C. In this structural study, xylanase reveals that to perform high enzymatic activity, it was necessary a conformational change. Its secondary structure is conserved even at pH extremes at temperatures up to 70°C and in the presence of MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) and high concentration of guanidine (6 M). Intrinsic fluorescence reveals that the tertiary structure is influenced by pH, guanidine (1 M) associated with temperature and in the presence of MnCl2 and DTT, whereas extrinsic fluorescence, using the ANS probe, shows changes in pH extremes and in the presence of MnCl2 and DTT. Fluorescence results suggest that both the increased enzymatic activity in the presence of cofactors and the loss of activity at extreme pH values are related to changes in the tertiary structure of the enzyme. Thus, T. lanuginosus xylanase has interesting biochemical characteristics for application in several industrial sectors that mainly use high temperature conditions. / As enzimas do complexo xilanolítico, provenientes de microrganismos, têm se tornado uma ferramenta biotecnológica cada vez mais importante, principalmente em processos industriais que requerem temperaturas elevadas, como na indústria de panificação, de rações animais, têxtil, polpa e celulose. Dentre os fungos produtores de enzimas termoestáveis, Thermomyces lanuginosus tem se destacado como bom produtor de xilanases. Nesse contexto, a xilanase do fungo termofílico recentemente isolado da Mata Atlântica do Paraná, T. lanuginosus, foi purificada, caracterizada bioquimicamente, bem como um estudo de correlação estruturaatividade da enzima foi investigado através das espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. A xilanase extracelular foi purificada após quatro etapas cromatográficas envolvendo colunas de troca iônica e filtração molecular. A pureza e massa molecular (21,3 kDa) da enzima foram determinadas por SDS-PAGE e MALDI-TOF/MS. A xilanase é altamente específica para o substrato xilano de beechwood e gerou principalmente xilobiose (X2) e xilotriose (X3), produtos característicos da ação de endoxilanase. A enzima foi capaz de clivar os xilooligossacarídeos xitotetraose e xilopentaose, exceto a xilobiose e xilotriose. Exibe maior atividade em pH 6,5 e temperatura de 75°C, com estabilidade entre os pH 5,0-8,0 durante 100 horas e termoestabilidade entre 40 e 75°C durante 5 horas. A deconvolução do espectro de dicroísmo circular (CD) da enzima revela uma conformação secundária rica em estruturas-β, com temperatura do ponto médio da transição (Tm) de 73,0  0,2°C. Neste estudo estrutural, a xilanase revelou que, para desempenhar elevada atividade enzimática, foi necessário ocorrer mudança conformacional. Sua estrutura secundária é conservada mesmo em extremos de pH, em temperaturas até 70°C e na presença de MnCl2 (1 mM), DTT (5 mM) e elevada concentração de guanidina (6 M). A fluorescência intrínseca revela que a estrutura terciária sofre influência do pH, guanidina (1 M) associado à temperatura e na presença de MnCl2 e DTT, enquanto a fluorescência extrínseca, utilizando a sonda ANS, revela mudanças em extremos de pH e na presença de MnCl2 e DTT. Os resultados da fluorescência sugerem que tanto o aumento da atividade enzimática na presença dos cofatores quanto a perda da atividade em valores extremos de pH relacionam-se às alterações da estrutura terciária da enzima. Dessa forma, a xilanase de T. lanuginosus possui características bioquímicas interessantes para aplicação em diversos setores industriais que utilizam principalmente condições de temperatura elevada.

O intenso uso de compostos orgânicos em conjunto com o grande avanço industrial culminou em um enorme acúmulo de poluentes orgânicos no meio ambiente. Dentre estes poluentes têm-se destacado a presença de hidrocarbonetos aromáticos altamente tóxicos e resistentes à degradação física, química, fotolítica e biológica. Desta maneira, uma nova forma de combater a presença deste tipo de composto no meio ambiente têm sido estudada: o uso de microorganismos, naturais ou geneticamente modificados, capazes de transformá-los em substâncias inertes, como CO2 e água. Tal metodologia é denominada biorremediação. Dentres estes microorganismos destacam-se bactérias dos gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Beijerinckia, dentre outros, que têm sido estudadas para esta finalidade. A enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD) é uma das proteínas expressas por bactérias do gênero Pseudomonas putida, sendo responsável pela clivagem de hidrocarbonetos aromáticos através da incorporação de ambos os átomos de uma molécula de oxigênio à estrutura do anel aromático, sendo a proteína escolhida para desenvolvermos o presente trabalho. Mais especificamente, nos interessa estudar como o mecanismo de ação da referida enzima é controlado por moléculas extrínsecas, como fosfolipídios. Tal interesse pela interação entre a enzima e fosfolipídios surgiu recentemente quando da obtenção da primeira estrutura cristalográfica de uma enzima da família da CCD (dioxigenases intradióis). Nesta estrutura foi observado um sítio de ligação por monômero para fosfolipídios, o que fez com que várias questões relativas à influência desses sobre a atividade da enzima fossem levantadas. Nosso objetivo foi fazer uso das técnicas de Dicroísmo Circular (CD), Calorimetria e Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) para estudar alterações conformacionais da enzima e de sua cinética induzidas por moléculas de fosfolipídio, e assim, obter informações que correlacionem as mudanças estruturais com o mecanismo de atividade enzimática da enzima. Os resultados obtidos através do uso daquelas técnicas em conjunto com protocolos que possibilitam a delipidação da enzima mostraram que a presença do fosfolipídios na estrutura da enzima tem influência sobre a atividade enzimática. Quando retiramos o fosfolipídio/ácido graxo, pudemos visualizar uma pequena mudança na estrutura secundária da enzima, um aumento da entalpia de reação, bem como um aumento na velocidade de reação, enquanto que a afinidade da enzima pelo substrato diminuiu. Pudemos também observar uma maior estabilidade térmica da enzima quando na ausência do fosfolipídio/ácido graxo e não foi observado interação da Pp 1,2-CCD com modelos micelares constituídos por lisofosfolipídios. Um breve estudo realizado sobre o papel da força iônica na atividade e na estabilidade térmica da proteína mostrou que na ausência de NaCl, em pH 8, a enzima se mostrou mais ativa, com uma afinidade pelo substrato maior e neste ambiente com baixa força iônica foi observado uma pequena interação da enzima com modelos micelares carregados negativamente. Assim, pudemos concluir que as moléculas anfipáticas, retiradas com os processos de delipidação, apesar de modificarem muito pouco a estrutura secundária da enzima, ainda assim instauram modificações na sua função de catálise do substrato catecol. Esta informação juntamente com os dados sobre inibição do processo reacional ocasionada pelo produto da reação formam um novo conjunto de dados que pode ser utilizado para se alcançar o objetivo mais geral de se controlar a atividade biológica da Pp 1,2-CCD. / The intensive use of organic compounds in conjunction with the industrial advances led to a huge accumulation of organic pollutants in the environment. Among these pollutants it has been noticed the presence of aromatic hydrocarbons that are highly toxic and resistant to physical, chemical and biological degradation. Thus, a new way to deal with the presence of this compounds in the environment has been studied: the use of microorganisms, natural or genetically modified, that can turn them into inert substances such as CO2 and water. This methodology is called bioremediation. Among those microorganisms, bacteria from the gender Pseudomonas, Aeromonas, Beijerinckia, among others, have been studied for this purpose. The enzyme chlorocatechol 1,2-dioxygenase (Pp 1,2-CCD) is one of the proteins expressed by Pseudomonas putida bacteria, being responsible for the cleavage of aromatic hydrocarbons through the incorporation of both atoms of a molecule of oxygen into the aromatic ring structure, being the protein chosen for investigation in this work. More specifically, we are interested in studying how the mechanism of action of this enzyme is controlled by extrinsic molecules such as phospholipids. The interest in the interaction between the enzyme and phospholipids arose recently when the first crystal structure of an enzyme of the intradiol dioxygenase family was reported. In this structure it was observed a binding site for a phospholipid per monomer, which raised many issues concerning its influence on the activity of the enzyme. Our goal was to use the techniques of Circular Dichroism (CD), calorimetry and Electron Magnetic Resonance (EMR) to study enzyme conformational changes and kinetics alterations induced by phospholipid molecules, thus gathering information on the structure-function correlation. The results obtained through those experimental techniques in conjunction with the use of protocols for protein delipidation showed that the presence of phospholipids/fatty acids in the structure of the enzyme play a role in enzyme activity. Upon removal of the phospholipid/fatty acids, we observed small changes in the secondary structure of the enzyme, an increase of the enthalpy of reactions as well as an increase in the reaction rate, whereas the affinity of the enzyme for the substrate decreased. We also observed a higher thermal stability of the Pp 1,2-CCD in the absence of the phospholipids/fatty acids, but no interaction was observed between the Pp 1,2-CCD and lysophospholipid micelles. A brief study of the function of ionic strength on the activity and thermal stability of the protein showed that in the absence of NaCl, at pH 8, the enzyme is more active, showing a greater affinity for the substrate and a low interaction was observed between Pp 1,2-CCD and negatively charged micelles. This information along with the data on the inhibition capacity of the reaction product are a new set of data that can be used to achieve the more general goal of controlling Pp 1,2-CCD biological activity.

The purpose of this study was to identify factors that influence leadership and its distribution in the Arab Bureau of Education for the Gulf States (ABEGS) Saudi Arabia. The research was undertaken in the ABEGS as a case study and its two initiatives, the Gulf Arab States Educational Research Centre (GASERC) Kuwait, and the Arab Educational Training Centre for Gulf States (AETCGS) Qatar respectively. The findings of this study reveal that the leadership in this interorganizational environment is distributed within the four levels of organizational structures. The visionary leadership comes from the inner most core political level that has its influence and direction at the strategic, managerial, and operational levels of the organization. . Based on extensive research of Leithwood and his colleagues, this study will integrate four leadership functions of setting directions, structuring the organization, developing capacity, and managing the (partnership) program into the analysis of interorganizational partnerships. The study also examined ‘securing accountability’ as another important leadership function in the partnership environment. I learnt that multiple factors influence leadership and enable different individuals and groups to perform these functions at the strategic, managerial and operational levels of the interorganizational structures. However, the major influence on leadership that weaves through the strategic level to the grassroots levels is the consultative process embedded in the organizational structures of the Arab Bureau. Some other prominent factors that influence leadership found in the study are positional power in the hierarchy, experience and knowledge, and dedication and commitment. Researchers like Benson, Mawhiney, Kickert, Proven, and Rodríguez, explored interorganizational partnerships and view the structures of leadership either vertically centralized or horizontally distributive. I argue that interorganizational leadership works horizontally at each level of the partnership i.e. strategic, managerial, and operational and vertically between these levels in the ABEGS partnership as shown in the ‘Circular Model of Interorganizational Leadership’ of this study. The leaders at various levels in the Arab Bureau from the member states function as equals. However, firm vertical hierarchy exists between various levels in the structures of the ABEGS. It is therefore established that horizontal and vertical leadership work simultaneously in interorganizational partnership environments as found in the case study of the Arab Bureau.

The sensitivity of biological studies performed between 190 and 650 nm is greatly reduced due to the autofluorescence of biomolecules and impurities in this region. Therefore, the enhanced signal-to-noise ratios encountered at longer wavelengths makes biological analysis within the near infrared (NIR) region from 650 nm to 1100 nm far more advantageous. This dissertation describes the noncovalent binding interactions of near-infrared (NIR) carbocyanine dyes with human serum albumin (HSA) and poly-L-lysine (PLL) using UV-Vis/NIR absorption spectroscopy, emission spectroscopy, circular dichroism (CD), and fluorescence detected circular dichroism (FDCD). The optical spectroscopy methods used in this work are described in detail in Chapter 1. The various applications of NIR dyes in protein analysis are introduced in Chapter 2. In general, the sensitivity of cyanines to the polarity of their local environment makes them quite suitable for protein labeling schemes. In aqueous media, cyanines have a high propensity for self-association. Yet in the hydrophobic binding sites of globular proteins, these aggregates often dissipate. Absorption and emission spectroscopy can be utilized to observe the differential spectral properties of monomer, intra-molecular and intermolecular aggregates. In Chapter 3, the photophysical properties of bis(cyanine) NIR dyes containing di-, tri-, and tetraethylene glycol linkers were each examined in the presence of HSA are discussed. Variations in chain length as well as probe flexibility were demonstrated through distinct differences in absorption and emission spectra. The observed changes in the spectral properties of the NIR dyes in the presence and absence of HSA were correlated to the physical parameters of the probes' local environment (i.e., protein binding sites and self-association). All three bis-cyanines examined exhibited enhanced fluorescence in the presence of HSA. The bis-cyanine dye containing the tri(ethylene glycol) spacer allowed for a complete overlap of the benzene rings, to form π-π interactions which were observed as intra-molecular H-aggregate bands. The dye exhibited no fluorescence in buffer, owing to the H-aggregation observed in the absorption data. In the presence of HSA, the intra-molecular dimers were disrupted and fluorescence was then detected. The "cut-on" fluorescence displayed by the dye in the presence of HSA made it ideal for noncovalent labeling applications. The utility of several NIR dyes for use as secondary structural probes was investigated in Chapter 4. NIR dyes were screened thoroughly using UV-Vis/NIR absorption spectroscopy dyes with spectral properties which were sensitive to protein secondary structure models of such as PLL in basic solution. Two NIR dyes were found to be quite sensitive to the structural features of uncharged α- and β-PLL. The chiral discrimination of these probes for basic protein secondary structures was also evaluated through CD measurements within the NIR probes' absorption bands.