Bakgrund: De senaste åren har cirkulär ekonomi fått uppmärksamhet och även funnits på den politiska agendan inom Sverige och Europa, tack vare en ökad klimatinsikt. Cirkulär ekonomi syftar på en sluten värdekedja som bör ersätta den linjära värdekedjan då den slutna kedjan fokuserar på hållbarhet. Den linjära värdekedjan har sedan den industriella revolutionen orsakat ett ”slit och släng samhälle”, detta ska den cirkulära ekonomin motverka. Klädbranschen är en marknad som producerar mycket avfall vilket gör den cirkulära ekonomin till ett mer hållbart alternativ. Trots fördelarna med det cirkulära så finns det problematik för företag kring förändringen. För att övervinna problematiken blir förståelsen kring de primära drivkrafterna viktiga faktorer. Detta för att se hur utvecklingen mot ett cirkulärt arbete fortskrider. Syfte: Uppsatsens syfte är att öka förståelse kring vilka drivkrafter som är de mest primära som leder till en organisatorisk förändring mot en cirkulär ekonomi. Metod: Detta är en kvalitativ studie som utgår ifrån ett hermeneutiskt perspektiv som ska öka förståelsen utifrån de intervjuade organisationernas uppfattning. Empirin formades utifrån semistrukturerade intervjuer med tre organisationer genom en Små-N- Studie. Studien startades med en litteraturstudie som formade uppsatsens inriktning och teorikapitel, ansatsen inom uppsatsen är abduktiv. Slutsats: Inom studien sågs det att de drivkrafter som berör både interna och externa faktorer har en större inverkan. Den mest primära interna drivkraften anses vara ledningen för att deras värderingar formar företag och de förändringarna som beslutas genomföra. Den mest primära externa drivkraften anses vara att förstärka företagens konkurrenskraft. Detta relaterar till att överleva i en värld som förändras och att anpassa sig utefter de förutsättning som kommer med en cirkulär ekonomi, ifrån marknaden och andra intressenter. Interna drivkrafter tenderar även till att leda till starkare hållbarhetsarbeten på grund av att sådana drivkrafter leder mer proaktiva förändringar. De externa drivkrafterna tenderar att orsaka mer reaktiva förändringar. / Background: Circular economy have during the last years gotten attention and been on the political agenda within Sweden and Europe due to an increased climate awareness. The circular economy refers to a closed value chain, which should replace the linear value chain due to its sustainability focus. The linear chain has since the industrial revolution caused a “tear and toss society”, which the circular economy is supposed to counteract. The fashion branch is today a market that produces a lot of waste, which would make the circular economy a more sustainable option. Despite the circular economy’s advantages there is still some problems regarding the companies’ changing processes. Therefore, the increased understanding of the primary driving forces regarding the development towards circular working methods becomes an important factor. Purpose: The purpose is to increase the understandings about which drivers that are the most primary for organizations that leads a change towards a circular economy. Method: The thesis is built on a qualitative method based on a hermeneutist perspective, which aims to increase understandings regarding drivers to a circular economy. The empiric came from semi-structured interviews with three organizations through a Small-N-Study. The thesis was based on a literature study that formed the essay’s alignment and theoretical framework. The thesis has an abductive approach. Conclusion: Within the study the drivers that is affected by both internal and external factors is shown having a bigger impact. The most primary internal driver is seen being the management and the founders due to their values which forms the company and the decisions about which changes to perform. The most primary external driver is to enhance the company’s competitiveness. The competitiveness relates to survival in a changeable world and to adjust to the conditions that comes with a circular economy, the market and other stakeholders. Internal drivers tend to lead stronger sustainability focus because of that those drivers causes more proactive changes. The external drivers tend to cause more reactive changes.

Estudos anteriores mostram que o polímero Nafion® pode causar deslocamento do equilíbrio conformacional de proteínas em valores de pH que não o fisiológico. Nesse sentido, o Nafion® não só pode ser utilizado como uma sonda interessante para estudos estruturais de proteínas, mas, também, é importante entender seu papel na conformação da proteína. Portanto, a Albunina do Soro Bovino (BSA) foi escolhida como modelo para o estudo dos efeitos do Nafion® na conformação helicoidal de proteínas. A finalidade deste trabalho é entender as alterações na conformação e vizinhanças aromáticas da BSA, na faixa de pH de 2 a 12, na presença e ausência de Nafion®, que pode também revelar o papel do polímero na exposição dos aromáticos e nos processos de transferência de energia. As alterações da estrutura secundária foram medidas por Dicroísmo Circular e os espectros de fluorescência no estado estacionário foram usados para analisar as mudanças nas vizinhanças dos aromáticos. Os resultados mostraram a diminuição discreta do conteúdo helicoidal da conformação da BSA na região extremamente básica, pH 11 em relação à conformação em pH 7. Já na região ácida, pH 2, embora haja considerável diminuição do conteúdo helicoidal, a BSA ainda mantém quase 50% de sua conformação secundária regular. Em relação aos ambientes dos aromáticos triptofano e tirosina, a eficiência quântica da emissão de fluorescência diminui em regiões ácidas e básicas, indicando que, nessas estruturas, os aromáticos encontram-se em restrição conformacional em relação ao observado na proteína nativa. Estes resultados apontam para a mudanças na conformação da BSA em ambas as regiões: ácidas e básicas, incluindo mudanças das estruturas secundárias e nas vizinhanças dos aromáticos. A adição do Nafion®, por outro lado, acentua o deslocamento para o azul e diminuição da exposição dos aminoácidos, tanto em solução quanto em estado sólido. A estrutura secundária da proteína é completamente modificada pelo polímero na região ácida, e esta conformação é mantida nas regiões neutra e básica, sugerindo que o Nafion® não estabiliza estruturas helicoidais / Previous studies have shown that Nafion® can disturb the conformational equilibrium of some proteins when at pH other than physiological ones. In this sense, Nafion® can used to study protein conformation, but is also important to understand its interaction with the proteins. In this work, Bovine Serum Albimun (BSA) was chosen as a model to understand the modifications caused by Nafion® at helicoidal proteins conformation. More specifically, the aim encloses the understanding of changes in BSA secondary conformation and aromatic vicinities, at pH range from 2 to 12, in the Nafion®s presence and absence. Secondary changes were measured by Circular Dichroism and steady-state fluorescence was used to study the aromatic vicinities. Results have shown small differences at helix content in the extremely basic pH (pH 11) when compared to BSA conformation at pH 7 (native one). At pH 2, on the other hand, although a decreasing in helical content was observed, BSA was able to keep almost 50% of secondary regular conformation. Regarding the aromatic vicinities (tryptophans and tyrosines) the fluorescence emission quantum eficience decreased in both regions (acid and basic), suggesting that the aromatics in these conformations are found in a more restrict environment. Nafion®, when added, promoted a decreasing in aromatic exposition, both in solution and solid state, while the secondary structure is completelu modified by its presence in all pH range, suggesting that helical conformations are not stabilized by Nafion®

Foram examinadas as propriedades conformacionais de um peptídeo (YRWPFGNHL-NH2) presente na primeira alça extra-celular do receptor AT1 do hormônio angiotensina II. Espectros de dicroísmo circular (CD) e fluorescência foram obtidos em solução aquosa (em função do pH e da temperatura), na presença de um solvente indutor de estrutura secundária (trifluoroetanol, TFE), e na presença de micelas carregadas negativamente (dodecil sulfato de sódio, SDS) ou zwitteriônicas (N-hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propano sulfonato, HPS e lisofosfatidilcolina, liso-PC), e de bicamadas contendo um fosfolipídio zwitteriônico (1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilcolina, POPC) ou uma mistura de POPC e um fosfolipídio carregado negativamente (ácido l-palmitoil-2-oleoil fosfatídico, POPA). O estudo por calorimetria de titulação permitiu analisar a termodinâmica da ligação. Espectros de CD indicaram uma estrutura flexível em solução aquosa, modulada pelo pH e pela temperatura. Na presença de TFE, de micelas, e de vesículas de POPC:POPA o peptídeo adquire estrutura secundária, sugerindo a presença de uma dobra beta. Espectros de fluorescência intrínseca (W3) mostraram um deslocamento do comprimento de onda máximo de emissão (λmax) para o azul na presença de micelas e de vesículas de POPC:POPA. Observou-se também um aumento da intensidade de fluorescência, exceto no caso de SDS. Esses resultados indicaram que o peptídeo interagiu com os agregados. Não se observou alteração da fluorescência na presença de POPC. Medidas de anisotropia de fluorescência mostraram que, quando ligado, o peptídeo toma-se mais imobilizado. Estudos de supressão de fluorescência empregando agentes supressores aquossolúveis e de membrana sugeriram que o W3 localiza-se próximo à interface bicamada-água. Os resultados mostraram que o peptídeo se liga a micelas zwitteriônicas e negativas, enquanto que, no caso de bicamadas (mais empacotadas), a ligação depende da presença de cargas negativas. Experimentos de calorimetria mostraram que o ΔH de ligação do peptídeo a vesículas é negativo, compatível com a ocorrência de interações eletrostáticas. Foram observadas diferenças qualitativas e quantitativas na ligação do peptídeo às micelas de HPS e liso-PC. A fim de examinar se essas diferenças eram devidas ao empacotamento molecular, foram obtidos espectros de ressonância paramagnética eletrônica de marcadores de spin intercalados nos dois sistemas. Diferenças foram observadas principalmente na região da cabeça polar, as quais poderiam ser responsáveis pela diferença de comportamento do peptídeo em ambos os agregados. Os resultados obtidos para a primeira alça extra-celular do receptor AT1 indicam que a sua conformação pode ser modulada pelo pH e pela polaridade do ambiente, que ela pode interagir com a membrana através de interações hidrofóbicas e eletrostáticas, e ainda que essa interação depende do grau de empacotamento da fase lipídica. Esses resultados estão de acordo com a visão de que domínios extra-membranares de GPCRs situam-se na interface membrana-água. As alterações conformacionais induzidas pelo meio, bem como pela interação entre domínios extra-membranares de GPCRs e a fase lipídica ou pela ligação do agonista, poderiam ter um papel no mecanismo molecular de transdução de sinal. / In this work the conformational properties of a peptide (YRWPFGNHL-NH2) whose sequence is present in the first extra-cellular loop of the angiotensin II AT1 receptor were examined. Circular dichroism (CD) and fluorescence spectra were obtained in aqueous solution (as a function of pH and temperature), in the presence of a secondary structure inducing solvent (trifluoroethanol, TFE), and in the presence of negatively charged (sodium dodecyl sulfate, SDS) or zwitterionic (N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane sulfonate, HPS and lysophosphatidylcholine, liso-PC) micelles, and of bilayers containing a zwitterionic phospholipid (l-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine, POPC) or a mixture of POPC and a negatively charged phospholipid (l-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid, POPA). Studies of titration calorimetry allowed the analysis of the binding thermodynamics. CD spectra indicated a flexible structure in aqueous solution, which was modulated by pH and temperature. In the presence of TFE, micelles and of POPC:POPA vesicles, the peptide acquired secondary structure, which is suggestive of a β turn. The intrinsic fluorescence spectra (W3) showed a blue-shift of the maximum emission wavelenght (λmax) in the presence of micelles and of POPC:POPA vesicles. An increase in fluorescence intensity was also observed, except in the case of SDS. These results indicated that the peptide interacted with the aggregates. No fluorescence changes were observed in the presence of POPC. Fluorescence anisotropy measurements showed that, when bound to the aggregates, the peptide becomes more immobilized. Fluorescence quenching studies using water soluble and membrane-bound quenchers suggested that W3 is located close to the water-bilayer interface. The results showed that the peptide binds to negativelly charged and zwitterionic micelles, while in the case of bilayers (which are more tightly packed) the binding depends on the presence of negative charges. Titration calorimetry showed that ΔH of peptide binding to the vesicles is negative, which is compatible with the ocurrence of eletrostatic interactions. Qualitative and quantitative differences in binding of the peptide to HPS and liso-PC micelles were observed. In order to examine whether these differences were due to molecular packing, electron paramagnetic resonance spectra of spin labels intercalated in both systems were obtained. Differences were observed, mainly in the polar head group region, that could be responsible for the different behaviour displayed by the peptide in both aggregates. The results obtained for the first extra-cellular loop of the AT1 receptor indicated that its conformation can be modulated by pH and by the polarity of the medium, and that it can interact with the membrane through hydrophobic and electrostatic interactions, and also that this interaction depends on the molecular packing of the lipid phase. These results are in aggrement with the idea that the GPCRs extra-membrane domains are located at the water-membrane interface. Conformational changes induced by the medium, as well as by the interaction between extra-cellular segments and the membrane or by ligand binding, could play a role in the molecular mechanism of signal transduction.

O produto de redução da nicotinamida adenina dinucleotídio (NADH) foi convertido no seu derivado hidratado NADH-X (6-hidroxi-l,4,5,6-tetraidronicotinamida adenina dinucleotídio) por ação de íons polibásicos tais como: fosfato, arsenato etc, ou por ação enzimática da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD). A cinética da hidratação foi acompanhada pelo aumento de absorbância (ΔA285 nm) e o aparecimento de um efeito Cotton a 285 nm , notando-se que quando se parte do anômero β da coenzima, o efeito Cotton positivo só se desenvolve nos estágios finais da reação na presença de enzima. Com base nesses resultados postulou-se a formação de um intermediário que se transforma num produto final, o qual mostra um efeito Cotton positivo a 285 nm. Supõe-se que essa última transformação seja uma epimerização β→α, de maneira que a adição de água não afeta inicialmente a configuração do átomo C1, da ribose. Contudo, após a hidratação, o produto se transforma no epímero α, que é termodinamicamente mais estável. Na ausência da enzima, o efeito Cotton aparece em estágios anteriores, sugerindo que a hidratação, sendo lenta, dá oportunidade à epimerização. Consequentemente não há tanto acúmulo deste intermediário, que apresenta efeito Cotton praticamente nulo. A hidratação do anômero α-NADH, na presença de GDP, mostrou um aumento de absorbância a 285 nm mais rápido do que para a forma β. Por outro lado, o efeito Cotton positivo só começou a aparecer após desenvolvimento de 60% do ΔA285 nm. Isto indicou que também para α-NADH há formação de um intermediário, o qual apresenta um efeito Cotton nulo. Quando β-NADH foi hidratado na ausência da enzima, observou-se um comportamento semelhante, porém, menos marcante com relação ao aparecimento do efeito Cotton. O fato de GPD e íons polibásicos produzirem efeitos semelhantes sobre os anômeros α e β, sugere que a ação enzimática da GPD não é estereoespecífica, produzindo uma mistura de epímeros em C6. Explica, também, o efeito Cotton nulo quando já se tem grande parte da hidratação efetuada. Desta maneira pôde-se afirmar (i) que o intermediário é uma mistura de epímeros em C6; (ii) que com o tempo predomina o epímero termodinamicamente mais estável. Os mesmos estudos foram desenvolvidos com NADPH, desamino-NADH e NMNH, para esclarecimentos a respeito da influência de grupos fosfato, amino e açúcar na catálise da hidratação e dos centros responsáveis pelo efeito Cotton positivo a 285 nm, nos piridinos nucleotídios. Observou-se que NADPH tem comportamento semelhante ao β-NADH, indicando que o grupo fosfato não tem papel importante nas catálises química e enzimática. No caso do mononucleotídio e desamino-dinucleotídio não houve diferença significativa entre as velocidades de hidratação química e enzimática, o que siginifica ser importante a presença do amino grupo da adenina para catálise enzimática no caso de NADH. Os derivados acima, também, apresentaram efeito Cotton positivo nos estágios finais da reação. Com base no fato, que o mononucleotídio também apresentou efeito Cotton positivo, de mesma intensidade dos dinucleotídios, pôde-se afirmar que o açúcar ligado ao anel da nicotinamida é o responsável pela dissimetria do produto formado. Traçou-se o espectro de absorção circular dicróica do isômero 1,6-NADH, ainda desconhecido, para obter-se informações a respeito da sua estrutura. Através dos valores de elipticidades molares, concluiu-se que é mais rígida do que a do 1,4-NADH, presumivelmente, devido a ligação simples, que une os anéis piridínico e ribosídico, ter rotação mais impedida, como consequência da maior proximidade do par de hidrogênios da piridina, com a ribose. O estudo da adição de CN- aos piridinos nucleotídios e compostos relacionados, usando técnica de dicroismo circular, mostrou haver estereosseletividade na adição. O espectro de absorção circular dicróica do aduto β-NAD+/CN- mostrou uma banda negativa larga com máximo em torno de 330 nm. Esta banda é assimétrica, o que permite um desdobramento em outras duas, com máximos a 325 e a 345 nm, de intensidade semelhantes. Em analogia com a redução dos piridinos nucleotídios, que ocorre nas posições 2, 4 e 6, pôde-se afirmar que a adição de CN-, também, ocorre em outras posições e não exclusivamente em 4. A banda de dicroismo circular na região de 345 nm, pareceu indicar a presença do isômero 1,6. O fato deste estar em concentração baixa a ponto de não ser detectável espectrofotometricamente, indicou que a força rotacional é bem maior do que para o isômero 1,4. Tal fato deve estar relacionado com a maior proximidade do CN- ao anel carboidrático. No aduto da forma α do piridino nucleotídio, o espectro de dicroismo circular apresentou uma banda negativa, com máximo de 342 nm e uma inflexão a 325 nm. Essa assimetria mostrou, claramente, a existência dos dois isômeros e, que a adição de CN- em C6 é bastante estereosseletiva. Além da estereosseletividade, pode estar contribuindo, também a menor mobilidade rotacional do anel diidronicotinamídico, quando se tem aduto em C6. A estereosseletividade da adição de cianeto veio corroborar com a proposição de um equilíbrio rápido entre as conformações aberta e fechada para os piridino nucleotídios. A possível existência de uma transição fraca, associada ao núcleo diidronicotinamídico, foi confirmada detectando-se um efeito Cotton associado a ela. Esse efeito foi observado para α-NADH, β-NADH e seus correspondentes adutos de CN-. Realizando-se o mesmo estudo para o complexo de β-NADH.Cu++, verificou-se que o efeito Cotton é 15 vezes mais intenso, confirmando assim, a detecção pioneira dessa transição fraca, presumivelmente de natureza singlete-triplete. / The reduction product of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is converted into the hydration product NADH-X (6-hydroxy-1,4,5,6-tetrahydronicotinamide adenine dinucleotide) by the action of polybasic ions such as phosphate, arsenate etc., or by enzymatic catalysis with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD). The hydration kinetics were followed by the increase in absorbance at 285 nm. Starting with the β-anomer of the coenzyme, the transition at 285 nm begins to exhibit a positive Cotton effect only in the later stages of the reaction. On the basis of the results, the formation of an interrnediate not exhibiting a Cotton effect at 285 nm is postulated. Since the hydration would not be expected to change the configuration at C1, of the ribose, the appearance of the Cotton effect is presumably due to an epimerization from the β-epimer to the thermodynamically more stabe α-epimer. In the absence of enzyme, the Cotton effect appears at somewhat lower conversions, suggesting that the slower hydration reaction provides greater opportunity for the occurrence of the epimerization. The increase in absorbance at 285 nm is more rapid for the hydration of the α-anomer of NADH than for the β-form in the presence of GPD. A positive Cotton effect is only observed for the forrner after the reaction has gone to about 60% completion. This indicates that an intermediate not exhibiting a Cotton effect is also formed in the case of α-NADH. Similar behavior was observed in the non-enzymatic hydration, however, as in the case of β-NADH, the onset of the Cotton effect occurred at lower conversions. The fact that GPD and polybasic ions produce similar effects on both the α and β anomers suggests that the enzymatic action of GPD is non-stereospecific, producing a mixture of epimers at C6. This also explain the absence of a Cotton effect even though significant hydrations has occurred. Thus we conclude (i) that the intermediate is a mixture of C6 epimers and (ii) that the more thermodynamically stable epimer predominates at long reaction times. The same studies were carried out with NADPH, deamino-NADH and NMNH to clarify the catalytic influence of the phosphate, amino, and sugar groups on the hydration and to identify the centers responsible for the positive Cotton effect at 285 nm in pyridine nucleotides. The observation that the behavior of NADPH is similar to that of β-NADH indicates that the phosphate group does not play an important role in the chemical and enzymatic catalysis. In the case of NMNH and deamino-NADH there is no significant difference between the rates of the chemical and enzymatic hydration, which implies that the presence of the amino group of adenine is important in the enzymatic catalysis of the hydration of NADH. The above derivatives also present positive Cotton effects in the later stages of the reaction. Since that mononucleotide exhibits a positive Cotton effect of intensity equal to that of the dinucleotides, it can be concluded that the sugar attached to the nicotinamide ring is responsible for the assymetry of the product. The previously unknown circular dichroic absorption spectrum of 1,6-NADH was determined in order to gain insight into its structure. From the values of the molar ellipticity it is concluded that the assymetric center of 1,6-NADH is more rigid than that of. 1,4-NADH. This is presumably due to a greater hindrance to rotation about the single bond between the pyridine and ribose rings in 1,6-NADH. A circular dichroic study of the addition of CN- to pyridine nucleotides and related compounds demonstrated the stereoselectivity of the addition. The circular dichroic absorption spectrum of the B-NAD+/CN- adduct exhibits a broad assymetric negative band with a maximum at about 330 nm. This band was interpreted in terms of two bands of similar intensity with maxima at 325 and 345 nm. By analogy with the reduction of pyridine nucleotides,which occurs at position 2,4 and 6, it is concluded that CN- addition also occurs at positions other than C4. The band at 345 nm was attributed to the 1,6-isomer. The fact that this isomer could not be detected by conventional absorption techniques indicates that it is present in low concentrations relative to the 1,4-isomer. It must have therefore has a much greater rotational strength, which is reasonable in view of the proximity of the CN- to the carbohydrate ring. The circular dichroic absorption spectrum of the α-NAD+/CN- adduct exhibited a negative band with a maximum at 342 nm and an inflection at 325 nm. This assymetry clearly demonstrated the presence of two isomers and the stereoselectivity of CN- addition at C6. Although the l,6-adduct could not be detected by conventional absorption techniques, the stereoselectivity of the addition and a large rotational strength contribute to its circular dichroic intensity. The stereoselectivity of the CN- addition corroborates the existence of a rapid conformational equilibrium between the folded and unfolded forms of pyridine nucleotides. A Cotton effect associated with the weak electronic transition attributed to the dihydronicotinamide nucleus was observed for α-NADH, β-NADH, and the corresponding CN- adducts, confirming the existence of the transition. For the β-NADH.CU++ complex, the Cotton effect was found to be 15 times more intense, thus confirming the original detection of this weak transition, which presumably has singlet-triplet character.

A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas caracterizações. / Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as \"amarelinho\". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase, chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein. Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence spectroscopy.

Neste trabalho, descrevemos um espectrômetro ótico para medidas de Dicroismo Circular Magnético (DCM), utilizado nas seguintes experiências: 1) Medidas de tempo de relaxação spin-rede (T1) para centros F em NaCl, NaBr, CsBr e CsCl, a temperatura de 1,8&#176K em campos magnéticos até 17000Gs. Verificamos a validade da teoria da referência (8) para explicar as diferenças observadas, no comportamento de \'T IND.1\', para halogenetos com diferentes íons alcalinos, bem como diferentes estruturas. Comprovamos que a interação hiperfina ainda continua a ser o mecanismo mais importante para esses centros. Verificamos também que, para temperaturas entre 6&#176K e l5&#176K, os valores de experimentais para T1, em KBr, concordam razoavelmente com a teoria da referência (21). Esta terapia é uma extensão daquela da referência (8). 2) Espectros de DCM para KCl: Co++ e CaF2: Co++ foram obtidos para campos magnéticos ate 56KGs e temperaturas entre 1,8&#176K e 4,2 &#176K. Os resultados obtidos mostraram ser concordantes com a hipótese dos centros Co++ ocuparem sítios intersticiais na rede de KCl. / In this work we describe a Magnetic Circular Dicroism Spectrometer wich was used in the following experiments: 1) We measured the spin-lattice relaxation time (T1) for F centers in NaCl, NaBr, CsBr and CsCl, at 1,8&#176K in magnetic fields up to 15000Gs. We verified the suitability of the theory of ref.(O8) to explain the differences observed for halides of differents alkali ions as well as for different structures. This proves that the hyperfine interaction is the most important mechanism for this kind of centers. We also verified that, for temperatures between 6&#176K and l5&#176K, T1, the T1 experimental values fits the theory of ref.(21) reasonably well ,for F centers in KBr. This theory is an extension of that of ref.(8). 2) We obtained the MCD spectra for KCl: Co++ and CaF2: Co++ in different magnetic fields up to 56KGs, and in temperature range between 1,8 &#176K and 4,2&#176K. Our results are consistent with the assumption that Co++ centers are intersticial in KCl lattice.

Este trabalho trata do estudo de complexos de rutênio contendo antiinflamatórios não-esteróides, com o objetivo de contribuir para ampliar as pesquisas na área de potenciais metalofármacos antitumorais. A partir de reações do precursor dimetálico [Ru2(O2CCH3)4Cl] com os fármacos carboxílicos sulindaco (HSulin) e diclofenaco de sódio (NaDiclofen) foram isolados, respectivamente, os correspondentes complexos [Ru2(Sulin)4Cl] e [Ru2(Diclofen)4Cl]. A reação entre o monômero [RuCl2(dmso)4] e o meloxicam (H2Melox) deu origem ao derivado misto [Ru(dmso)2(HMelox)2]. Os compostos foram caracterizados por meio de análise elementar, medidas de condutância molar, medidas de susceptibilidade magnética, espectroscopia de absorção eletrônica UV-VIS-IR, espectroscopia vibracional FTIR e Raman, e estudos de análise térmica (TG/DSC/MS). As interações da albumina de soro humana HSA, importante proteína do plasma, com os complexos obtidos, com o análogo [Ru2(IBP)4Cl] (HIBP = ibuprofeno) e também com os fármacos orgânicos não-complexados foram investigadas empregando-se dicroísmo circular, SDS-Page e fluorescência. A atividade antitumoral dos metalofármacos foi avaliada, através de ensaios com MTT, com base nos seus efeitos citotóxicos para a linhagem celular de leucemia humana K562. / This work describes the study of ruthenium complexes containing non-steroidal antiinflammatory drugs with the aim of helping to expand the research in the field of potential anticancer metallodrugs. Reactions of the [Ru2(O2CCH3)4Cl] dimetal complex with sulindac (HSulin) and sodium diclofenac (NaDiclofen) carboxylic drugs gave the correspondent complexes [Ru2(Sulin)4Cl] and [Ru2(Diclofen)4Cl], respectively. The reaction between the [RuCl2(dmso)4] monomer and the meloxicam drug (H2Melox) led to the mixed derivative [Ru(dmso)2(HMelox)2]. The compounds were characterized by elemental analysis, molar conductance measurements, magnetic susceptibility, UV-VIS-IR electronic absorption spectroscopy, Raman and FTIR vibrational spectroscopies and by studies of thermal analysis (TG / DSC / MS). The interactions of human serum albumin (HSA), the major plasma protein, with the obtained complexes, the analogous [Ru2(IBP)4Cl] (= HIBP ibuprofen) and also with the noncoordinated organic drugs have been investigated by circular dichroism, SDS-Page and fluorescence. The antitumor activity of the metallodrugs has been evaluated by MTT assays, on the basis of their cytotoxic effects on K562 human leukemia cell line.

O genoma de Xanthomonas citri (Xac) possui mais de 20 tipos de transportadores do tipo ABC incluindo o operon ssuABC associado ao transporte de alcano sulfonatos. Deste operon, escolhemos a proteína periplasmática ligadora de alcano sulfonatos SsuA2, para caracterização e análises espectroscópicas e estruturais. A rSsuA2 foi expressa no citoplasma de células de Escherichia coli e utilizada para a preparação de anticorpos em camundongos, que foram capazes de reconhecer a proteína recombinante, mas não a nativa no extrato de células de Xac. A rSssuA2 apresenta estrutura característica de proteínas alfa-beta, maior estabilidade em pH neutro (7.0), como também foi evidenciado pela obtenção de cristais somente nesta faixa, e pouca flexibilidade ao desenovelamento térmico. Os cristais difratam com resolução de 1.8 Å e pertencem ao grupo espacial de simetria P21. Além do o operon ssu (ssu2) altamente conservado, Xac apresenta o operon tau (ssu1) para captação de taurina. O papel do operon para Xac é discutido. / Xanthomonas citri (Xac) genome has more than 20 different ABC transporters, including the ssuABC operon. In this work, the alkanosulphonate-periplasmic binding protein SsuA2 was chosen for spectroscopic and structural analysis. The rSsuA2 protein was expressed as a soluble form and purified by immobilized metal affinity chromatography. Antibodies produced from the recombinant protein were able to recognize the rSsuA2, but not the native protein in the Xac extract samples. The protein presents secondary structure defined by alfa helices and beta-sheets, high stability in neutral pH and low flexibility to the thermal denaturation. The determination of the optimal pH range was important to produce crystals of high quality diffracting at 1.8 Å with symmetry of the P21 spatial group. Besides the highly conserved operon ssu (ssu2), Xac has the tau operon (ssu1) for taurine uptake.

Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.

Esticolisinas I e II (S tI e St II), citolisinas pertencentes à família das actinoporinas, da anêmona Stichodactila heliantus, formam poros em membranas biológicas e modelo onde seu receptor putativo é esfingomielina (SM). A ligação das actinoporinas a membranas ocorre pelo ancoramento da proteína à interface lipídio-água, por uma região rica em resíduos aromáticos. Evidências apontam para o papel fundamental da região N-terminal para formação do poro. O mecanismo proposto para a formação do poro consiste na ligação da toxina à interface membrana-água, oligomerização, e dissociação da região N-terminal do corpo da proteína, cuja α-hélice anfipática interaje com a bicamada, levando à formação de um poro toroidal. Estudos com peptídeos correspondentes à região N-terminal de St II e equinatoxina II (Eqt II) mostraram que estes fragmentos adquirem conformação em α-hélice na presença de membranas modelo, possuindo a capacidade de formar poros em membranas biológicas e modelo, mimetizando o comportamento desta região nas proteínas. St I e St II, que possuem 93% de identidade, apresentam atividades hemolíticas distintas, sendo St II mais ativa. Estudos mostraram que fragmentos da região N-terminal de St I e St II possuem atividades hemolíticas diferentes, e que os primeiros dez resíduos de St II tem papel importante na lise, e na agregação. Para compreender a nível molecular a interação entre o N-terminal das toxinas com membranas e sua dependência da composição lipídica, foram realizados estudos de dicroísmo circular (CD) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) da interação de quatro fragmentos da região N-terminal de St I (St I1-31 e S t I12-31) e St II (St II1-30 e St II11-30) com membranas modelo - bicamadas e micelas. A interação peptídeo-membrana mostrou-ser dependente: da sequência, e da composição lipídica. Espectros de CD mostraram que a ligação dos peptídeos promove aquisição de estrutura helicoidal; em solução os peptídeos possuem essencialmente estrutura ao acaso. O efeito da ligação dos peptídeos sobre a organização molecular dos lipídios foi monitorado por EPR. Os espectros de EPR mostraram que a ligação a bicamadas e micelas leva ao aumento da organização molecular dos lipídios, St II1-30 alterando o empacotamento molecular em maior extensão. A incorporação de lipídios negativamente carregados e de lipídios formadores de microdomínios ordenados aumentou a afinidade dos peptídeos pelas membranas modelo, especialmente em proporções molares onde ocorre a formação desses microdomínios. Os resultados também indicaram que apenas St II1-30 promoveu alterações significativas no espectro de um marcador de spin fosfolipídico marcado em C16 da cadeia acila incorporado em vesículas multilamelares (MLV), sugerindo que apenas este peptídeo penetra na bicamada, enquanto que os demais permanecem preferencialmente na interface. Os peptídeos interagiram de forma diferente com micelas e bicamadas, provavelmente devido a diferenças no empacotamento molecular nos dois sistemas. A interação diferencial dos peptídeos com bicamadas e micelas poderia refletir as interações com a membrana em diferentes etapas da formação do poro toroidal. Considerando a curvatura positiva na parede de um poro toroidal, a interação com micelas poderia estar mimetizando a topografia desse ambiente. / Sticholysins I and II (S tI and St II), belong to the actinoporins family and are produced by the anemone Stichodactila heliantus. The toxins form pores in biological and model membranes, their putative receptor being sphingomyelin (SM). Binding of actinoporins to membranes occurs via anchoring of an aromatic amino acid-rich region to the lipid-water interface. Evidences point to the importance of the N-terminal region for pore formation. The mechanism proposed for pore formation consists of toxin binding to the membrane-water interface, oligomerization, and dissociation of the N-terminus from the body of the protein. Next, the amphipathic α-helix in this region interacts with the bilayer, forming a toroidal pore. Studies of peptides from St II and equinatoxin II (Eqt II) N-terminus showed that they acquire α-helical conformation upon binding to model membranes and form pores in biological and model membranes, thereby mimicking the conformational and functional behavior of this region in the proteins. St I and St II (93% identity) display different hemolytic activity, St II being more active. Studies showed that fragments of St I and St II N-terminus also display different hemolytic activity, and that the first ten residues of St II play are important for lysis and peptide aggregation. In order to understand at the molecular level the N-terminus-membrane interaction, as well as its dependence on lipid composition, circular dichroism (CD) and electron paramagnetic resonance (EPR) studies of the interaction between four fragments of St I (St I1-31 and S t I12-31) and St II (St II1-30 and St II11-30) with model membranes bilayers and micelles - were performed. The interaction was found to depend on peptide sequence, and lipid composition. CD spectra showed that peptide binding promotes acquisition of helical structure. The effect of binding on lipid molecular organization was monitored by EPR. EPR spectra showed that peptide binding to bilayers and micelles leads to an increase of membrane molecular organization, St II1-30 being more effective. Incorporation of negatively charged lipids and of lipids that ordered microdomains increased peptide affinity for model membranes, especially when they were present at molar proportions known to originate such microdomains. It was found that only St II1-30 promoted significant alterations in the spectra of a phospholipid spin-labeled at C16 incorporated in multilamellar vesicles, (MLV), suggesting that while this peptide penetrates in the bilayer, the others remain preferentially at the interface. The peptides interaction with micelles was both qualitatively and quantitatively different than that with bilayers, electrostatic interactions playing a lesser role in this case. One important reason for the observed differences is probably due to differences in molecular packing in both types of aggregates. The differential interaction with bilayers and micelles could reflect the interaction with membranes indifferent steps of toroidal pore formation. Taking into account the positive curvature of a toroidal pore, the interaction with micelles could represent a model for peptide and lipid organization in the toroidal pore