Kidney bean proteins and peptides can be developed to serve as an important ingredient for the formulation of high quality foods or therapeutic products that may positively impact on body function and human health. The main goal of this thesis was to determine the in vitro structural and functional characteristics of major proteins and enzymatic protein hydrolysate of red kidney bean (Phaseolus vulgaris). Selective aammonium sulfate precipitation of the kidney bean proteins yielded 88% globulin and 7% albumin.The globulin and albumin are glycoproteins that contained ~4% and 45% carbohydrate contents, respectively. Physicochemical and functional characteristics of the globulin fraction, such as, gelation concentration, foam stability, emulsion capacity, and emulsion stability were superior to those of albumin. Reducing SDS-PAGE revealed vicilin with molecular weight of ~45 kDa as the major globulin in kidney beans. Circular dichroism spectroscopy of the purified vicilin showed reductions in α-helix, and β-pleated sheet conformations upon addition of NaCl or changes in pH. Likewise, the tertiary structures as observed from the near-UV CD spectra were also changed by shifts in pH conditions and NaCl addition. Far UV-CD showed increased β-sheet content up till 60oC from room temperature, but a steady loss in the tertiary structure as temperature was further increased; however, β-sheet structure was still detectable at 80oC. Differential scanning calorimetry thermograms showed a prominent endothermic peak with denaturation temperature at around 90oC, attributed to thermal denaturation of vicilin. Alcalase hydrolysis of kidney bean globulin produced multifunctional peptides that showed potential antihypertensive properties because of the in vitro inhibition of activities of renin and angiotensin I converting enzyme as well as the antioxidant properties. The <1 and 5-10 kDa peptide fractions exhibited highest (p<0.05) renin inhibition and the ability to scavenge 2, 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical, inhibit peroxidation of linoleic acid and reduce Fe3+ to Fe2+. Based on this study, incorporation of kidney bean globulin as an ingredient may be useful for the manufacture of high quality food products. Likewise, the kidney bean protein hydrolysates, especially the <1 kDa fraction represent a potential source of bioactive peptides for the formulation of functional foods and nutraceuticals.

The number of gene products available for structural and functional study is increasing at an unprecedented rate as a result of the successful whole genome sequencing projects. Systematic structure determination of proteins on a genomic scale, called structural genomics, can significantly contribute to the field of protein science and to functional annotation of newly identified genes. This thesis covers different aspects of protein production in Eschericiha coli for structural studies in the context of structural genomics. Protocols have been downscaled and standardized to allow for a rapid assessment of the production characteristics for multiple proteins in parallel under a number of different conditions. Foremost, the ability of different proteins and peptide tags to affect the solubility of the recombinant protein when produced as fusion proteins has been systematically studied. Large differences in the success-rate for production of soluble protein in E. coli were found depending on the fusion partner used, with a more than two-fold increase in the number of proteins produced as soluble when comparing the best and the poorest fusion tags. For different constructs with a histidine tag, commonly used to facilitate protein purification, large differences in yield depending on the design of the expression vector were found. When comparing different fusion proteins produced from identical expression vectors, fusions to the GB1 domain were found to result in the highest yield of purified target protein, on average 25 % higher than any of the other fusions. The suitability for further structural studies was tested at an intermediate scale for proteins that were identified as soluble in the expression screening. For this purpose, protocols for rapid purification and biophysical characterization using nuclear magnetic resonance and circular dichroism spectroscopy were developed and tested on 19 proteins, of which four were structured. / QC 20100826

Orientador: Prof. Dr. Vani Xavier de Oliveira Junior / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2016. / Apos a descoberta da penicilina por Alexander Fleming - em 1940, muitos outros compostos antimicrobianos foram relatados, oriundos de uma ampla variedade de invertebrados, plantas e especies de animais - os antimicrobianos, como: tirocidina, gramidicina, bombinina, melitina, surgindo assim a gera antibioticah. Em seguida, no intuito de obter candidatos para a geracao de novas drogas, particularmente no combate aos virus, fungos e bacterias, o foco na obtencao de peptideos antimicrobianos tambem passou a serem bacterias, fungos, insetos, aracnideos, crustaceos, anfibios, peixes e plantas. Nesse contexto, um peptideo antimicrobiano, denominado IsCT foi isolado em 2001, em Isalo-Madagascar, durante a analise do veneno do escorpiao Opisthacanthus madagascariensis, o qual apresentou atividade hemolitica e antimicrobiana. No intuito de obter-se melhores resultados biologicos contra os agentes patogenicos e uma baixa toxicidade, esse trabalho propoe o desenho de novos analogos do IsCT, com a substituicao de alguns residuos de aminoacidos da sua sequencia, levando-se em consideracao o balanco hidrofobico, carga e sua anfipaticidade. Todos os peptideos foram sintetizados em fase solida, pela estrategia Fmoc, purificados em Cromatografia Liquida de Alta Eficiencia (HPLC) e caracterizados por Espectrometria de Massas (LC/ESI-MS); alem disso, foram realizados estudos conformacionais por Dicroismo Circular (CD).Os ensaios biologicos foram realizados em bacteria gram-negativa Escherichia coli (SBS 363), bacteria gram-positiva, Micrococcus luteus (A270) e a levedura Candida albicans (MDM8). Alem disso, foram realizados ensaios hemoliticos e de degradacao enzimatica. Os resultados demonstraram que o analogo 6foi duas vezes mais ativo que o IsCT nativo, nos tres micro-organismos testados, enquanto que os analogos 1, 5 e 8 mostraram-se menos ativos. Em contrapartida, os analogos 2, 3, 6, 7 e 9 apresentaram um aumento na atividade hemolitica. Todos os analogos apresentaram uma rapida cinetica de degradacao, contudo verifica-se que as substituicoes na posicao 8 (analogo 3 e 4) propiciaram analogos um pouco mais resistentes as proteases. Nos Estudos de CD observa-se que a maioria dos analogos apresenta uma propensao a ¿¿-helice em meios com 50% de TFE e 10 ¿ÊM de SDS, como relatado para o IsCT nativo. De forma geral, com os resultados obtidos dos dez peptideos sintetizados neste trabalho foi possivel obter dois peptideos - [Lys]3-IsCT e [Ala]1[Phe]5[Lys]8-IsCT - os quais mostraram uma reducao do 50% na inibicao dos micro-organismos testados, uma menor atividade hemolitica, em comparacao com o IsCT (peptideo nativo), alem de serem mais resistentes a degradacao proteolitica, indicando que as alteracoes pontuais no IsCT afetam significativamente a sua atividade biologica, hemolitica e a sua estruturacao, tornando-os possiveis candidatos a novas drogas. / After the discovery of penicillin by Alexander Fleming in 1940, many other antimicrobial compounds (as tyrocidine, gramicidin, bombin and melittin) were described from a wide variety of plants, invertebrates and other animal species, providing the Antibiotic Era. Then, in order to obtain candidates for the generation of new drugs, particularly in the fight against viruses, fungi and bacteria, focus on obtaining antimicrobial peptides also came to be bacteria, fungi, insects, arachnids, crustaceans, amphibians, fishes and plants. In this sense, an antimicrobial peptide called IsCT was isolated in 2001 in Isalo Madagascar, while analyzing the venom of the scorpion Opisthacanthus madagascariensis that showed hemolytic and antimicrobial activity. In the attempt to obtain better biological outcomes against pathogens and a low toxicity, this study proposes the design of new IsCT analogues, with the replacement of some amino acids of its original sequence, considering its hydrophobic balance, charge and amphipathicity. All peptides were synthesized on solid phase, by Fmoc strategy, purified by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterized by mass spectrometry (LC / ESI-MS); furthermore, were performed conformational studies by circular dichroism (CD). The biological tests were carried out on gram-negative bacteria Escherichia coli (SBS 363), gram-positive bacteria Micrococcus luteus (A270) and Candida albicans (MDM8). In addition, enzymatic degradation and hemolytic assays were performed. The results showed that the analog 6 was twice more active than native IsCT in three micro-organisms tested, whereas the analogs 1, 5 and 8 were less active. In contrast, the analogous 2, 3, 6, 7 and 9 exhibited an increase in hemolytic activity. All analogs exhibited rapid degradation kinetics, however, it is seen that substitutions at positions 8 (analogous 3 and 4) analogs provided a little more resistant to proteases. In the CD studies, was observed that most analogs presents a propensity for á-helix in solutions with 50% TFE and 10 ìM of SDS, as has been reported for the native IsCT. In general, the results obtained from the ten peptides synthesized in this work it was possible to obtain two peptides to [Lys]3-IsCT and [Ala]1[Phe]5[Lys]8-IsCT which showed a reduction of 50% in inhibition of tested microorganisms, a lower hemolytic activity compared with the IsCT (native peptide) plus were more resistant to protease degradation, indicating that specific changes in IsCT significantly affect its biological activity, hemolytic and their structure, making the possible candidates for new drugs.

Orientadora: Profa. Dra. Giselle Cerchiaro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / Entender os mecanismos pelos quais os radicais livres e espécies oxidantes atuam em processos fisiológicos torna-se cada vez mais complexo, especialmente aqueles envolvendo metais de transição com elevada atividade redox como o cobre, ou com funções celulares como o zinco, ambos presentes na metaloenzima Cu,Zn-Superóxido Dismutase (SOD1). Muitos processos envolvendo a sua agregação e função peroxidásica deletéria ainda estão em plena discussão na literatura , mesmo após mais de 40 anos de sua descoberta e caracterização. Nesta área de pesquisa, o papel de mutações na enzima relacionado a casos familiares da doença Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) começou a ser elucidado recentemente, quando soube-se que o tipo de agregação proteica observado e a gravidade da doença apresenta relação com o tipo de mutação na SOD1. Mutações que afetam o modo de coordenação do zinco são as mais intrigantes, pois revelam uma alta patogenicidade da ELA. Sabe-se muito pouco sobre como a SOD1 estaria envolvida com casos de ELA esporádicos, mais comumente encontrados, e nossa proposta esta relacionada a alterações no sítio de ligação ao zinco na enzima, levando a agregações proteicas e formas agressivas da doença. Portanto, neste trabalho de Doutorado, foi estudada a mutação sítio dirigida T135SK136E da SOD1 em relação ao comportamento estrutural e catalítico da proteína. Estudos de Dicroísmo Circular e Ressonância Paramagnética Eletrônica mostraram que a mutação causa alterações estruturais, sem alterar, no entanto, o sítio catalítico da enzima. A proteína mutada apresentou dificuldade em alocar os metais Cobre e Zinco em seus sítios metálicos, porem, mostrou maior atividade catalítica quando comparada à SOD1 nativa. / Mechanisms involving Free-radical and oxidant species are too complexes to understand, especially those which involves high redox activity transition metals ions as copper, or those that are part of cell function, as zinc, both present at metaloenzyme Cu,Zn-Superoxide Dismutase (SOD1). It is known that many process involving SOD1 aggregation and peroxidase activity remain in literature discussion even more than 45 years from its discovery and characterization. In this research area the role of mutation on the enzyme related to cases of familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) begins to be elucidated and mutations related to zinc coordination are more intriguing because they seem to cause a more pathogenic ALS. In this way, in this PhD work we studied the site-direct mutation T135SK136E on SOD1, taking special attention to zinc site, to verify how the enzyme acts catalytic and structurally. Circular Dichroism and Electronic Paramagnetic Resonance assays have shown that the mutation causes structural alterations, without altering, however, the catalytic site of the enzyme. The mutated protein presented difficulty in allocating the copper and zinc metals in their metallic sites, but showed greater catalytic activity when compared to wild type SOD1.

Uma nova lectina extraída da semente de Artocarpus integrifólia, denominada KM+ foi recentemente descrita. KM+ e haptotática para neutrófilos, promove a aglutinação de hemácias dos grupos A, B, 0, estimula a proliferação de linfócitos do baço de camundongos e liga-se em &#945 D-manose, &#945 metil manosidio e &#945 D-glicose. Esta lectina é composta por quatro monômeros, com peso molecular de 13.150 daltons cada, unidos por interações não covalentes. KM+ contem 1,8% de carboidratos e apresentou quatro isoformas com pontos isoelétricos entre 4,2 e 5,2. Este trabalho teve como objetivos estudar modificações estruturais de KM+ em função de parâmetros como temperatura, força iônica, pH, agentes desnaturantes, ligação com D-manose, monitoradas por dicroísmo circular (CD) e fluorescência. CD também foi utilizado para estimar o conteúdo de estrutura secundaria de KM+, utilizando-se dois programas descritos na literatura: SSE (Secondary Structure Estimation), que utiliza o método dos mínimos quadrados para a estimativa da estrutura secundaria e obtenção dos espectros básicos, baseados nos dados cristalográficos de proteínas de .estrutura resolvida; CCA (Convex Constraint Analisys) que utiliza o algoritmo simplex e a partir dos espectros de CD das proteínas de referencia calcula os espectros das componentes básicas. Para a estimativa das frações de estrutura secundária o segundo método utiliza o programa Lincomb. Os espectros de CD foram registrados no intervalo de 185 a 260 nm. O conteúdo em estrutura secundária, estimado pelo programa SSE foi: 0% de &#945-hélice, 41% de folha &#946, 27% de volta &#946 e 32,3 de estrutura desordenada; pelo programa CCA foi: 1% de &#945-hélice, 35% de folha &#946 anti-paralela, 21% de volta &#946 e/ou folha &#946 paralela, 15% de contribuições de aromáticos e/ou ligações dissulfeto, 28% de estrutura desordenada. Os desvios médios quadráticos para os programas SSE e CCA foram 12% e 1%, respectivamente. Portanto a lectina KM+ é principalmente constituída por estruturas tipo folha &#946 e tipo desordenada. A curva calculada pelo programa CCA foi mais bem estimada, pois tem o desvio médio quadrático 12 vezes menor que o do programa SSE. Este resultado, provavelmente ocorre devido aos seguintes fatores: (i) no programa CCA, o espectro da proteína a ser analisada e alinhado com os espectros das proteínas de referência, influenciando no calculo dos espectros básicos; (ii) maior número de proteínas com estrutura &#946 no grupo de referência do programa CCA. A estabilidade de KM+ em função da temperatura tem comportamento diferente em tampão sódio fosfato (PBS) daquele observado em água. Em PBS, quando a amostra esta a 70&#176C, a forma do espectro de CD mostrou-se consistente com um espectro de proteína desnaturada. Comumente, um espectro de proteína desnaturada caracteriza-se pela perda da estrutura secundaria predominante e aumento da estrutura desordenada. Em água, também a 70&#176C, na região da estrutura &#946 (216 nm) surge uma nova banda e na região da estrutura desordenada (195 nm) aparece uma banda com valores positivos mimetizando um espectro da estrutura &#945-hélice. Esta diferença de comportamento pode ser devida à força iônica. A desorganização promovida na molécula de KM+ por cloreto de guanidina foi típica de desnaturação. o máximo da emissão de fluorescência, da KM+ em PBS pH 7,2, foi a 328 nm, característico de resíduos de triptofano protegidos do solvente. Este máximo mudou para 340 nm em pH 10,5. Este resultado indica mudanças no ambiente químico do triptofano neste pH. O deslocamento para a região do vermelho indica, que em pH. os resíduos de triptofano estio em maior contato com o solvente. O número de sitios ligantes de D-manose J)a molécula de KM+, foi estimado pela supressão da fluorescência promovida pelo D-manose. Esta estimativa foi baseada na suposição de que todos os sítios ligantes de D-manose estivessem próximos aos resíduos de triptofano. A relação encontrada foi de 2 moles de D-manose/mol de KM+ / Recently a new lectin, KM+, isolated from Artocarpus integrifolia seeds was described. KM+ induces neutrophil migration, agglutination of human red blood cells, proliferation of mouse spleen cells and binding with monosacharides D-mannose, D-glicose and &#945-metil mannoside. This glycoprotein is composed of four monomers, assembled by non covalent bonds, has 500 aminoacids residues/mol, with a Molecular Weight of 52,000 Daltons and 1.8% of carbohydrates [27]. In this work structural changes of KM+ was studied as a function of temperature, pH, chemical denaturing agents as well as the binding with D-mannose. These changes were monitored by circular dichroism (CD) and fluorimetry. Circular Dichroism (CD) spectroscopy was used for the analysis of the secondary structure of KM+ in solution due do its capacity to indicate the presence and to estimate the proportion of &#945-helix, &#946-sheet, &#946-turn and unordered conformations. This measurent can be regarded as a function of the relative orientation of the chromophores responsible for their chiroptical activity. CD spectroscopy is also one of the methods of choice for monitorization of conformational changes in proteins as a function of solvents, pH, temperature, ionic strength and specific or non specific binding. Two programs which are in use for estimation of secondary structure: SSE, using the linear least squares method and CCA, using the simplex method, were evaluated in the present work. SSE uses a set of proteins with known X-ray data as the basis for evaluation while CCA uses only pure proteins experimental CD spectra. Fluorescence spectroscopy is very useful to monitore of protein conformational changes in solution due to the presence of intrinsic fluorophores. Fluorescence Measurements were performed at 25&#176C. Samples were excited at 280 nm and the emission was monitored in the range 290-450 nm. The maximum emission as a function of pH was at pH 7.0. The wavelength for maximum emission changed from 328 nm at pH 7.0 to 340 nm at pH 10.5. CD spectra were recorded over the range of 185 up to 260 nm. The Secondary structure content estimated by SSE program was: 0% &#945-helix, 41% &#946-sheet, 26% &#946-turn and 32% random with RMS of 12% and CCA program was: 1% &#945-helix, 35% antiparallel &#946-sheet, 21% &#946-turn and/or parallel B-sheet, 28% random, 15% aromatics contributions and dissulfide linkages with RMS of 1%. The fractions of secondary structure obtained when using CCA program were more consistent than those of SSE program. The simulation by CCA program was better probably due to its desconvolution of the spectral contribution of the common secondary structures using experimental CD curves of proteins. The stability of KM+, in PBS, as a function of temperature changes above 55&#176C but only at 70&#176C the shape of the CD spectrum is consistent with the loss of the native ordered secondary structure that should accompany protein unfolding. CD spectra of KM+ in water showed conformational changes as a function of temperature was not consistent with denaturated proteins. The unfolding of KM+ by GdnCl and SDS resulted in CD spectroscopic changes: consistent with the increased random structure and disappearance of beta sheet. Using the two denaturing agents together GdnCl and temperature, the denaturation was observed at lower decreased both GdnCl concentration and at lower temperature. The estimation of the number of binding sites for D-mannose was obtained through the fluorescence intensity decrease due to a quenching effect of D-mannose and showed that the stoichiometry of binding was 2 moles of D-mannoseimol of lectin

A forma ativa da vitamina B1, tiamina pirofosfato (TPP), é um cofator indispensável para certas enzimas que atuam no metabolismo de carboidratos e aminoácidos. Sua biossíntese se dá pela formação independente de suas partes componentes pirimidina e tiazol. Em procariotos a via de síntese para vitamina B1 já foi esclarecida, entretanto em eucariotos ainda existem ainda algumas lacunas a serem preenchidas. Em Arabidopsis thaliana a proteína Thi1 é possivelmente a responsável pela síntese do motivo tiazólico, uma vez que um composto relacionado a TPP foi encontrado em sua estrutura. Neste trabalho, Thi1 e seu mutante natural Thi1(A140V), o qual é responsável pela auxotrofia para tiamina numa linhagem mutante de A. thaliana, foram estudados com intuito de verificar a influência da mutação pontual na estrutura e na atividade de Thi1. As proteínas foram produzidas em E. coli e análises biofísicas usando anisotropia de fluorescência e Dicroísmo Circular (CD) mostraram diferenças consideráveis na estabilidade protéica. Estudos de desnaturação mostraram diferenças na temperatura de transição (Tm), de cerca de 4 ºC maior para Thi1, e na concentração de guanidina na qual metade das proteínas estavam desnaturadas, de 0,42 M para Thi1 e 0,24 M para Thi1(A140V). Os dados de anisotropia de fluorescência obtidos a partir da desnaturação térmica também confirmaram a maior instabilidade de Thi1(A140V) frente a Thi1. Para avaliar a presença e caracterizar o provável precursor de TPP em Thi1(A140V), foram também realizados ensaios de absorção, CD e infra-vermelho dos ligantes intrínsecos. Os resultados destas análises mostraram que as moléculas poderiam apresentar diferenças em seus grupos constituintes. Entretanto, os experimentos complementares de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1D 1H e 2D TOCSY) revelaram que as diferenças observadas nas amostras dos ligantes, provenientes de Thi1 e de Thi1(A140V), tratavam-se na verdade de diferenças nas proporções de quatro populações distintas de compostos, compondo um pool de ligantes. Na amostra proveniente de Thi1(A140V), a população dominante correspondeu à molécula de adenosina difosfato, ADP. Ainda, embora em ambas as amostras o ADT tenha sido encontrado, aquela derivada de Thi1(A140V) apresentou uma população significativamente menor deste composto. Concluindo, os resultados demonstraram que a mutação A140V levou a uma maior instabilidade conformacional em Thi1 e, além disso, a presença de quantidades reduzidas de ADT em Thi1(A140V) sugerem que esta alteração tenha contribuído de alguma forma para a redução de sua atividade. / The active form of vitamin B1, Thiamine pyrophosphate (TPP), is an indispensable cofactor for some enzymes that act on carbohydrates and amino acids metabolism. Its biosynthesis requires the independent formation of its compounds, pyrimidine and thiazole. In prokaryotes, the vitamin B1 biosynthetic way has already been elucidated, but in eukaryotes there are some gaps to be filled. In Arabidopsis thaliana, the Thi1 protein is possibly responsible for the synthesis of the thiazole moiety, since a related compound to TPP was found in its structure. In this work, we have investigated Thi1 and its natural mutant Thi1(A140V), which is responsible for the thiamin auxotrophy in A. thaliana mutant line, to identify the role this mutation plays in the structure and activity of Thi1. The proteins were produced in E. coli and the results of biophysical analysis using fluorescence and Circular Dichroism (CD) showed considerable differences in the protein stability. Thermal and chemical unfolding studies have shown a difference in the melting temperature (around 4 ºC higher for Thi1) and concentration of guanidine at which half of the protein had unfolded (0,42 M for Thi1 and 0,24 M for Thi1(A140V)). The fluorescence anisotropy data obtained from thermal unfolding showed Thi1(A140V) is more unstable compared to Thi1. We have also carried out tests of absorption, CD and infra-red to assess the presence and to characterize the possible precursor of TPP in Thi1 (A140V). The results showed that the ligants could have different compositions. However, complementary results from NMR (1D 1H e 2D TOCSY) revealed that the difference observed in the ligant samples from both proteins were actually related to the proportion of four distinct compound population, representing a ligant pool. In the sample from Thi1(A140V), the dominant population corresponded to ADP. Besides, although both samples contained ADT, it was significantly less abundant in that one derived from Thi1(A140V). Concluding, the results demonstrated that the A140V mutation leaded to a more unstable conformation of Thi1 and, additionally, the presence of smaller amounts of ADT in Thi1(A140V) suggests this change might have contributed to reducing its activity.

Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.

Esticolisinas I e II (S tI e St II), citolisinas pertencentes à família das actinoporinas, da anêmona Stichodactila heliantus, formam poros em membranas biológicas e modelo onde seu receptor putativo é esfingomielina (SM). A ligação das actinoporinas a membranas ocorre pelo ancoramento da proteína à interface lipídio-água, por uma região rica em resíduos aromáticos. Evidências apontam para o papel fundamental da região N-terminal para formação do poro. O mecanismo proposto para a formação do poro consiste na ligação da toxina à interface membrana-água, oligomerização, e dissociação da região N-terminal do corpo da proteína, cuja &#945;-hélice anfipática interaje com a bicamada, levando à formação de um poro toroidal. Estudos com peptídeos correspondentes à região N-terminal de St II e equinatoxina II (Eqt II) mostraram que estes fragmentos adquirem conformação em &#945;-hélice na presença de membranas modelo, possuindo a capacidade de formar poros em membranas biológicas e modelo, mimetizando o comportamento desta região nas proteínas. St I e St II, que possuem 93% de identidade, apresentam atividades hemolíticas distintas, sendo St II mais ativa. Estudos mostraram que fragmentos da região N-terminal de St I e St II possuem atividades hemolíticas diferentes, e que os primeiros dez resíduos de St II tem papel importante na lise, e na agregação. Para compreender a nível molecular a interação entre o N-terminal das toxinas com membranas e sua dependência da composição lipídica, foram realizados estudos de dicroísmo circular (CD) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) da interação de quatro fragmentos da região N-terminal de St I (St I1-31 e S t I12-31) e St II (St II1-30 e St II11-30) com membranas modelo - bicamadas e micelas. A interação peptídeo-membrana mostrou-ser dependente: da sequência, e da composição lipídica. Espectros de CD mostraram que a ligação dos peptídeos promove aquisição de estrutura helicoidal; em solução os peptídeos possuem essencialmente estrutura ao acaso. O efeito da ligação dos peptídeos sobre a organização molecular dos lipídios foi monitorado por EPR. Os espectros de EPR mostraram que a ligação a bicamadas e micelas leva ao aumento da organização molecular dos lipídios, St II1-30 alterando o empacotamento molecular em maior extensão. A incorporação de lipídios negativamente carregados e de lipídios formadores de microdomínios ordenados aumentou a afinidade dos peptídeos pelas membranas modelo, especialmente em proporções molares onde ocorre a formação desses microdomínios. Os resultados também indicaram que apenas St II1-30 promoveu alterações significativas no espectro de um marcador de spin fosfolipídico marcado em C16 da cadeia acila incorporado em vesículas multilamelares (MLV), sugerindo que apenas este peptídeo penetra na bicamada, enquanto que os demais permanecem preferencialmente na interface. Os peptídeos interagiram de forma diferente com micelas e bicamadas, provavelmente devido a diferenças no empacotamento molecular nos dois sistemas. A interação diferencial dos peptídeos com bicamadas e micelas poderia refletir as interações com a membrana em diferentes etapas da formação do poro toroidal. Considerando a curvatura positiva na parede de um poro toroidal, a interação com micelas poderia estar mimetizando a topografia desse ambiente. / Sticholysins I and II (S tI and St II), belong to the actinoporins family and are produced by the anemone Stichodactila heliantus. The toxins form pores in biological and model membranes, their putative receptor being sphingomyelin (SM). Binding of actinoporins to membranes occurs via anchoring of an aromatic amino acid-rich region to the lipid-water interface. Evidences point to the importance of the N-terminal region for pore formation. The mechanism proposed for pore formation consists of toxin binding to the membrane-water interface, oligomerization, and dissociation of the N-terminus from the body of the protein. Next, the amphipathic &#945;-helix in this region interacts with the bilayer, forming a toroidal pore. Studies of peptides from St II and equinatoxin II (Eqt II) N-terminus showed that they acquire &#945;-helical conformation upon binding to model membranes and form pores in biological and model membranes, thereby mimicking the conformational and functional behavior of this region in the proteins. St I and St II (93% identity) display different hemolytic activity, St II being more active. Studies showed that fragments of St I and St II N-terminus also display different hemolytic activity, and that the first ten residues of St II play are important for lysis and peptide aggregation. In order to understand at the molecular level the N-terminus-membrane interaction, as well as its dependence on lipid composition, circular dichroism (CD) and electron paramagnetic resonance (EPR) studies of the interaction between four fragments of St I (St I1-31 and S t I12-31) and St II (St II1-30 and St II11-30) with model membranes bilayers and micelles - were performed. The interaction was found to depend on peptide sequence, and lipid composition. CD spectra showed that peptide binding promotes acquisition of helical structure. The effect of binding on lipid molecular organization was monitored by EPR. EPR spectra showed that peptide binding to bilayers and micelles leads to an increase of membrane molecular organization, St II1-30 being more effective. Incorporation of negatively charged lipids and of lipids that ordered microdomains increased peptide affinity for model membranes, especially when they were present at molar proportions known to originate such microdomains. It was found that only St II1-30 promoted significant alterations in the spectra of a phospholipid spin-labeled at C16 incorporated in multilamellar vesicles, (MLV), suggesting that while this peptide penetrates in the bilayer, the others remain preferentially at the interface. The peptides interaction with micelles was both qualitatively and quantitatively different than that with bilayers, electrostatic interactions playing a lesser role in this case. One important reason for the observed differences is probably due to differences in molecular packing in both types of aggregates. The differential interaction with bilayers and micelles could reflect the interaction with membranes indifferent steps of toroidal pore formation. Taking into account the positive curvature of a toroidal pore, the interaction with micelles could represent a model for peptide and lipid organization in the toroidal pore

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T21:20:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_FlaviaRaquelGoncalves_D.pdf: 4565621 bytes, checksum: 26bdfc2a971d3837321625172c6745e8 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O gene que codifica a proteína INT6 corresponde a um dos sítios de inserção do vírus de tumor de glândula mamária em camundongo (MMTV). Esta inserção pode levar à formação de proteínas truncadas sem a porção C-terminal e sem o domínio PCI, descrito como domínio de interação entre proteínas. Neste trabalho, realizamos 3 triagens para a identificação dos ligantes protéicos da proteína humana INT6 (hINT6) pelo método do duplo-híbrido de levedura. Embora interações específicas tenham sido identificadas, não foi possível a confirmação in vitro das novas interações isoladas. Para análises estruturais, usamos a proteína INT6 de Arabidopsis thaliana (AtINT6), visto que a proteína humana expressou em níveis muito baixos na fração solúvel do extrato de Escherichia coli. Análises de dicroísmo circular revelaram que a proteína AtINT6 é rica em estrutura do tipo a-hélice. A região que compreende os aminoácidos 172 a 415, incluindo o domínio PCI, foi identificada por proteólise parcial e espectrometria de massas como um domínio estrutural que após sua clonagem apresentou alto nível de expressão, solubilidade e estabilidade. Este trabalho envolveu também a caracterização da NY-REN-21, que foi isolada pelo duplo-híbrido para a identificação dos ligantes protéicos da proteína hINT6 e representa uma possível ortóloga para o fator de transcrição ZFP38 de camundongo. Ambas as proteínas apresentam um domínio de dimerização (SCAN), 7 domínios dedos de zinco tipo C2H2 na porção C-terminal e uma região central predita como desestruturada. A proteína NY-REN-21 se mostrou parcialmente desenovelada e sua estrutura secundária é afetada pela incubação com EDTA. Ensaios de proteólise limitada, dicroísmo circular e fluorescência confirmaram que sua região central é intrinsicamente desordenada, além de apresentar mobilidade anômala em gel de SDS-PAGE e representa uma fração flexível da proteína. Não foi possível a caracterização da região dos dedos de zinco, pois esta região se mostrou altamente instável. O domínio SCAN da NY-REN-21 é capaz de formar homodímeros e heterodímeros com a proteína SCAND1. Esta interação pode representar uma forma de regulação da atividade da proteína NY-REN-21 / Abstract: The INT6 gene was reported as a frequent genome integration site of Mouse Mammary Tumor Virus (MMTV). This integration may result in truncated forms of INT6 protein lacking its C-terminal region and the PCI domain. It has been reported that this domain is involved in protein-protein interaction. We performed 3 yeast two-hybrid screens in order to identify the human INT6 (hINT6) interaction partners. Although two previously described specific interactions were identified in these screens, it was not possible to confirm the new interactions by in vitro binding assays. The Arabidopis thalina INT6 ortholog (AtINT6) was used for structural analyses, since the hINT6 was insoluble following expression in Escherichia coli. AtINT6 showed CD spectra with high helical content. The region comprising amino acids 172 to 415 forms a compact protease resistant domain as determined by limited proteolysis and mass spectrometry analyses. This domain, comprising the PCI domain sequence, was cloned and expressed in E. coli and showed high solubility and stability. This recombinant protein has the potential to serve as a model protein for three-dimensional structure determination of the PCI domain. We also studied the NY-REN-21 protein, which was isolated as a potential hINT6 interaction partner and represents a putative ortholog of the mouse ZFP38 transcriptional factor. Both proteins are C2H2 type multifinger proteins, containing a conserved oligomerization domain (SCAN) in the N-terminal region and a predicted disordered central region. Our analyses showed that full-length NY-REN-21 is partially unfolded and its secondary structure content is affected by incubation with EDTA. The central region of NY-REN-21 shows an aberrant mobility on SDS-PAGE and is intrinsically unstructured as reveled by circular dichroism, fluorescence and limited proteolysis. The zinc finger region was not characterized because of its unstable nature. The recombinant SCAN domain of NY-REN-21 can form homodimers and heterodimers with the SCAND1 protein. This interaction may represent a novel regulatory mechanism of NY-REN-21 activity / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O intenso uso de compostos orgânicos em conjunto com o grande avanço industrial culminou em um enorme acúmulo de poluentes orgânicos no meio ambiente. Dentre estes poluentes têm-se destacado a presença de hidrocarbonetos aromáticos altamente tóxicos e resistentes à degradação física, química, fotolítica e biológica. Desta maneira, uma nova forma de combater a presença deste tipo de composto no meio ambiente têm sido estudada: o uso de microorganismos, naturais ou geneticamente modificados, capazes de transformá-los em substâncias inertes, como CO2 e água. Tal metodologia é denominada biorremediação. Dentres estes microorganismos destacam-se bactérias dos gêneros Pseudomonas, Aeromonas, Beijerinckia, dentre outros, que têm sido estudadas para esta finalidade. A enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD) é uma das proteínas expressas por bactérias do gênero Pseudomonas putida, sendo responsável pela clivagem de hidrocarbonetos aromáticos através da incorporação de ambos os átomos de uma molécula de oxigênio à estrutura do anel aromático, sendo a proteína escolhida para desenvolvermos o presente trabalho. Mais especificamente, nos interessa estudar como o mecanismo de ação da referida enzima é controlado por moléculas extrínsecas, como fosfolipídios. Tal interesse pela interação entre a enzima e fosfolipídios surgiu recentemente quando da obtenção da primeira estrutura cristalográfica de uma enzima da família da CCD (dioxigenases intradióis). Nesta estrutura foi observado um sítio de ligação por monômero para fosfolipídios, o que fez com que várias questões relativas à influência desses sobre a atividade da enzima fossem levantadas. Nosso objetivo foi fazer uso das técnicas de Dicroísmo Circular (CD), Calorimetria e Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) para estudar alterações conformacionais da enzima e de sua cinética induzidas por moléculas de fosfolipídio, e assim, obter informações que correlacionem as mudanças estruturais com o mecanismo de atividade enzimática da enzima. Os resultados obtidos através do uso daquelas técnicas em conjunto com protocolos que possibilitam a delipidação da enzima mostraram que a presença do fosfolipídios na estrutura da enzima tem influência sobre a atividade enzimática. Quando retiramos o fosfolipídio/ácido graxo, pudemos visualizar uma pequena mudança na estrutura secundária da enzima, um aumento da entalpia de reação, bem como um aumento na velocidade de reação, enquanto que a afinidade da enzima pelo substrato diminuiu. Pudemos também observar uma maior estabilidade térmica da enzima quando na ausência do fosfolipídio/ácido graxo e não foi observado interação da Pp 1,2-CCD com modelos micelares constituídos por lisofosfolipídios. Um breve estudo realizado sobre o papel da força iônica na atividade e na estabilidade térmica da proteína mostrou que na ausência de NaCl, em pH 8, a enzima se mostrou mais ativa, com uma afinidade pelo substrato maior e neste ambiente com baixa força iônica foi observado uma pequena interação da enzima com modelos micelares carregados negativamente. Assim, pudemos concluir que as moléculas anfipáticas, retiradas com os processos de delipidação, apesar de modificarem muito pouco a estrutura secundária da enzima, ainda assim instauram modificações na sua função de catálise do substrato catecol. Esta informação juntamente com os dados sobre inibição do processo reacional ocasionada pelo produto da reação formam um novo conjunto de dados que pode ser utilizado para se alcançar o objetivo mais geral de se controlar a atividade biológica da Pp 1,2-CCD. / The intensive use of organic compounds in conjunction with the industrial advances led to a huge accumulation of organic pollutants in the environment. Among these pollutants it has been noticed the presence of aromatic hydrocarbons that are highly toxic and resistant to physical, chemical and biological degradation. Thus, a new way to deal with the presence of this compounds in the environment has been studied: the use of microorganisms, natural or genetically modified, that can turn them into inert substances such as CO2 and water. This methodology is called bioremediation. Among those microorganisms, bacteria from the gender Pseudomonas, Aeromonas, Beijerinckia, among others, have been studied for this purpose. The enzyme chlorocatechol 1,2-dioxygenase (Pp 1,2-CCD) is one of the proteins expressed by Pseudomonas putida bacteria, being responsible for the cleavage of aromatic hydrocarbons through the incorporation of both atoms of a molecule of oxygen into the aromatic ring structure, being the protein chosen for investigation in this work. More specifically, we are interested in studying how the mechanism of action of this enzyme is controlled by extrinsic molecules such as phospholipids. The interest in the interaction between the enzyme and phospholipids arose recently when the first crystal structure of an enzyme of the intradiol dioxygenase family was reported. In this structure it was observed a binding site for a phospholipid per monomer, which raised many issues concerning its influence on the activity of the enzyme. Our goal was to use the techniques of Circular Dichroism (CD), calorimetry and Electron Magnetic Resonance (EMR) to study enzyme conformational changes and kinetics alterations induced by phospholipid molecules, thus gathering information on the structure-function correlation. The results obtained through those experimental techniques in conjunction with the use of protocols for protein delipidation showed that the presence of phospholipids/fatty acids in the structure of the enzyme play a role in enzyme activity. Upon removal of the phospholipid/fatty acids, we observed small changes in the secondary structure of the enzyme, an increase of the enthalpy of reactions as well as an increase in the reaction rate, whereas the affinity of the enzyme for the substrate decreased. We also observed a higher thermal stability of the Pp 1,2-CCD in the absence of the phospholipids/fatty acids, but no interaction was observed between the Pp 1,2-CCD and lysophospholipid micelles. A brief study of the function of ionic strength on the activity and thermal stability of the protein showed that in the absence of NaCl, at pH 8, the enzyme is more active, showing a greater affinity for the substrate and a low interaction was observed between Pp 1,2-CCD and negatively charged micelles. This information along with the data on the inhibition capacity of the reaction product are a new set of data that can be used to achieve the more general goal of controlling Pp 1,2-CCD biological activity.