Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-13Bitstream added on 2014-06-13T19:35:40Z : No. of bitstreams: 1 konta_em_me_arafcf.pdf: 565336 bytes, checksum: 6c84917b1244d00658ee92bffe42aa3f (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Os antioxidantes, principalmente os encontrados na dieta, são agentes responsáveis pela inibição e redução dos danos oxidativos causados pelas espécies reativas nas células. A cisplatina (cDDP), um potente agente antineoplásico utilizado com frequência no tratamento de tumores sólidos, tem seu uso clínico limitado devido aos efeitos adversos como nefrotoxicidade, genotoxicidade e supressão da medula óssea. Como a geração de espécies reativas pode resultar em danos ao DNA pela ação destas espécies ou indiretamente via produtos de degradação da peroxidação lipídica, nosso estudo avaliou o possível efeito protetor da adição da polpa de maracujá amarelo na dieta de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e Wistar normotensos, contra a nefrotoxicidade e genotoxicidade induzida pela cDDP. Os resultados obtidos nas condições experimentais estabelecidas neste trabalho mostraram que a cDDP promoveu um aumento dos níveis das substâncias reativas aos ácido tiobarbitúrico, bem como decréscimo nos níveis de glutationa nos rins dos animais SHR, reforçando a hipótese que a peroxidação lipídica está relacionada com o mecanismo de nefrotoxicidade. O tratamento com doses múltiplas da polpa de maracujá amarelo não alterou os outros parâmetros da função renal no período analisado. Embora o efeito protetor da polpa de maracujá contra os danos induzidos ao DNA em células renais e hepáticas não tenha sido evidente nos resultados obtidos pelo Ensaio do Cometa, a polpa foi eficaz na redução de micronúcleos induzidos pela cDDP. Assim, umas das hipóteses para a redução da pressão arterial sistólica observada neste trabalho, poder ser atribuída à presença de alguns compostos fenólicos e outros ainda não identificados na polpa. Visto que, a interação entre os fitoquímicos presentes na polpa de maracujá demonstraram eficácia na redução da mutagenicidade e efeitos protetores antioxidantes. / The antioxidants, particularly those found in the diet, are responsible for inhibiting and reducing the damage caused by reactive species in the cells. Cisplatin (cDDP), a potent anticancer agent often used in the treatment of solid tumors, has limited clinical use due to adverse effects such as nephrotoxicity, genotoxicity and myelosuppression. As the generation of reactive species can result in DNA damage by direct action of this or indirectly by degradation products of the lipid peroxidation, our study evaluated the potential protector of adding yellow passion fruit pulp to the diet of spontaneously hypertensive rats (SHR) and normotensive wistar rats, against the nephrotoxicity and genotoxicity induced by cDDP. The results showed that the cDDP promoted an increase in the levels of thiobarbituric acid reactive substances and a decrease in the levels of glutathione in the kidneys of the animals, reinforcing the hypothesis that lipid peroxidation be related to the mechanism of nephrotoxicity. The treatment with multiple doses of passion fruit pulp did not change the others parameters of renal function in the schedule. Although the protective effect of passion fruit pulp against the damage caused to the DNA of kidney and hepatic cells has not been evident in the results obtained by Comet assay, the pulp was effective in the reduction of micronuclei induced by cDDP. One of the hypotheses for the reduction in systolic blood pressure observed in the present study attributed this effect to the presence of some phenolic compounds and others not yet identified in the passion fruit pulp. Furthermore, the interaction between the phytochemicals of the pulp demonstrated effectiveness in reducing the mutagenic and antioxidant effects.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Platinum compounds, such as cisplatin, oxaloplatin and carboplatin, have been used as chemotherapeutic agents for the treatment of various types of cancer. Several other complexes of this metallic ion are also under clinical evaluation. However, the utilization of platinum compounds as antitumor agents is associated with many severe effects and cellular resistance has also been observed. Therefore, many research groups have been working to synthesize new platinum complexes that are more efficient and show fewer undesired effects associated with their use in medicine. Thus in this work, six new complexes of platinum and palladium were isolated with 4- nitrobenzoic hydrazide(4-NH), acid 2-furoic hydrazide(FH) and 2,4- dinitrophenylhydrazine(2,4-DNPH). These complexes were characterized by spectroscopic techniques and the results have shown that the ligands are coordinated to platinum or palladium by the basic nitrogen of NH2 group and have the general formula [M(L)2X2].nH2O where M= Pt2+ or Pd2+, X = Cl- or I- and n = 0 or 1. Infrared Analyses were made in the region of 400 - 4000 cm-1, except the complex with the ligand 2,4 - dinitrophenylhydrazine which began in the range of 200 cm-1. In addition, UV spectroscopy was performed on-visible range of 200-800 nm. The thermal stability of the complexes containing acid 2-furoic hydrazide and 2, 4-dinitrophenylhydrazine was analyzed in the temperature range 25 900 ºC. The antitumor activity of the synthesized compounds has been studied. The compound [Pt(4-NH)2I2], was found to display cytotoxicity (IC50 = 0.96 μmol/L) against K562 tumoral cell line and, when compared to cisplatin, it was five times more active. / Alguns compostos de platina(II), como por exemplo, a cisplatina, a oxaloplatina e a carboplatina, têm sido utilizados como agentes quimioterápicos no tratamento de alguns tipos de câncer, sendo que vários outros complexos deste íon metálico encontram-se em fase de testes clínicos. Entretanto, estes fármacos apresentam diversos efeitos colaterais severos e, além disso, tem sido observado o aparecimento de resistência celular. Nesse sentido, vários grupos de pesquisa têm buscado a síntese de novos complexos de platina que sejam mais eficazes e que apresentem uma diminuição dos efeitos indesejáveis associados à utilização destes na medicina. Assim, neste trabalho seis novos complexos de platina(II) e paládio(II) foram isolados com os ligantes 4-nitrobenzóico hidrazida(4-NH), ácido 2-furóico hidrazida(FH) e 2,4 dinitrofenilhidrazina(2,4-DNPH). Esses complexos foram caracterizados por técnicas espectroscópicas e, os resultados mostram que os ligantes estão coordenados ao íon platina ou paládio via nitrogênio (NH2) e possuem a fórmula geral [M(L)2X2].nH2O, em que M= Pt2+ ou Pd2+, X = Cl- ou I- e n = 0 ou 1. As analises de infravermelho foram feitas na região de 400- 4000 cm-1, salvo os complexos com o ligante 2,4- dinitrofenilhidrazina que começaram na faixa de 200 cm-1. Além disso, a espectroscopia na região do UV-visível foi feita na faixa de 200-800 nm. A estabilidade térmica dos complexos contendo os ligantes ácido 2-furóico hidrazida e 2,4- dinitrofenilhidrazina foi avaliada no intervalo de temperatura compreendido entre 25- 900°C. A atividade antitumoral dos compostos sintetizados foi estudada contra a linhagem celular tumoral K562. O composto [Pt(4-NH)2I2] exibe uma ótima atividade antiproliferativa (IC50 = 0,96 μmol/L) e, se comparado à cisplatina, é cerca de cinco vezes mais ativo. / Mestre em Química

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-07-31T14:52:51Z No. of bitstreams: 1 Edna Barboza de Lima.pdf: 1887608 bytes, checksum: 310d47dc918d66209fc26060683ce16f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-31T14:52:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Edna Barboza de Lima.pdf: 1887608 bytes, checksum: 310d47dc918d66209fc26060683ce16f (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This work utilized a flow-batch based system aiming to study the growth kinetic profile and resistance of microorganisms tested with inorganic drug cisplatin (CDDP), commonly used in cancer treatment. Aiming to reduce costs and waste production during the tests, Solenoid mini-pumps were used as fluid propulsion system. Such a device was connected to an integrated circuit ULN 2803 which was coupled to an electronic serial interface (USB 4000) to connect to computer's USB output that had the function to control the pulses of solenoid mini-pumps sent to reaction chamber. A multichannel UV-Vis spectrophotometer with a linear array of photodetectors was used as detection system. The data acquisition and control devices were obtained from program written in LABVIEW 8.5 language. Initially, the tests with Saccharomyces cerevisiae yeast were carried out to obtain their growth kinetic profile; however, the micro-organism produced a high amount of biomass and this caused interference in turbidimetric analysis, causing what we call backscattering or backscatter effect. In order to reduce interference, subsequent tests were performed with the bacterium Zymomonas mobilis, which not only produces a smaller amount of biomass but is also a non-pathogen used in cell biology. For such bacteria, it was was possible to obtain the kinetic growth profile and verify its behavior with the use of inorganic drugs cisplatin for a period of 24 hours. After this time the system presented interference and reading errors caused by the increase in cell concentration. To evaluate the CDDP-resistance profile of the Z. mobilis turbidimetric readings were performed at 600 nm in UV-Vis without the flow-batch system. The cell count of the microbial were carried out in a Neubauer chamber and Gram stain was checked on glass slides. The result from such analyzes, reaffirm the anti-mitotic action of cisplatin as well allowed the chronological elucidation of the biochemical mechanisms of the resistance against anticancer tested (CDDP). / Neste trabalho foi empregado um sistema baseado em fluxo-batelada para estudo do perfil cinético de crescimento e resistência de microrganismos na presença do fármaco cisplatina, usada comumente no tratamento de câncer. Com o intuito de minimizar a geração de resíduos, foram utilizadas mini-bombas solenoide como sistema de propulsão de fluidos. Inicialmente foram realizados testes com a levedura Saccharomyces cerevisiae para verificar o seu perfil cinético de crescimento, porém tal microrganismo produziu uma elevada quantidade de biomassa aglomerada gerando assim interferência na análise turbidimétrica, chamada de efeito backscaterring ou retroespalhamento. A fim de reduzir esse tipo de interferência, os testes posteriores, foram realizados com a bactéria Zymomonas mobilis, pois esta, mesmo produzindo uma quantidade considerável de biomassa, possui mobilidade (1 a 4 flagelos polares) o que garante melhor sua distribuição, dificultando a formação de aglomerados. Desde modo, foi possível obter o perfil cinético de crescimento e verificar seu comportamento frente ao uso da droga inorgânica cisplatina, no período de 24 h. Após esse tempo, o sistema apresentou interferências causadas pelo aumento da concentração celular. Para verificar a resistência da Z. mobilis ao agente antineoplásico (cisplatina) foram realizadas leituras turbidimétricas a 600 nm, empregando espectrofotômetro UV-Vis sem utilização do sistema fluxo-batelada. Também foram realizadas contagens microbianas em câmara de Neubauer e coloração de gram em lâminas de vidro. Os resultados obtidos com tais análises, além de reafirmar a ação anti-mitótica da cisplatina, também possibilitaram a elucidação temporal para os mecanismos bioquímicos de resistência do microrganismo testado frente ao antineoplásico em questão (CDDP).

Os agentes antineoplásicos são considerados drogas de risco, ou seja, aquelas que podem ocasionar efeitos como genotoxicidade, carcinogenicidade , teratogenicidade ou alteração na fertilidade e a exposição dos profissionais de saúde constitui-se em grande preocupação do ponto de vista de saúde ocupacional. Precedendo o seu emprego na terapia oncológica, estes medicamentos devem ser submetidos a análises físicas, químicas e biológicas para avaliação da qualidade, sendo que estes testes geram considerável volume de resíduos que também requerem tratamento. O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de diferentes métodos de inativação para as moléculas de cisplatina, doxorrubicina e paclitaxel em solução injetável, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (avaliação química) e teste de citotoxicidade in vitro (avaliação biológica). Foram avaliados os inativantes Asepto 75® (solução a 0,5%), hipoclorito de sódio (solução a 10%) e tiossulfato de sódio (solução a 10%). Os ativos ficaram expostos aos inativantes por períodos que variaram de 0 a 6 horas. Os resultados demonstraram que o asepto 75 é eficiente para a inativação química e biológica dos três ativos, sendo o tempo de exposição fator determinante para a degradação química da cisplatina. Os graus de citotoxicidade variaram de nenhum a leve (IZ= 0 a 1). O hipoclorito de sódio possui um grau de citotoxicidade por si só, porém foi eficaz na inativação química dos três ativos. Já o inativante tiossulfato de sódio se mostrou eficaz na in ativação química da cisplatina, não tendo efeito sobre a doxorrubicina ou sobre o paclitaxel. Os resultados da avaliação in vitro mostraram-se compatíveis com os da avaliação química. Conclui-se que a inativação dos princípios ativos previamente ao descarte é eficaz para reduzir os riscos ocupacionais e ambientais das drogas citotóxicas. / The anti-neoplastic agents are considered risk drugs, that is, the ones that can cause effects, such as genotoxicity, carcinogenicity, teratogenicity or change in fertility. Because of these factors, the exposure of the health care professionals are a great concern of occupational health. Before the use of the oncological therapy, these drugs should be undergone to the physical, chemical and biological tests for the quality evaluation, considering that these test also produce a considerable amount of waste which also demand treatment. The aim of this work is to evaluate the efficacy oh the different methods of inactivation for the cisplatine molecules, doxorubicine and paclitaxel in injection solutions. Using high performance liquid chromatography (chemical evalution) and in vitro citotoxity test (biological evaluation). It has been evaluated Asepto 75 degradant (aqueous solution at 0,5%), sodium hypochlorite (aqueous solution at 10%) and sodium thyosulfate (aqueous solution at 10%). The drugs were exposed to the degradants in periods that ranged from 0 to 6 hours. The results have been demonstrated that asepto 75 is efficient for the chemical and biological inativation of the drugs, and the time of exposition is determinant for the chemical degradation of cisplatin. The citotoxicity grades have ranged from \"none\" to \"slight\". The sodium hypochlorite has a toxicity grade for itself, although it was effective in the chemical degradation of the three drugs. Yet the sodium thiosulfate degradant has demonstrated to be effective in the chemical inativation of cisplatin, not having effects over doxorubicin or paclitaxel. The results of in vitro evaluation have been compatible with the chemical evaluation. It concludes that the inactivation of the drugs before the waste is effective to reduce the occupational and environmental risks of citotoxic drugs.

A cisplatina é um dos mais efetivos agentes antitumorais, porém seu uso clínico é limitado principalmente pela nefrotoxicidade. A terapia adjuvante com antioxidantes tem sido sugerida como estratégia de proteção contra a toxicidade induzida pela cisplatina nos tecidos saudáveis, e a eficácia de diferentes antioxidantes tem sido demonstrada em diversos modelos experimentais. Entretanto, a maioria dos compostos descritos como citoprotetores não foi ainda avaliada em modelos experimentais portadores de tumores e não há um consenso sobre o impacto da terapia antioxidante na atividade antitumoral da cisplatina. Além disso, há poucos dados sobre o efeito de muitos destes citoprotetores sobre a saúde humana, sendo que alguns podem apresentar atividade pró-oxidante sob determinadas condições. Nossos estudos anteriores demonstraram que o beta-bloqueador carvedilol protege eficazmente contra a nefrotoxicidade induzida pela cisplatina em ratos. No presente estudo foram explorados dois novos aspectos da proteção exercida pelo carvedilol: (a) o efeito da carvedilol na atividade antitumoral da cisplatina e (b) os mecanismos moleculares de proteção. O primeiro aspecto foi avaliado in vivo em camundongos portadores de Sarcoma 180. Neste modelo, quatro grupos (n=8) de camundongos Swiss, machos adultos, inoculados com uma suspensão de células de Sarcoma 180 (via subcutânea) foram submetidos aos seguintes tratamentos: (I) Grupo Controle: carboximetilcelulose 0,5% (0,10mL/ animal 30g, via oral ou v.o, 1 vez ao dia, por 3 dias) e solução salina (0,75mL/animal 30g, intraperitoneal ou i.p. no primeiro dia) ; (II) Grupo Cisplatina (Cisp): cisplatina (25 mg/kg, i.p., no primeiro dia); (III) Grupo Carvedilol+Cisplatina (CV+Cisp): carvedilol (10 mg/kg, v.o, 1 vez ao dia, por 3 dias) e cisplatina (25 mg/Kg, i.p., no primeiro dia); e (IV) Grupo Carvedilol (CV): carvedilol (10 mg/kg, v.o., 1 vez ao dia, por 3 dias). A função renal (uréia e creatinina plasmáticas), e a análise histopatológica do tecido renal comprovaram o dano renal induzido pela cisplatina e a nefroproteção exercida pelo carvedilol. A biodistribuição da platina (ICP-MS) e a atividade antitumoral da cisplatina (índice de remissão tumoral e curva de sobrevida) não foram alteradas pelo carvedilol. O carvedilol não protegeu contra a mutagenicidade (avaliada em sangue periférico) e contra a mielossupressão induzidas pela cisplatina. O ensaio de TUNEL e análise imuno-histoquímica da caspase-3 clivada e da proteína pró-apoptótica Bax comprovaram a proteção do carvedilol contra a apoptose que foi induzida pela cisplatina no tecido renal, porém a proteína anti-apoptótica Bcl-xL permaneceu inalterada nos quatro grupos. O envolvimento da atividade antioxidante do carvedilol no mecanismo de proteção foi demonstrado pelos ensaios de peroxidação lipídica e GSH no tecido renal. Os estudos mecanísticos foram realizados em modelo in vitro com células HK-2 (de rim humano normal) divididas em quatro grupos de tratamento: (I) Controle: salina tamponada com fosfato (PBS); (II) Cisp: 25?M de cisplatina; (III) CV+Cisp: 50?M de carvedilol e 25 ?M de cisplatina; (IV) CV: 50 ?M de carvedilol. Foi observada diminuição da morte celular por apoptose e da expressão das proteínas caspase-3, pro-caspase-9 e Bax no grupo CV+Cisp quando comparado ao grupo Cisp. Assim como nos estudos in vivo, não houve alteração na expressão da ii proteína Bcl-xL. A atividade da proteína SIRT-1 apresentou-se aumentada no grupo CV+Cisp e inalterada nos demais. Adicionalmente, o mecanismo antioxidante do carvedilol foi associado ao sequestro dos íons ferrosos, mas não ao sequestro de radicais livres. Em conclusão, a atividade nefroprotetora do carvedilol está associada a mecanismos antioxidantes provavelmente decorrentes do sequestro de íons ferrosos. O mecanismo nefroprotetor do carvedilol não diminui a atividade antitumoral da cisplatina, o que sugere que mecanismos distintos sejam responsáveis pela nefrotoxicidade e pela atividade antitumoral da cisplatina. Ainda, o estresse oxidativo parece desempenhar papel central na nefrotoxicidade, o que não acontece na atividade antitumoral, que tem sido associada principalmente a danos ao DNA nuclear. Estes resultados sugerem que a terapia antioxidante pode ser uma alternativa segura na proteção dos tecidos saudáveis durante a quimioterapia com cisplatina. / Cisplatin is one of the most effective anticancer agents; however, its clinical use is limited mainly by its nephrotoxicity. The adjuvant therapy with antioxidants has been suggested as a strategy of protection against the toxicity induced by cisplatin in healthy tissues and the efficacy of different antioxidants has been demonstrated in several experimental models. However, most of these compounds described as cytoprotectors have never been tested in tumor-bearing models, and there is not a consensus on the impact of the antioxidant therapy on the antitumor activity of cisplatin. Moreover, there are few data about the effect of many of these compounds on human health; some can even display pro-oxidant activity under certain conditions. Our previous studies have demonstrated that the beta-blocker carvedilol efficiently protects against the nephrotoxicity induced by cisplatin in rats. In the present study two new aspects of the protection of carvedilol were explored: (a) the effect of carvedilol on the antitumoral effect of cisplatin and (b) the molecular mechanisms of protection. The first aspect was evaluated in vivo in Sarcoma-180-tumor-bearing mice. In this model, four groups groups (n=8) of Swiss, adult mice, inoculated with Sarcoma-180 cells (subcutaneous via) were treated as follows: (I) Control group: carboxymethylcellulose 0.5% (0.10mL/ 30g animal, oral, once a day, 3 days) and saline solution (0.75mL/30g animal, intraperitoneal or ip, on the first day); (II) Cisplatin group (Cisp): cisplatin 25mg/kg, i.p., on the first day; (III) Carvedilol + Cisplatin group (CV+Cisp): carvedilol (10mg/kg, oral, once a day, 3 days) and cisplatin (25 mg/kg, i.p., on the first day); (IV) Carvedilol group (CV): carvedilol (10mg/kg, oral, once a day, 3 days). The renal function (plasmatic BUN and creatinine) and the renal histopathology, showed the renal damage induced by cisplatin and the nephroprotection of carvedilol. The biodistribution of platinum (ICP-MS) and the antitumor activity of cisplatin (tumor remission index and survival curve) were not altered by carvedilol. Carvedilol did not protect against the mutagenicity (evaluated in the peripheral blood) and the bone marrow suppression induced by cisplatin. TUNEL assay and the imunnohistochemical analyses of the cleaved caspase-3 and the proapoptotic protein Bax showed the protection of carvedilol against the apoptosis induced by cisplatin in the renal tissue; however, the anti-apoptotic protein Bcl-xL remained unaltered in the four groups. The involvement of the antioxidant activity of carvedilol in the protective mechanism was demonstrated by lipid peroxidation and GSH assays in the renal tissue. The mechanistic studies were performed in vitro in HK-2 cells (from normal human kidney) divided into four groups of treatment: (I) Control: phosphate buffered saline (PBS); (II) Cisp: 25?M cisplatin; (III) CV+Cisp: 50?M carvedilol and 25 ?M cisplatin; and (IV) CV: 50 ?M carvedilol. Reduced cell death by apoptosis and reduced expression of caspase-3, pro- caspase-9 and Bax were observed in CV+Cisp as compared to Cisp. Similarly to the in vivo studies, no alterations in the expression of Bcl-xL were observed. The activity of SIRT-1 was increased in the group CV+Cisp, but was unaltered in all the other groups. Additionally, the antioxidant mechanism of carvedilol was associated with the scavenging of ferrous ions but not with the scavenging of free radicals. In conclusion, the nephroprotective activity of carvedilol is associated with antioxidant iv mechanisms which probably results from the scavenging of ferrous ions. The nephroprotective mechanism of carvedilol does not reduce the antitumor activity of cisplatin, which suggests that distinct mechanisms are responsible for the nephrotoxicity and the antitumor activity of cisplatin. Moreover, the oxidative stress might play a central role in the nephrotoxicity, but this does not happen in the antitumor activity, which has been associated mainly with nuclear DNA damage. These findings suggest that the antioxidant therapy might be a safe alternative to protect healthy tissues during cisplatin chemotherapy.

Pode-se dizer que o câncer, ao lado da AIDS, é a doença que atinge, a níveis mundiais, maior clamor da sociedade por desenvolvimento de cura e melhor qualidade de vida ao paciente. Várias terapias são utilizadas para o tratamento do câncer, podendo-se destacar a importância da quimioterapia em inúmeros protocolos de tratamento. Um dos fármacos mais antigos e mais utilizados na quimioterapia é a cisplatina, que ao longo dos seus mais de 30 anos na prática clínica demonstrou sua eficácia e foi incorporada no protocolo de tratamento de uma variedade de tumores. Entretanto, ao lado se sua comprovada eficácia, é inerente o desenvolvimento de vários efeitos colaterais resultante de sua toxicidade à células sadias. Neste trabalho, destaque é dado a neurotoxicidade, que surge em um grande número de pacientes que recebem tratamento com a cisplatina. Inúmeros esforços têm sido realizados na tentativa de prevenir ou controlar os efeitos tóxicos induzidos pela cisplatina, com atenção especial à suplementação do tratamento quimioterápico com compostos antioxidantes. Nesse sentido, este estudo visa avaliar a associação da curcumina, um composto polifenólico com notável atividade antioxidante e neuroprotetora, ao tratamento com cisplatina, em um modelo in vitro com culturas de células PC12. A curcumina é reconhecidamente um composto polifenólico com um amplo espectro de atividades biológicas, com suas propriedades neuroprotetoras demonstradas em vários modelos estudados estando principalmente relacionadas com seu potencial antioxidante. Os múltiplos mecanismos de ação dos compostos fenólicos e suas propriedades neuroprotetoras atribuídas a capacidade de inibição das espécies reativas de oxigênio indicam um potencial de inibição da neurotoxicidade que surgem durante o tratamento quimioterápico com a cisplatina, visto a reconhecida capacidade de geração de espécies reativas de oxigênio da cisplatina. Como a geração de espécies reativas de oxigênio intracelular pode resultar em danos ao DNA pela ação direta das espécies reativas ou indiretamente via produtos de degradação da peroxidação lipídica, nosso estudo avaliou o potencial protetor da curcumina contra a genotoxicidade induzida pela cisplatina em culturas de células PC12, analisando a indução de micronúcleos e a análise de quebras de cadeia simples, cadeia dupla do DNA e sítios álcali-labeis pelo ensaio do cometa. Antes da avaliação antigenotóxica da curcumina, foi realizada uma avaliação citotóxica e genotóxica, em que pode-se observar que em concentrações elevadas a curcumina é citotóxica e genotóxica às células PC12. O efeito protetor da curcumina foi avaliado em pré-tratamento das culturas de células PC12 com concentrações não tóxicas. Nas três concentrações de curcumina estudadas não houve indícios de interferência com a citotoxicidade ou o efeito citostático da cisplatina. Embora o efeito protetor da curcumina contra os danos induzidos ao DNA de células PC12 não tenha sido evidente nos resultados obtidos pelo ensaio do cometa, a curcumina foi eficaz na redução de micronúcleos induzidos pela cisplatina, de maneira semelhante nas três concentrações avaliadas. Os resultados positivos obtidos nesse estudo juntamente com os dados pré-existentes a respeito de efeitos protetores da curcumina incentivam novas pesquisas em relação aos possíveis benefícios da utilização da curcumina em terapia combinada aos quimioterápicos. / Several therapies are used for treating cancer and the importance of chemotherapy can be emphasized in many protocols of treatment. One of the oldest and most used drugs in chemotherapy is the cisplatin which, with its more than thirty years of clinical practice, has demonstrated its effectiveness being incorporated into the protocol of a variety of tumor treatments. On the other hand, it is intrinsic the development of various side effects resulting from its toxicity to healthy cells. This research gives emphasis to the neurotoxicity which appears in a large number of patients receiving the cisplatin treatment. Numerous efforts are being made in attempt to prevent or even control the toxic effects induced by cisplatin with special attention being given to the supplementation of chemotherapy treatment with antioxidant compounds. In that sense, this study aims to assess the association of curcumin, a polifenolic compound with remarkable antioxidant and neuroprotective activity, to the cisplatin treatment in an in vitro neuronal model with PC12 cell cultures. The curcumin is admittedly a polifenolic compound with a broad spectrum of biological activities and their neuroprotective properties, demonstrated in several models, are strongly related to its antioxidant potential. The multiple mechanisms of action of the phenolic compounds and their neuroprotective properties credited to the ability of inhibition of the reactive oxygen species indicate a potential inhibition of neurotoxicity that takes place during the chemotherapy treatment with cisplatin, given its well known ability to generate reactive oxygen species. Since the generation of reactive oxygen species intracellular can result in DNA damage by direct action of reactive species or indirect, through degradation products of the lipid peroxidation, our studies evaluated the potential protector of curcumin against the genotoxicity induced by cisplatin in PC12 cell cultures by examining the induction of micronuclei and analyzing DNA single strand breaks, double strand breaks, and alkali-labeis sites through the comet test. Before the antigenotoxic evaluation of the curcumin, a cytotoxic and genotoxic test was conducted where it was observed that when in high concentrations the curcumin is cytotoxic and genotoxic to the PC12 cells. The protective effect of curcumin was evaluated at the pre-treatment of PC12 cell cultures with non-toxic levels of concentration. In the three studied curcumin concentrations there was no evidence of interference with the cytotoxicity or cytostatic effect of the cisplatin. Although the protective effect of the curcumin put against the damage caused to the DNA of cells PC12 was not evident in the results obtained by the comet test, the curcumin was equally effective in the reduction of micronuclei induced by the cisplatin in all three concentrations evaluated. The positive results obtained in this study combined with the pre-existing data about the protective effects of the curcumin encourage some more new research on possible benefits of using curcumin in combination to chemotherapy.

Embora a cisplatina (cis-diaminocloroplatina II) seja um efetivo agente anticâncer, seu uso clínico é altamente limitado, predominantemente devido ao seu potencial nefrotóxico. Muitos estudos têm demonstrado que a cisplatina causa disfunção mitocondrial em células epiteliais renais e danos ao DNA nuclear devido à ação de espécies reativas de oxigênio tais como superóxido e radicais hidroxila. O aumento na produção destas espécies de oxigênio causa liberação de citocromo c no citosol, iniciando uma cascata de eventos que leva à morte celular por apoptose. A proteção seletiva da mitocôndria contra espécies reativas de oxigênio geradas pela cisplatina nos tecidos intactos tais como os rins, é fundamental na quimioterapia de pacientes com câncer. O presente estudo investigou os efeitos da cisplatina na bioenergética, no estado redox e no estresse oxidativo mitocondrial renal, bem como o potencial protetor da dimetiltiouréia (DMTU), um antioxidante seqüestrador de radicais hidroxila, com relação à toxicidade renal induzida pela cisplatina. Método: Ratos Wistar machos adultos pesando de 200 a 220 g foram divididos em quatro grupos de 8 animais cada. Ao primeiro grupo foi administrada cisplatina (10 mg/ kg) por via intra peritonial (i.p.). O segundo grupo recebeu somente injeções de DMTU (500 mg/kg, i.p., seguida de 2 injeções diárias de 125 mg/Kg, i.p). O terceiro grupo de animais foi tratado com DMTU (500 mg/kg, i.p.), imediatamente antes da injeção de cisplatina (10 mg/kg, i.p.), seguida de 2 injeções diárias de DMTU (125 mg/Kg, i.p.). O grupo controle recebeu somente solução salina (1ml/200g, i.p.). Os animais foram sacrificados 72 horas após a injeção de cisplatina (ou salina). Resultados: O tratamento com a cisplatina resultou em uma marcante diminuição da função renal demonstrada pela elevação dos níveis plasmáticos de uréia e de creatinina, concomitante a uma significativa alteração nos parâmetros relacionados à função Resumo ix mitocondrial (síntese de ATP, estado 3 da respiração, RCR, ADP/O, potencial de membrana e transporte de cálcio); ao estresse oxidativo mitocondrial (oxidação da cardiolipina, atividade da aconitase, lipoperoxidação, níveis de proteína carbonila e proteína sulfidrila); ao estado redox mitocondrial (oxidação do NAD(P)H, relação glutationa reduzida e glutationa oxidada) e à apoptose (atividade da caspase 3). O pré-tratamento dos animais com DMTU preveniu a falência renal aguda e as alterações dos parâmetros mitocondriais , sendo capaz de inibir a morte celular por apoptose. Conclusão: Os resultados demonstram o papel central da mitocôndria na falência renal aguda induzida pela cisplatina, bem como o efeito protetor do DMTU e sugerem que o desenvolvimento de potentes seqüestradores de radicais hidroxila, passíveis de uso clínico, poderia contribuir de forma marcante na prevenção dos danos renais resultantes da quimioterapia com este fármaco. / Although cis-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin) is an effective anticancer agent, its clinical use is highly limited predominantly due to its adverse effects on renal functions. Many studies have shown that cisplatin causes mitochondrial dysfunction and direct injury to nuclear DNA by generating reactive oxygen species such as superoxide and hydroxyl radicals. Overproduction of reactive oxygen species causes the release of cytochrome c into cytosol, thereby triggering the sequence of events leading to cell death via apoptosis. The selective protection of mitochondria against reactive oxygen species generated by cisplatin in intact tissues, such as kidney, is of critical importance in the chemotherapy of patients with cancer. The present study examined the effects of cisplatin on renal mitochondrial bioenergetics, redox state and oxidative stress as well as the protective potential of dimethylthiourea (DMTU), a hydroxyl radical scavenger, against the cisplatin-induced nephrotoxicity. Methods: Adult male Wistar rats weighing 200 to 220g were divided into 4 groups with 8 animals each.. The first group was given a single intraperitoneal (i.p.) injection of cisplatin (10 mg/kg). The second group was given only DMTU (500 mg/kg body weight, i.p, followed by intraperitoneal injections of 125 mg/Kg twice a day until sacrifice). A third group of animals was given DMTU (500 mg/kg body weight, i.p.), just before cisplatin injection (10 mg/kg body weight, i.p.), followed by intraperitoneal injections of DMTU (125 mg/Kg body weight) twice a day until sacrifice. The control group was treated only with saline solution (1ml/200g body weight, i.p.). Animals were sacrificed 72 hours after the treatment. Results: Cisplatin treated animals presented a marked impairment of the renal function evidenced by the elevation of plasmatic creatinine and urea levels simultaneously to a significant alteration of the parameters related to: (a) the mitochondrial function assessed by ATP synthesis, Summary xi state 3 respiration, RCR, ADP/O ratio, membrane potential, calcium uptake; (b) the mitochondrial oxidative stress assessed by cardiolipin oxidation, aconitase activity, lipid peroxidation, protein carbonyls and protein sulphydryl; (c) the mitochondrial redox state assessed by NADPH/NADP+ ratio, GSH/GSSG ratio and (d) apoptosis assessed by caspase-3 activity. DMTU substantially inhibited cisplatin-induced mitochondrial injury and cellular death by apoptosis, thereby suppressing the occurrence of acute renal failure. Conclusions: Results show the central role of the mitochondria in the cisplatin-induced renal acute failure, the protective potential of DMTU and suggest that the development of potent hydroxyl radical scavengers suitable for use in man could minimize the adverse effects of cisplatin in the kidney of patients under chemotherapy.

A coenzima Q10 é uma provitamina lipossolúvel sintetizada endogenamente e naturalmente encontrada em alimentos como a carne vermelha, peixes, cereais, brócolis e espinafre. É comercializada como suplemento alimentar e utilizada em formulações cosméticas. Localiza-se na membrana de organelas celulares como retículo endoplasmático, vesículas e membrana interna da mitocôndria, onde atua como um cofator essencial na cadeia respiratória. Apresenta propriedades antioxidantes e potencial no tratamento de doenças neurodegenerativas e neuromusculares. O objetivo deste trabalho foi investigar os possíveis efeitos protetores de uma formulação hidrossolúvel de coenzima Q10 em células PC12 expostas à cisplatina, um fármaco antineoplásico que tem a neurotoxicidade como um dos fatores limitantes à sua utilização. A linhagem celular PC12 (feocromocitoma de ratos) utilizada nesta investigação é um reconhecido modelo in vitro para estudos neuronais. Os métodos empregados foram os ensaios do MTT, cometa, citoma micronúcleo com bloqueio da citocinese, crescimento de neuritos e análise da expressão do gene Tp53. Os resultados obtidos na avaliação da citotoxicidade da coenzima Q10 (0,1 - 20 µg/mL) mostraram que este antioxidante foi citotóxico às células PC12 na concentração de 20,0 µg/mL e não apresentou citotoxicidade em baixas concentrações. Para os ensaios do citoma e cometa, foram selecionadas três concentrações não citotóxicas de coenzima Q10 (0,1; 0,5 e 1,0 µg/mL) que não apresentaram mutagenicidade e genotoxicidade às células PC12. O efeito protetor da coenzima Q10 sobre a cisplatina no ensaio do citoma foi caracterizado pela diminuição da freqüência de micronúcleos e brotos nucleares, entretanto a proteção da coenzima Q10 não foi evidenciada no ensaio cometa. Alterações significativas na expressão do gene Tp53 não foram observadas no tratamento coenzima Q10 (1,0 µg/mL) associado à cisplatina (0,1 µg/mL). A coenzima Q10 (0,1 e 1,0 µg/mL) não foi neurotóxica em células PC12 indiferenciadas e diferenciadas após exposição ao fator de crescimento do nervo, e seu melhor efeito neuroprotetor foi observado na menor concentração avaliada. A coenzima Q10 reduziu a citotoxicidade da cisplatina (10,0 µg/mL) em células PC12 indiferenciadas e estimulou o crescimento de neuritos em células PC12 diferenciadas. A determinação dos efeitos citoprotetores da coenzima Q10 em um modelo neuronal é importante para elucidar possíveis estratégias de neuroproteção que poderiam ser aplicadas aos pacientes submetidos à quimioterapia. / Coenzyme Q10 is a liposoluble provitamin endogenously synthesized and naturally found in various foods items, such as meat, fish, cereals, broccoli and spinach. It is a dietary supplement in some countries and used in cosmetic formulations. Coenzyme Q10 is located in the membrane of cellular organelles such as endoplasmic reticulum, vesicles and inner mitochondrial membrane, where acts as an essential cofactor in the respiratory chain. It has antioxidant properties and potential in the treatment of neurodegenerative and neuromuscular diseases. The objective of this study was to investigate the possible protective effects of a water-soluble formulation of coenzyme Q10 in PC12 cells exposed to cisplatin, an anticancer drug that has neurotoxicity as a dose-limiting factor. The PC12 cell line (rat pheocromocytoma) used in this investigation is a recognized in vitro model for neuronal studies. The methods used were the MTT, comet, cytokinesis-block micronucleus cytome, neurite outgrowth assays and expression of Tp53 gene. The results obtained in the cytotoxicity of coenzyme Q10 (0.1-20 µg/mL) showed that this antioxidant was cytotoxic to PC12 cell at a concentration of 20.0 µg/mL and it was not cytotoxic at low concentrations. For the cytome and comet assays, were selected three non-cytotoxic concentrations of coenzyme Q10 (0.1, 0.5 and 1.0 µg/mL) without mutagenicity and genotoxicity PC12 cells. The protective effect of coenzyme Q10 in cytome assay was characterized by decreased frequency of micronuclei and nuclear buds induced by cisplatin, however the protection of coenzyme Q10 was not evidenced by the comet assay. No significant change in the Tp53 gene expression were observed in the coenzyme Q10 (1.0 µg/mL) plus cisplatin (0.1 µg/mL) treatment. Coenzyme Q10 (0.1 and 1.0 µg/mL) was not neurotoxic in undifferentiated and nerve growth factor differentiated PC12 cells and the lowest concentration evaluated showed the best neuroprotective effect. The coenzyme Q10 treatment reduced the citotoxicity of cisplatin (10.0 µg/mL) in undifferentiated PC12 cells and stimulated the neurite outgrowth in differentiated PC12 cells. Determination of the cytoprotective effects of the coenzyme Q10 in a neuronal model is important to elucidate possible strategies for neuroprotection that could be applied to patients undergoing chemotherapy.

A cisplatina (Cis-diamino-dicloro-platina II) é um dos mais efetivos quimioterápicos, porém seu uso clínico é altamente limitado devido à sua nefrotoxicidade. Estudos sugerem que o diabetes atua como fator protetor contra a nefrotoxicidade da cisplatina, entretanto, os mecanismos envolvidos ainda não foram elucidados. Esta nefroproteção tem sido associada ao menor acúmulo de cisplatina nos rins, o que poderia ser atribuído a problemas no transporte ativo das células do túbulo proximal ou ainda a alterações farmacocinéticas provocadas pelo diabetes. Entretanto, não se sabe ainda se os mecanismos envolvidos na nefroproteção do diabetes interferem na atividade antitumoral da cisplatina. No presente estudo foram avaliados os efeitos do diabetes na nefrotoxicidade e na atividade antitumoral da cisplatina em camundongos portadores de sarcoma 180, divididos em 4 grupos (n=8): (i) C, grupo controle (sem tratamento); (ii) CIS, grupo tratado com cisplatina; (iii) DB, grupo diabético (estreptozotocina) e (iv) DB+CIS grupo diabético tratado com cisplatina. Os parâmetros avaliados foram: marcadores de função renal e de estresse oxidativo, histopatologia do tecido renal, desenvolvimento do tumor, sobrevida dos animais, genotoxicidade da cisplatina, concentração de platina nos órgãos e no tumor e marcadores de apoptose. Os resultados indicam que: (i) o diabetes protege contra o dano renal induzido pela cisplatina (ii) o diabetes altera a biodistribuição da cisplatina no tumor, nos rins e em vários órgãos; (iii) o diabetes diminui a atividade antitumoral da cisplatina. Os dados obtidos são relevantes, dada a prevalência de certos tipos de tumores em pacientes diabéticos e a importância da cisplatina na quimioterapia e, portanto, podem indicar a necessidade de uma maior atenção no tratamento anticâncer de pacientes diabéticos. / Cisplatin (cis-diamine-dichloro-platinum ll) is one of the most effective chemotherapeutic drugs; however, its clinical use is highly restricted due to its nephrotoxicity. Studies suggest that diabetes is a protective factor against cisplatin nephrotoxicity, but the mechanisms involved remain unclear. This nephroprotection has been associated with decreased cisplatin accumulation in the kidneys, which could be attributed to impaired active transport in proximal tubular cells or even to pharmacokinetic changes induced by diabetes. However, it is not clear if the mechanisms involved in the renal protection of diabetes interfere in the antitumor activity of cisplatin. In the present study we evaluated the effects of diabetes on the nephrotoxicity and antitumor activity of cisplatin in tumor-bearing mice, divided in four groups (n=8): (i) C, control group (without treatment); (ii) CIS, cisplatin group; (iii) DB, diabetic group (streptozotocin) and (iv) DB+CIS, diabetic group treated with cisplatin. The following parameters were evaluated: markers of renal function and oxidative stress, renal histopathology, tumor development, animals survival, cisplatin genotoxicity, platinum concentration in organs and tumor and markers of apoptosis. Our results indicate that: (i) diabetes protects against the renal damage induced by cisplatin (ii) diabetes alters the biodistribution of cisplatin in tumor, kidneys and many other organs (iii) diabetes decreases the antitumor activity of cisplatin. These data are relevant due to the prevalence of certain tumors in diabetic patients and the importance of cisplatin in chemotherapy; therefore they may indicate the need of more attention in cancer treatment in diabetic patients

O melanoma cutâneo maligno é uma lesão neoplásica originada nos melanócitos epidérmicos, sendo altamente invasiva e agressiva, com elevada taxa de mortalidade, cuja incidência vem aumentando nos últimos anos. O tratamento do melanoma é cirúrgico e os pacientes com metástase podem receber quimioterapia com cisplatina que ao formarem adutos com o DNA alteram o processo de replicação da célula cancerosa. Sugere-se que os sistemas de reparo do DNA tenham um papel importante na etiologia do melanoma (reparo deficiente) e no tratamento do mesmo (eficiente eliminação dos adutos). A identificação prévia da resposta dos pacientes com melanoma ao tratamento com cisplatina pode ser um indicador biológico importante na clínica oncológica. O presente trabalho teve como objetivo, a partir de linfócitos de sangue periférico de pacientes com melanoma e de controles, avaliar o dano no DNA antes e após a adição, in vitro, de cisplatina (10?M, 100?M e 250?M), além de estimar a capacidade de reparo do DNA, após a retirada da droga (1h, 2,5h e 5h). Foram utilizados os testes do micronúcleo (MN - dano basal) e do Cometa (dano basal, ação da cisplatina e reparo do DNA). A análise citogenética foi possível em 20 pacientes com melanoma (10 homens e 10 mulheres, média de 50,6 ± 5,9 anos) e 19 controles (9 homens e 10 mulheres, média de 49,9 ± 5,5 anos) que também responderam a um questionário sobre hábitos e tipos de exposição a fatores de risco ao melanoma. A frequência do dano basal pelo teste do MN e do Cometa em linfócitos de pacientes (MN = 1,2 ± 1,2 e Cometa = 59,3 ± 62,5) foi praticamente o dobro da observada nos controles (MN = 0,6 ± 1,0 e Cometa = 35,3 ± 18,6) embora a diferença entre os grupos, em ambos os testes, não tenha sido considerada estatisticamente significante (p=0,23 e p=0,85, respectivamente). O tratamento in vitro com cisplatina, em comparação com o dano basal, aumentou a frequência de Cometas nas três concentrações estudadas (10?M, 100?M e 250?M) tanto para os pacientes (65,50 ± 50,06, 72,74 ± 50,89 e 77,26 ± 44,16) quanto para os controles (66,53 ± 49,85, 66,53 ± 26,33 e 81,74 ± 43,12) diferença esta considerada significante somente para o grupo controle, nas três concentrações avaliadas (p=0,0175, p=0,0002, e p=0,0002, respectivamente). Quanto aos diferentes tempos de reparo (1h, 2,5h e 5h), após a retirada de cisplatina nas diferentes concentrações estudadas, verificou-se aumento na frequência média de Cometas tanto para os pacientes com melanoma (93,88 ± 33,7, 101,75 ± 35,7 e 99,31 ± 32,30) quanto para os controles (92,45 ± 38,4, 100,82± 38,8 e 100,81± 31,7), diferença que foi estatisticamente significante quando comparada ao dano basal observado nos pacientes (p<0,001) e nos controles (p<0,001). Resultados semelhantes foram observados quando comparados em conjunto os escores dos tempos de reparo com o escore obtido após tratamento com cisplatina nos pacientes (71,09 ± 48,2; p<=0,005) e nos controles (71,59 ± 40,5; p<=0,005). Os resultados obtidos parecem indicar um padrão de resposta semelhante em relação à cisplatina e ao reparo do DNA nos dois grupos de indivíduos avaliados. O período de incubação das células, após a retirada da cisplatina, bem como o número de indivíduos avaliados podem ter influenciado nos resultados obtidos. Por outro lado, a resposta observada nos linfócitos in vitro, pode não ser representativa do efeito in vivo da célula tumoral. Entretanto, a identificação de marcadores de resposta a tratamentos com quimioterápicos, a partir de linfócitos de sangue periférico pode ser uma estratégia de pesquisa importante na prática clínica, inclusive para o melanoma. / Cutaneous melanoma is a malignant tumor originated from epidermal melanocytes, highly invasive and aggressive, with high mortality, and incidence that has been increasing over the years. The treatment for melanoma is surgery and patients with metastasis may receive chemotherapy with cisplatin, that results in DNA adducts that alters the replication process in cancer cells. It is suggested that the DNA repair systems have an important role in the etiology of melanoma (risk due to deficient repair) and treatment efficiency (removal of DNA adducts can decrease the treatment results). The prior identification of the response of melanoma patients to treatment with cisplatin may be an important biological marker in clinical oncology. The aim of this study was to assess, in peripheral blood lymphocytes from melanoma patients and controls, the DNA damage before and after the addition of cisplatin (10?M, 100?M and 250?M), in vitro, and estimate the capacity of DNA repair after drug removal (1h, 2.5h and 5h). The micronucleus test (MN - basal DNA damage) and the Comet assay (basal DNA damage, action of cisplatin and DNA repair) were used for the evaluation. Cytogenetic analysis was performed in 20 melanoma patients (10 men and 10 women, average age 50.6 ± 5.9 years old) and 19 controls (9 men and 10 women, average age 49.9 ± 5.5 years old) who also answered a questionnaire on habits and types of exposure to risk factors for melanoma. The frequency of basal DNA damage by the MN test and the Comet assay in lymphocytes from patients (MN = 1.2 ± 1.2 and Comet = 59.3 ± 62.5) was nearly twice the observed in controls (MN = 0, 6 ± 1.0 and Comet = 35.3 ± 18.6), although the difference between the groups in both tests was not considered statistically significant (p = 0.23 and p = 0.85, respectively). The in vitro treatment with cisplatin, compared with the basal DNA damage, increased the frequency of Comets in the three studied concentrations (10?M, 100?M and 250?M) for patients (65.50 ± 50.06, 72.74 ± 50.89 and 77.26 ± 44.16) and for the controls (66.53 ± 49.85, 66.53 ± 26.33 and 81.74 ± 43.12) and the difference was statistically significant only for the control group, for all cisplatin concentrations (p = 0.0175, p = 0.0002 and p = 0.0002, respectively). Considering the different repair times (1h, 2.5h and 5h), after removal of cisplatin at different concentrations, there was an increase in the mean frequency of Comets for both melanoma patients (93.88 ± 33.7, 101.75 ± 35.7 and 99.31 ± 32.30) and for the controls (92.45 ± 38.4, 100.82 ± 38.8 and 100.81 ± 31.7), and the difference was statistically significant when the repair Comet score was compared to the basal DNA damage observed in patients (p <0.001) and controls (p <0.001). Similar results were observed when the Comet scores of repair times were compared to the Comet scores obtained after treatment with cisplatin in patients (71.09 ± 48.2, p <= 0.005) and controls (71.59 ± 40.5, p <= 0.005). The results seem to indicate a similar pattern of response to cisplatin and DNA repair in both groups of subjects evaluated. The period of incubation of the cells after cisplatin removal and the number of individuals studied may have influenced the results. The lymphocytes\' response, in vitro, to cisplatin may not be representative of the in vivo effect of tumor cell. However, the identification of markers of response to treatment with chemotherapy from peripheral blood lymphocytes may be an important research strategy in clinical practice, including melanoma.