Os tumores de cabeça e pescoço ocupam o sexto lugar no ranking de incidência mundial, e estão localizados na região da face, fossas nasais, seios paranasais, boca, faringe, laringe entre outros tecidos moles do pescoço. O tabagismo, o etilismo, a radiação solar e o vírus HPV, são fatores de risco associados a esse tipo de tumors. A terapia combinada de drogas antineoplásicas tem sido utilizada para amenizar os efeitos colaterais e potencializar o tratamento antitumoral. A combinação de paclitaxel e cisplatina tem se mostrado eficaz em tumores sólidos, como o HNSCC. A morte celular induzida pelo paclitaxel é mediada pela ruptura da dinâmica dos microtúbulos normais, já a cisplatina induz ligações cruzadas de DNA estes tratamentos induzem a célula à morte por apoptose. A apoptose é um processo de morte dividido, didaticamente, em via intrínseca (via mitocondrial) e via extrínseca (via receptor de morte). Entender por qual via essas células tumorais são induzidas a morte é fundamental para tentar evitar a resistência dessas células ao tratamento. Nosso objetivo é entender se células tumorais de HNSCC são resistentes ou sensíveis ao tratamento com paclitaxel e cisplatina sozinhos ou em associação. Para isso, realizamos o tratamento da linhagem celular FaDu por um período de 48 horas com as drogas e verificamos sua resistência a indução de morte por esses tratamentos. Os resultados mostraram que o tratamento com paclitaxel não potencializa a morte desta célula, sendo a linhagem FaDu mais sensível ao tratamento com cisplatina e a associação apresenta o mesmo perfil de quando tratada com cisplatina. A morte desta linhagem é dependente de caspases e possui uma preferência pela via extrínseca da apoptose que, consequentemente, induz a morte também pela via intrínseca. A modulação desta morte se dá pelo balanço das proteínas pró- e anti-apoptóticas da família BCL-2 que são responsáveis pela regulação da apoptose, o tratamento com cisplatina induz a expressão da proteína pró-apoptótica BAK e a diminuição das proteínas anti-apoptóticas BCL-2 e BCL-XL. Com os resultados obtidos, concluímos que a associação de paclitaxel e cisplatina não potencializa a morte da linhagem celular FaDu. Contudo, a cisplatina apresentou-se efetiva na indução de morte por apoptose através do aumento da expressão da proteína BAK e a diminuição da expressão das proteínas BCL-2 e BCL-XL. / Head and neck squamous cell carcinoma is the sixth most common cancer in the world, and are located in the region of the face, nasal fossas, sinuses, mouth, pharynx, larynx and other soft tissues of the neck. Tobacco smoke, etilism, solar radiation and HPV are risk factors associated with this type of tumors. Combination therapy of anticancer drugs has been used to alleviate the side effects and potentiate the antitumor treatment. The combination of paclitaxel and cisplatin has been shown to be effective in solid tumors such as HNSCC. The paclitaxel-induced cell death is mediated by disruption of the normal microtubule dynamics, and the cisplatin induced DNA cross-links, these treatments induce cell death by apoptosis. Apoptosis is a death process divided in, intrinsic pathway (mitochondrial pathway) and extrinsic pathway (death receptor pathway). Understand by what pathway those tumor cells which are induced death is important to try and avoid the resistance of these cells to treatment. Our aims understand if HNSCC tumor cells are resistant or sensitive to treatment with paclitaxel and cisplatin alone or in combination. We carried out the treatment of cell line FADU a period of 48 hours with the drug and we verify their resistance to death induction by these treatments. The results showed that treatment with paclitaxel did not potentiate the cell death, in the other hand, FADU cell line appeared to be more sensitive to cisplatin treatment, and the association has the same profile when treated with cisplatin. The death of this line is dependent on caspases and has a preference for the extrinsic pathway of apoptosis, consequently, also induces the death by the intrinsic pathway. The modulation of death is caused by the balance of pro-and anti-apoptotic proteins of BCL-2 family proteins that are responsible for regulation of apoptosis, treatment with cisplatin induces the expression of pro-apoptotic protein BAK and the decrease of anti-apoptotic proteins BCL -2 and BCL-XL. With these results, we conclude that the combination of paclitaxel and cisplatin did not potentiate the cell death of the cell line Fadu. However, cisplatin showed to be effective in induction of death by apoptosis through increased expression of BAK protein and decreased expression of BCL-2 and BCL-XL.

A dor associada ao câncer pode ser causada não somente pelos efeitos diretos ou indiretos da patologia primária, mas também pelo tratamento quimioterápico. A Cisplatina é um dos medicamentos anti-neoplásicos mais efetivos e mais comumente usados no tratamento de tumores sólidos. Entretanto, um de seus principais efeitos colaterais é a neurotoxicidade periférica. Os mecanismos celulares e moleculares da dor crônica induzida por quimioterápico são ainda bastante obscuros. Investigamos o papel da proteína quinase dependente de RNA (PKR) nos diferentes mecanismos neurobiológicos associados à dor crônica induzida pelo quimioterápico Cisplatina. O presente estudo avaliou: (1) O desenvolvimento de alodínia mecânica e hipernocicepção térmica em camundongos PKR-/- e PKR+/+ submetidos à administração do quimioterápico Cisplatina; (2) O estado de fosforilação das MAPKs (Erk1,2, p38 e JNK/SAP) e o fator de transcrição STAT-3 nas células do gânglio da raiz dorsal de animais tratados com Cisplatina; (3) Alterações na resistência e força muscular dos camundongos PKR-/- e PKR+/+ submetidos a administração do quimioterápico Cisplatina; (4) A proteólise muscular em músculos EDL (glicolíticos) e soleus (oxidativos) de camundongos PKR-/- e PKR+/+ após tratamento com Cisplatina (5) A síntese proteica através de Western Blot das proteínas Akt, FoxO 1 e FoxO 4, S6k1 e a S6 em células C2C12 analisando temporalmente o efeito da Cisplatina (6h, 12h e 24h); (6) O estresse oxidativo mitocondrial em células do gânglio da raiz dorsal e do músculo Soleus de camundongos PKR-/- e PKR+/+ após tratamento com Cisplatina. Os resultados obtidos foram: (1) Que com o tratamento com cisplatina produziu hipernocicepção térmica e alodínia mecânica nos animais PKR+/+; (2) A reduz da fosforilação do p38 não justifica o quadro de hipernocicepção e a hipernocicepção pode ocorrer a partir do aumento da fosforilação de STAT 3; (3) Animais que não tem a PKR são menos vulneráveis à ação deletéria da cisplatina sobre o músculo pois todos os testes comportamentais para atividade motora; (4) Não houve diferença na proteólise total mas sim na síntese proteica em animais PKR tratados com cisplatina; (5) Há alteração na via Akt quando analisa temporalmente a ação da cisplatina; (6) animais PKR -/- apresentaram índices mais altos da respiração mitocondrial comparados aos PKR +/+. Este estudo combinou métodos de biologia celular e molecular com paradigmas comportamentais a fim de investigar os possíveis mecanismos de ação da PKR no desenvolvimento de hipersensibilidade sensorial após o tratamento com quimioterápico. Os resultados deste trabalho devem evidenciar novos mecanismos neurobiológicos que contribuam para o entendimento da fisiopatologia da dor crônica de origem neurotóxica e apontar novas estratégias terapêuticas para o tratamento da dor crônica causada por quimioterapia / Pain associated with cancer can be caused by only direct or indirect products of the primary pathology, but also by chemotherapeutic treatment. Cisplatin is one of the most effective and most common anti-neoplastic drugs without the treatment of solid tumors. However, one of its major side effects is peripheral neurotoxicity. The cellular and molecular mechanisms of chronic pain induced by chemotherapy are still rather obscure. Investigators of role of RNA-dependent protein kinase (PKR) in the different neurobiological mechanisms associated with chronic pain induced by the chemotherapeutic Cisplatin. The present study evaluated: (1) the development of mechanical allodynia and thermal hypernociception in mice PKR - / - and PKR + / + submitted to chemotherapy Cisplatin; (2) The state of phosphorylation of the MAPKs (Erk1,2, p38 and JNK / SAP) and the transcription factor STAT-3 in the cells dorsal root ganglion of Cisplatin-treated animals; (3) Changes in muscle strength and strength of mice PKR - / - and PKR + / + submitted to the administration of the chemotherapeutic Cisplatin; (4) Muscle protein in EDL (glycolytic) and soleus (oxidative) muscles of mice PKR - / - and PKR + / + after treatment with Cisplatin (5) Western Blot Synthesis Protein of Akt, FoxO 1 and FoxO 4 S6k1 proteins and S6 in C2C12 cells by temporarily analyzing the effect of Cisplatin (6h, 12h and 24h); (6) Mitochondrial oxidative stress in dorsal root ganglion and Soleil muscle cells of PKR - / - and PKR + / + mice after treatment with Cisplatin. The results obtained were: (1) That with the treatment with cisplatin produced thermal hypernociception and mechanical allodynia in the animals PKR + / +; (2) The reduced phosphorylation of p38 does not justify the hyperencouragement and hypernociception can occur from increased STAT 3 phosphorylation; (3) Animals that do not have a PKR are less vulnerable to the deleterious action of cisplatin on muscle for all behavioral tests for motor activities; (4) There was no difference in total proteolysis but in protein synthesis in PKR animals treated with cisplatin; (5) There is alteration in the Akt pathway when the action of cisplatin is temporarily analyzed; (6) Animals PKR - / - had higher mitochondrial respiration rates compared to PKR + / +. This study combined methods of cellular and molecular biology with behavioral paradigms to investigate the possible mechanisms of action of PKR in the development of sensory hypersensitivity after treatment with chemotherapy. The results of this program are mandatory, which are responsible for the development of medicines for health and human health

A cisplatina (cis-diaminodicloroplatina II) é um efetivo agente anticâncer, porém seu uso clínico é altamente limitado, predominantemente devido à sua nefrotoxicidade. Muitos estudos têm demonstrado que a cisplatina causa disfunção mitocondrial em células epiteliais renais devido à ação de espécies reativas de oxigênio tais como ânions superóxido e radicais hidroxila. A proteção seletiva das mitocôndrias renais contra espécies reativas de oxigênio geradas pela cisplatina é fundamental na quimioterapia de pacientes com câncer. Vários estudos têm sugerido que o carvedilol é capaz de proteger contra a toxicidade mitocondrial cardíaca induzida pelo quimioterápico doxorubicina. Assim, no presente estudo investigou-se o potencial protetor deste fármaco contra a toxicidade mitocondrial renal induzida pela cisplatina, bem como os mecanismos moleculares envolvidos nesta proteção. Foram estudados 4 grupos (n=6, cada) de ratos Wistar machos tratados da seguinte forma: (i) Grupo controle: uma injeção intraperitoneal (i.p.) de DMSO (0,2mL/200g, i.p.) imediatamente antes da injeção de solução salina isotônica (2 ml/200g, i.p.) e posteriormente uma injeção diária de DMSO (0,2mL/200g, i.p.) em dois dias consecutivos; (ii) Grupo cisplatina (CISP): uma injeção de cisplatina (10 mg/kg, i.p.); (iii) Grupo carvedilol (CV): uma injeção de carvedilol (1 mg/kg, i.p.), seguida de uma injeção diária de carvedilol em dois dias consecutivos (1 mg/Kg, i.p) e (iv) Grupo carvedilol + cisplatina (CV+CISP): uma injeção de carvedilol (1mg/kg, i.p.), imediatamente antes da injeção de cisplatina (10 mg/Kg, i.p.) seguida de uma injeção diária de carvedilol nos dois dias seguintes (1 mg/Kg, i.p.). Os animais foram sacrificados 72 horas após o início do tratamento. O grupo CV+CISP apresentou uma significativa redução na lesão renal, marcada pela diminuição da concentração de uréia e creatinina plasmáticas, quando comparado ao grupo CISP. A avaliação da função mitocondrial comprovou o efeito protetor do carvedilol contra a toxicidade mitocondrial renal da cisplatina através da significativa melhora nos valores da (i) RCR, (ii) do consumo de oxigênio no estado 3 e (iii) da razão ADP/O. Além disso, no grupo CV+CISP o potencial de membrana mitocondrial e a captação de cálcio mitocondrial foram preservados. Adicionalmente, a redução da oxidação do NADPH, da cardiolipina, da glutationa e das proteínas sulfidrilas, bem como a redução na formação de MDA no grupo CV+CISP sugerem efeito protetor do carvedilol contra o estresse oxidativo mitocondrial. O grupo CV+CISP também apresentou menor ativação da caspase-3, o que sugere menor indução de apoptose. Os grupos CISP e CV+CISP apresentaram concentrações semelhantes de platina na suspensão mitocondrial renal, indicando que o mecanismo de proteção do carvedilol provavelmente não envolve a formação de complexos e a subseqüente inativação da cisplatina. Os resultados do presente estudo são promissores, pois o carvedilol é um fármaco de uso seguro e já estabelecido na clínica e a comprovação do seu efeito protetor contribuirá para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção dos danos nefrotóxicos da cisplatina. / Cisplatin (cis-diamminedichloridoplatinum II) is an affective anticancer agent; however its clinical use is highly limited, predominantly due to its nephrotoxicity. Many studies have shown that cisplatin cause mitochondrial dysfunction in renal epithelial cells due to the generation of reactive oxygen species, such as superoxide anions and hydroxyl radicals. The selective protection of the renal mitochondria against the reactive oxygen species generated by cisplatin is of critical importance in the chemotherapy of cancer patients. Some studies have suggested that carvedilol can protect against the cardiac mitochondrial toxicity induced by the chemotherapeutic agent doxorubicin. Therefore, in the present study we investigated the protective effect of carvedilol against renal mitochondrial toxicity, as well as the molecular mechanisms involved in this protection. We studied 4 groups (n=6, each) of male Wistar rats treated as follows: (i) Control group: one injection of DMSO (0,2 mL/200g body weight, i.p.), intraperitoneal injection (i.p.), immediately before the injection of isotonic saline solution (2mL/200g body weight) followed by one injection of DMSO (0,2 mL/200g body weight, i.p.) in the two following days; (ii) Cisplatin group (CISP): one injection of cisplatin (10 mg/kg body weight, i.p.); (iii) Carvedilol group (CV): one injection of carvedilol (CV) (1mg/kg body weight, i.p.) in three consecutive days and (iv) Carvedilol + Cisplatin group (CV+CISP): one injection of carvedilol (1mg/kg, body weight, i.p.) immediately before the injection of cisplatin (10mg/kg, body weight, i.p.), followed by one injection of carvedilol (1mg/kg, body weight, i.p.) in the two following days. Animals were killed 72h after the beginning of the treatment. CV+CISP group presented a significantly reduced renal injury, marked by the decrease of urea and creatinine plasmatic levels, as compared to the CISP group. The evaluation of the mitochondrial function showed the protective effect of carvedilol against the renal mitochondria toxicity induced by cisplatin, as demonstrated by the improvement in the values of (i) RCR; (ii) the oxygen consumption on state 3 respiration and ADP/O ratio. Besides that, in the CV+CISP group the mitochondrial membrane potential and the mitochondrial calcium uptake were preserved. Additionally, the lower oxidation of NADPH, cardiolipin, glutathione and sulfhydryl proteins, as well as the lower values of MDA in the CV+CISP group, suggests a protective effect of carvedilol against the mitochondrial oxidative stress. CV+CISP group also presented lower values of caspase 3, which suggests lower induction of apoptosis. The groups CISP and CV+CISP presented a similar platinum concentration in the mitochondrial suspension, which indicates that the protective mechanism of carvedilol probably does not involve complex formation with cisplatin and its ensuing inactivation. The present results are promising, since carvedilol is a safe drug, which is currently used in the clinical practice and the evidence of its protective effect will contribute to the development of new strategies to prevent the nephrotoxic damage of cisplatin.

Carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor maligno de glândulas salivares mais comum, representando cerca de 30% dos tumores malignos. O tratamento do CME é a ressecção cirúrgica com eventual radioterapia. Assim, o tratamento do CME pode levar a varias complicações estéticas e funcionais. A quimioterapia tem sido utilizadas apenas em casos recorrentes ou com metástases à distancia. Vários relatos na literatura tem mostrado que o tratamento com drogas isoladas ou combinadas possuem uma resposta insatisfatória e de curta duração em grande parte devido a aquisição de resistência a quimioterapia. Recentemente, a quimiorresistência tem sido relacionada com a presença de Células-Tronco Tumorais (CTT). Essa resistência tem sido associada ao fato de que as essa células são quiescentes e possuem altos níveis de proteínas associadas ao reparo do DNA e baixos níveis das proteínas que levam a apoptose. Recentemente mostrou-se que a resistência a quimioterapia tem sido relacionada com modificações de histonas, uma vez que as células quimiorresistentes possuem núcleo pequeno e baixos níveis de acetilação de histonas, adicionalmente as células sensíveis são relacionadas com núcleo aumentado. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com IHDAC e cisplatina sobre a população de CTT de CME. Inicialmente analisamos os níveis de acetilação do histona através da expressão imuno-histoquímica de acetil histona H3 em casos de CME, sendo encontrado altos níveis de acetilação de histona principalmente nas células epiteliais do ducto excretor. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com SAHA (inibidor de histona deacetilase) impacta diretamente a população de CTT, de uma maneira mais eficiente do que a cisplatina ou da combinação de SAHA e cisplatina. É interessante que o tratamento com cisplatina resultou no acúmulo de uma subpopulação especifica de CTT em um processo que inclui o aumento na expressão da via de sinalização do mTOR. Estes achados sugerem que o uso de IHDAC constitui uma forma eficiente de tratamento de CME através da depleção da população de CTT , porém mais estudos são necessários para validar estes achados para uso clinico. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common malignant salivary tumor compromising about 30% of all salivary malignances. Managing MEC patients remain challenging especially due to the heterogeneous response of tumor cells to available therapy. For this reason clinical outcome remains unpredictable. Current treatment of MEC encompasses surgical resection with eventual adjuvant radiotherapy, which frequently leads to functional and aesthetic complications. The use of chemotherapy is often reserved for recurrent and metastatic tumors. Administration of single-agent or combination therapy has showed activity, however overall response rates are unsatisfactory and of short duration. Emerging evidences suggest that the modest response of tumor cells to therapy resulting in high recurrence rates and poor survival, are associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Quiescence of CSC is achieved by the reduced levels of transcription in a process that requires tight folding of DNA driven by core histone proteins. Changes in DNA folding are responsible for different cellular phenotypes mediated by a cell type-specific chromatin organization. Of interest, we also found that acetylation of HNSCC tumor histones driven by histone deacetylase (HDAC) inhibitors abrogate tumor resistance to chemotherapy. We investigate the effects of HDACi and cisplatin in the population of CSCs of MEC. Initially, we found that MEC tumors are composed by a heterogeneous population of squamous-like and mucous-like cells presenting distinct acetylation levels of histone 3 (Lys9). Tumor cells where treated with cisplatin and SAHA, a Food and Drug Administration (FDA) approved histone deacetylase inhibitor. Surprisingly, we found that administration of SAHA resulted in complete depletion of MEC CSCs. In facts, SAHA alone surpassed the inhibitory therapeutic effects of cisplatin and the combined therapy using SAHA and cisplatin over the population of CSCs. We also found that administration of cisplatin to MEC tumor cells result in unexpected accumulation of a sub population of CSC (paraclones), suggesting a correlation between the administration of intercalating agents such as cisplatin to the development of resistance of MEC cells to chemotherapy.

Carcinoma mucoepidermóide (CME) é o tumor maligno de glândulas salivares mais comum, representando cerca de 30% dos tumores malignos. O tratamento do CME é a ressecção cirúrgica com eventual radioterapia. Assim, o tratamento do CME pode levar a varias complicações estéticas e funcionais. A quimioterapia tem sido utilizadas apenas em casos recorrentes ou com metástases à distancia. Vários relatos na literatura tem mostrado que o tratamento com drogas isoladas ou combinadas possuem uma resposta insatisfatória e de curta duração em grande parte devido a aquisição de resistência a quimioterapia. Recentemente, a quimiorresistência tem sido relacionada com a presença de Células-Tronco Tumorais (CTT). Essa resistência tem sido associada ao fato de que as essa células são quiescentes e possuem altos níveis de proteínas associadas ao reparo do DNA e baixos níveis das proteínas que levam a apoptose. Recentemente mostrou-se que a resistência a quimioterapia tem sido relacionada com modificações de histonas, uma vez que as células quimiorresistentes possuem núcleo pequeno e baixos níveis de acetilação de histonas, adicionalmente as células sensíveis são relacionadas com núcleo aumentado. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com IHDAC e cisplatina sobre a população de CTT de CME. Inicialmente analisamos os níveis de acetilação do histona através da expressão imuno-histoquímica de acetil histona H3 em casos de CME, sendo encontrado altos níveis de acetilação de histona principalmente nas células epiteliais do ducto excretor. Adicionalmente, demonstramos que o tratamento com SAHA (inibidor de histona deacetilase) impacta diretamente a população de CTT, de uma maneira mais eficiente do que a cisplatina ou da combinação de SAHA e cisplatina. É interessante que o tratamento com cisplatina resultou no acúmulo de uma subpopulação especifica de CTT em um processo que inclui o aumento na expressão da via de sinalização do mTOR. Estes achados sugerem que o uso de IHDAC constitui uma forma eficiente de tratamento de CME através da depleção da população de CTT , porém mais estudos são necessários para validar estes achados para uso clinico. / Mucoepidermoid carcinoma (MEC) is the most common malignant salivary tumor compromising about 30% of all salivary malignances. Managing MEC patients remain challenging especially due to the heterogeneous response of tumor cells to available therapy. For this reason clinical outcome remains unpredictable. Current treatment of MEC encompasses surgical resection with eventual adjuvant radiotherapy, which frequently leads to functional and aesthetic complications. The use of chemotherapy is often reserved for recurrent and metastatic tumors. Administration of single-agent or combination therapy has showed activity, however overall response rates are unsatisfactory and of short duration. Emerging evidences suggest that the modest response of tumor cells to therapy resulting in high recurrence rates and poor survival, are associated with the presence of cancer stem cells (CSC). Quiescence of CSC is achieved by the reduced levels of transcription in a process that requires tight folding of DNA driven by core histone proteins. Changes in DNA folding are responsible for different cellular phenotypes mediated by a cell type-specific chromatin organization. Of interest, we also found that acetylation of HNSCC tumor histones driven by histone deacetylase (HDAC) inhibitors abrogate tumor resistance to chemotherapy. We investigate the effects of HDACi and cisplatin in the population of CSCs of MEC. Initially, we found that MEC tumors are composed by a heterogeneous population of squamous-like and mucous-like cells presenting distinct acetylation levels of histone 3 (Lys9). Tumor cells where treated with cisplatin and SAHA, a Food and Drug Administration (FDA) approved histone deacetylase inhibitor. Surprisingly, we found that administration of SAHA resulted in complete depletion of MEC CSCs. In facts, SAHA alone surpassed the inhibitory therapeutic effects of cisplatin and the combined therapy using SAHA and cisplatin over the population of CSCs. We also found that administration of cisplatin to MEC tumor cells result in unexpected accumulation of a sub population of CSC (paraclones), suggesting a correlation between the administration of intercalating agents such as cisplatin to the development of resistance of MEC cells to chemotherapy.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present work aims to investigate the cisplatin influence on the cochlea and the deoxiribonucleic acid (DNA) of guinea pigs. An experimental study was executed with 12 guinea pigs (Cavia porcellus). The inclusion criterion for guinea pigs in the sample was the presence of Preyer's reflex (contraction of the pinna when facing sound stimulus) and distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs). Guinea pigs were divided into two groups: Control Group (CG) - composed by six guinea pigs, to which it was administrated physiological solution of sodium chloride 0.9% during six consecutive days; Study Group (SG) - composed by six guinea pigs to which it was administrated cisplatin in six consecutive doses of 3mg/kg/day intraperitoneally. Twenty-four hours after the last cisplatin injection, guinea pigs were sacrificed, the blood sample was collected to perform the Comet Essay, and the cochleas were removed to histological analysis. When comparing the SG guinea pigs before and after the cisplatin administration, it was verified a statistically significant reduction of the amplitude of DPOAEs, mainly in the frequencies of 1000Hz to 3998Hz. After the cisplatin administration, it was certified that the amplitude of the DPOAEs frequencies of 2830Hz and 5657Hz from the SG guinea pigs suffered a statistically significant reduction compared to the CG guinea pigs. After the Cisplatin administration there were not detected any identifiable DNA changes in the Comet essay, the histological analysis showed alterations in the organ of Corti and in the spiral ganglion. Cisplatin causes alterations in the function and cochlear morphology, however, any damage to the DNA was detected. / O presente trabalho tem como objetivo verificar a influência da cisplatina sobre a cóclea e o ácido desoxirribonucleico (DNA) de cobaias. Estudo experimental executado com 12 cobaias (Cavia porcellus). O critério de inclusão de cobaias na amostra foi a presença de reflexo de Preyer (contração do pavilhão auricular frente a estímulo sonoro) e emissões otoacústicas produto de distorção (EOAPDs). As cobaias foram dividas em dois grupos: Grupo controle (GC) - composto de seis cobaias, às quais foi administrada solução fisiológica de cloreto de sódio a 0,9% por seis dias consecutivos; Grupo estudo (GE) - composto por seis cobaias, às quais foi administrada cisplatina em seis doses consecutivas de 3mg/kg/dia via intraperitoneal. Vinte e quatro horas após a última aplicação de cisplatina as cobaias foram sacrificadas, foi coletada amostra sanguínea para realização do Ensaio Cometa, e as cócleas foram removidas para análise histológica. Ao comparar-se as cobaias do GE antes e após a administração de cisplatina verificou-se redução estatisticamente significante da amplitude das EOAPDs principalmente nas frequências de 1000Hz à 3998Hz. Após a administração de cisplatina constatou-se que a amplitude das EOAPDs nas frequências de 2830Hz e 5657Hz, das cobaias do GE, sofreram redução estatisticamente significante quando comparado com as cobaias do GC. Após a administração de cisplatina não foram detectados danos genotóxicos identificáveis no Ensaio Cometa, a análise histológica mostrou alterações no órgão de Corti e gânglio espiral. A cisplatina provoca alterações na função e morfologia coclear, no entanto não foi detectado dano genotóxico.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This paper aimed to investigate the apoptosis modulation pathway and the otoprotection mechanism of N-acetylcysteine (NAC) through the analysis of the glutathione peroxidase (GSH-Px) enzyme and the Bcl-2 protein expression in outer hair cells (OHCs) of rats treated with cisplatin. The listening function was also assessed in mice under the effect of different doses of cisplatin and NAC. Two experiments were performed, named A and B, the first being over an experimental period of five days, and the second during three days. Each experiment comprised four groups, under the following protocols: group A1 (negative control): intraperitoneally saline solution 0,9%, in the same volume corresponding to cisplatin dose; group A2 (positive control): 100mg/kg/day of NAC, oral administration by gavage; group A3 (ototoxic): 3mg/kg/day of intraperitoneally cisplatin; group A4 (ototoxic with otoprotection): 100 mg/kg/day of NAC oral administration by gavage, one hour before the administration of 3 mg/kg/day of intraperitoneally cisplatin; group B1 (negative control): intraperitoneally saline solution 0,9% in the same volume corresponding to the cisplatin dose (8mg/kg/day); group B2 (positive control): 300 mg/kg/day of NAC, oral administration by gavage; group B3 (ototoxic): 8 mg/kg/day of intraperitoneally cisplatin; group B4 (ototoxic with otoprotection): 300 mg/kg/day of NAC orally by gavage, one hour before the administration of 8 mg/Kg/day of intraperitoneally cisplatin. The animals in experiment A underwent otoscopy, distortion-product otoacustic emissions (DPOAEs) and brainstem auditory evoked potential (BAEP), before and after the administration of drugs. The animals in experiment B underwent the same testing in pre- and post-treatment, their tympanic bulla being removed ant their cochleae prepared for anatomical assessment with scanning electron microscopy and immunofluorescence for labeling the GSH-Px enzyme and the Bcl-2 protein. In experiment A, it was verified that there was no significant decrease in the signal-to-noise ratio of DPOEAs, but there was a significant increase in the electrophysiologic threshold obtained through BAEP in groups A3 e A4. In experiment B, it was verified that: there was no significant increase in the electrophysiologic threshold obtained through BAEP; the OHCs remained anatomically intact; the GSH-Px enzyme showed immunostaining absent in group B1 and immunostaining present in groups B2, B3 and B4; the Bcl-2 protein showed immunostaining absent in all groups. From the results, it was concluded that the listening function was more impaired by the exposure to a subdose of cisplatin over a longer period, the apoptosis modulation pathway in outer hair cells of mice treated with cisplatin is related to the expression of the GSH-Px enzyme and not expression of the Bcl-2 protein. / Este trabalho teve o objetivo de investigar o mecanismo de otoproteção da N-acetilcisteína (NAC) e a via de modulação da apoptose por meio da análise da expressão da enzima glutationa peroxidase (GSH-Px) e da proteína Bcl-2 em células ciliadas externas (CCEs) de ratos tratados com cisplatina. Também foi avaliada a função auditiva de ratos sob efeito de diferentes doses de cisplatina e NAC. Foram realizados dois experimentos, denominados de A e B, sendo o primeiro com um período experimental de cinco dias e o segundo de três dias. Cada experimento foi composto por quatro grupos, submetidos aos seguintes protocolos: grupo A1 (controle negativo): solução fisiológica 0,9%, via intraperitoneal, no mesmo volume correspondente à dose de cisplatina; grupo A2 (controle positivo): 100mg/Kg/dia de NAC, via oral por gavagem; grupo A3 (ototóxico): 3mg/Kg/dia de cisplatina via intraperitoneal; grupo A4 (ototóxico com otoproteção): 100 mg/Kg/dia de NAC via oral por gavagem, uma hora antes da administração de 3 mg/Kg/dia de cisplatina via intraperitoneal; grupo B1 (controle negativo): solução fisiológica 0,9% via intraperitoneal no mesmo volume correspondente à dose de cisplatina (8mg/Kg/dia); grupo B2 (controle positivo): 300 mg/Kg/dia de NAC via oral por gavagem; grupo B3 (ototóxico): 8 mg/Kg/dia de cisplatina via intraperitoneal; grupo B4 (ototóxico com otoproteção): 300 mg/Kg/dia de NAC via oral por gavagem, uma hora antes da administração via intraperitoneal de 8 mg/Kg/dia de cisplatina. Os animais do experimento A realizaram otoscopia, emissões otoacústicas produto de distorção (EOAPD) e potencial evocado auditivo de tronco encefálico (PEATE), antes e depois da administração das drogas. Os animais do experimento B realizaram estas mesmas avaliações também no pré e pós-tratamento, além de terem suas bulas timpânicas removidas e suas cócleas preparadas para a avaliação anatômica com microscopia eletrônica de varredura e imunofluorescência para a marcação da enzima GSH-Px e da proteína Bcl-2. No experimento A, verificou-se que não houve diminuição significativa da relação sinal-ruído das EOAPD, porém houve aumento significativo do limiar eletrofisiológico obtido por PEATE nos grupos A3 e A4. No experimento B, verificou-se que: não houve aumento significativo do limiar eletrofisiológico obtido por PEATE; as CCEs mantiveram-se anatomicamente íntegras; a enzima GSH-Px apresentou imunomarcação ausente no grupo B1 e imunomarcação presente nos grupos B2, B3 e B4; a proteína Bcl-2 apresentou imunomarcação ausente em todos os grupos estudados. A partir dos resultados, concluiu-se que a função auditiva foi mais prejudicada com a exposição de uma subdose de cisplatina durante um período mais prolongado, a via de modulação da apoptose nas células ciliadas externas de ratos tratados com cisplatina está relacionada com a expressão da enzima GSH-Px e não expressão da proteína Bcl-2.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:35:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5613341 bytes, checksum: b10dc863b3516fce568d5d4513b2ee67 (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this work, by using the optical tweezers technique, it was possible to study the changes on the mechanical properties of DNA - cisplatin complexes, as a function of some parameters such as the drug diffusion time and its concentration in the sample. A model was proposed in order to explain the behavior of the persistent length as a function of drug concentration, using only the data obtained from single molecule stretching experiments. Such analysis allow us to show that cisplatin binds cooperatively to the DNA molecule. In addition, DNA molecule compactation by the action of the drug, was characterized from studying the kinetics of some mechanical properties such as the radius of gyration and the maximum average end - to - end distance. / Neste trabalho, utilizando a técnica de pinçamento óptico, foi possível estudar as mudanças nas propriedades mecânicas dos complexos DNA - cisplatina, em função de alguns parâmetros de interesse, tais como: o tempo de difusão do fármaco e a concentração do fármaco na amostra. Um modelo foi proposto para explicar o comportamento do comprimento de persistência em função da concentração do fármaco, utilizando-se apenas os dados obtidos a partir dos experimentos de estiramento. Tal análise nos permitiu mostrar que a cisplatina se liga cooperativamente à molécula de DNA. Além disso, a compactação da molécula de DNA pela ação da cisplatina foi caracterizada a partir do estudo da cinética de algumas propriedades mecânicas, tais como: o raio de giro e a distância máxima ponta - à - ponta dos complexos.

Orientador: Maria de Lourdes Pires Bianchi / Banca: Maria de Lourdes Pires Bianchi / Banca: Eliana Aparecida Varanda / Banca: Heloisa Della Coletta Francescato / Resumo: Os antioxidantes, principalmente os encontrados na dieta, são agentes responsáveis pela inibição e redução dos danos oxidativos causados pelas espécies reativas nas células. A cisplatina (cDDP), um potente agente antineoplásico utilizado com frequência no tratamento de tumores sólidos, tem seu uso clínico limitado devido aos efeitos adversos como nefrotoxicidade, genotoxicidade e supressão da medula óssea. Como a geração de espécies reativas pode resultar em danos ao DNA pela ação destas espécies ou indiretamente via produtos de degradação da peroxidação lipídica, nosso estudo avaliou o possível efeito protetor da adição da polpa de maracujá amarelo na dieta de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e Wistar normotensos, contra a nefrotoxicidade e genotoxicidade induzida pela cDDP. Os resultados obtidos nas condições experimentais estabelecidas neste trabalho mostraram que a cDDP promoveu um aumento dos níveis das substâncias reativas aos ácido tiobarbitúrico, bem como decréscimo nos níveis de glutationa nos rins dos animais SHR, reforçando a hipótese que a peroxidação lipídica está relacionada com o mecanismo de nefrotoxicidade. O tratamento com doses múltiplas da polpa de maracujá amarelo não alterou os outros parâmetros da função renal no período analisado. Embora o efeito protetor da polpa de maracujá contra os danos induzidos ao DNA em células renais e hepáticas não tenha sido evidente nos resultados obtidos pelo Ensaio do Cometa, a polpa foi eficaz na redução de micronúcleos induzidos pela cDDP. Assim, umas das hipóteses para a redução da pressão arterial sistólica observada neste trabalho, poder ser atribuída à presença de alguns compostos fenólicos e outros ainda não identificados na polpa. Visto que, a interação entre os fitoquímicos presentes na polpa de maracujá demonstraram eficácia na redução da mutagenicidade e efeitos protetores antioxidantes. / Abstract: The antioxidants, particularly those found in the diet, are responsible for inhibiting and reducing the damage caused by reactive species in the cells. Cisplatin (cDDP), a potent anticancer agent often used in the treatment of solid tumors, has limited clinical use due to adverse effects such as nephrotoxicity, genotoxicity and myelosuppression. As the generation of reactive species can result in DNA damage by direct action of this or indirectly by degradation products of the lipid peroxidation, our study evaluated the potential protector of adding yellow passion fruit pulp to the diet of spontaneously hypertensive rats (SHR) and normotensive wistar rats, against the nephrotoxicity and genotoxicity induced by cDDP. The results showed that the cDDP promoted an increase in the levels of thiobarbituric acid reactive substances and a decrease in the levels of glutathione in the kidneys of the animals, reinforcing the hypothesis that lipid peroxidation be related to the mechanism of nephrotoxicity. The treatment with multiple doses of passion fruit pulp did not change the others parameters of renal function in the schedule. Although the protective effect of passion fruit pulp against the damage caused to the DNA of kidney and hepatic cells has not been evident in the results obtained by Comet assay, the pulp was effective in the reduction of micronuclei induced by cDDP. One of the hypotheses for the reduction in systolic blood pressure observed in the present study attributed this effect to the presence of some phenolic compounds and others not yet identified in the passion fruit pulp. Furthermore, the interaction between the phytochemicals of the pulp demonstrated effectiveness in reducing the mutagenic and antioxidant effects. / Mestre

A cisplatina (cis-diaminodicloroplatina II) é um efetivo agente anticâncer, porém seu uso clínico é altamente limitado, predominantemente devido à sua nefrotoxicidade. Muitos estudos têm demonstrado que a cisplatina causa disfunção mitocondrial em células epiteliais renais devido à ação de espécies reativas de oxigênio tais como ânions superóxido e radicais hidroxila. A proteção seletiva das mitocôndrias renais contra espécies reativas de oxigênio geradas pela cisplatina é fundamental na quimioterapia de pacientes com câncer. Vários estudos têm sugerido que o carvedilol é capaz de proteger contra a toxicidade mitocondrial cardíaca induzida pelo quimioterápico doxorubicina. Assim, no presente estudo investigou-se o potencial protetor deste fármaco contra a toxicidade mitocondrial renal induzida pela cisplatina, bem como os mecanismos moleculares envolvidos nesta proteção. Foram estudados 4 grupos (n=6, cada) de ratos Wistar machos tratados da seguinte forma: (i) Grupo controle: uma injeção intraperitoneal (i.p.) de DMSO (0,2mL/200g, i.p.) imediatamente antes da injeção de solução salina isotônica (2 ml/200g, i.p.) e posteriormente uma injeção diária de DMSO (0,2mL/200g, i.p.) em dois dias consecutivos; (ii) Grupo cisplatina (CISP): uma injeção de cisplatina (10 mg/kg, i.p.); (iii) Grupo carvedilol (CV): uma injeção de carvedilol (1 mg/kg, i.p.), seguida de uma injeção diária de carvedilol em dois dias consecutivos (1 mg/Kg, i.p) e (iv) Grupo carvedilol + cisplatina (CV+CISP): uma injeção de carvedilol (1mg/kg, i.p.), imediatamente antes da injeção de cisplatina (10 mg/Kg, i.p.) seguida de uma injeção diária de carvedilol nos dois dias seguintes (1 mg/Kg, i.p.). Os animais foram sacrificados 72 horas após o início do tratamento. O grupo CV+CISP apresentou uma significativa redução na lesão renal, marcada pela diminuição da concentração de uréia e creatinina plasmáticas, quando comparado ao grupo CISP. A avaliação da função mitocondrial comprovou o efeito protetor do carvedilol contra a toxicidade mitocondrial renal da cisplatina através da significativa melhora nos valores da (i) RCR, (ii) do consumo de oxigênio no estado 3 e (iii) da razão ADP/O. Além disso, no grupo CV+CISP o potencial de membrana mitocondrial e a captação de cálcio mitocondrial foram preservados. Adicionalmente, a redução da oxidação do NADPH, da cardiolipina, da glutationa e das proteínas sulfidrilas, bem como a redução na formação de MDA no grupo CV+CISP sugerem efeito protetor do carvedilol contra o estresse oxidativo mitocondrial. O grupo CV+CISP também apresentou menor ativação da caspase-3, o que sugere menor indução de apoptose. Os grupos CISP e CV+CISP apresentaram concentrações semelhantes de platina na suspensão mitocondrial renal, indicando que o mecanismo de proteção do carvedilol provavelmente não envolve a formação de complexos e a subseqüente inativação da cisplatina. Os resultados do presente estudo são promissores, pois o carvedilol é um fármaco de uso seguro e já estabelecido na clínica e a comprovação do seu efeito protetor contribuirá para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção dos danos nefrotóxicos da cisplatina. / Cisplatin (cis-diamminedichloridoplatinum II) is an affective anticancer agent; however its clinical use is highly limited, predominantly due to its nephrotoxicity. Many studies have shown that cisplatin cause mitochondrial dysfunction in renal epithelial cells due to the generation of reactive oxygen species, such as superoxide anions and hydroxyl radicals. The selective protection of the renal mitochondria against the reactive oxygen species generated by cisplatin is of critical importance in the chemotherapy of cancer patients. Some studies have suggested that carvedilol can protect against the cardiac mitochondrial toxicity induced by the chemotherapeutic agent doxorubicin. Therefore, in the present study we investigated the protective effect of carvedilol against renal mitochondrial toxicity, as well as the molecular mechanisms involved in this protection. We studied 4 groups (n=6, each) of male Wistar rats treated as follows: (i) Control group: one injection of DMSO (0,2 mL/200g body weight, i.p.), intraperitoneal injection (i.p.), immediately before the injection of isotonic saline solution (2mL/200g body weight) followed by one injection of DMSO (0,2 mL/200g body weight, i.p.) in the two following days; (ii) Cisplatin group (CISP): one injection of cisplatin (10 mg/kg body weight, i.p.); (iii) Carvedilol group (CV): one injection of carvedilol (CV) (1mg/kg body weight, i.p.) in three consecutive days and (iv) Carvedilol + Cisplatin group (CV+CISP): one injection of carvedilol (1mg/kg, body weight, i.p.) immediately before the injection of cisplatin (10mg/kg, body weight, i.p.), followed by one injection of carvedilol (1mg/kg, body weight, i.p.) in the two following days. Animals were killed 72h after the beginning of the treatment. CV+CISP group presented a significantly reduced renal injury, marked by the decrease of urea and creatinine plasmatic levels, as compared to the CISP group. The evaluation of the mitochondrial function showed the protective effect of carvedilol against the renal mitochondria toxicity induced by cisplatin, as demonstrated by the improvement in the values of (i) RCR; (ii) the oxygen consumption on state 3 respiration and ADP/O ratio. Besides that, in the CV+CISP group the mitochondrial membrane potential and the mitochondrial calcium uptake were preserved. Additionally, the lower oxidation of NADPH, cardiolipin, glutathione and sulfhydryl proteins, as well as the lower values of MDA in the CV+CISP group, suggests a protective effect of carvedilol against the mitochondrial oxidative stress. CV+CISP group also presented lower values of caspase 3, which suggests lower induction of apoptosis. The groups CISP and CV+CISP presented a similar platinum concentration in the mitochondrial suspension, which indicates that the protective mechanism of carvedilol probably does not involve complex formation with cisplatin and its ensuing inactivation. The present results are promising, since carvedilol is a safe drug, which is currently used in the clinical practice and the evidence of its protective effect will contribute to the development of new strategies to prevent the nephrotoxic damage of cisplatin.