Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1196324 bytes, checksum: 0760aa5309df096b43864d5ebdabc40a (MD5) Previous issue date: 2013-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The bovine cysticercosis, caused by the larval form of Taenia saginata, is a current problem in Brazilian beef cattle, determining economic losses to the meat industry due to the carcass condemnation, also represents risks to public health. The main control measure of this zoonosis is applied after post-mortem examination at meat inspection; however, this method fails in detecting cysticerci in cases of low infections, reinforcing the need for additional research to develop alternatives for diagnosis, such as serological tests. The objectives of this study were: to evaluate different laboratory protocols of ELISA for the diagnosis of bovine cysticercosis using Taenia crassiceps (Tcra) larvae antigens to assess their performance against different categories of control sera from slaughtered cattle and, through immunoblotting, to identify peptides with significant diagnostic potential for bovine cysticercosis. Serum samples of cattle experimentally infected with eggs of T. saginata and negative for cysticercosis were also used in the evaluation of different laboratory protocols of ELISA, which involved six antigens of Tcra: total (T), total sonicated (Ts), total dialysate (Td), membrane (M), vesicular fluid (VF) and sonicated vesicular fluid (sVF). From previously defined protocols, we evaluated the performance of ELISA in a final step with the antigens T, Ts and M against sera of positive bovines (experimental and natural) and negative for cysticercosis, and of bovine with other pathologies. The immunoblotting assays were conducted with the T antigen, using four groups of control sera and then reactive peptides were identified and their frequencies and performance ratios were set. With previous evaluation of the protocols we have defined antigen concentrations of 10 μg/ml for VF and sVF antigens and 40 μg/ml for T, Ts, Td and M antigens; the established conjugate dilutions were 1:1.250 ( T, Ts and M) and 1:2,500 (Td, VF and sVF); the best serum dilution tested was 1:100 and the best blocking substance was 5% skimmed milk powder; and the antigens that best differed positive and negative animals were M and T antigens, followed by Ts and Td. The sensitivity rates obtained by ELISA were, respectively, with 2 and 3 standard deviations, 85 and 81.25% for T antigen, 82.5 and 78.75% for Ts antigen, and 80 and 80% for M antigen; specificity rates, with 2 and 3 standard deviations, were, respectively: 47.5 and 58.75% for T antigen, 65 and 73.75% for Ts antigen, and 58.75 and 62.5% for M antigen. In the immunoblotting, the most important diagnostical peptides, in descending order of accuracy were: 6-8 kDa (90.8%), 129-143 kDa (74.2%), 99-105 kDa (71.7%) and 14-19 kDa (71.1%). The suitable combination of various tested parameters contributed to increase the reliability of the ELISA test, once it facilitates the distinction between positive and negative animals. These protocols provided high sensitivity rates, which enables the practical applicability of the test, because it complements the post-mortem examination that shows high specificity, but low sensitivity in detecting carcasses with discrete infections. The results obtained by immunoblotting showed that the T antigen has peptides with a high diagnostic potential; hence, another serological test is useful in the diagnosis of bovine cysticercosis. / A cisticercose bovina, causada pela forma larvar da Taenia saginata, constitui um problema atual na pecuária de corte brasileira, determinando prejuízos econômicos para a indústria da carne em decorrência da condenação de carcaças parasitadas, além de representar riscos à saúde pública. A principal medida de controle desta zoonose é aplicada após o exame post mortem realizado na rotina de inspeção de carnes, no entanto, este método apresenta falhas na detecção de cisticercos em casos de infecções discretas, reforçando a necessidade de pesquisas adicionais para o desenvolvimento de alternativas para o diagnóstico, como os testes sorológicos. Os objetivos deste estudo foram avaliar diferentes protocolos laboratoriais do ELISA para o diagnóstico da cisticercose bovina utilizando antígenos de larva de Taenia crassiceps (Tcra), avaliar o seu desempenho frente a diferentes categorias de soros-controle de bovinos abatidos e, através do immunoblot, identificar os peptídeos com importante potencial diagnóstico para a cisticercose bovina. Amostras de soro de bovinos experimentalmente infectados com ovos de T. saginata e negativos para a cisticercose também foram utilizadas na avaliação de diferentes protocolos laboratoriais do ELISA, que envolveu seis antígenos de Tcra: total (T), total sonicado (Ts), total dialisado (Td), membrana (M), líquido vesicular (LV) e líquido vesicular sonicado (LVs). A partir de protocolos definidos previamente, foi avaliado o desempenho do ELISA numa etapa final com os antígenos T, Ts e M frente soros de bovinos positivos (experimentais e naturais) e negativos para a cisticercose e de bovinos com outras patologias. Os ensaios de immunoblot foram realizados, com o antígeno T, utilizando os quatro grupos de soros-controle e, em seguida, os peptídeos reativos foram identificados e estabelecidas as suas frequências e taxas de desempenho. Com a avaliação prévia dos protocolos ficaram definidas as concentrações de antígeno de 10 μg/ml para os antígenos LV e LVs e de 40 μg/ml para os antígenos T, Ts, Td e M; as diluições de conjugado estabelecidas foram 1:1.250 (T, Ts e M) e 1:2.500 (Td, LV e LVs); a melhor diluição de soro testada foi 1:100 e a melhor substância bloqueadora, o leite em pó desnatado a 5%; e os antígenos que melhor diferenciaram animais positivos e negativos foram o M e o T, seguidos pelos antígenos Ts e Td. As taxas de sensibilidade obtidas pelo teste ELISA foram respectivamente, com 2 e 3 desvios-padrão, 85 e 81,25% para o antígeno T, 82,5 e 78,75% para o antígeno Ts e 80 e 80% para o antígeno M; as taxas de especificidade, com 2 e 3 desvios-padrão, foram respectivamente: 47,5 e 58,75% para o antígeno T, 65 e 73,75% para o antígeno Ts e 58,75 e 62,5% para o antígeno M. Já no immunoblot os peptídeos de maior importância diagnóstica, em ordem decrescente de acurácia foram: 6-8 kDa (90,8%), 129-143 kDa (74,2%), 99-105 kDa (71,7%) e 14-19 kDa (71,1%). A combinação adequada dos diversos parâmetros testados contribuiu para ampliar a confiabilidade do teste ELISA, uma vez que facilita a diferenciação entre animais positivos e negativos. Estes protocolos proporcionaram altas taxas de sensibilidade o que facilita a aplicabilidade prática do teste, pois complementa o exame post mortem que apresenta alta especificidade, porém baixa sensibilidade em detectar carcaças com infecções discretas. Os resultados obtidos pelo immunoblot mostraram que o antígeno T possui peptídeos com alto potencial diagnóstico, sendo, portanto, outro teste sorológico útil no diagnóstico da cisticercose bovina.

Human neurocysticercosis (NC) is an important but neglected cause of epilepsy in developing countries where the parasite occurs. Expression of single-chain variable fragment (scFv) antibodies on the surface of bacteriophage is widely used to prepare antibodies with pre-defined specificities. A phage antibody library was selected against peptides displayed on phages coupled to beads and total saline extract of Taenia solium metacestodes immobilized on microtiter plate wells. After two rounds of selection 96 phage clones of each panning were selected, tested for scFv expression and specificity to each target. Specific clones were further analyzed by ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), Dot-blot, sequencing and immunofluorescence. After selection, three clones were used for antigen capture to characterize its targets for future immunodiagnostic assays development. Total saline extract was fractionated on ion exchange resin diethylaminoethyl (DEAE), and fractions were tested by ELISA to detect sera IgG from: NC, other parasites and health controls (40 each). The fractions with best diagnostic parameters (sensitivity, specificity, area under curve and likelihood ratio, calculated by TG-ROC) were selected and subjected to antigen capture using each purified scFv clone. Each captured fraction was tested by ELISA to detect IgG in 30 serum samples from each group. In immunofluorescence tests, no fluorescence was observed in negative controls, and all clones showed a non-uniform staining profile, and their targets were elucidated through mass spectrometry. After ion exchange fractionation and ELISA tests, DEAE S2 fraction showed to be the best one and was used to capture new antigens. DEAE S2 showed 93.3% specificity. Among all clones, A4 and B6 captured antigens from saline extract and DEAE S2 fraction, respectively, with the best diagnostic parameters. In conclusion, antibody phage display technology is a potential approach for the study of antigen-antibody interactions, which can be used to further elucidate the biology of interaction on neurocysticercosis and to capture new antigens with potential applications in NC diagnosis and therapeutics. / A neurocistocercose humana (NC) é uma doença muito importante, porém negligenciada e é a maior causa de epilepsia em países em desenvolvimento onde a parasitose ocorre. A expressão de fragmentos de cadeia única das regiões variáveis de anticorpo (scFv) na superfície de bacteriófagos é amplamente utilizada para obter anticorpos com especificidades pré-definidas. Uma biblioteca de anticorpos foi utilizada para a seleção de clones específicos à peptídeos expostos em fagos acoplados a beads e ao extrato salino total de Taenia solium (S) imobilizado em placas de microtitulação. Após dois ciclos de seleção, 96 clones de anticorpos foram selecionados contra cada alvo, testados para expressão do scFv e especificidade pelo alvo. Aqueles clones que se mostraram específicos foram melhor analisados por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), Dot blot, sequenciamento e imunofluorescência. Três clones foram selecionados para serem utilizados na captura antigênica e caracterização do antígeno verdadeiro e para captura de novos antígenos com potencial aplicação em testes diagnósticos. O extrato S foi fracionado em resina de troca iônica diethylaminoethyl (DEAE) para obter frações que foram posteriormente testadas por ELISA para detectar IgG em amostras de soro de pacientes: com NC, outras parasitoses e saudáveis, 40 amostras cada grupo. A fração com melhores parâmetros diagnósticos (sensibilidade, especificidade, área sob a curva e likelihood ratio, calculadas por TG-ROC) foi selecionada e sujeita à captura antigênica usando cada clone de scFv purificado. Cada fração capturada foi testada por ELISA para detectar IgG em 30 amostras de soro de cada grupo. Nos testes de imunofluorescência, nenhuma fluorescência foi observada com os controles negativos e todos os clones mostraram um padrão de marcação não uniforme, seus antígenos alvo foram elucidados por espectrometria de massas. Após fracionamento por troca iônica e ELISA, a fração DEAE S2 se mostrou a melhor e foi utilizada para a captura de novos antígenos. A fração DEAE S2 mostrou especificidade de 93,3%. Dentre todos os clones, o A4 e o B6 capturaram antígenos do extrato S e fração DEAE S2, respectivamente, com os melhores parâmetros diagnósticos. Em conclusão a tecnologia de exposição de anticorpos em fagos é uma técnica potencial para o estudo de interações antígeno-anticorpo utilizadas para melhor elucidar a a biologia da interação na NC e para capturar novos antígenos potencialmente aplicáveis para o diagnóstico da NC. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Neurocysticercosis (NC) is a polymorphic disease and the immune response in human carrier is heterogenic. In this study, 35 primers were used for amplifications by Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) of Taenia solium metacestodes, from five different geographic areas in Brazil: 1) Distrito Federal (DF), Center West; 2) Barreiras (BA), Northeast and Southeast; 3) Hydro Basin of the Mosquito River (North of Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) and 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Metacestodes saline crude extracts of four populations (DF, BA, RM-MG e SP) were used for the detection of specific IgG antibodies by ELISA and Western Blotting (WB). A total of 157 serum samples of three groups, (G1): 49 NC patients; (G2): 68 patients with other helminthiasis: hydatidosis (10), taeniasis (20), strongyloidiasis (20), schistosomiasis (10) and hymenolepiasis (8); and (G3): 40 healthy individuals; were analyzed by ELISA. From these, the 98 serum samples were assayed by WB; G1 (49), G2 (39) and G3 (10). The genetic distances, in disagreement percentage, between the metacestode populations were calculated from of 15 RAPD markers and showed 49.5% (DF), 48% (BA), 38.5% (UBMG) and 28% (RM-MG and SP) of genetic distances. Six primers identified polymorphic fragments and the primers 26 (GGGTTTGGCA) and 29 (TCGCCAGCCA) allowed a better differentiation of populations. The fragments of 1000, 500 and 326 pb (pairs of bases) in the UB-MG and of 600 and 244 pb in RM-MG were amplified by primer 26. The fragments generated by primer 29 were 500, 800 and 1191 pb, 300 and 1377 pb, 1000 pb and 244 and 434 pb in SP, UB-MG, DF and BA populations, respectively. In G1, the positivity by ELISA was: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) and 67% (SP). The DF extract was more antigenic than others (p=0.02). In WB, the 64-68 kDa antigens were recognized in all extracts, exclusively, in serum samples from active NC patients (p=0.001). Variation in banding pattern was detected between the extracts (p<0.05). In G2, the serum samples of hydatidosis patients presented from 70 to 90% positivity by ELISA in antigenic extracts (p<0.05); however, the bands recognition pattern in WB was different from that presented in G1 samples. The 77 kDa band was significantly identified in hydatidosis samples (p=0.0001). In conclusion, the T. solium populations analyzed showed genetic variability and antigenic differences. / A neurocisticercose (NC) constitui doença polimórfica, apresentando heterogeneidade da resposta imune no hospedeiro humano. Nesse estudo, o teste Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) foi utilizado com 35 primers na detecção de polimorfismo em metacestódeos de Taenia solium provenientes de cinco áreas geográficas distintas do Brasil: 1) Distrito Federal (DF), região Centro-Oeste; 2) Barreiras (BA), região nordeste e da região sudeste: 3) Bacia Hidrográfica do Rio Mosquito (norte de Minas Gerais, RM-MG), 4) São Paulo (SP) e 5) Uberaba (Minas Gerais, UB-MG). Os extratos salinos totais de metacestódeos de quatro populações (DF, BA, RM-MG e SP) foram utilizados na detecção de anticorpos IgG específicos pelo ELISA e Western Blotting (WB). As 157 amostras de soro de três grupos (G) de indivíduos: G1: 49 pacientes com NC; G2: 68 pacientes com outras helmintíases, sendo hidatidose (10), teníase (20), estrongiloidíase (20), esquistossomose (10) e himenolepíase (8) e G3: 40 indivíduos saudáveis (controles); foram analisadas pelo ELISA. Foram ensaiadas 98 amostras de soro: G1 (49), G2 (39) e G3 (10) pelo WB. As distâncias genéticas, por porcentagem de desacordo, foram de 49,5% (DF), 48% (BA), 38,5% (UB-MG) e 28% (RM-MG e SP) nas populações de metacestódeos, calculadas a partir de 15 marcadores de RAPD. Seis primers geraram fragmentos polimórficos nos isolados analisados, sendo que os primers 26 (GGGTTTGGCA) e 29 (TCGCCAGCCA) permitiram melhor diferenciação entre as populações, o primer 26 gerou os fragmentos de 1000, 500 e 326 pb (pares de bases) na amostra de UB-MG, e de 600 e 244 pb em RM-MG. O 29 gerou fragmentos em quatro das populações analisadas, sendo 500, 800 e 1191 pb em SP, 300 e 1377 pb em UBMG, 1000 pb no DF e 244 e 434 pb na BA. No G1, as freqüências de positividade no ELISA, foram: 90% (DF), 69% (BA), 71% (MG) e 67% (SP), sendo o extrato do DF mais antigênico que os demais (p = 0,02). No WB, o peptídeo de 64-68 kDa foi reconhecido em todos os extratos, exclusivamente, em amostras de pacientes com NC ativa (p=0,001). Detectou-se variação no padrão de reconhecimento de bandas entre os extratos (p<0,05). No G2, as amostras de soro de pacientes com hidatidose apresentaram de 70 a 90% de positividade no ELISA frente aos extratos analisados (p<0,05); porém, o padrão de reconhecimento de bandas no WB diferiu do apresentado pelas amostras do G1, sendo que a banda de 77 kDa foi significativamente identificada pelas amostras de pacientes com hidatidose (p=0,0001). Concluiu-se que as populações de T. solium analisadas nesse estudo, apresentaram variabilidade genética e diferenças de antigenicidade. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Orientador: Cáris Maroni Nunes / Resumo: O complexo teníase-cisticercose é causado pelos cestódeos Taenia saginata e Taenia solium, que têm o homem como hospedeiro definitivo e obrigatório e os bovinos e os suínos, respectivamente, como hospedeiros intermediários. A presença da forma adulta destes cestódeos no intestino delgado causa pequenos danos ao homem, enquanto a presença das formas larvárias nos tecidos e órgãos causam lesões nos hospedeiros intermediários, resultando na cisticercose. O homem pode também ser hospedeiro ocasional da T. solium e desenvolver a cisticercose, quando da ingestão acidental de seus ovos. Uma das medidas de controle desta zoonose é a inspeção sanitária de bovinos e suínos ao abate, evitando assim que os parasitas completem seu ciclo biológico. Assim, o complexo teníase-cisticercose, além de ser um grave problema de saúde pública, é também um problema econômico na agropecuária, visto que as carcaças podem ser condenadas quando da presença de formas larvares ou terem seu valor reduzido. A neurocisticercose é a forma mais grave desta zoonose no homem e seu diagnóstico é realizado por meios imunológicos e/ou por exames de imagens, que permitem a visualização dos das lesões no sistema nervoso central. Já a teníase é diagnosticada por meio da pesquisa de proglotes ou de ovos das tênias nas fezes, os quais são indistinguíveis morfologicamente. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de teníase humana por meio da análise dos resultados de exames coproparasitológicos rotineirame... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The taeniasis-cysticercosis complex is caused by the cestodes Taenia saginata and Taenia solium, which have man as their definitive and mandatory host and cattle and swine, respectively, as intermediate hosts. The presence of the adult form of these cestodes in the small intestine causes minor damage to humans, while the presence of the larval forms in tissues/organs causes damage to the intermediate hosts, resulting in cysticercosis. Man can also be an occasional host of T. solium and develop cysticercosis when ingesting its eggs. One of the measures to control this zoonosis is sanitary inspection of cattle and pigs at slaughter in order to prevent the parasites from completing their biological cycle. Thus, in addition of being a serious public health problem the taeniasiscysticercosis complex is also an economic problem once the carcasses with the larval forms can be condemned or have a reduced value. Neurocysticercosis is the most severe form of this zoonosis in man and its diagnosis is done by immunological method and/or by imaging exams, which allow the visualization of the lesions in the central nervous system. Taeniasis is diagnosed by searching for proglottids and/or tapeworm eggs in feces, which are morphologically indistinguishable. The objective of the present study was to evaluate the occurrence of human taeniasis by analyzing the results of the coproparasitological exams routinely performed in a private clinical analysis laboratory at a city in São Paulo state, B... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Larvas de cisticercos de Taenia crassiceps foram deixadas em repouso em TRIS 9mM pH 7,2 com 1mM EDTA até 180 minutos, os sobrenadantes coletados e processados nos 30, 60, 120 e 180 minutos, dando origem aos antígenos de excreção e secreção (ES 30; ES 60; ES 120 e ES 180). A caracterização do antígeno de excreção e secreção de larvas de Taenia crassiceps foi feito por SDS-PAGE e imunoblot utilizando anticorpos monoclonais (AcMos) anti-T. crassiceps e anti-T. solium e anticorpos humanos. Os resultados mostraram que o rendimento do antígeno ES foi menor nos primeiros 30 minutos (0,4 &#181;g) por larva quando comparado os demais ES (ES 60: 2,4 &#181;g; ES 120: 2,9 &#181;g; ES 180: 2,5 &#181;g). O SDS-PAGE confirmou que no ES 30 há menos proteínas. No imunoblot, o ES 180 mostrou que 6 AcMos (anti-LV-Tcra; anti-ES-Tcra; anti-LV-Tso: A3; anti-T-Tso: B4, B11 e A6) reconheceram apenas as frações 18- e 14-kDa do antígeno ES 180. Os AcMos anti-E-Tso (B8) e anti-LV-Tso (B6) não reconheceram frações do antígeno ES 180. Anticorpos presentes em amostras humanas de pacientes com NC reconheceram as frações protéicas entre 94- a 30-kDa e as de 18- e 14-kDa. Utilizando antígeno ES 180 e amostras de soros de pacientes supostamente saudáveis (GC), foram identificadas proteínas acima de 30-kDa e somente uma amostra reconheceu a de 16- kDa, anômala em relação ao perfil 18- e 14-kDa. As amostras de soro de pacientes com outras parasitoses mostraram reatividade com frações &#8805; de 30-kDa do ES 180 e o maior índice de reatividade foi com a proteína 71-KDa. Um total de 77%; 70%; 60% e 70% das amostras de pacientes com toxocaríase, esquistossomose mansônica, hidatidose e Chagas, respectivamente, reconheceram a fração 71-kDa do ES 180. O antígeno ES pode contribuir com futuros estudos abordando a complexa relação parasito hospedeiro na cisticercose e na produção de vacinas para o uso em suínos. / Cysticercus Larvae of Taenia crassiceps were maintained in TRIS 9mM pH 7,2 with 1mM EDTA for 180 minutes; the supernatant was collected and processed at 30; 60; 120 and 180 minutes, originating excretion-secretion antigens (ES 30; ES 60; ES 120 and ES 180). The characterization of the ES antigen was conducted through SDS-PAGE and immunoblot using anti-T. crassiceps and anti-T. solium monoclonal antibodies (AcMos) and human antibodies. The results showed that the production of ES antigen was lower in the first 30 min. (0,4 &#181;g) compared with the others (ES 60: 2,4 &#181;g; ES 120: 2,9 &#181;g; ES 180: 2,5 &#181;g). The SDS-PAGE confirmed that ES 30 presented less protein. By immunoblot,6 AcMos (anti-LV-Tcra; anti-ES-Tcra;anti-LV-Tso: A3; anti-T-Tso: B4, B11 and A6) have recognized only the 18- and 14-kDa fractions of the ES 180. The anti-E-Tso (B8) and the anti-LV-Tso (B6) AcMos did not recognize any fractions. Antibodies from human samples NC recognized the proteins from 94- to 30-kDa and from 18- and 14-kDa. Using serum samples of apparently healthy individuals (GC), the ES 180 antigen showed proteins &#62; 30-kDa and one sample recognized the 16-kDa fraction, anomalous when compared to the 18- and 14-kDa fractions. The serum samples of subjects with other parasitoses showed reactivity &#8805; 30-kDa, more frequently with 71-KDa protein. A total of 77%; 70%; 60% and 70% of the samples from subjects presenting toxocariasis, esquistossomose mansonic, hydatidosis and Chagas disease, respectively, recognized the 71-kDa fraction of ES 180. The ES antigen may contribute to further studies on the complex cysticercosis parasite/host relation as well as for the production of vaccines for swine.

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As doenças parasitárias dos animais de produção causam grande impacto produtivo na produção pecuária, e também, devido ao caráter zoonótico de algumas delas, podem oferecer riscos à saúde humana. O serviço de inspeção veterinária se encarrega de realizar os controles necessários para evitar que produtos contaminados cheguem ao consumo humano. A planificação dos diagnósticos realizados na inspeção post-mortem, aliada ao cruzamento com os dados de origem dos animais, é uma importante ferramenta para elencar quais as doenças mais prevalentes e quais os principais fatores epidemiológicos envolvidos nestas doenças, auxiliando na tomada de decisões para efetuar medidas de controle. Para tanto foram realizados dois estudos: Um estudo para investigar a prevalência geral de lesões correspondentes a cisticercose, hidatidose e fasciolose em carcaças de bovinos, suínos, ovinos e bubalinos abatidos em matadouros-frigoríficos de todo o estado do Rio Grande do Sul, Brasil, inspecionados pelo Serviço de Inspeção Estadual (SIE) da Secretaria da Agricultura, Pesca e Agronegócio do Estado do Rio Grande do Sul, no período de Dezembro de 2012 a Maio de 2013. Os suínos abatidos nas condições deste estudo não apresentaram casos de cisticercose, e obtiveram uma prevalência de lesões por doenças parasitárias de 0,007%, demonstrando níveis mínimos de contaminação. Os bovinos apresentaram índices baixos de cisticercose (0,6%), porém os índices de fasciolose (6,5%) e hidatidose (4,6%) demonstram que o estado ainda é endêmico para estas doenças. Nos abates de ovinos obteve-se prevalência alta para hidatidose (15,5%), demonstrando a doença ainda como um risco desta atividade. O conhecimento de tais dados pode servir de base para o planejamento de controle das doenças e também para avaliação da eficácia dos sistemas produtivos em manter os rebanhos livres de doenças. O segundo estudo avaliou a influência das diferentes idades e diferentes sistemas de terminação na prevalência de Hemoncose e/ou a presença de formas adultas de Haemonchus spp em bovinos no momento do abate. O sistema de manejo na recria e terminação alterou significativamente a prevalência de Haemonchus spp. em bovinos abatidos. Novilhos Superprecoces têm 5,91 vezes mais chance de estarem parasitados por Haemonchus spp. no momento do abate do que bovinos abatidos com mais de 36 meses de idade. As contagens de ovos de helmintos por grama de fezes em Novilhos Superprecoces foram significativamente superiores as de bovinos com idade tradicional de abate. Ressalta-se a importância da detecção do parasitismo por inspeção no abate e exame laboratorial das fezes, para servir de norte para a avaliação da eficácia de programas sanitários e detectar possíveis falhas ou riscos de manejo, possíveis causadores de prejuízos nos sistemas pecuários. / In Brazil, livestock production plays an important role in the economy. Parasitic diseases of livestock cause great impact on production, and also due to zoonotic characteristics of some of them, may offer risks to human health. The veterinary inspection service is in charge of the necessary controls to prevent contaminated products from reaching the human consumption. The planning of diagnoses made by post-mortem inspection, together with the linkage with the data of animal origin, is an important tool to determine what the most prevalent diseases and what the main epidemiological factors involved in these diseases, assisting in making decisions to make control measures. Therefore, we conducted two studies: A study to investigate the overall prevalence of lesions corresponding cysticercosis, hydatidosis and fascioliasis in beef, swine, sheep and buffaloes slaughtered in all abattoirs inspected by the State Inspection Service (SIE) of the Secretariat of Agriculture, Fisheries and Agribusiness State of Rio Grande do Sul, in the period December 2012 to May 2013. The pigs slaughtered in the conditions of this study showed no cases of cysticercosis, and obtained a prevalence of injuries parasitic diseases of 0.007%, showing minimum levels of contamination. The cattle have low rates of cysticercosis (0.6%), but the prevalences of fascioliasis (6.5%) and hydatid disease (4.6%) show that the state is still endemic for these diseases. In sheep slaughter gave high prevalence for cystic echinococcosis (15.5%), demonstrating the disease still is a risk of this activity. Knowledge of such data can serve as a basis for disease control planning and also to evaluate the effectiveness of production systems to keep livestock free of diseases. The second study evaluated the influence of different ages and different finishing systems in the prevalence of hemoncosis and or the presence of adult stages of Haemonchus spp in cattle at slaughter. The management system in growing and finishing influences significantly the prevalence of Haemonchus spp. in slaughtered cattle. Super-young steers have 5.91 times more likely to be infected with Haemonchus spp. at slaughter than slaughtered bovine animals over 36 months of age. The helminth egg counts per gram of feces in Super-young steers were significantly higher than those of traditional cattle slaughter age. We emphasize the importance of detection of parasitism by inspection at slaughter and laboratory examination of feces to serve guidance for the evaluation of the effectiveness of health programs and detect possible failures or risks managements, which are possible causes of losses in livestock systems.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 928214 bytes, checksum: f836c005563b3eda57ceef56008490fb (MD5) Previous issue date: 2007-07-17 / The bovine cisticercosis is an illness caused by the larva of Taenia saginata called Cysticercus bovis. Recently the implementation of immunologic tests has been suggested as alternative for the diagnosis of the illness, amongst these tests the Immunoblotting, that basically detect antibodies in the serum. The present work objectives the evaluation of the Immunoblotting performance in the immunodiagnosis of bovine cisticercosis as well as of Taenia saginata and Taenia crassiceps antigens. The Taenia saginata antigens (Tsag) was gotten from the calves through the experimental infection and the Taenia crassiceps (LVcra and Tcra) antigen was gotten through experimental infection in mice balb/c. The antigens had been tested in four groups of Immunoblot control-serum: 28 samples of animals experimentally infected, 32 from naturally infected animals, 28 samples without illnesses and 19 samples with other pathologies. The peptides that had only reacted with the positive serum had been selected and identified as important, observing the localization criteria (molecular weight) as well as its physical appearance, particularly the color intensity. Related to these characteristics, valid for three tested antigens, the bands of 4-6, 14 and 18KDa had been distinguished between the others, showing the highest taxes of performance and a differentiated profile, with bigger area and height, similar to a spot. The 4-6KDa peptides presented the taxes of 66.7, 66.7 and 50% of sensitivity and 97.5, 84.6 and 96.2% of specificity when used the LVcra, Tcra and Tsag antigens, respectively. The 14KDa peptide presented 87.5, 87.5 and 77.8% of sensitivity and 97.5 94.9 and 100% of specificity with the LVcra, Tcra and Tsag antigens, respectively. The 18KDa peptide presented for LVcra, Tcra and Tsag, respectively, 75, 41.7 and 88.9% sensitivity values and 97.5, 89.7 and 92.3% of specificity. Crossed reactions with other illnesses between the three antigenic preparations and the 4-6, 14 and 18KDa peptides had not been observed. The values reached in this experiment indicate that the peptides with molecular weight of 4-6, 14 and 18KDa, can be considered important in the diagnosis of bovine cisticercosis. Low sensitivity values of Immunoblot had been observed when serum of animals with natural infection, generally discrete, had been considered. On the other hand, serum samples of antibodies from the studied bovines demonstrated high taxes of performance in the recognition of the 4-6, 14 and 18 Kda peptides, what characterize the test qualitatively, becoming it useful for the diagnosis of cisticercosis, as well as teste antigens. / A cisticercose bovina é uma doença causada pela larva de Taenia saginata, denominada Cysticercus bovis. Recentemente, tem sido sugerida, como alternativa para o diagnóstico da doença, a implementação de testes imunológicos, dentre eles o Imunoblot, que tem por princípio a detecção de anticorpos no soro. O presente trabalho objetiva a avaliação do desempenho do imunoblot no imunodiagnóstico da cisticercose bovina, bem como, dos antígenos de Taenia saginata e Taenia crassiceps. Os antígenos de Taenia saginata (Tsag) foram obtidos através da infecção experimental dos bezerros e os de Taenia crassiceps (LVcra e Tcra), através da infecção experimental em camundongos balb/c. Os antígenos foram testados no Immunoblotting frente a quatro grupos de soros-controle: 28 amostras de soro de animais experimentalmente infectados, 32 de animais naturalmente infectados, 28 sem doenças e 19 com outras patologias. Foram selecionados os peptídeos que reagiram somente com os soros positivos, os quais foram identificados como importantes, observando os critérios de localização (peso molecular), bem como sua aparência física, particularmente a intensidade de cor. As bandas de 4-6, 14 e 18KDa destacaram-se entre as outras, mostrando as mais altas taxas de desempenho e um perfil diferenciado, com área e altura maiores, semelhantes a uma mancha. Os peptídeos de 4-6KDa apresentaram as taxas de 66,7, 66,7 e 50% de sensibilidade e 97,5, 84,6 e 96,2% de especificidade quando utilizados os antígenos LVcra, Tcra e Tsag, respectivamente. O peptídeo de 14KDa apresentou 87,5, 87,5 e 77,8% de sensibilidade e 97,5 94,9 e 100% de especificidade com os antígenos LVcra , Tcra e Tsag , respectivamente. O peptídeo de 18KDa apresentou para LVcra, Tcra e Tsag, respectivamente, valores de 75, 41,7 e 88,9% de sensibilidade e 97,5, 89,7 e 92,3% de especificidade. Não foram observadas reações cruzadas com outras doenças entre as três preparações antigênicas e os peptídeos de 4-6, 14 e 18KDa. Os valores alcançados neste experimento indicam que os peptídeos com peso molecular de 4-6, 14 e 18KDa, podem ser considerados importantes no diagnóstico da cisticercose bovina. Observaram-se baixos valores de sensibilidade do imunoblot quando se consideraram soros de animais com infecção natural, geralmente discreta. Por outro lado, as altas taxas de desempenho demonstradas no reconhecimento dos peptídeos de 4-6, 14 e 18KDa, pelos anticorpos presentes nas amostras de soros dos bovinos estudados, caracterizam qualitativamente o teste, tornando-o útil no diagnóstico da cisticercose.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1111599 bytes, checksum: 1d237896c865356f1238a4fc70aec751 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The taeniasis-cysticercosis complex is a disease of great importance to public and animal health, and human beings play an important role as the only definitive hosts that develop taeniasis. Cysticercosis can affect pigs, which are infected by the larva of Taenia solium, cattle, which are infected by the larva of Taenia saginata and, accidentally, humans, who can act as an intermediate hosts (T. solium), developing cysticercosis in their tissues, with neurocysticercosis being the most severe form of the disease. Despite the importance of taeniasis and cysticercosis to public health, animal health and economy in Brazil, the epidemiological reality of the occurrence of zoonoses is poorly understood. In the state of Minas Gerais, most of the data is obtained from official sanitary inspection agencies in slaughterhouses, and little information is based on field data from live animals. In order to assess the epidemiological situation of the taeniasis-cysticercosis complex in small and medium-sized farms in the municipalities of Iraí de Minas, Romaria, Grupiara and Douradoquara, located in the microregion of Patrocínio, in the Triangulo Mineiro region, this study addressed the occurrence of human taeniasis, bovine and porcine cysticercosis, and the main risk factors associated with transmission of parasitic forms of T. saginata and T. solium in the sampled farms. Thus, a cross-sectional epidemiological study was conducted with 68 farms located in rural areas of the four aforementioned municipalities, and these properties were georeferenced. Data collected consisted of 1002 bovine blood samples, 22 porcine blood samples, and stool samples from 119 members of the households and applied an epidemiological questionnaire. The serological diagnosis of animal cysticercosis was performed by screening using the indirect ELISA test, and the suspected cases underwent Immunoblot testing for confirmation purposes. Stool examination was performed by the simple sedimentation method (HPJ). This study found a prevalence of 4.5% of porcine cysticercosis and 4.69% of bovine cysticercosis in the farms of the rural area of the sampled municipalities between July and August 2013. No case of human taeniasis was disagnosed; however, other enteroparasitoses were diagnosed. This study evaluated the association between some risk factors and the prevalence of cases of bovine cysticercosis, in which the variables that were statistically significant were the profession of the person in charge of such farms, income and the water treatment in the farms. From the georeferencing of farms, which generated maps of the collected points and the points diagnosed with bovine cysticercosis. There was the possibility that the transmission of this parasite may occur from the rivers and tributaries that flow along the sampled municipalities from the hydrography of the region. This study identified the prevalence of taeniasis-cysticercosis complex in the sampled municipalities and the results will aid in the prevention and control of this zoonosis in the areas of occurrence. / O complexo teníase-cisticercose é uma doença de grande importância para a saúde pública e animal, no qual o ser humano desempenha importante papel como o único hospedeiro definitivo, desenvolvendo a teníase. A cisticercose pode acometer o suíno, que desenvolve a larva da Taenia solium, o bovino, que desenvolve a larva da Taenia saginata e, acidentalmente, o homem pode atuar como hospedeiro intermediário (T. solium), desenvolvendo a cisticercose em seus tecidos, sendo a neurocisticercose a forma mais grave. Apesar da importância da teníase e da cisticercose para a saúde pública, para a saúde animal e para economia, a realidade epidemiológica da ocorrência dessas zoonoses no Brasil é pouco conhecida. No estado de Minas Gerais a maioria dos dados é obtida dos serviços oficiais de Inspeção Sanitária nos matadouros- frigoríficos, sendo poucas as informações baseadas em dados de campo oriundos de animais vivos. Com o objetivo de avaliar a situação epidemiológica do complexo teníase-cisticercose em pequenas e médias propriedades rurais dos municípios de Iraí de Minas, Romaria, Grupiara e Douradoquara, situados na microrregião de Patrocínio, região do Triângulo Mineiro, se pesquisou a ocorrência da teníase humana, da cisticercose bovina e suína e os principais fatores de risco associados à transmissão das formas parasitárias T. saginata e T. solium nas propriedades amostradas. Dessa forma, foi realizado um estudo epidemiológico de corte transversal envolvendo as 68 propriedades localizadas nas zonas rurais dos quatro municípios, sendo essas propriedades georreferenciadas. Foram coletadas 1002 amostras de sangue bovino e 22 amostras de sangue suíno, 119 amostras de fezes dos integrantes das famílias residentes nas propriedades e aplicado um questionário epidemiológico. O diagnóstico sorológico da cisticercose animal foi realizado por triagem pelo teste ELISA indireto e os casos suspeitos foram submetidos ao Immunoblot para confirmação. O exame de fezes foi realizado pelo método de sedimentação simples. Este estudo revelou prevalência de 4,5% de cisticercose suína e de 4,69% de cisticercose bovina nas propriedades da zona rural dos municípios amostrados, no período de julho a agosto de 2013. Não foi diagnosticado nenhum caso de teníase humana, no entanto, outras enteroparasitoses foram diagnosticadas. Avaliou-se a associação entre alguns fatores de risco e a prevalência dos casos de cisticercose bovina, no qual as variáveis que se mostraram estatisticamente significantes foram profissão do responsável pela propriedade, renda familiar e tratamento da água da propriedade. A partir do georreferenciamento das propriedades, foram produzidos os mapas dos pontos coletados e dos pontos diagnosticados com cisticercose bovina. Observou-se a possibilidade da transmissão dessa parasitose ocorrer a partir dos rios e seus afluentes nos municípios amostrados a partir da hidrografia da região. O estudo permitiu a identificação da prevalência do complexo teníase-cisticercose nos municípios amostrados e os resultados permitirão auxiliar a prevenção e o controle dessa zoonose nas áreas de ocorrência.

Larvas de cisticercos de Taenia crassiceps foram deixadas em repouso em TRIS 9mM pH 7,2 com 1mM EDTA até 180 minutos, os sobrenadantes coletados e processados nos 30, 60, 120 e 180 minutos, dando origem aos antígenos de excreção e secreção (ES 30; ES 60; ES 120 e ES 180). A caracterização do antígeno de excreção e secreção de larvas de Taenia crassiceps foi feito por SDS-PAGE e imunoblot utilizando anticorpos monoclonais (AcMos) anti-T. crassiceps e anti-T. solium e anticorpos humanos. Os resultados mostraram que o rendimento do antígeno ES foi menor nos primeiros 30 minutos (0,4 &#181;g) por larva quando comparado os demais ES (ES 60: 2,4 &#181;g; ES 120: 2,9 &#181;g; ES 180: 2,5 &#181;g). O SDS-PAGE confirmou que no ES 30 há menos proteínas. No imunoblot, o ES 180 mostrou que 6 AcMos (anti-LV-Tcra; anti-ES-Tcra; anti-LV-Tso: A3; anti-T-Tso: B4, B11 e A6) reconheceram apenas as frações 18- e 14-kDa do antígeno ES 180. Os AcMos anti-E-Tso (B8) e anti-LV-Tso (B6) não reconheceram frações do antígeno ES 180. Anticorpos presentes em amostras humanas de pacientes com NC reconheceram as frações protéicas entre 94- a 30-kDa e as de 18- e 14-kDa. Utilizando antígeno ES 180 e amostras de soros de pacientes supostamente saudáveis (GC), foram identificadas proteínas acima de 30-kDa e somente uma amostra reconheceu a de 16- kDa, anômala em relação ao perfil 18- e 14-kDa. As amostras de soro de pacientes com outras parasitoses mostraram reatividade com frações &#8805; de 30-kDa do ES 180 e o maior índice de reatividade foi com a proteína 71-KDa. Um total de 77%; 70%; 60% e 70% das amostras de pacientes com toxocaríase, esquistossomose mansônica, hidatidose e Chagas, respectivamente, reconheceram a fração 71-kDa do ES 180. O antígeno ES pode contribuir com futuros estudos abordando a complexa relação parasito hospedeiro na cisticercose e na produção de vacinas para o uso em suínos. / Cysticercus Larvae of Taenia crassiceps were maintained in TRIS 9mM pH 7,2 with 1mM EDTA for 180 minutes; the supernatant was collected and processed at 30; 60; 120 and 180 minutes, originating excretion-secretion antigens (ES 30; ES 60; ES 120 and ES 180). The characterization of the ES antigen was conducted through SDS-PAGE and immunoblot using anti-T. crassiceps and anti-T. solium monoclonal antibodies (AcMos) and human antibodies. The results showed that the production of ES antigen was lower in the first 30 min. (0,4 &#181;g) compared with the others (ES 60: 2,4 &#181;g; ES 120: 2,9 &#181;g; ES 180: 2,5 &#181;g). The SDS-PAGE confirmed that ES 30 presented less protein. By immunoblot,6 AcMos (anti-LV-Tcra; anti-ES-Tcra;anti-LV-Tso: A3; anti-T-Tso: B4, B11 and A6) have recognized only the 18- and 14-kDa fractions of the ES 180. The anti-E-Tso (B8) and the anti-LV-Tso (B6) AcMos did not recognize any fractions. Antibodies from human samples NC recognized the proteins from 94- to 30-kDa and from 18- and 14-kDa. Using serum samples of apparently healthy individuals (GC), the ES 180 antigen showed proteins &#62; 30-kDa and one sample recognized the 16-kDa fraction, anomalous when compared to the 18- and 14-kDa fractions. The serum samples of subjects with other parasitoses showed reactivity &#8805; 30-kDa, more frequently with 71-KDa protein. A total of 77%; 70%; 60% and 70% of the samples from subjects presenting toxocariasis, esquistossomose mansonic, hydatidosis and Chagas disease, respectively, recognized the 71-kDa fraction of ES 180. The ES antigen may contribute to further studies on the complex cysticercosis parasite/host relation as well as for the production of vaccines for swine.

A detecção de antígenos em amostras de líquido cefalorraquiano (LCR) de pacientes com neurocisticercose (NC) foi realizada empregando-se o teste ELISA com soros policlonais de coelhos imunizados com os antígenos total de Taenia solium (T-Tso), líquido vesicular de Taenia crassiceps (LV-Tcra) e peptídeos &#60;30kDa de LV-Tcra. Os soros policlonais foram fracionados para a obtenção da fração IgG - IgG anti-Tso, IgG antiTcra e IgG anti-Tcra&#60;30kDa. Também foi empregado o anticorpo monoclonal específico para o antígeno de excreção e secreção de Taenia crassiceps (ES-Tcra). A seleção dos clones foi realizada por ELISA empregando-se os antígenos T-Tso e LV-Tcra. Foram analisados diferentes grupos de amostras divididos em: grupo de pacientes com NC (grupo NC), incluindo pacientes em diferentes fases evolutivas da doença, grupo de pacientes \"suspeito\" de NC (grupo \"suspeito\" NC), grupo controle (grupo C) e grupo de outros patologias (grupo OP). No teste ELISA empregando-se as frações IgG anti-Tso, IgG anti-Tcra e IgG anti-Tcra&#60;30kDa, a sensibilidade obtida foi de 70%, 82,5% e 95,8% e a especificidade de 82,5%, 98% e 100%, respectivamente nas amostras do grupo NC e grupo C. Nas amostras do grupo diferentes fases evolutivas da doença, não houve diferença significativa de reatividade entre as amostras com as frações empregadas. Para as 21 amostras do grupo NC - fase ativa da doença, com a fração IgG anti-Tcra e o anticorpo monoclonal anti-ES-Tcra, respectivamente, 13 e 16 amostras foram positivas para a pesquisa de antígenos. As amostras de LCR do grupo C não apresentaram reatividade com os anticorpos empregados nos ensaios. Também foram ensaiadas 68 amostras de LCR de pacientes com \"suspeita\" de NC. De acordo com as características citoprotéicas além da reatividade para a pesquisa de anticorpos anti-T solium, as amostras de LCR apresentaram, neste grupo, padrão de reatividade para a pesquisa de antígenos que variou também de acordo com a presença de anticorpos, além das alterações de proteína e/ou células, que as amostras apresentavam ou não. Frações de 14 e 18kDa foram identificadas pelo teste imunoblot somente nas amostras de LCR de pacientes com NC utilizando as frações IgG anti-Tso, IgG anti-Tcra e anticorpo monoclonal anti-ES-Tcra. O anticorpo monoclonal anti-ES-Tcra mostrou-se eficiente para a pesquisa de antígenos no teste de competição por ELISA nas amostras de LCR de pacientes com NC e o antígeno ES-Tcra. / Antigen detection in cerebrospinal fluid (CSF) samples of patients with neurocysticercosis (NC) was performed through ELISA test using rabbits polyclonal sera immune with total antigens of Taenia solium (T-Tso) cysticercus, vesicular liquid of Taenia crassiceps (VL-Tcra) and vesicular liquid peptides (VLP-Tcra&#60;30kDa) cysticercus. The polyclonal sera were separated obtaining IgG-lgG anti-Tso, IgG anti-Tcra and IgG anti-Tcra&#60;30kDa fractions. A specific monoclonal antibody was also applied for reaching the excretion and secretion antigen of the T. crassiceps (ES-Tcra) larvae culture. Clones selection was performed through Elisa test applying the T-Tso and VL-Tcra antigens. When IgG anti-Tso, IgG anti-Tcra and IgG anti-Tcra&#60;30kDa fractions were applied in the ELISA test, the accuracy obtained was 70%, 82,5% and 95,8% and the specificity of 82,5%, 98% and 100%, respectively, in samples of both NC and C groups. In the samples of the group in different stages of the disease there was no significant difference on reactivity between the samples when the fractions were applied. For the 21 samples of the NC group - active stage of the disease with IgG anti-Tcra fraction and the anti-ES-Tcra monoclonal antibody respectively, 13 and 16 samples were positive for antigen analyses. The CSF samples of the C group did not present reactivity with the antibodies applied in the tests. Tests for 68 CSF samples of \"suspected\" NC group, were also conducted. According to the cytoproteic characteristics besides the reactivity for the anti-T. solium antibody study, the CSF samples of this group showed standard reactivity for antigen detection ranging also in accordance with the presence of antibodies and of the protein and/or cell alterations that the samples would or not present. Fractions of 14 and 18kDa were identified by immunoblot test only in the CSF samples of patients with NC using the IgG anti-Tso IgG anti-Tcra fractions and the anti-ES-Tcra monoclonal antibody. The anti-ES-Tcra monoclonal antibody has shown to be efficient for analyzing antigens by a comparing method of the ELISA test in CSF samples of patients with NC and the ES-Tcra antigen.