El objetivo general de esta tesis doctoral es determinar la utilidad de los biomarcadores en la evaluación del estado de masas de agua costeras y de transición afectadas por vertidos dentro del ámbito de la Directiva Marco del Agua. Para ello, se realizaron trasplantes con mejillones en zonas afectadas por diferentes fuentes (difusas y puntuales) y tipos de contaminación (urbana, industrial y portuaria). Se cuantificaron concentraciones de contaminantes en muestras de agua, sedimentos y mejillones. Así mismo, se recogieron mejillones para el análisis de una batería de biomarcadores de efecto y de exposición. Además, se estudió la estructura de la comunidad de invertebrados bentónicos en algunos lugares de estudio. Los biomarcadores indicaron que los mejillones estuvieron expuestos a metales, disruptores endocrinos estrogénicos, compuestos genotóxicos y contaminantes orgánicos en algunos sitios de estudio. Además, los resultados sobre biomarcadores mostraron correlaciones significativas con las concentraciones de contaminantes en el agua y con las comunidades bentónicas. Por lo tanto, el análisis de biomarcadores se propone como un estadio intermedio en la evaluación de los estados químico y ecológico exigidos por la Directiva Marco del Agua. / The general objective of this PhD thesis is to determine the usefulness of the biomarker approach as a complementary tool for the assessment of the effects of a broad range of discharges for the evaluation of the status of coastal and transitional water bodies within the scope of the Water Framework Directive. For this purpose, mussels were transplanted to areas affected by different types of diffuse and point source discharges. Chemical analyses of contaminants were performed in water, sediments and mussel samples. A battery of effect and exposure biomarkers were also performed on mussels. Besides, the structure of the community of benthic invertebrates was analysed in certain study sites. Results on biomarkers indicated that mussels were exposed to metals, estrogenic endocrine disruptors, genotoxic compounds and organic pollutants in some study sites. Besides, results on biomarkers showed significant correlations with concentrations of contaminants in water and with results on benthic communities. Thus, the analysis of biomarkers is proposed as a link between chemical and ecological statuses demanded by Water Framework Directive.

a. Introduction The immune system must detect a wide variety of agents, from viruses to parasitic worms, and distinguish them from the organism's own healthy tissue. However, the immune system needs to be well regulated since a disorder in an immune response can result in autoimmune diseases, tissue destruction, inflammatory diseases and cancer. Within the context of innate immunity, the mononuclear phagocyte system, cells comprising bone marrow progenitors, blood monocytes and tissue macrophages is acquiring great importance in the study of different pathologies and particularly the monocytes/macrophage functions. In this regard, recent studies demonstrate that monocytes present a heterogeneous population of innate cells. Monocyte was found leading to distinct cell populations with various subtypes with distinct functions. Two types of monocytes were identified in mice. Resident monocytes, with a CD11b+CCR2lowLy-6ClowCX3CR1high phenotype, migrate to uninjured tissues after emigration from bone marrow and differentiate into resident macrophages and dendritic cells. In contrast, a distinct inflamed monocyte subset with a CD11b+CCR2highLy-6ChighCX3CR1low phenotype infiltrates infected tissue and contributes to the development of inflammation. Currently, all studies performed with monocytes are done in transgenic models (i.e. CCR2-/-; GPF-CX3CR1 models) or with expensive techniques to study and acquire the maximum number of cell possible from mice blood. Monocytes constitute around 2% (100cells/μl) of the total peripheral blood leukocyte pool in mice, where only 1-5% are Ly-6Chigh monocytes. What makes difficult to study it. b. Objective 1. Development of an in vitro model that allow the generation of large amounts of Ly-6Chigh monocytes from bone marrow from mice. 2. Characterization of the phenotype of Ly-6Chigh monocyte generated in vitro. 3. Analyze the activation function of Ly-6Chigh monocyte generated in vitro. 4. Study the migration of Ly-6Chigh monocytes in to two inflammation models: - Skin (DNFB model) - Muscle (Notexin muscle model) 5. Analyze the therapeutic effect of Ly-6ChighCD11b+ monocytes injection in the resolution of inflammation in two experimental models of inflammation. c. Methodology and Results To achieve the first aim of our work, bone marrow cells were cultured with different grows factors and FCS at 37ºC in a humidified 5% CO2 atmosphere for 7 days when the population of floating cells was obtained and stained with Ly-6C and CD11b markers. This population was sorted for the acquirement of the Ly-6ChighCD11b+ cells. In order to characterize the phenotype of these cells we stained them with several markers. Our results demonstrated that this Ly-6Chigh enriched population is CD11b+CD62L+CCR2+ F4/80+CX3CR1low, presenting the same phenotype of the cells presents in the blood. To study the functional heterogeneity of enriched Ly-6Chigh cells, these cells were incubated with IFN-γ as typical classical stimuli and IL-4 as an alternative pathway stimulus. Ly-6Chigh cells incubated with IFN induced the expression of TNF and NOS2 with a characterized kinetics similar to macrophages. However, these cells increased arginase-1 levels when were stimulated with IL-4. Thus, the in vitro results have shown the plasticity and heterogeneity of monocytes as previously described by macrophages and thus, suggests us that these cells can also adapt to changing microenvironments as previously described. Further, to observe the migration capacity and functionality of these cells in vivo, we optimized two experimental model of inflammation. In the first model an ear skin irritation with 1%DNFB was induced. In the second model, muscle inflammation was developed by the injection of Notexin in the tibialis anterioris. In both models inflammation was induced and Ly-6Chigh enriched cells stained with an infrared fluorocrome were injected intravenous in mice and migration was observed by in vivo image at different days. Migratory capacity of Ly-6C cells to the inflamed tissues was appreciated in both models, corroborating with data previously described. To analyze the therapeutic effect of Ly-6ChighCD11b+ monocytes injection in the resolution of inflammation, RNA and histology cuts were obtained from both models. The results showed that Ly-6Chigh-injected mice express higher levels of anti-inflammatory genes such as mannose receptor, which corroborate with the histological images where animals treated with Ly-6Chigh cells recover before of the inflammatory process that untreated animals. d. Conclusion 1. We established a novel in vitro protocol to generate Ly-6ChighCD11b+ monocyte obtained from bone marrow of Balb/C mice. 2. The cells generated in vitro have the same phenotype of the Ly-6C from blood flow. 3. Cells Ly-6ChighCD11b+ monocyte present high plasticyty. 4. Ly-6ChighCD11b+ monocytes generated in vitro migrate in vivo. 5. Injection in acute and chronic in vivo inflammatory models of Ly-6ChighCD11b+ monocytes generated in vitro, display an improvement in the site of inflammation through the presentation of a more anti-inflammatory profile. / Monocitos circulantes proporcionan una defensa contra las infecciones y también a enfermedades autoinmunes. Recientemente dos tipos de monocitos fueran identificaron en la sangre periférica de ratones. El monocito ¿residente¿ con fenotipo CD11b+CCR2lowLy-6ClowCX3CR1high, que migran a tejidos no lesionados y se diferencian en macrófagos residentes y células dendríticas (DC). En contraste, un subconjunto distinto conocido como monocitos ¿inflamatorios¿, con un fenotipo CD11b+CCR2highLy-6ChighCX3CR1low son células que migran al tejido infectado y en lo cual contribuye al desarrollo de la inflamación. Monocitos Ly-6Chigh, el objetivo de nuestro trabajo, representan un 2-5% de los monocitos del torrente sanguínea de los ratones. Dado que estas células son de difícil obtención y que la cantidad obtenida de la sangre de ratones es muy baja, nuestro grupo desarrolló un nuevo sistema para generar monocitos Ly-6Chigh in vitro a partir de médula ósea de ratón, con el objetivo de estudiar sus funciones in vivo en dos modelos animales de inflamación. Nuestro laboratorio ha optimizado dos modelos animales capaces de inducir inflamación local en ratones Balb/c, inmunocompetentes. En el primer modelo, 1-fluoro-2 ,4-dinitrobenceno (DNFB) se aplicó tópicamente en la oreja derecha para crear en la piel condiciones que inducen la migración de estas células para el sitio de la irritación (modelo DNFB). En este modelo de piel, la inflamación en la oreja fue calculada atreves del peso neto, donde el peso de la oreja izquierda es restado del peso de la oreja derecha después de 24h y 48h de la inyección intravenosa (iv) de los monocitos Ly-6ChighCD11b+ en los ratones. En el segundo modelo, la inflamación es inducida atreves de la aplicación de una inyección de Notexin en el tibial anterior (TA) de la pierna derecha del animal la cual induce una inflamación muscular (modelo Notexin). Finalmente en ambos modelos, monocitos Ly-6ChighCD11b+ generados in vitro pre-tratados in vitro con citocinas pro- o anti-inflamatoria (IFN-¿ o IL-4) o no tratados, fueran inyectados iv en la colas de los ratones. Por otra parte, expresión génica fue medida mediante PCR cuantitativa en tiempo real, la migración celular fue evaluada in vivo atreves de imágenes realizadas por el equipo de IVIS, estudios de citometría de flujo y ensayos de histología también fueran realizados para evaluar la función de las células Ly-6Chigh en el sitio de inflamación. El principal objetivo de nuestro estudio es: 1. Desarrollo de un modelo in vitro que permita generar grandes cantidades de monocitos Ly-6Chigh a partir de médula ósea de ratones. 2. Caracterización del fenotipo de los monocitos Ly-6Chigh generados in vitro. 3. Analizar funciones de los monocitos Ly-6Chigh generados in vitro tras su activación in vitro. 4. Estudio de la capacidad migratoria de los monocitos Ly-6Chigh generados in vitro en dos modelos de inflamación. - Piel (modelo de DNFB en oreja). - Músculo (modelo Notexin muscular). 5. Analizar el efecto terapéutico de la inyección de monocitos Ly-6Chigh generados in vitro en la resolución de la inflamación en dos modelos experimentales de inflamación. En ambos modelos animales la inflamación local aumentó en función del número de monocitos Ly-6Chigh inyectados. Migración celular fue analizada por imágenes in vivo en ambos modelos, donde células Ly-6Chigh generated in vitro fluorescentes estaban presentes apenas en el tejido inflamado. Análisis de hematoxilina y eosina en cortes histológicos demostraron una mejoría del tejido de los animales tratados con monocitos Ly6Chigh. En resumen, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral revelar un nuevo método para generar in vitro Ly-6Chigh monocitos de médula ósea de ratones, con una mejora en la eficiencia de la producción celular, que facilitan el estudio de estas células in vitro e in vivo. Además, también han demostrado la capacidad de las células Ly-6Chigh para cambiar el fenotipo de la estimulación in vitro verdadera y la capacidad de migrar, así como la heterogeneidad funcional en dos modelos de inflamación in vivo, lo que indica que estas células accionar de la misma manera como se las células proveniente de la sangre periférica. Además, hemos demostrado que Ly-6Chigh monocitos pueden ser pre-tratados con citoquinas en orther para retrasar o aumentar la reparación de tejidos (IFN-¿ o IL-4), respectivamente Todos estos resultados juntos sugieren que los monocitos Ly-6Chigh generado por nosotros in vitro son células funcionales que se pueden utilizar como una herramienta terapéutica para tratar enfermedades inflamatorias.

El síndrome de Down constituye la cromosomopatía más frecuente que ocurre en uno de cada 700 a 1000 nacimientos y está causado por la trisomía completa o por una parte del cromosoma 21 humano (HSA21). Aún se desconoce cómo la presencia del cromosoma 21 extra da lugar al fenotipo característico de este síndrome. En este sentido la participación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) ha sido propuesta como uno de los mecanismos que intervienen en la patogénesis del mismo. Dicho mecanismo se fundamenta en la sobreexpresión de al menos 16 genes del HSA21 relacionados con el metabolismo de las especies reactivas de oxígeno (ROS) y con la generación de energía mitocondrial. Uno de estos genes es el que codifica una importante enzima del sistema antioxidante celular, el gen SOD1, propuesto como potencial culpable del estrés oxidativo inusual en los individuos con SD. En condiciones normales, los ROS, producidos in vivo principalmente por la respiración aeróbica, se eliminan de la célula por la acción de las enzimas antioxidantes, superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPx). La Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD1) convierte el radical superóxido a peróxido de hidrógeno, el cual es eliminado por la glutatión peroxidasa y/o catalasa a agua y oxígeno. La sobreexpresión de la SOD1 puede producir un desequilibrio en la relación de las enzimas antioxidantes (SOD1, GPx y CAT) generando estrés oxidativo y podría resultar en el daño oxidativo a biomoléculas tales como ácidos grasos poliinsaturados en los lípidos de las membranas, proteínas esenciales y el DNA, ya que existe una variabilidad en los niveles de enzimas antioxidantes dentro de la población con SD, lo que puede estar relacionado con una desregulación compleja que afecte no sólo a los genes del HSA21 sino también en otros cromosomas. Así, el daño celular puede ser inducido por los ROS y asociarse a algunas de las alteraciones celulares en el SD, causando diversas patologías y conducir a un envejecimiento prematuro. Se obtuvieron 18 muestras de fibroblastos primarios fetales humanos, 9 de ellos con síndrome de Down (FT21) y 9 controles (FC), en los cuales se evaluó la disminución de la capacidad endógena antioxidante debido a la sobreexpresión de la SOD1, causando un exceso en la producción intracelular de ROS y el origen prematuro de estrés oxidativo asociado al daño oxidativo a lípidos y proteínas, así como a una disfunción mitocondrial. Se analizaron varios marcadores de senescencia celular con la finalidad de contribuir al conocimiento de un nuevo aspecto de la patología de este síndrome, el envejecimiento prematuro. Estos mecanismos fisiopatológicos podrían estar relacionados con la aparición y establecimiento de la senescencia celular prematura en los fibroblastos con trisomía del cromosoma 21 (FT21). / Down syndrome is the most common chromosomal disorder that occurs in 1 in 700 to 1,000 births and is caused by trisomy full or part of human chromosome 21 (HSA21). It is still unknown how the presence of the extra chromosome 21 results in the phenotype of this syndrome. In this sense the involvement of reactive oxygen species (ROS) has been proposed as one of the mechanisms involved in the pathogenesis of same. This mechanism is based on the overexpression of at least 16 genes related HSA21 metabolism of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial energy generation. One of these genes encoding is an important cellular antioxidant enzyme system, the SOD1 gene, proposed as a potential culprit unusual oxidative stress in individuals with DS. Under normal conditions, the ROS produced in vivo mainly by aerobic respiration of the cells are removed by the action of antioxidant enzymes, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx). The Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) converts the superoxide radical to hydrogen peroxide, which is eliminated by glutathione peroxidase and/or catalase into water and oxygen. SOD1 overexpression can produce an imbalance in the ratio of antioxidant enzymes (SOD1, GPx and CAT) generating oxidative stress and may result in oxidative damage to biomolecules such as polyunsaturated fatty acids in the membrane lipids, proteins and essential DNA, since there is a variability in the levels of antioxidant enzymes in the DS population, which can be related to a complex deregulation affects not only Hsa21 genes but also on other chromosomes. Thus, cell damage can be induced by ROS and associated with some of the cellular changes in the DS, causing various diseases and lead to premature aging. Eighteen samples were obtained from primary human fetal fibroblasts, 9 with Down syndrome (TF21) and 9 normal (NF), which was evaluated in decreasing endogenous antioxidant capacity due to overexpression of the SOD1, causing excess in intracellular production of ROS and oxidative stress origin associated premature oxidative damage to lipids and proteins, as well as mitochondrial dysfunction. We analyzed several markers of cellular senescence in order to contribute to the knowledge of a new aspect of the pathology of this syndrome, premature aging. These pathophysiological mechanisms may be related to the emergence and development of premature cellular senescence in fibroblasts with trisomy 21 (FT21).

Las neuronas son muy vulnerables al estrés genotóxico. Esta vulnerabilidad es particularmente relevante en las neuronas ganglionares sensitivas (NGS) dado que los ganglios carecen de barrera hematoencefálica que impida el acceso de agentes genotóxicos, como determinados fármacos utilizados en la quimioterapia del cáncer. Tales agentes producen un efecto neurotóxico que se traduce en neuropatías periféricas. Nuestro estudio analiza las bases celulares de la neurotoxicidad en las NGS en dos modelos experimentales, el tratamiento con radiaciones ionizantes (RI, 4 Gy) y la inhibición del proteasoma con Bortezomib, fármaco utilizado en la terapia del mieloma múltiple Nuestros resultados demuestran que las RI inducen daño de la doble cadena del DNA que dispara la vía de señalización y reparación del DNA. Se forman dos tipos de focos de lesión del DNA, transitorios, que se reparan en las primeras 24 horas, y permanentes de DNA no reparado. Las RI inducen también la reentrada en ciclo (transición G0-G1) e inhibición transcripcional transitoria. El tratamiento con bortezomib produce daño en el DNA y cromatolisis central con severa inhibición de la traducción. Como mecanismo compensatorio estas neuronas activan la transcripción nucleolar y mantienen un dominio perinuclear de síntesis de proteínas. Estas alteraciones claramente indican que la disfunción neuronal representa un componente esencial de la neuropatía periférica inducida por el Bortezomib. / Neurons are highly vulnerable to genotoxic stress. This vulnerability is particularly relevant in sensory ganglion neurons (SGN) since ganglia lacks of blood-brain barrier that prevents the access of genotoxic agents, such as certain drugs used in cancer chemotherapy. Such agents produce a neurotoxic effect resulting in peripheral neuropathies. Our study analyzes the cellular basis of neurotoxicity in SGN using two experimental models: treatment with ionizing radiation (IR, 4Gy) and proteasome inhibition with Bortezomib, a drug used in the therapy of multiple myeloma. Our results demonstrate that IR induces DNA double strand breaks, which triggers the signaling pathway and DNA repair. Two types of DNA damage foci are formed, transient, which are repaired within 24 hours, and permanent foci of unrepaired DNA. The IR also induces reentry in the cell cycle (G0-G1 transition) and transient transcriptional inhibition. Treatment with Bortezomib causes DNA damage and central chromatolysis with severe inhibition of translation. As a compensatory mechanism, SGN activate nucleolar transcription and maintain a perinuclear domain of protein synthesis. These changes support that neuronal dysfunction is an essential component of the Bortezomib-induced peripheral neuropathy in patients

La proporción de sexos está distribuida de forma equilibrada en la mayor parte de las especies, y generalmente está determinada por el sexo heterogamético. En mamíferos, los ovocitos producidos por las hembras mantienen siempre la misma carga cromosómica sexual (cromosoma “X”), y son los machos, con una dotación cromosómica distinta en sus gametos (cromosomas “X” e “Y”) los que determinan el sexo. Durante la espermatogénesis se produce igual cantidad de gametos portadores del cromosoma “X” e “Y”, por lo que la probabilidad de tener una cría macho o una cría hembra por cada evento de fecundación en especies monotocas o politocas sería del 50%. Sin embargo, los datos obtenidos por los registros en muchas especies nos muestran que no siempre la proporción de los sexos es equilibrada al 50%. En la literatura se han descrito muchos factores que podrían tener influencia directa o indirecta en el desequilibrio de la proporción de sexos. A pesar de ello, hasta la fecha se desconocen con precisión los mecanismos por los cuales se produce este fenómeno. Objetivo: La presente tesis propone analizar distintos factores y posibles mecanismos que pueden estar relacionados con la proporción de sexos. Metodología: En nuestro estudio, utilizamos un modelo ratón transgénico que posee una secuencia marcadora integrada en el cromosoma “X”, y hemos analizado en primer lugar la posible distorsión primaria y secundaria del sexo debida a la presencia del transgén. Así como la calidad embrionaria medida en número de células del blastocisto. Analizamos el efecto de la dieta durante los periodos de pre-implantación y post-implantación, tomando en consideración la lateralidad (origen ovárico o uterino). Se estudiaron las relaciones que existen entre la ovariectomía y la compensación hormonal ovárica, la proporción del sexo y la posición adoptada en el útero por cada uno de los sexos. Se analizó si existía una relación entre la velocidad de desarrollo pre-implantacional (segunda división mitótica embrionaria y posterior desarrollo a blastocisto) y la calidad y el sexo de los embriones producidos in vivo. Resultados y Discusión: En el capítulo I. Se observó que esta modificación genética, no alteraba las proporciones primaria ni secundaria de sexos, ni el número celular de embriones pre-implantacionales, y debido a ello, consideramos el factor transgénico como no determinante en la proporción de los sexos. En el capítulo II se encontraron diferencias de proporción del sexo cuando se registraron los datos del lado de procedencia (derecho o izquierdo), principalmente en estadios cercanos al momento de la fecundación, y en ratonas de menor constitución física. Estas diferencias se correlacionan con la perdida embrionaria y dejan de ser significativas cuando se observaban estas proporciones de manera global. En el capítulo III, no se encontraron diferencias en las proporciones de machos y hembras entre las hemi-ovariectomías derecha e izquierda. Sin embargo los resultados muestran una preferencia de las hembras a implantar en secciones uterinas cercanas al cérvix, siendo estas hembras de un peso inferior al resto de hembras implantadas en otras secciones del útero. Por último, en el capítulo IV, nuestros resultados no indican una diferencia de la proporción del sexo en los embriones recuperados en el paso de 2 a 3 células, ni tampoco en la velocidad de desarrollo a blastocisto. Solamente se observó una mayor proporción de hembras en los embriones que más lentamente se dividían a 3 células y posteriormente tardaban más en llegar al estadio de blastocisto. También se observó una relación entre la calidad embrionaria definida por la expresión de marcadores de pluripotencia y la velocidad de división pre-implantacional. / Sex ratio is equally distributed in most species, and it is generally determined by the heterogametic sex. In mammals, oocytes produced by females always keep the same chromosomal sex (chromosome “X”); however, the males, with a different chromosome in their gametes (chromosomes “X” and “Y”)determine the sex. During spermatogenesis, equal number of gametes carrying the chromosome “X” and “Y” is produced. According to Mendelian’s genetic, the chance of breeding a male or a female pup per fertilization event in polytocous and monotocous species would be 50%. However, the data obtained in many species show that not always the sex ratio is balanced at 50%. In the literature, many factors that could have a direct or indirect influence on the imbalance of the sex ratio have been described. However, the precise mechanism by which this phenomenon occurs is still unknown. Objetive: This thesis aims to analyze various factors and possible mechanisms that may be related to the sex ratio. Methods: In our study, we used a transgenic mouse model that presents a marker sequence integrated in the “X” chromosome, and we first analyzed the possible primary and secondary sex distortion due to the presence of the transgene, as well as embryo quality measured by the number of cells of the blastocyst. We analyzed the effect of diet during pre-implantation and post-implantation periods, considering laterality (ovarian or uterine origin). The relationship between ovariectomy and ovarian hormonal balance, sex proportion and position in the uterus for each of the sexes were studied. We analyzed whether there was a relationship between the rate of preimplantation development (second mitotic division and subsequent embryo development to blastocyst) and the quality and sex of embryos produced in vivo. Results and discussion: In chapter I, It was noted that this genetic modification did not alter the sex ratio primary or secondary, or cell number of pre-implantation embryos, and because of this, we considered the transgenic factor as non-determinant in the sex ratio. In Chapter II, differences in sex ratio were found when the data of the source side (right or left) were recorded, mainly in stages near to the time of fertilization, and in mice with minor physical condition. These differences were correlated with embryonic loss and were not significantly different when these ratios were observed globally. In Chapter III, no differences in the proportions of males and females between the right and left hemi-ovariectomy were found. However, the results showed that females had a tendency to implant in sections close to uterine cervix, presenting a lower weight than those females implanted elsewhere in the uterus. Finally, in Chapter IV, our results do not show a difference in the sex ratio in embryos recovered in the 2 to 3-cells stage, nor on the rate of development to blastocyst. It was only observed a higher proportion of females in embryos that arrived to the 3-cell stage the slowest and subsequently took longer to reach the blastocyst stage. A relationship between the embryo quality defined by the expression of markers of pluripotency and by the preimplantation speed division was also observed.