A leprose é uma das principais doenças na citricultura brasileira devido à sua ocorrência difundida nos pomares e aos altos custos para o controle químico do ácaro vetor. A doença compromete a produção da planta e sua vida útil, manifestando-se através de lesões locais cloróticas ou necróticas em folhas, ramos e frutos, levando à queda prematura destes órgãos e à seca de ramos. O patógeno, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recentemente classificado como espécie tipo de um novo gênero de vírus de planta, Cilevirus, é transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis (Geijskes). Apesar de haver consenso de que a doença tem etiologia viral, ainda existem muitas questões pendentes sobre as interações vírus-planta-vetor, cujas soluções contribuirão para o controle integrado da doença. O presente trabalho teve como objetivo obter informações sobre a interação do vírus com células hospedeiras através de ensaios de imunolocalização das proteínas MP (putativa proteína de movimento), helicase (associada à replicação) e p29 (putativa proteína capsidial) do CiLV-C. Para tal, as sequências codificadoras das ORFs mp e hel foram amplificadas via RT-PCR e clonadas em vetor de expressão. Em seguida, promoveu-se a expressão in vitro das respectivas proteínas em células de E. coli e purificação por cromatografia de afinidade e troca iônica. A proteína MP pura foi utilizada para produção de antissoro policlonal específico que foi testado quanto à especificidade por métodos sorológicos. Os resultados do ELISA mostraram que o antissoro apresentou reação positiva com extratos foliares de lesões lepróticas em todos os estágios de desenvolvimento da doença, quando utilizado em altas concentrações. Além disso, lesões maduras reagiram mais intensamente que lesões mais novas. Por Western Blot, detectou-se somente a proteína pura, não sendo possível obter reação positiva em extrato de lesões foliares. Também não foi possível detectar a MP por imunolocalização in situ. Os resultados em conjunto sugerem que ocorre baixo nível de expressão da MP nos tecidos do hospedeiro. Empregando-se anticorpo policlonal contra proteína p29 do CiLV-C, foi possível detectar o CiLV-C em extratos de lesões foliares de leprose por ambos os métodos sorológicos testados e também por Tissue Blotting. Ensaios de imunolocalização in situ permitiram confirmar que as partículas baciliformes presentes em cisternas do retículo endoplasmático de tecidos de lesões lepróticas em plantas representam de fato vírions do CiLV-C. Além disso, também demonstrou-se que o viroplasma que ocorre no citoplasma representa o sítio de acúmulo da proteína p29. Este mesmo ensaio revelou que partículas baciliformes que ocorrem entre membranas de células adjacentes (intestino médio, glândulas prosomais, músculos e epiderme) de B. phoenicis virulíferos são de fato do CiLV-C. A ausência de viroplasma no ácaro sugere que a relação vírus/vetor seria do tipo circulativo, sem replicação. Baseado neste fato discutem-se alternativas para explicar como o vírus trafegaria do lúmen do intestino até o duto salivar para causar infecção numa planta sadia. / Citrus leprosis is one of the most important diseases in the Brazilian citrus production due to the wide occurrence in orchards and also to the high costs involved in the chemical control of the mite vector. The disease affects the plant production and longevity and it is characterized by localized chlorotic and/or necrotic spots on the leaves, stems and fruits. Affected leaves and fruits may drop prematurely and dieback can be observed in stems. The pathogen, Citrus leprosis virus C (CiLV-C), recently considered as the type member of a new genus, Cilevirus, is transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis Geijskes. Despite the consensus that citrus leprosis has viral etiology, there are many pending questions regarding the viral interactions with the infected plant and the viruliferous mites. The solution of these questions may contribute to a better disease integrated management. This work aimed to obtain a better understanding about the virus-plant-vector relationship with the host cell by immunolocalization assays of the putative movement protein (MP), helicase (protein involved in the viral replication) and p29 (putative coat protein) of the CiLV-C. ORFs coding sequences of mp and hel was amplified by RT-PCR and cloned in the expression vector. Afterwards, in vitro expression of these proteins in E. coli and its purification by affinity chromatography were realized. The purified MP was used to produce specific polyclonal antibody that was tested for specificity by serological methods. The ELISA results showed that high concentration antibody reacted with the leaves extracts from lesions in all the disease stage of development. Furthermore, the old lesions reacted more intensely than the younger. Western blot (which detected only the pure protein) and in situ immunolocalization assays failed to detect the native MP in lesioned leave extracts. The results as a hole suggest the occurrence of low expression of MP in host tissue. The polyclonal antibody against p29 was able to detect the virus in lesioned plant extracts by PTA-ELISA, Western Blot, and Tissue Blotting. The viral nature of the putative viral particles, present within endoplasmic reticulum cisternae of infected leaf tissue, was confirmed by immunogold label. The labeling also occurred intensely in the viroplasmas, indicating that these structures represent p29 protein accumulation site. Putative virus particles, visualized in viruliferous B. phoenicis, between membranes of adjacent cells (midgut, prosomal glands, epidermis, muscles), was also immunogold labeled indicating that they represent CiLV-C. The absence of viroplasma in the mite tissues suggests that CiLV-C / B. phoenicis relationship is of the circulative type, without replication. Based on this finding, we search for possible alternatives for the viral circulation in the mite body from the midgut lumen to the salivary duct for the infection of a healthy plant to occur.

A hibridação somática de citros tem sido extensivamente aplicada, favorecendo o desenvolvimento de híbridos somáticos em programas de melhoramento genético, como fonte de germoplasma ou como variedades copa e porta-enxerto. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de selecionar plantas de toranja (Citrus grandis L. Osbeck) tolerantes à Phytophthora sp. e utilizá-las como parentais no processo de hibridação somática com outras espécies do gênero Citrus, a fim de produzir híbridos somáticos para o melhoramento de porta-enxertos. Plantas de 20 variedades de toranja tolerantes à Phytophthora spp. foram selecionadas, após serem cultivadas em solo infestado. Experimentos de fusão de protoplastos foram realizados envolvendo laranjas doces, tangerinas e o tangor ‘Murcote’, como parentais embriogênicos, e variedades de toranja selecionadas e plantas enxertadas de 12 variedades de toranja, como parentais não-embriogênicos, utilizando-se a técnica de fusão química, via polietilenoglicol (PEG). Microcolônias foram transferidas para meio de cultura MT semi-sólido, suplementado com 500 mg.l -1 de extrato de malte para indução da embriogênese somática. A confirmação da hibridação somática das plantas regeneradas e aclimatizadas foi realizada por meio de análises de morfologia foliar, de citologia, pela contagem do número de cromossomos, e moleculares, por marcadores do tipo RAPD. As metodologias utilizadas para seleção de plantas matrizes, fusão de protoplastos, regeneração de plantas e confirmação da hibridação somática foram adequadas, e permitiram a obtenção de híbridos somáticos de laranja ‘Hamlin’ com toranja enxertada ‘Indian Red’ e com ‘seedling’ selecionado de toranja ‘Singapura’, que apresentam potencial para serem incorporados em programas de melhoramento de porta-enxertos. / Citrus somatic hybridization has been extensively applied assisting the development of the somatic hybrids which can be used in improvement programs, indirectly as germoplasm source or directly as scion and rootstock varieties. In this context, this research was developed with the objective of selecting plants of pummelo (C. grandis L. Osb) tolerant to Phytophthora sp. and use these plants as parents in the somatic hybridization process with other species of Citrus. Plants of 20 pummelo varieties, tolerant to Phytophthora sp., were selected after being grown in infested soil. Protoplast fusion experiments were induced by chemical method, with polyethylene glicol (PEG), involving sweet oranges, mandarins and Murcott tangor, as embryogenic parents, selected pummelo varieties and grafted plants of 12 pummelo varieties, as non-embryogenic parents. Microcolonies were transferred to EME semi-solid MT containing 500 mg.l -1 of malt extract for somatic embryogenesis. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, citology by chromosome counting and molecular analysis by RAPD markers. The protocols used to select plants to be used as protoplast source, protoplast fusion, plant regeneration and somatic hybridization confirmation were adequate, allowing to produce somatic hybrids of Hamlin sweet orange with Indian Red grafted pummelo and Singapura pummelo selected seedling, which may be used as rootstocks and incorporated in rootstocks improvement programs.

O Brasil é o maior produtor mundial de citros e também o maior produtor e exportador de suco de laranja concentrado congelado, principal produto da cadeia citrícola. A citricultura brasileira convencional é uma das culturas que mais emprega agroquímicos. Como alternativa ao sistema de produção convencional, propiciando menor agressão ao meio ambiente, a citricultura orgânica oferece ao consumidor um alimento mais seguro à saúde. Objetivando discriminar os citros orgânicos dos citros convencionais, avaliou-se a composição química elementar de laranjas provenientes dos dois sistemas de produção pela análise por ativação neutrônica instrumental (INAA). O experimento foi realizado em pomares cítricos de duas fazendas sob sistema de cultivo orgânico e sistema de cultivo convencional na região de Bebedouro-SP. Selecionou-se a variedade Valência (Citrus sinensis L. Osbeck) enxertada sobre limão cravo (Citrus limonia Osbeck), encontrada nos principais países produtores de citros. Amostraram-se 30 plantas em cada sistema de cultivo, sendo coletados folhas, frutos e solos. Amostras de calda sulfocálcica foram analisadas para verificar sua influência na composição química de frutos e folhas do sistema de produção orgânico. Foram também adquiridas no varejo 14 amostras de sucos de laranjas comerciais orgânicos e convencionais. As amostras de sucos foram liofilizadas e as folhas lavadas, secas em estufa e pulverizadas em moinho orbital de alumina. Os solos foram secos em estufa e moídos em gral de porcelana. As amostras foram irradiadas no reator nuclear de pesquisa do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/CNEN), São Paulo. A radioatividade induzida foi medida em detectores semicondutores de germânio hiperpuro no Laboratório de Radioisótopos (LRi) do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP) por espectrometria gama de alta resolução. As concentrações dos elementos químicos foram calculadas pelo método k0. A avaliação dos espectros e os cálculos das concentrações foram realizados pelo programa de computador Quantu. Empregaram-se as técnicas de análise estatística de caráter univariado e multivariado buscando discriminar citros orgânicos de citros convencionais. Determinaram-se os elementos As, Br, Ce, Co, Cr, Cs, Eu, Fe, Hf, K, La, Na, Nd, Sc, Sm, Ta, Tb, Th, U, Yb e Zn nas amostras de solo; os elementos Ba, Br, Ca, Ce, Co, Cs, Eu, Fe, K, La, Na, Nd, Rb, Sc, Sm, Sr, Tb, Th, Yb e Zn nas amostras de folhas e os elementos Br, Ca, Co, Cs, Fe, K, La, Na, Rb e Zn nas amostras de sucos. Os elementos Br, Ca, Co, Cs, La e Rb foram os discriminantes potenciais para as amostras de folhas e sucos dos sistemas de produção orgânico e convencional. Contudo, Br foi o melhor discriminante tanto para amostras de sucos provenientes das fazendas do presente estudo como para sucos comerciais. / Brazil is the world largest producer of citrus and the largest producer and exporter of frozen concentrated orange juice, the principal product of the citrus chain. The Brazilian conventional citriculture is one of the most sprayed culture with agrochemicals. The organic citriculture is an alternative production system, with respect to the environment and offering consumers a safe food. Aiming at discriminating organic citrus from conventional citrus, the elemental composition of oranges from two production systems was evaluated by instrumental neutron activation analysis (INAA). A comprehensive sampling of two citrus farms having different production system, organic and conventional, was carried out in the Bebedouro region, state of São Paulo. The variety Valencia (Citrus sinensis L. Osbeck) budded on Rangpur lime (C. limonia Osbeck) was selected due to its wide distribution in the producing countries. Thirty orange trees of each production system (conventional and organic) were sampled for leaves, fruits and soils. Fourteen samples of retail commercial orange juices (organic and conventional) were purchased. Samples of lime sulfur were analyzed to investigate the influence on the elemental composition of organic fruits and leaves. Sample preparation included freeze-drying for juices, washing, oven-drying and grinding in alumina mill for leaves and oven-drying and grinding in mortar pistle for soils. The samples were irradiated in the nuclear research reactor IEA-R1m of the Nuclear and Energetic Research Institute (IPEN/CNEN), São Paulo. The induced radioactivity was measured with germanium detectors at the Radioisotopes Laboratory (LRi) of the Nuclear Energy Center for Agriculture (CENA/USP) by high-resolution gamma ray spectrometry. Elemental concentrations were calculated by the k0-method with an in-house software package. The difference between the two production systems was evidenced by multivariate and univariate analysis. The elements As, Br, Ce, Co, Cr, Cs, Eu, Fe, Hf, K, La, Na, Nd, Sc, Sm, Ta, Tb, Th, U, Yb and Zn were determined for soil samples; Ba, Br, Ca, Ce, Co, Cs, Eu, Fe, K, La, Na, Nd, Rb, Sc, Sm, Sr, Tb, Th, Yb and Zn for leaves samples and Br, Ca, Co, Cs, Fe, K, La, Na, Rb and Zn for juice samples. Br, Ca, Co, Cs, La and Rb were the key elements for separating samples (leaves and juices) of organic and conventional oranges. Br has proven to be the best discriminator either for the orange juices from the farms of the present study and the commercial orange juices.

A interação bactéria-planta é um processo complexo que envolve diversos fatores bióticos e abióticos, podendo resultar em interações neutras, benéficas ou patogênicas. O gênero Methylobacterium tem sido descrito como endófito em diferentes plantas hospedeiras, podendo beneficiá-las por meio da promoção de crescimento vegetal e do controle de fitopatógenos. Em citros, este endófito coloniza o mesmo nicho que patógenos, e, assim, muitas espécies desse gênero são interessantes candidatas ao controle simbiótico contra Xylella fastidiosa. É conhecido que o processo de interação Methylobacterium-bactéria é coordenado por genes cuja expressão é regulada pelo sistema Quorum Sensing (QS), o qual utiliza N-acil-homoserina lactonas (AHLs) como moléculas sinalizadoras, importantes, entre outras coisas, para a formação de biofilme, encontrado em muitas plantas como estratégia de colonização bacteriana. No entanto, os mecanismos envolvidos na interação Methylobacterium-planta são ainda pouco compreendidos. Dessa forma, o presente trabalho buscou estudar, de diferentes maneiras, a interação entre Methylobacterium spp. e citros, avaliando os efeitos dessas bactérias sobre o crescimento de plântulas e a variação da expressão gênica. Neste contexto, foi verificado que a especificidade da interação bactéria-planta e a escolha do método de inoculação das bactérias são importantes para a geração de resultados benéficos sobre a germinação de sementes e o desenvolvimento da planta hospedeira. Possivelmente, a produção de AIA e a fixação biológica de nitrogênio foram os mecanismos envolvidos na promoção de crescimento de citros por Methylobacterium spp. neste estudo. Com relação à origem, essas bactérias parecem ser transmitidas horizontalmente em plantas cítricas. Visando empregar Methylobacterium spp. no controle de fitopatógenos em citros, M. extorquens AR1.6/2 foi geneticamente modificada para expressar uma endoglicanase A (EglA). Por meio de microscopia eletrônica de varredura, foi verificado que a bactéria modificada colonizou a superfície e o interior de Catharanthus roseus, planta modelo para experimentos com bactérias endofíticas e X. fastidiosa. Além disso, quando inoculada junto com X. fastidiosa, essas bactérias compartilharam o xilema das plântulas, sugerindo que durante a colonização e estabelecimento no hospedeiro estas bactérias poderiam interagir. Estudando a ação de uma AHL sobre a expressão de genes envolvidos na interação entre M. mesophilicum SR1.6/6-planta, foi observado que a presença dessa molécula foi importante na ativação da expressão dos genes mxaF, relacionado ao estabelecimento e metabolismo metilotrófico da bactéria; pat, relacionado a vantagens adaptativas e competitivas durante a colonização da planta; e acdS, envolvido com o metabolismo bacteriano e modulação de níveis hormonais na planta. A expressão dos genes crtI e sss, envolvidos com respostas a estresse e transporte de compostos, respectivamente, e do gene phoU, relacionado com patogenicidade, não foram alterados na presença da AHL nas condições avaliadas Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que Methylobacterium spp. interagem com plântulas de Citrus spp., demonstrando especificidade entre a espécie de planta e da bactéria endofítica. Foi observado também que esta interação ocorre não somente com a planta, mas possivelmente com outras bactérias que habitam o xilema de citros. Além disso, esta interação Methylobacterium-citros-bactérias do xilema pode ser regulada por AHLs. / The bacterium-plant interaction is a complex process that involves several biotic and abiotic factors that may result in neutral, beneficial or harmful interactions. The Methylobacterium genus has been described as endophytic bacterium in different host plants. It could benefit the plants by growth promotion and control of phytopathogens. In citrus, this endophyte colonizes the same pathogen-niche, and therefore many species of this genus are interesting candidates to symbiotic control against X. fastidiosa. It is known that the process of Methylobacterium-bacteria interaction is coordinated by genes whose expression is regulated by the Quorum Sensing (QS), which uses N-acyl homoserine lactones (AHLs) as signaling molecules. Its importance is associated with the biofilm formation, found in many plants as a strategy for bacterial colonization. However, the mechanisms in Methylobacterium-plant interactions are still poorly understood. Thus, this work studied in different ways, the interaction between Methylobacterium spp. and citrus, evaluating the effects of these bacteria on the seedling growth and the variation of gene expression. In this context, it was found that the specificity of bacteria-plant interactions and the bacterial inoculation methods are important to generate beneficial results on seed germination and host plant development. Possibly, IAA production and nitrogen biological fixation were the major involved mechanisms in citrus growth promotion by Methylobacterium spp. These bacteria seem to be transmitted horizontally in citrus plant. Aiming to employ Methylobacterium spp. to control phytopathogens in citrus plant, M. extorquens AR1.6/2 was genetically modified to express an endoglucanase A (EglA) enzyme. Using scanning electron microscopy was observed that the modified bacteria colonized the surface and interior of the Catharanthus roseus, a model plant for experiments with endophytic bacteria and X. fastidiosa. Furthermore, when inoculated with X. fastidiosa, these bacteria shared the seedlings xylem, suggesting that during the colonization and establishment in the host, these bacteria could interact. Studying the action of a AHL on the expression of genes involved in the interaction between M. mesophilicum SR1.6/6- plant it was observed that the presence of this molecule was important in the activation of genes expression mxaF (related to the establishment and methylotrophic metabolism); pat (related to adaptive and competitive advantages during the plant colonization); acdS (involved in bacterial metabolism and modulation of hormone levels in the plant). Expression of crtI and sss, involved in bacterial stress and transport of compounds, respectively, and phoU, related with pathogenicity were not altered in the presence of AHL in the evaluated conditions. The results of this study demonstrated that Methylobacterium spp. interact with seedlings of Citrus spp., showing specificity between plant species and endophytic bacteria. Also, it was observed that this interaction occurs not only with the plant molecular modification levels, but possibly with other bacteria that inhabit the xylem of citrus. Also, this interaction Methylobacteriumcitrus- xylem bacteria may be regulated by AHLs.

O objetivo principal deste trabalho foi testar redes neurais artificiais (RNAs) do tipo multilayer perceptron (MLP) na estimativa da evapotranspiração de referência e da evapotranspiração na linha de plantio de limeira ácida. As RNAs foram treinadas sob algoritmo de gradiente conjugado de erros, com funções de ativação sigmóide na camada intermediária e linear na camada de saída. Foram conduzidas análises comparativas com modelos de regressão. Valores diários de evapotranspiração de referência foram calculados usando o modelo Penman-Monteith (EToPM) a partir de dados meteorológicos (1997-2006) observados em Piracicaba, estado de São Paulo, Brasil (latitude: 22º 42 30 S; longitude: 47º 38 30 W; altitude: 546 m). Os modelos foram desenvolvidos a partir de dados de radiação solar global (Rg), saldo de radiação (Rn) ou radiação no topo da atmosfera (RTA) em combinação com temperatura do ar (Tar), déficit de pressão de vapor no ar (DPV) e velocidade do vento (u). Bom desempenho foi obtido quando os dados de Rg ou Rn estavam disponíveis, mesmo com a falta de uma ou mais das outras variáveis exigidas pelo modelo Penman- Monteith. As RNAs mostraram melhor desempenho do que os modelos de regressão, especialmente quando RTA foi considerada na entrada. O erro absoluto médio (MAE) das RNAs variou de 0,1 a 0,2 mm d-1, representando de 4 a 6 % dos valores médios de EToPM. A evapotranspiração na linha de plantio, condutância difusiva e transpiração foliar foram obtidas em pomar adulto de limeira ácida (Citrus latifolia Tan.), com espaçamento 7 m × 4 m , orientação Leste-Oeste das linhas de plantio e sem limitação hídrica, em Piracicaba, Brasil. A condutância à difusão de vapor (gs) e transpiração foliar (T) foram determinadas com porômetro de equilíbrio constante e balanço nulo, em folhas completamente expandidas, na parte média da copa nas faces expostas da linha de plantio, a intervalos horários ao longo de 42 dias. A densidade de fluxo de fótons fotossintéticos (DFFF) incidentes sobre a folha, temperatura e déficit de pressão de vapor no ar (Tar e DPV) no interior do pomar e o horário de observação (h) foram combinados nos modelos de estimativa de gs e T. Somente os modelos ajustados para o inverno apresentaram bom desempenho. Medidas lisimétricas foram utilizadas na determinação da evapotranspiração diurna na linha de plantio (ETli 9-17h). Saldo de radiação (Rn), temperatura do ar (Tar), déficit de pressão de vapor (DPV), evapotranspiração de referência estimada pelo modelo Penman-Monteith (EToPM) e dia do ano foram combinados na estimativa de ETli 9-17h. O desempenho das RNAs foi superior ao dos modelos com base em regressão. O erro médio absoluto (MAE) nos modelos RNAs variou entre 3,6 e 10,6 L planta-1, representando de 6 a 18% dos valores médios de ETli 9-17h. Os modelos incluindo o efeito temporal apresentaram melhor desempenho. A estimativa da evapotranspiração de referência na escala diária e da evapotranspiração diurna na linha de plantio pelos modelos propostos mostrou-se adequada. Ficou evidente a existência de outros efeitos temporais operando concomitantemente com o ambiente atmosférico na determinação de gs e ETli 9-17h. / The main objective of this study was to test artificial neural networks (ANNs) of multilayer perceptron type (MLP) for estimating reference evapotranspiration, diffusive leaf conductance and crop evapotranspiration of a mature and irrigated citrus orchard. The ANNs were trained under conjugate gradient algorithm. The sigmoid and linear activation functions were used for the hidden and output nodes, respectively. Comparative analyses with regression models were carried out. Daily values of reference evapotranspiration were computed using the Penman-Monteith method (EToPM) from climatic data (1997-2006) at Piracicaba, Brazil. All models were developed considering global radiation (Rg), net radiation (Rn) or extraterrestrial radiation (Ra) in combination with air temperature (Tar), air vapor pressure deficit (VPD) and wind velocity (u) as input data. Good performance was obtained for any model when net radiation or solar radiation were available, even missing one or more of other variables required by the Penman-Monteith equation. The performance of ANNs were improved when compared to those obtained with regression model basis, especially when Ra was considered as input data. Mean absolute error (MAE) from ANNs varied from 0.1 to 0.2 mm d-1, representing between 4 and 6 % of the mean EToPM values. Crop evapotranspiration, leaf diffusive conductance and leaf transpiration data were obtained from an acid lime (Citrus latifolia Tan.) mature orchard, located at the same region. The orchard, with East-West planting rows and 7 m × 4 m spacing, was drip irrigated to maintain non-limiting water conditions. Leaf diffusive conductance to water vapor (gs) and transpiration (T) were measured on fully expanded leaves, in the middle height of the canopy, at Northen and Southern exposed faces, in hourly intervals along 42 selected days, using a steady-state null-balance porometer. Variability of gs and T values were described as function of the exposition faces of the planting rows, time of day and season. Significant differences between exposition faces for gs and T values were only observed in the spring. The relationship between gs or T values and leaf environmental conditions varied according to the season. Photosynthetic photon flux density (PPFD) incident on the leaf, air temperature (Tar) and vapor pressure deficit (VPD) and time of day (h) were used as inputs. Adequate performance was only observed for winter models. Lysimetric data were used to determine diurnal evapotranspiration from orchard row (ETli 9-17h). Net radiation (Rn), air temperature and deficit pressure vapor (Tar, DPV) and Penman-Monteith reference evapotranspiration (EToPM) data were combined in the regression analyses and developing process of ANNs. Also any other temporal effect was taken into account by including day of the year (DOY). Mean absolute error (MAE) for ANNs models varied from 3.6 to 10.6 L plant-1, representing between 6 and 18% of mean ETli 9-17h values. Errors decreased when DOY was included. According to the results, it can be concluded that it is possible to estimate daily EToPM and diurnal citrus orchard evapotranspiration (ETli 9-17h) accurately by the proposed models. Relevance of other temporal effects operating on gs and ETli 9-17h determination, in addition to environmental variations, was evident.

O presente trabalho teve o objetivo de avaliar os efeitos da vegetação intercalar composta por gramíneas e leguminosas perenes e da cobertura morta, obtida pelo manejo mecânico da vegetação intercalar, e herbicidas aplicados em pós-emergência, na linha da cultura, sobre a população de plantas daninhas, características químicas do solo, estado nutricional, desenvolvimento vegetativo e produção de citros. O experimento foi conduzido, durante as safras 2004/2005 e 2005/2006, na Fazenda São Judas, Lucianópolis - SP, em um pomar de laranja Pêra (Citrus sinensis (L.) Osbeck.), plantado em outubro de 2002. O delineamento utilizado foi o de blocos ao acaso, com parcelas subdivididas sendo 7 tratamentos e 2 subtratamentos, com 4 repetições. Os tratamentos foram: 1) vegetação intercalar de Brachiaria ruziziensis R. Germ. & Evrard, sem cobertura morta na linha da cultura; 2) vegetação intercalar de B. ruziziensis, com cobertura morta1 na linha da cultura; 3) vegetação intercalar de B. ruziziensis e Arachis pintoi Krap. & Greg com cobertura morta1 na linha da cultura; 4) vegetação intercalar de B. ruziziensis e Stylosantes spp. com cobertura morta1 na linha da cultura; 5) vegetação intercalar composta por Brachiaria plantagineacom cobertura morta1 na linha da cultura 6) vegetação intercalar de Arachis pintoi com cobertura morta1 na linha da cultura; 7) vegetação intercalar de estilosantes \'mineirão\' (Stylosathes macrocephala (25%), S. capitata (60%) e S. guianensis (15%)) com cobertura morta1 na linha da cultura. Os herbicidas aplicados às subparcelas foram: 1) glyphosate a 1260 g e. a. ha-1 e 2) paraquat a 400 g i. a. ha-1. Pelos dados obtidos pode-se observar que: a vegetação intercalar dos tratamentos 2, 3 e 4 obtiveram as maiores produções de fitomassa e cobertura morta, seguido pelos tratamentos 5 e 7 e a menor produção de fitomassa foi obtida pelo tratamento 6. A cobertura morta de B. ruziziensis proporcionou menor densidade de plantas daninhas por até 90 dias. O teor de matéria orgânica, nas entrelinhas, na camada de 0-0,10 m, nos tratamentos 2 e 4 foi superior em 3,79 e 3,48 g cm-3 em relação ao tratamento 6, enquanto que na camada de 0,20-0,40 m, o teor de matéria orgânica, do tratamento 6, foi superior em 4,6, 5,1 e 3,9 g cm-3 em relação aos tratamentos 1, 3 e 4, respectivamente. Nas linhas da cultura, o tratamento 4 e 3 apresentaram teor de K superior em 1,28 e 0,95 mmolc dm-3, respectivamente, em relação ao tratamento 6, nas camadas de 0-0,10 e 0,10-0,20 m de solo. O estilosantes proporcionou incrementos no teor foliar de N de 2,58 e 2,55 g kg-1, em relação aos tratamentos 1 e 2. O teor foliar de P do tratamento 4 foi superior ao tratamento 1 em 0,31 g kg-1, sendo observada uma correlação entre a densidade do sistema radicular na camada de 0-0,10 m de solo e o teor foliar de P. Não foi verificado efeitos dos tratamentos e herbicidas no desenvolvimento vegetativo, bem como na produção total no período avaliado. / The objective of this research was to evaluate the effects of cover crops from grass and perennial leguminous in the orchard inter-rows, mulch, produced through mechanical management with a lateral rotary mower from inter-row cover crops associated with herbicides applied in pos-emergence, on the rows, on population dynamics of weeds, soil chemical characteristics and development, nutrition and citros production. The experiment was carried out at the São Judas farm, Lucianópolis - SP - Brazil during the harvest of 2004/2005 and 2005/2006 in a citrus orchard of Citrus sinensis L. Osbeck cv. Pera, planted in October, 2002. The experimental design used was of randomized blocks with subdivided plots and 4 replications. The treatments were; 1) Cover crop of Brachiaria ruziziensis R. Germ. & Evrard, without mulch on the row; 2) Cover crop of B. ruziziensis and mulch on the row, produced through mechanical management with a lateral rotary mower (REL) from this cover crop; 3) Cover crop of B. ruziziensis and Arachis pintoi Krap. & Greg and mulch on the row, produced through REL from this cover crop; 4) Cover crop of B. ruziziensis and estilosantes \"mineirão\" (Stylosathes macrocephala (25%), S. capitata (60%) e S. guianensis (15%)) and mulch on the row, produced through REL from this cover crop; 5) Cover crop of Brachiaria plantaginea and mulch on the row, produced through REL from this cover crop; 6) Cover crop of Arachis pintoi and mulch on the row, produced through REL from this cover crop; 7) Cover crop of estilosantes \"mineirão\" and mulch on the row, produced through REL from this cover crop.The herbicides applied into the subplots were: 1) glyphosate at the rate 1260 g a.e. ha-1 and 2) paraquat at the rate 400 a.i. ha-1. In these experiments, it could be observed that: the cover crops from the treatments 2, 3 and 4 got higher wet biomass and mulch than others treatments; B. ruziziensis mulch decrease the weeds density until 90 days after the distribution; in the inter-row, into 0-0,10 m soil layer, the treatments 2 and 4 organic matter, was higher than treatment 6, however, into 0,20-0,40 m soil layer, treatment 6 organic matter was higher than treatments 1, 3 and 4. Into the rows, treatments 4 and 3 achieved K tenor higher than treatment 6 in 1,28 and 0,95 mmolc dm-3, respectively, into 0-0,10 and 0,10-0,20 m soil layers. Estilosantes promoted N foliar increases of 2,58 and 2,55 g kg-1 regarding treatments 1 and 2. Treatment 4 P foliar tenor was higher than treatment 1 in 0,31 g kg-1. It was observed a correlation between root density into superficial layer soil and P foliar tenor. It was not verified any effect of treatment or herbicides on development and total citros production.

O objetivo deste trabalho foi aplicar a técnica de fusão química de protoplastos para desenvolver híbridos somáticos interespecíficos entre tangerinas (Citrus reticulata) e toranjas (Citrus grandis), visando a obtenção de porta-enxertos semelhantes à laranja azeda Citrus aurantium). Como fonte de protoplastos foram utilizadas suspensões celulares embriogênicas de tangelo \'Page\' (C. reticulata x C. paradisi) e tangor \'Murcote\' (C. reticulata x C. sinensis) e folhas jovens de seedlings de toranjas \'Lau Tau\' e \'Ogami\' (Citrus grandis). Após a fusão os protoplastos foram cultivados sob ausência de luz, até a formação de microcolônias, que foram então cultivadas em meio de cultura EME em dupla-fase, suplementado com 13,33 g/L de maltose para a indução da embriogênese. Os embriões globulares formados foram transferidos para meio EME com 25 g/L de sacarose e quando em estádio cotiledonar foram transferidos para meio de cultura suplementado com 1,5 g/L de extrato de malte. As brotações obtidas foram enxertadas in vitro sobre laranja \'Hamlin\' e \'Valência\'. As plantas obtidas foram levadas para casa de vegetação e cultivadas em substrato comercial. As 17 plantas regeneradas de tangelo \'Page\' + toranja \'Lau Tau\' apresentaram conformação fenotípica adversa aos genitores, com folhas de tamanho reduzido, ápice arredondado, coloração verde escura, mesófilo enrugado e ausência de pecíolo alado. A análise de citometria de fluxo confirmou o caráter diplóide das plantas regeneradas. Marcadores moleculares RAPD apresentaram padrão de bandas similar entre a planta regenerada e o genitor tangelo \'Page\'. O protocolo utilizado para isolamento, fusão e cultura de protoplastos, bem como para a regeneração e aclimatização de plantas permitiram a obtenção 17 plantas da combinação entre tangelo \'Page\' e toranja \'Lau Tau\' com conformação fenotípica diferente dos genitores, duas plantas da combinação entre tangor \'Murcote\' e toranja \'Ogami\' e uma planta da combinação entre tangor \'Murcote\' e toranja \'Lau Tau\'. / The aim of this work was to apply the technique of chemical fusion of protoplasts, in order to develop interspecific somatic hybrids between mandarins (Citrus reticulata) and pummelos (Citrus grandis), in order to produce similar to sour orange (Citrus aurantium). The sources for protoplasts were embryogenic suspension cultures of \'Page\' tangelo (C. reticulata x C. paradisi) and \'Murcott\' tangor (C. reticulata x C. sinensis) and young leaves from seedlings of \'Lau Tau\' and \'Ogami\' pummelos (Citrus grandis). After the fusion, the protoplasts were cultivated in the absence of light, until the formation of microcolonies, and were then cultivated in double-phase EME medium, supplemented with 13.33 g/L of maltose for embryogenesis induction. The globular embryos thus formed were transferred to EME medium with 25 g/L of sucrose and, when in cotyledonal stage, were transferred to a culture medium supplemented with 1.5 g/L of malt extract. The shoots obtained were grafted in vitro onto \'Hamlin\' and \'Valencia\' sweet oranges. The regenerated plants were cultivated in a greenhouse, over commercial substrate. In this process, 17 plants were obtained. These plants presented phenotypic conformation different from the genitors, with leaves with reduced size, round apex, dark green coloration, rough leaf blade and absence of developed petiole. The analysis by flow cytometry confirmed the diploid character of the regenerated plants. RAPD molecular markers presented a similar band pattern between the regenerated specimen and the genitor \'Page\' tangelo. The protocol used for isolation, hybridization and cultivation of protoplasts, as well as for the regeneration and acclimatization of the plants allowed the obtainment of 17 plants from the combination of \'Page\' tangelo + \'Lau Tau\' pummelo, with phenotypic conformation different from the genitors, two plants from the combination of \'Murcott\' tangor + \'Ogami\' pummelo and one plant from the combination of Murcote\' tangor + \'Lau Tau\' pummelo.

A Morte Súbita dos Citros (MSC) é uma nova doença que afeta a citricultura paulista, podendo levar à morte de milhões de plantas cítricas enxertadas sobre limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbeck), com um impacto comparável ao do vírus da Tristeza dos Citros durante as décadas de 30 e 40. Técnicas alternativas na propagação dos citros podem contornar os efeitos da MSC, seja diretamente, pela produção de subenxertos tolerantes, ou indiretamente, pelo emprego de estaquia de citros e interenxertia em combinações copa/porta-enxerto incompatíveis, mas sobre porta-enxertos tolerantes à MSC. O presente trabalho visou avaliar diferentes métodos de produção de mudas cítricas em recipientes que proporcionem possível prevenção futura das plantas à MSC em condições de campo, através de três experimentos. 1) desenvolvimento de onze porta-enxertos para fins de subenxertia, em diferentes recipientes. Os recipientes usados foram tubetes de 290 mL, sacolas de 1,7L e porta-enxertos transplantados de tubetes de 75mL para sacolas de 1,7L e 4,5L; 2) viabilização de produção de mudas de laranja 'Pêra' (Citrus sinensis L. Osbeck) sobre porta-enxertos citrumelo 'Swingle' (Poncirus trifoliata x Citrus paradisi) e limão 'Volkameriano' (Citrus volkameriana Pasquale), através de interenxertos de laranjas 'Valência' e 'Hamlin'(Citrus sinensis L. Osbeck), tangerina 'Sunki' (Citrus sunki Hort. ex Tanaka) e tangerina 'Cleópatra' (Citrus reshni Hort. ex Tanaka); 3) produção de mudas cítricas e subenxertos a partir de estacas enraizadas de citrumelo 'Swingle'. Utilizaram-se estacas herbáceas, semi-lenhosas e lenhosas obtidas de porta-enxertos de seis meses de idade, submetidas a imersão em solução com IBA 0 ou 500mg L-1 e a enxertia antes do enraizamento. Porta-enxertos produzidos diretamente em sacolas de 1,7L atingiram ponto ideal de subenxertia em menor tempo, ou seja, cerca de 100 a 150 dias após a semeadura, além de permitir a obtenção de plantas maiores e com sistema radicular adequado em mesmo espaço de tempo, quando se necessitar de subenxertos mais vigorosos no campo. A interenxertia se mostrou uma técnica promissora para propagação de citros, especialmente no caso de viabilizar o plantio de laranja 'Pêra' sobre citrumelo 'Swingle' em áreas afetadas pela MSC. Contudo, determina um ciclo de produção mais prolongado e com maior percentagem de descarte de mudas, levando-se até 17 meses para a formação da muda a partir da semeadura do porta-enxerto. Estacas herbáceas com um par de folhas são as mais indicadas para enraizamento e multiplicação de citrumelo 'Swingle'. / Citrus Sudden Death (CSD) is a new disease detected in the citrus industry in São Paulo State, Brazil. It affects all citrus varieties budded on ‘Rangpur’ Lime (Citrus limonia Osbeck), causing lost of vigor and leaf brightness, root system destruction, yield reduction, degeneration of rootstock phloem tissue and death of plants in few months. CSD has a great potential to destroy millions of plants such as Citrus Tristeza Virus has caused between 1930 and 1940. Alternative production methods of container-grown citrus nursery trees could prevent some effects of CSD, for instance, by the use of tolerant inarchings, citrus cuttings, or even interstocks in incompatible scion/rootstock combinations. This work evaluated the following alternative production methods of citrus aiming to prevent occurrence of CSD in groves: 1) production of citrus inarchings using eleven rootstocks in four container types: 290mL tubes and 1,7L and 4,5L plastic bags; 2) production of 'Pera' sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) nursery trees on incompatible 'Swingle' citrumelo (Poncirus trifoliata x Citrus paradisi) and 'Volkamer' lemon (Citrus volkameriana Pasquale) with four interstocks: 'Valencia' and 'Hamlin' sweet oranges (Citrus sinensis L. Osbeck), 'Sunki' mandarin (Citrus sunki Hort. ex Tanaka) and 'Cleópatra' mandarin (Citrus reshni Hort. ex Tanaka); 3) production of citrus inarchings and nursery trees using 'Swingle' citrumelo cuttings. Herbaceous, semi-hardwood and hardwood cuttings were used and were submitted to IBA solution (0 or 500mg L-1) and budded before rooting. Production of inarchings directly sowed in 1,7L containers resulted in rootstocks ready for use about 100 to 150 days after sowing with more vigorous plants and well shaped root system. Interstocking is a promising citrus propagation technique especially regarding incompatible combinations, and could allow the use of 'Pera' sweet orange on 'Swingle' citrumelo in areas affected by CSD. On the other hand, the production cycle is longer, up to 17 months from sowing, besides producing a higher percentage of inadequate plants. Twoleaf herbaceous cuttings are indicated for appropriate rooting and multiplication of 'Swingle' citrumelo.

O objetivo deste trabalho foi aplicar a técnica de fusão química de protoplastos para desenvolver híbridos somáticos interespecíficos entre tangerinas (Citrus reticulata) e toranjas (Citrus grandis), visando a obtenção de porta-enxertos semelhantes à laranja azeda Citrus aurantium). Como fonte de protoplastos foram utilizadas suspensões celulares embriogênicas de tangelo \'Page\' (C. reticulata x C. paradisi) e tangor \'Murcote\' (C. reticulata x C. sinensis) e folhas jovens de seedlings de toranjas \'Lau Tau\' e \'Ogami\' (Citrus grandis). Após a fusão os protoplastos foram cultivados sob ausência de luz, até a formação de microcolônias, que foram então cultivadas em meio de cultura EME em dupla-fase, suplementado com 13,33 g/L de maltose para a indução da embriogênese. Os embriões globulares formados foram transferidos para meio EME com 25 g/L de sacarose e quando em estádio cotiledonar foram transferidos para meio de cultura suplementado com 1,5 g/L de extrato de malte. As brotações obtidas foram enxertadas in vitro sobre laranja \'Hamlin\' e \'Valência\'. As plantas obtidas foram levadas para casa de vegetação e cultivadas em substrato comercial. As 17 plantas regeneradas de tangelo \'Page\' + toranja \'Lau Tau\' apresentaram conformação fenotípica adversa aos genitores, com folhas de tamanho reduzido, ápice arredondado, coloração verde escura, mesófilo enrugado e ausência de pecíolo alado. A análise de citometria de fluxo confirmou o caráter diplóide das plantas regeneradas. Marcadores moleculares RAPD apresentaram padrão de bandas similar entre a planta regenerada e o genitor tangelo \'Page\'. O protocolo utilizado para isolamento, fusão e cultura de protoplastos, bem como para a regeneração e aclimatização de plantas permitiram a obtenção 17 plantas da combinação entre tangelo \'Page\' e toranja \'Lau Tau\' com conformação fenotípica diferente dos genitores, duas plantas da combinação entre tangor \'Murcote\' e toranja \'Ogami\' e uma planta da combinação entre tangor \'Murcote\' e toranja \'Lau Tau\'. / The aim of this work was to apply the technique of chemical fusion of protoplasts, in order to develop interspecific somatic hybrids between mandarins (Citrus reticulata) and pummelos (Citrus grandis), in order to produce similar to sour orange (Citrus aurantium). The sources for protoplasts were embryogenic suspension cultures of \'Page\' tangelo (C. reticulata x C. paradisi) and \'Murcott\' tangor (C. reticulata x C. sinensis) and young leaves from seedlings of \'Lau Tau\' and \'Ogami\' pummelos (Citrus grandis). After the fusion, the protoplasts were cultivated in the absence of light, until the formation of microcolonies, and were then cultivated in double-phase EME medium, supplemented with 13.33 g/L of maltose for embryogenesis induction. The globular embryos thus formed were transferred to EME medium with 25 g/L of sucrose and, when in cotyledonal stage, were transferred to a culture medium supplemented with 1.5 g/L of malt extract. The shoots obtained were grafted in vitro onto \'Hamlin\' and \'Valencia\' sweet oranges. The regenerated plants were cultivated in a greenhouse, over commercial substrate. In this process, 17 plants were obtained. These plants presented phenotypic conformation different from the genitors, with leaves with reduced size, round apex, dark green coloration, rough leaf blade and absence of developed petiole. The analysis by flow cytometry confirmed the diploid character of the regenerated plants. RAPD molecular markers presented a similar band pattern between the regenerated specimen and the genitor \'Page\' tangelo. The protocol used for isolation, hybridization and cultivation of protoplasts, as well as for the regeneration and acclimatization of the plants allowed the obtainment of 17 plants from the combination of \'Page\' tangelo + \'Lau Tau\' pummelo, with phenotypic conformation different from the genitors, two plants from the combination of \'Murcott\' tangor + \'Ogami\' pummelo and one plant from the combination of Murcote\' tangor + \'Lau Tau\' pummelo.

A hibridação somática de citros tem sido extensivamente aplicada, favorecendo o desenvolvimento de híbridos somáticos em programas de melhoramento genético, como fonte de germoplasma ou como variedades copa e porta-enxerto. Neste contexto, este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de selecionar plantas de toranja (Citrus grandis L. Osbeck) tolerantes à Phytophthora sp. e utilizá-las como parentais no processo de hibridação somática com outras espécies do gênero Citrus, a fim de produzir híbridos somáticos para o melhoramento de porta-enxertos. Plantas de 20 variedades de toranja tolerantes à Phytophthora spp. foram selecionadas, após serem cultivadas em solo infestado. Experimentos de fusão de protoplastos foram realizados envolvendo laranjas doces, tangerinas e o tangor ‘Murcote’, como parentais embriogênicos, e variedades de toranja selecionadas e plantas enxertadas de 12 variedades de toranja, como parentais não-embriogênicos, utilizando-se a técnica de fusão química, via polietilenoglicol (PEG). Microcolônias foram transferidas para meio de cultura MT semi-sólido, suplementado com 500 mg.l -1 de extrato de malte para indução da embriogênese somática. A confirmação da hibridação somática das plantas regeneradas e aclimatizadas foi realizada por meio de análises de morfologia foliar, de citologia, pela contagem do número de cromossomos, e moleculares, por marcadores do tipo RAPD. As metodologias utilizadas para seleção de plantas matrizes, fusão de protoplastos, regeneração de plantas e confirmação da hibridação somática foram adequadas, e permitiram a obtenção de híbridos somáticos de laranja ‘Hamlin’ com toranja enxertada ‘Indian Red’ e com ‘seedling’ selecionado de toranja ‘Singapura’, que apresentam potencial para serem incorporados em programas de melhoramento de porta-enxertos. / Citrus somatic hybridization has been extensively applied assisting the development of the somatic hybrids which can be used in improvement programs, indirectly as germoplasm source or directly as scion and rootstock varieties. In this context, this research was developed with the objective of selecting plants of pummelo (C. grandis L. Osb) tolerant to Phytophthora sp. and use these plants as parents in the somatic hybridization process with other species of Citrus. Plants of 20 pummelo varieties, tolerant to Phytophthora sp., were selected after being grown in infested soil. Protoplast fusion experiments were induced by chemical method, with polyethylene glicol (PEG), involving sweet oranges, mandarins and Murcott tangor, as embryogenic parents, selected pummelo varieties and grafted plants of 12 pummelo varieties, as non-embryogenic parents. Microcolonies were transferred to EME semi-solid MT containing 500 mg.l -1 of malt extract for somatic embryogenesis. Somatic hybridization was confirmed by analysis of leaf morphology, citology by chromosome counting and molecular analysis by RAPD markers. The protocols used to select plants to be used as protoplast source, protoplast fusion, plant regeneration and somatic hybridization confirmation were adequate, allowing to produce somatic hybrids of Hamlin sweet orange with Indian Red grafted pummelo and Singapura pummelo selected seedling, which may be used as rootstocks and incorporated in rootstocks improvement programs.