OBJECTIF: L’apoB plasmatique prédit le diabète de type 2 chez l’humain. Une clairance ralentie des triglycérides (TG) favorise la lipotoxicité et la résistance à l’insuline (RI). Nous avons démontré ex vivo que les LDL, forme majeure d’apoB-lipoprotéines, altèrent le stockage des gras dans le tissu adipeux blanc (TAB) humain. Nous émettons l’hypothèse que le lien reliant l’apoB plasmatique à la RI et l’hyperinsulinémie est médié par un retard de clairance des gras diététiques. MÉTHODE/RÉSULTATS: Nous avons examiné la sécrétion d’insuline (SI), puis la RI lors d’un test de tolérance au glucose intraveineux suivi d’un clamp hyperinsulinémique-euglycémique chez des sujets obèses normoglycémiques (N=29, 45%hommes, indice de masse corporelle (IMC)≥27kg/m2, 45-74ans, post-ménopausés). La clairance des TG diététiques a été mesurée suivant l’ingestion d’un repas gras marqué au 13C. La fonction d’une biopsie de TAB (à jeun) a été mesurée comme la capacité à stocker un substrat de 3H-TG. L’apoB était de 1,03±0,05g/L et corrélait avec la RI, la 2ième phase de SI, un délai de clairance des TG diététiques et une réduction de la fonction du TAB. Un retard de clairance des TG diététiques était associé à la RI et la 2ième phase de SI. Une correction pour la clairance des TG diététiques ou la fonction du TAB a éliminé l’association entre l’apoB et la RI et la 2ième phase de SI. CONCLUSION: L’association entre l’apoB plasmatique et la RI et la SI chez les sujets obèses est médiée par une clairance ralentie des gras diététiques et une dysfonction du TAB. / OBJECTIVE: Plasma apoB predicts type 2 diabetes in humans. Delayed TG clearance promotes lipotoxicity and insulin resistance (IR). We demonstrated ex vivo that LDL, the major form of apoB-lipoproteins, impairs human white adipose tissue (WAT) fat storage. We hypothesized that the link between plasma apoB, IR and hyperinsulinemia is mediated through delayed dietary fat clearance. METHODS/RESULTS: We examined insulin secretion (IS) and IR during a intravenous-glucose tolerance test followed by a hyperinsulinemic-euglycemic clamp in normoglycemic obese (N=29, 45%men, body mass index (BMI)≥27kg/m2, 45-74yrs, postmenopausal). Dietary TG clearance was measured after the ingestion of a 13C-triolein-labeled high-fat meal. The function of a fasting WAT biopsy was measured as the ability to store a 3H-TG substrate. Plasma apoB averaged 1.03±0.05g/L, and correlated with IR, 2nd phase IS, delayed dietary TG clearance and reduced WAT function. Moreover, delayed dietary TG clearance was associated with higher IR and 2nd phase IS. Correcting for dietary TG clearance or WAT function eliminated the association of plasma apoB with IR and 2nd phase IS. CONCLUSION: The association of plasma apoB with IR and IS in obese subjects is mediated by delayed dietary fat clearance and WAT dysfunction.

La phagocytose, fonction fondamentale des macrophages, est un processus qui se décompose en deux étapes bien distinctes : les étapes précoces d’internalisation menant à la formation du phagosome et les étapes tardives de maturation du phagosome. Le virus de l’immunodéficience humaine de type I (VIH-1) infecte les macrophages, ce qui perturbe leurs fonctions. L’effet de l’infection virale dans ces cellules est peu caractérisé en comparaison des lymphocytes T. Des travaux antérieurs ont montré d’une part que l’étape précoce d’internalisation de larges particules et bactéries était bloquée de moitié dans les macrophages primaires humains infectés par le VIH-1 via Nef, la protéine de virulence majeure du virus et d’autres part, que la réponse cytokinique était atténuée chez les patients infectés. Ainsi, nous avons étudié l’effet du VIH-1 sur les étapes tardives de la phagocytose : la maturation du phagosome et l’activation des macrophages qui en résulte. Nous avons montré que le VIH-1 altère les étapes tardives de la phagocytose en inhibant la maturation du phagosome, définie par le recrutement de marqueurs tardifs de la voie d’endocytose, d’hydrolases et la production d’espèces réactives oxygénées. Malgré une pré-activation basale, les macrophages infectés par le VIH-1 sont incapables de répondre efficacement à une stimulation induite par phagocytose, ce qui conduit à une modulation de la réponse transcriptionnelle et cytokinique. La dynamique des microtubules et la migration centripète des phagosomes sont profondément affectées par le virus. De façon inattendue, la protéine virale Vpr est impliquée dans ces perturbations, alors que Nef ne joue pas de rôle notable. Nos résultats indiquent que les composants intracellulaires de la machinerie de tri endosomal sont détournés par le compartiment viral dans les macrophages infectés. Par cette étude, nous avons donc identifié la protéine Vpr comme nouveau modulateur de la dynamique des microtubules et du trafic intracellulaire, entraînant ainsi une altération profonde de la maturation du phagosome et de la clairance bactérienne dans les macrophages infectés. Ce travail contribue à mieux comprendre l’établissement d’infections opportunistes chez les patients infectés. / Phagocytosis, a crucial function of macrophages, is composed of two well defined steps : the early step of internalization leading to phagosome formation and the late step of phagosome maturation. The immunodeficiency virus type I (HIV-1) infects macrophages, which disturbs theirs functions. The effects of HIV-1 infection are poorly characterized in this cell type compared to T lymphocytes. Previous results have already shown that the early step of internalization of large particles and bacteria are half blocked by Nef in HIV-1 infected primary macrophages and that the cytokine response is attenuated in infected patients. Thus, we have studied the effect of HIV-1 infection on the late step of phagocytosis : phagosome maturation and the resulting macrophage activation. We shown that HIV-1 impairs late phagocytic events affecting the phagosome maturation, as defined by late endocytic markers and hydrolases recruitment, and reactives oxygens species production. HIV-1 infected macrophages exhibited a basal preactivation but appeared unable to respond efficiently to phagocytic triggers leading to cytokine and transcriptional modifications. Centripetal migration of phagosomes and microtubule dynamics were deeply altered upon viral infection. Surprisingly, the Vpr viral protein was implicated in these pertubations, while Nef was not. Our results revealed that elements of the endosomal sorting machinery were hijacked to the virus-containing compartments in HIV-infected macrophages. With this study, we identify Vpr as a modulator of the microtubule dynamics and intracellular trafficking, leading to alterations in phagosome maturation and bacterial clearance in HIV-1 infected macrophages. This work contribute to better understanding of the establishment of opportunistic infections in HIV-infected patients.

La population générale est exposée à un grand nombre de pesticides, principalement via son alimentation. Alors que ces matières actives ont reçu une autorisation de mise sur le marché individuelle, l’effet sur l’organisme humain d’un mélange de tels composés est en revanche très peu connu. Afin de contribuer à mieux appréhender cet « effet mélange », notre étude s’est attachée à étudier le métabolisme hépatique humain in vitro de deux mélanges de pesticides communément retrouvés dans l’alimentation française / General population is exposed to several pesticides, mainly via the diet. Whereas these active ingredients obtained their marketing authorization individually, the available data regarding their impact as a mixture on the human body are scarce. In order to help better understanding this “mixture effect”, we aimed at studying the human hepatic in vitro metabolism of two pesticides mixtures commonly found in the diet

Dans mon projet de doctorat, j’ai étudié des fonctions primordiales de l’épithélium respiratoire telles que la régulation du transport ionique, la clairance liquidienne et la réparation épithéliale. J’ai particulièrement mis l’emphase sur le rôle des canaux potassiques qui interviennent dans ces trois fonctions de l’épithélium respiratoire. J’ai tout d’abord prouvé que la modulation des canaux potassiques régulait l’activité du promoteur de αENaC, en partie via la voie de signalisation ERK1/2, dans des cellules alvéolaires. Cette régulation entraîne une variation de l’expression génique et protéique du canal ENaC. Physiologiquement, il en résulte une augmentation du phénomène de clairance liquidienne suite à l’activation des canaux K+, tandis que l’inhibition de ces canaux la diminue sévèrement. J’ai aussi pu démontrer que l’absence de canal KvLQT1 entraînait une diminution du courant (ENaC) sensible à l’amiloride, dans les cellules de trachée en culture primaire, isolées de souris KO pour kcnq1. Dans la seconde partie de mon étude, j’ai évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la capacité de transport ionique et de réparation de cellules épithéliales bronchiques saines ou Fibrose Kystique. Mes résultats montrent que l’hyperglycémie diminue le transport transépithélial de chlore et le transport basolatéral de potassium. Des études préalables du laboratoire ayant montré que les canaux K+ et Cl- contrôlent les processus de réparation, j’ai donc évalué si ceux-ci étaient modifiés par l’hyperglycémie. Et en effet, l’hyperglycémie ralentit la vitesse de réparation des cellules issues des voies aériennes (CFBE-wt et CFBE-ΔF508). J’ai donc démontré que le transport de potassium intervenait dans des fonctions clés de l’épithélium respiratoire, comme dans la régulation génique de canaux ioniques, le contrôle de la clairance liquidienne alvéolaire, et que l’hyperglycémie diminuait le transport ionique (K+ et Cl-) et la réparation épithéliale. / During my Ph.D. training, I studied 3 important functions of respiratory epithelium : regulation of ion transport, liquid clearance and epithelial repair. I focused on potassium channels, because they control these three respiratory epithelial functions. First, I proved that αENaC promoter activity was regulated following K+ channel modulation, in alveolar cells. This regulation of αENaC promoter which might be through a modification of ERK1/2 phosphorylation, was followed by ENaC mRNA and protein expression regulation. I then showed that activation of KvLQT1 and KATP channels increased alveolar liquid clearance, whereas inhibition of these K+ channels decreased the alveolar clearance. I showed that the absence of KvLQT1 channel inhibited the amiloride-sensitive current (ENaC), in tracheal epithelial cells isolated from KvLQT1-KO mice. In the second part of my Ph.D. project, I studied the impact of hyperglycemia on Cystic Fibrosis (CF) and non-CF epithelial cells. I first observed that K+ and Cl- currents were reduced by hyperglycemia. Because we have previously shown that wound-healing process was dependant on K+ and Cl- channels, I then evaluated the impact of hyperglycemia on wound-healing. As expected, hyperglycemia slowed the repair rate of non-CF (CFBE-wt) and CF (CFBE-ΔF508) cell monolayers.

La clairance mucociliaire est un processus physico-chimique qui sert à transporter et éliminer le mucus bronchique. Pour cela, des milliards d'appendices de taille micrométrique, que l'on nomme cils, recouvrent l'épithélium respiratoire. Ces cils propulsent le mucus en suivant un motif périodique comprenant une phase de poussée où leur pointe peut pénétrer dans le mucus, et une phase de récupération où ils sont totalement immergés dans le fluide périciliaire. Un dysfonctionnement de ce processus peut engendrer de nombreux problèmes de santé. Il a été observé expérimentalement que les cils ne battent pas aléatoirement, mais synchronisent leurs battements avec leurs voisins, formant ainsi des ondes métachronales. Toutefois, les observations in vivo sont extrêmement difficiles à réaliser, et les propriétés de ces ondes restent mal connues. Dans cette thèse, nous utilisons un solveur Lattice Boltzmann - Frontière Immergée afin de reproduire un épithélium bronchique et étudier l'émergence, ainsi que les capacités de transports et de mélanges, de ces ondes / The mucociliary clearance process is a physico-chemical process which aims is to transport and eliminate bronchial mucus. To do so, billions of micro-sized appendages, called cilia, cover the respiratory epithelium. These cilia propel the mucus by performing a periodical pattern composed of a stroke phase where their tips can enter the mucus layer, and a recovery phase where the cilia are completely immersed in the periciliary liquid layer. A failure of this process may induce numerous health problems. It has been experimentally observed that cilia do not beat randomly, but instead adapt their beatings accordingly to their neighbours, forming metachronal waves. However, in vivo observations are extremely difficult to perfom, and the properties of these waves remain poorly understood. In this thesis, we use a Lattice Boltzmann - Immersed Boundary solver to reproduce a bronchial epithelium and study the emergence, as well as the transport and mixing capacities, of these waves

OBJECTIF: La mauvaise clairance des lipoprotéines riches en triglycérides par le tissu adipeux blanc (TAB) entraîne l’hypertriglycéridémie, la résistance à l’insuline et la sécrétion hépatique d’apolipoprotéine B (apoB). Ce mémoire tente de déterminer si le LDL entraîne une clairance réduite des lipoprotéines riches en triglycérides par le TAB. MÉTHODES/RÉSULTATS: Suivant l’ingestion d’un repas riche en gras marqué à la trioléine-13C, des femmes obèses postménopausées avec apoB plasmatique élevé (> médiane 0.93 g/L, N=22, 98% sous forme de IDL/LDL) avaient une clairance réduite de triglycérides-13C et acides gras non-estérifiés-13C (AGNE), comparées à celles avec un apoB plus bas. L'aire sous la courbe à 6 heures des triglycérides-13C et AGNE-13C plasmatiques corrélait avec l'apoB, suggérant une moindre captation dans les tissus périphériques chez les femmes avec apoB élevé. Ex vivo, suivant une incubation de 4 heures de biopsies de TAB avec de la trioléine-3H, l’apoB des patientes corrélait négativement avec les lipides-3H intracellulaires. Le traitement des biopsies de TAB des participantes avec leur propre LDL menait à une réduction de l’hydrolyse et de la captation de la trioléine-3H et à l’accumulation d’AGNE-3H dans le médium. In vitro, le LDL inhibait l’activité de la LPL. De plus, les adipocytes 3T3-L1 différenciés en présence de LDL avaient une hydrolyse et une captation réduite des lipoprotéines riches en trioléine-3H. CONCLUSION: Ce mémoire suggère que le LDL diminue la clairance des lipoprotéines riches en triglycérides par le TAB humain, ce qui pourrait expliquer la résistance à l’insuline observée chez des sujets avec apoB élevé. / OBJECTIVE: Delayed plasma clearance of postprandial triglyceride-rich lipoproteins (TRL) by white adipose tissue (WAT) promotes hypertriglyceridemia, insulin resistance and hepatic secretion of apoB-lipoproteins. The aim of this memoir was to examine whether low-density lipoproteins (LDL) induced delayed clearance of TRL by WAT. METHOD/RESULTS: Six hours following the ingestion of a high-fat meal, 22 postmenopausal obese women were separated based on plasma apoB levels (above/below median of 0.93 g/L). The high apoB group had delayed plasma clearance of postprandial triglyceride and non-esterified fatty acids (NEFA) compared to women with low apoB. There was no group difference in triolein oxidation rate, suggesting a lower NEFA uptake and storage in peripheral tissue in women with high apoB. Ex vivo, following a 4 hour incubation of participant’s WAT with synthetic 3H-triolein-TRL, plasma apoB correlated negatively with incorporated 3H-lipids. Incubation of women’s WAT with their own LDL (90% of apoB-lipoproteins in plasma) decreased 3H-TRL hydrolysis and increased medium 3H-NEFA accumulation. In vitro, LDL directly inhibited LPL activity. Finally, LDL-differentiated 3T3-L1 adipocytes had lower 3H-TRL hydrolysis and 3H-NEFA storage. CONCLUSION: This thesis suggests that LDL delay clearance and storage of TRL in human WAT, possibly explaining the increased insulin resistance observed in subjects with high apoB.

OBJECTIF: La mauvaise clairance des lipoprotéines riches en triglycérides par le tissu adipeux blanc (TAB) entraîne l’hypertriglycéridémie, la résistance à l’insuline et la sécrétion hépatique d’apolipoprotéine B (apoB). Ce mémoire tente de déterminer si le LDL entraîne une clairance réduite des lipoprotéines riches en triglycérides par le TAB. MÉTHODES/RÉSULTATS: Suivant l’ingestion d’un repas riche en gras marqué à la trioléine-13C, des femmes obèses postménopausées avec apoB plasmatique élevé (> médiane 0.93 g/L, N=22, 98% sous forme de IDL/LDL) avaient une clairance réduite de triglycérides-13C et acides gras non-estérifiés-13C (AGNE), comparées à celles avec un apoB plus bas. L'aire sous la courbe à 6 heures des triglycérides-13C et AGNE-13C plasmatiques corrélait avec l'apoB, suggérant une moindre captation dans les tissus périphériques chez les femmes avec apoB élevé. Ex vivo, suivant une incubation de 4 heures de biopsies de TAB avec de la trioléine-3H, l’apoB des patientes corrélait négativement avec les lipides-3H intracellulaires. Le traitement des biopsies de TAB des participantes avec leur propre LDL menait à une réduction de l’hydrolyse et de la captation de la trioléine-3H et à l’accumulation d’AGNE-3H dans le médium. In vitro, le LDL inhibait l’activité de la LPL. De plus, les adipocytes 3T3-L1 différenciés en présence de LDL avaient une hydrolyse et une captation réduite des lipoprotéines riches en trioléine-3H. CONCLUSION: Ce mémoire suggère que le LDL diminue la clairance des lipoprotéines riches en triglycérides par le TAB humain, ce qui pourrait expliquer la résistance à l’insuline observée chez des sujets avec apoB élevé. / OBJECTIVE: Delayed plasma clearance of postprandial triglyceride-rich lipoproteins (TRL) by white adipose tissue (WAT) promotes hypertriglyceridemia, insulin resistance and hepatic secretion of apoB-lipoproteins. The aim of this memoir was to examine whether low-density lipoproteins (LDL) induced delayed clearance of TRL by WAT. METHOD/RESULTS: Six hours following the ingestion of a high-fat meal, 22 postmenopausal obese women were separated based on plasma apoB levels (above/below median of 0.93 g/L). The high apoB group had delayed plasma clearance of postprandial triglyceride and non-esterified fatty acids (NEFA) compared to women with low apoB. There was no group difference in triolein oxidation rate, suggesting a lower NEFA uptake and storage in peripheral tissue in women with high apoB. Ex vivo, following a 4 hour incubation of participant’s WAT with synthetic 3H-triolein-TRL, plasma apoB correlated negatively with incorporated 3H-lipids. Incubation of women’s WAT with their own LDL (90% of apoB-lipoproteins in plasma) decreased 3H-TRL hydrolysis and increased medium 3H-NEFA accumulation. In vitro, LDL directly inhibited LPL activity. Finally, LDL-differentiated 3T3-L1 adipocytes had lower 3H-TRL hydrolysis and 3H-NEFA storage. CONCLUSION: This thesis suggests that LDL delay clearance and storage of TRL in human WAT, possibly explaining the increased insulin resistance observed in subjects with high apoB.

La prédiction des paramètres pharmacocinétiques/toxicocinétiques (PK/TK), tels que la clairance intrinsèque (CLint) et la clairance hépatique (CLh) des médicaments, demeure un défi majeur en modélisation quantitative. Selon « l’hypothèse du médicament libre », seul le médicament libre peut traverser la membrane plasmique et la CLh de ce médicament est calculée en fonction de sa fraction libre (fup). Néanmoins, la captation hépatique facilitée par l’albumine (ALB) représente clairement une violation de « l’hypothèse du médicament libre ». Cette captation hépatique se base sur la possibilité que le complexe ALB-médicament puisse assurer un apport supplémentaire en médicament aux hépatocytes. Ainsi, cela pourrait expliquer en grande partie les sous-prédictions observées de CLh. Par ailleurs, certains médicaments peuvent se lier fortement à plusieurs protéines plasmatiques telles que l’ALB et l’alpha-1-glycoprotéine acide (AGP). Ainsi, la forte liaison d’un même médicament à l’ALB, à l’AGP, ou aux deux, pourrait avoir des répercussions bien distinctes sur la prédiction de ces paramètres PK/TK. Cependant, aucune étude n’a été faite pour simuler la différence entre leurs effets. L’objectif principal de cette thèse est donc d’évaluer (avec plus d’exactitude et de précision), pour une série de médicaments, en condition in vivo (ou in situ), ces répercussions en présence des deux protéines plasmatiques, conjointement ou séparément. En outre, il est indispensable de vérifier si une approche générique en modélisation peut être appliquée. Cette thèse est répartie en trois objectifs spécifiques. Le premier est de proposer un arbre décisionnel pour faciliter la sélection des approches prédictives appropriées de CLhin vivo pour des médicaments ayant des caractéristiques différentes. Le second est d’évaluer les répercussions de fortes liaisons aux deux protéines plasmatiques ALB et AGP sur la CLh de deux xénobiotiques choisis (perampanel (PER) et fluoxétine (FLU)) ; ces médicaments ont de fortes affinités pour les deux protéines et un métabolisme exclusif (ou prédominant) dans le foie. Et, le dernier est de développer et valider un nouveau modèle prédictif de CLh pour les xénobiotiques ayant le potentiel de se lier fortement dans le plasma, à l’ALB ainsi qu’à l’AGP. Dans un premier temps, des données in vitro rapportées chez l’humain ont été colligées pour 19 médicaments (substrats des transporteurs OAT2 et OATP1B1), et ont été ensuite utilisées dans six modèles d’extrapolation in vitro-in vivo (IVIVE) pour prédire lesdits paramètres. Après une comparaison statistique, les résultats ont montré que l’approche 2 (c’est-à-dire « fup-adjusted model ») qui se base sur la captation hépatique facilitée par l’ALB, avait la meilleure performance prédictive. Cependant, l’approche 5 (c’est-à-dire « Extended Clearance Model ») qui se base sur le transport facilité, en était une très pertinente à appliquer pour les substrats de transporteurs membranaires. Lesdits substrats seraient potentiellement moins affectés par l’ALB. Ainsi, un arbre décisionnel a été proposé pour choisir rapidement et judicieusement la meilleure approche IVIVE servant à prédire la CLhin vivo pour chaque xénobiotique en présence de l’ALB. Dans un deuxième temps, les médicaments PER et FLU ont été sélectionnés à partir d’une collecte de données (N= 1907 médicaments) en fonction de certains critères (avoir un métabolisme exclusif ou prédominant dans le foie, pas de transport facilité par les transporteurs membranaires, une haute affinité pour les deux protéines ALB et AGP, et un ratio de liaison à l’AGP sur celle à l’ALB proche de l’unité). Cette sélection a été réalisée pour faire des expériences sur des foies isolés et perfusés de rats (IPRL), en présence et en absence des protéines ALB et AGP (c’est-à-dire quatre scénarios IPRL). Les résultats IPRL ont démontré que PER est faiblement à moyennement métabolisé (extraction hépatique= 0,2-0,7), tandis que FLU est fortement métabolisé (extraction hépatique= 0,8-0,99). Le modèle Michaelis-Menten a été ajusté aux cinétiques métaboliques, et différents paramètres Vmax, Km et Km, u ont été obtenus de ce modèle. À de faibles concentrations libres pour les deux médicaments (c’est-à-dire à des concentrations thérapeutiques) et en présence des protéines plasmatiques, les valeurs de CLint non liée ont augmenté pour PER (avec l’ALB et le mélange des deux protéines (MIX)) et FLU (avec l’ALB, l’AGP et le MIX) par rapport à celles obtenues du scénario sans protéine (sauf pour PER avec AGP, lesdites valeurs ont diminué). Par ailleurs, les calculs des ratios CLint (SANS versus AVEC protéine) ont permis d’indiquer l’occurrence d’une facilitation de la captation hépatique de médicaments par l’ALB ou l’AGP. Ces ratios ont aussi permis de vérifier si la cinétique métabolique pour PER et FLU suivait soit « l’hypothèse du médicament libre » soit celle de « la captation hépatique facilitée par les protéines plasmatiques ». Dans un dernier temps, une nouvelle approche prédictive de CLh (approche WO-to-MIX) est développée en se basant sur une nouvelle notion de liaison fractionnelle et en intégrant dans le « fup-adjusted model » de nouveaux paramètres tels que la fraction liée à l’ALB (fB-ALB) et celle liée à l’AGP (fB-AGP) à partir du scénario MIX. Ce modèle est basé sur la captation facilitée par l’ALB. Contrairement à l’approche WO-to-MIX, le « well-stirred model » (ou modèle conventionnel) est basé sur l’hypothèse du médicament libre. Ensuite, les paramètres Vmax et Km obtenus in situ pour PER et FLU lors des expériences IPRL sans protéines, ont été utilisés en combinaison avec le paramètre intrant de la fraction libre ajustée (fup-adjusted) pour le « fup-adjusted model » ou avec la fraction libre (fup) pour le « well-stirred model ». Une comparaison des performances prédictives globales des deux modèles a été faite. Les performances prédictives du nouveau modèle étaient prometteuses, en particulier pour FLU qui montrait le plus haut degré de captation hépatique médiée par l’ALB, par rapport au modèle conventionnel. L’approche WO-to-MIX est une première validation d’un nouveau modèle d’extrapolation proposé pour les médicaments comme FLU qui se lient à l’ALB et à l’AGP. Néanmoins, le modèle conventionnel reste utile à utiliser pour les médicaments comme PER. L’exactitude de prédiction était inférieure pour ce dernier médicament probablement parce que la captation hépatique par l’ALB ne semble pas être maximale, et, par conséquent, l’utilisation de fup-adjusted a surestimé la CLhin vivo. Par conséquent, plus de travail est nécessaire en particulier pour PER. Cette thèse démontre qu’une seule approche générique pour prédire la CLh n’existe pas. Néanmoins, le choix d’une approche IVIVE ayant une performance prédictive satisfaisante est maintenant possible. Les résultats de cette thèse contribuent à : 1) mieux comprendre les répercussions sur les paramètres PK/TK de la forte liaison des médicaments à l’ALB et à l’AGP ; 2) choisir la meilleure approche prédictive de CLh sur la base de l’affinité du xénobiotique (médicament ou contaminant) pour chacune des protéines plasmatiques et des mécanismes impliqués dans le foie ; et 3) prédire la CLh avec précision et exactitude des xénobiotiques qui se lient aux deux protéines plasmatiques. Ces approches IVIVE pour la CLh pourront assurément être intégrées dans des modèles PK/TK à base physiologique pour les xénobiotiques afin d’améliorer la prédiction de leur pharmacocinétique et d’accélérer le processus de développement de médicaments. / The prediction of pharmacokinetic/toxicokinetic (PK/TK) parameters such as intrinsic clearance (CLint) and hepatic clearance (CLh) for highly bound drugs is a major challenge in quantitative modeling. According to the ‘free drug hypothesis’, only the free drug can pass through the plasma membrane and the CLh of this drug is calculated according to its free fraction (fup). Nevertheless, the hepatic uptake facilitated by albumin (ALB) is a violation of the ‘free drug hypothesis’. This facilitated hepatic uptake is based on the possibility that the ALB-drug complex may provide additional drug intake to the hepatocytes. Thus, this could largely explain the underpredictions of CLh. In addition, some drugs can bind extensively in plasma, and to several plasma proteins such as ALB and alpha-1-glycoprotein acid (AGP). Thus, the high binding of the same drug to either ALB or AGP, or to both, could have distinct impacts on the prediction of these PK/TK parameters. However, no study has yet explored how to simulate the difference between these impacts. The main objective of this thesis is therefore to evaluate (with accuracy and precision) for a series of drugs, in the in vivo (or in situ) condition, these impacts in the presence of the two plasma proteins, jointly or separately. Also, it is important to verify if a generic model can be applied. This thesis is divided into three specific objectives. The first is to propose a decision tree to facilitate the selection of appropriate predictive approaches of CLhin vivo for drugs with different characteristics. The second is to assess the impacts of extensive binding to the two plasma proteins ALB and AGP on the CLh of two selected xenobiotics (perampanel (PER) and fluoxetine (FLU)); these drugs have strong affinities to both proteins and an exclusive (or predominant) metabolism in the liver. And the last objective is to develop and validate a new predictive model of CLh for xenobiotics with the potential to bind extensively to ALB as well as to AGP. Firstly, in vitro data obtained in humans were collected for 19 drugs (i.e. substrates of OAT2 and OATP1B1 transporters) and were then used in six in vitro-to-in vivo (IVIVE) extrapolation models to predict these PK/TK parameters. After a statistical comparison, the results showed that the approach 2 (i.e. ‘fup-adjusted model’) that is based on the ALB-facilitated hepatic uptake, had the best predictive performance. However, the approach 5 (i.e. ‘Extended Clearance Model’) that is based on the membrane transporter-mediated uptake, was very relevant to apply for the substrates of membrane transporters. These substrates would potentially be less affected by ALB. Thus, a decision tree has been proposed to quickly and judiciously select the best IVIVE approach to predict CLhin vivo for each xenobiotic in the presence of ALB. Secondly, the PER and FLU drugs were selected from a data collection of 1907 drugs depending on certain criteria (exclusive or predominant metabolism in the liver, no transport facilitated by membrane transporters, high affinity for the two proteins ALB and AGP, and having a binding ratio between AGP and ALB close to the unity). This selection was made to conduct experiments using the isolated and perfused rat liver (IPRL) apparatus, in the presence, and in the absence of the ALB and AGP proteins (i.e. four IPRL scenarios). The IPRL results showed that PER is low to moderately metabolized (hepatic extraction= 0.2-0.7), while FLU is highly metabolized (hepatic extraction= 0.8-0.99). The Michaelis-Menten model was fitted to the obtained metabolic kinetics, and different parameters Vmax, Km and Km, u were obtained from the model. At low free concentrations for both drugs (i.e. therapeutic concentrations) and in the presence of plasma proteins, the values of unbound CLint increased for PER (with ALB and the mixture of the two proteins (MIX)) and FLU (with ALB, AGP and MIX); when compared to those obtained from the protein-free scenario (except for PER with AGP, the unbound CLint values decreased). In addition, the calculations of CLint ratios (WITHOUT versus WITH protein) indicated the occurrence of a hepatic uptake facilitated by ALB or AGP. These ratios also helped in verifying whether the metabolic kinetics for PER and FLU followed either ‘the free drug hypothesis’ or that of ‘plasma protein-facilitated hepatic uptake’. Finally, a new predictive approach of CLh (WO-to-MIX approach) was developed based on a new notion of fractional binding and incorporating new parameters such as the ALB bound fraction (fB-ALB) and the AGP bound fraction (fB-AGP) from the MIX scenario into the ‘fup-adjusted model’. This model is based on the ‘ALB-facilitated hepatic uptake’. Unlike the WO-to-MIX approach, the ‘well-stirred model’ is based on ‘the free drug hypothesis’. Then, the Vmax and Km parameters that were obtained in situ for PER and FLU from the protein-free IPRL experiments, were used in combination with the fup-adjusted input parameter for the ‘fup-adjusted model’ or with the free fraction (fup) for the ‘well-stirred model’. A comparison of the two models’ overall predictive performances was made. The predictive performances of the new model were promising for FLU, which showed the highest degree of ‘ALB-mediated hepatic uptake’, compared to the conventional model. This WO-to-MIX approach is a first validation of a novel extrapolation model suggested for drugs such as FLU that bind to both ALB and AGP. The well-stirred model remains however a useful tool to predict the clearance for drugs such as PER. The prediction accuracy was lower for the latter drug probably because the ALB-mediated hepatic uptake does not seem to be maximal, and, hence, the use of fup-adjusted has overestimated its CLhin vivo. Therefore, more work is needed particularly for PER. This thesis shows that a generic approach to predict the CLh in vivo does not exist. Nevertheless, the choice of an IVIVE approach with satisfactory predictive performances is now possible. The results of this thesis contribute to: 1) better understand the impacts on the PK/TK parameters of extensive drug binding to ALB and AGP; 2) choose the best predictive approach to CLh based on the affinity of xenobiotic (drug or contaminant) to each of the plasma proteins and the mechanisms involved in the liver; and 3) predict accurately and with precision the output CLh of xenobiotics that bind to the two plasma proteins. These IVIVE approaches for CLh can certainly be integrated into physiologically based PK/TK models for xenobiotics to improve the prediction of their pharmacokinetics and to accelerate the drug development process.

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie chronique affectant 3 millions de canadiens. Une augmentation progressive de la résistance à l'insuline (RI) et de la sécrétion d'insuline est observée chez des sujets normoglycémiques bien avant la survenue du DT2. La moindre fonction du tissu adipeux blanc (TAB) est centrale dans le développement du DT2 car elle accroît le flux d'acides gras vers les tissus périphériques, y induisant la RI, l'hyperinsulinémie et l’inflammation chronique. Durant ma maîtrise, nous avions démontré que les lipoprotéines de basses densité (LDL) natifs réduisent la différentiation et la fonction des adipocytes et induisent la dysfonction du TAB humain. De plus, nous avions montré qu'un taux plasmatique élevé d'apolipoprotéine B (apoB), indiquant un nombre élevé d'apoB-lipoprotéines dont principalement les LDL, est associé à la RI, la sécrétion d'insuline gluco-stimulée (SIGS) élevée, la clairance plasmatique retardée des gras alimentaires et la moindre fonction du TAB chez 81 sujets obèses non diabétiques. Afin de déterminer si l'apoB plasmatique permet aussi d'identifier les sujets obèses répondant le mieux à une diète hypocalorique en termes de réduction des facteurs de risque du DT2, nous avons testé l'effet d'une intervention hypocalorique de six mois. Parmis 59 sujets qui ont terminés l’intervention, nous avons mesuré une diminution de la SIGS et une amélioration de la fonction du TAB seulement chez les sujets avec apoB plasmatique élevée. Toutefois, les mécanismes de ces effets délétères possibles des apoB-lipoprotéines n'avaient pas été explorés. Des évidences suggèrent que l'activation chronique de l'inflammasome Nucleotide- binding domain and Leucine-rich repeat Receptor containing a Pyrin domain 3 (NLRP3) et la sécrétion d'interleukine-1b (IL-1b) promeuvent la dysfonction du TAB et la RI systémique. Cependant, les signaux métaboliques induisant l'inflammasome NLRP3 dans le TAB humain sont inconnus. Afin de tester si l'activation de l'inflammasome NLRP3/système IL-1b participe au mécanisme précédemment identifié liant les apoB-lipoprotéines et les facteurs de risque du DT2, nous avons investigué l'association et l'effet direct des apoB-lipoprotéines sur le système IL-1b. Nous avons démontré chez 81 sujets obèses non-diabétiques que les individus avec apoB plasmatique élevée montrent un taux élevé d'antagoniste du récepteur à l'IL-1 (IL-1Ra) plasmatique, un marqueur de l'activation systémique de la voie IL-1b. Aussi, les associations entre l'apoB plasmatique élevée et la RI et SIGS étaient statistiquement dépendantes des niveaux d'IL-1Ra plasmatique. Dans une autre population de 32 sujets, nous avons démontrés que ceux avec apoB plasmatique élevée ont une sécrétion augmentée d'IL-1b par le TAB ex vivo. Les relations entre l'apoB plasmatique, la clairance plasmatique retardée des gras alimentaires et la sécrétion de C-peptide glucostimulée étaient statistiquement dépendantes de la sécrétion d'IL- 1b du TAB. Puis, les LDL natifs ajoutés au TAB ex vivo induisaient la sécrétion d'IL-1b, y agissant en tant que signaux d'amorçage (1er signal de l'inflammasome NLRP3/système IL-1b). En conclusion, ces résultats suggèrent que les LDL natifs, forme principale d'apoB- lipoprotéines, régulent positivement l'inflammasome NLRP3 du TAB humain. Ceci pourrait expliquer la dysfonction du TAB, l'hyperinsulinémie et l'incidence élevée du DT2 présents chez les sujets avec apoB plasmatique élevée. En outre, ils suggèrent que l'apoB plasmatique élevée pourrait être un biomarqueur permettant d'identifier les sujets obèses qui répondraient le mieux à la diète hypocalorique afin de réduire le risque de DT2. / Type 2 diabetes (T2D) is chronic disease affecting 3 million Canadians and a new case is diagnosed every 3 minutes in Canada. Long before the onset of T2D, a progressive increase in insulin resistance (IR) and insulin secretion is observed in normoglycemic subjects. A decreased white adipose tissue (WAT) function is central to the development of T2D as it promotes an increased fatty acid flux to peripheral tissues, inducing IR, hyperinsulinemia and chronic inflammation. During my MSc, we reported that low density lipoproteins (LDL) reduce the differentiation and function of adipocytes and induce the dysfunction of human WAT. Moreover, we showed that elevated plasma apolipoprotein B (apoB), indicating high numbers of circulating apoB-lipoproteins mainly in the form of LDL, is associated to IR, elevated glucose-induced insulin secretion (GIIS), delayed postprandial plasma clarance of fat and reduced WAT function in 81 non-diabetic obese subjects. To explore whether apoB also identifies obese subjects who best respond to weight loss to reduce risk factors for T2D, we tested the effect of a 6 months hypocaloric diet. We showed in the 59 completers of the hypocaloric intervention that the decrease in GIIS and increase in WAT function were significant in subjects with high plasma apoB but not in subjects with low plasma apoB. However, the mechanism underlying the negative effects apoB-lipoproteins was yet unexplored. Chronic activation of the Nucleotide-binding domain and Leucine-rich repeat Receptor containing a Pyrin domain 3 (NLRP3) inflammasome and secretion of interleukin-1b (IL-1b) promote WAT dysfunction and systemic IR. However, endogenous metabolic signals that induce the activation of WAT NLRP3 inflammasome are unknown. To test if the activation of the NLRP3 inflammasome/ IL-1b system is an underlying mechanism linking apoB- lipoproteins to risk factors for T2D, we examined the association and direct effect of apoB- lipoproteins on the IL-1b system. We observed in our cohort of 81 non-diabetic obese subects that subjects with high plasma apoB have higher plasma IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra), which is an marker of systemic activation of the Il-1b pathway. Furthermore, the associations between high plasma apoB and IR and GIIS were statistically dependent on plasma IL-1Ra. Additionnaly, in a separate population of 32 subjects, we demonstrated that subjects with high plasma apoB have higher ex vivo WAT IL-1b secretion. The relation between plasma apoB and delayed postprandial plasma fat clearance and elevated glucose-induced C-peptide secretion were statistically dependent on WAT IL-1b secretion. Finally, native LDLs directly induce IL- 1b secretion from ex vivo WAT, acting primarily as priming signals (i.e. the first signal leading to activation of the NLRP3 inflammasome/ IL-1b system). In conclusion, the findings from this thesis suggest that native LDL, the main form of apoB-lipoproteins, upregulate human WAT NLRP3 inflammasome. This may explain WAT dysfunction, hyperinsulinemia and higher incidence of T2D in subjects with high plasma apoB. Moreover, they suggest that high apoB may serve as biomarker to identify obese subjects who best respond to a hypocaloric-intervention to reduce the risk of T2D.