Un défi majeur en cancérologie est le traitement des tumeurs mammaires dites triple-négatives (ER-, PR-, HER2-). Elles sont le plus souvent résistantes aux traitements conventionnels et présentent un haut risque de récidive. De plus, l’absence de cibles thérapeutiques ne permet pas le développement de thérapie spécifique. 78% de ces tumeurs expriment faiblement la claudine 1 et sont de très mauvais pronostic. Cette protéine est impliquée dans l'adhérence des cellules entre elles et pourrait jouer un rôle suppresseur de tumeur dans les cancers mammaires. Dans ce contexte, nous étudions si sa réexpression pourrait être une piste de traitement. Au laboratoire, nous avons développé des dérivés de la famille des thiazolidinediones (TZD) qui stimulent l’expression de la claudine 1 et induisent l’apoptose des cellules cancéreuses mammaires. Les objectifs de ma thèse ont consisté 1) à déterminer l’implication de la claudine 1 dans l’effet pro-apoptotique de ces composés 2) à l’étude de leurs mécanismes d’action 3) évaluer si l’expression de la claudine 1 pourrait sensibiliser les cellules cancéreuses triple-négatives aux agents de chimiothérapie. Au cours de cette thèse, nous avons montré que la surexpression de la claudine 1 et le composé Δ2-TGZ induisent l’apoptose des cellules triple-négatives « claudin 1-low » MDA-MB-231 et Hs578T. De plus, la claudine 1 est impliquée dans l’effet pro-apoptotique de la Δ2-TGZ dans les cellules MDA-MB-231. Par ailleurs, nous avons démontré que les dérivés TGZ, la Δ2-TGZ et l’AB186, agissent de manière précoce en modifiant la morphologie des cellules suivie d’une réexpression de la claudine 1 membranaire et d’une inhibition de la migration cellulaire avant même d’induire la mort cellulaire par apoptose. De plus, la surexpression de la claudine 1 inhibe la migration cellulaire associée à la perte des fibres de stress et la formation des jonctions intercellulaires. Nous avons également montré que la réexpression de la claudine 1 sensibilise les cellules MDA-MB-231 à l’agent de chimiothérapie, le 5-FU. L’ensemble des résultats de thèse a permis de mieux comprendre le mécanisme d’action de la Δ2-TGZ et de l’AB186 sur les cellules cancéreuses mammaires mais aussi d’identifier la claudine 1 comme cible potentielle prometteuse dans les cellules triple-négatives « claudin 1-low » / A major challenge in oncology is the treatment of triple-negative breast cancer (ER-, PR-, HER2-) as no targeted therapy are available. These tumors present often a chemotherapy resistance and a higher relapse incidence. 78% of them do not express claudin 1 and display a poor prognosis. Claudin 1 is involved in cell-cell adhesion and may be a tumor suppressor gene in breast cancer. In this context, we study if claudin 1 re-expression could be a possible approach. In the laboratory, we developed derivatives thaziolidinediones (TZD) compounds, which increase claudin 1 expression and lead to apoptosis of breast cancer cells. The goals of my thesis is 1) to characterize the involvement of claudin 1 in their pro-apoptotic effect 2) to study their mechanism of action 3) to determine if claudin 1 could sensitize the TNBC cells to the chemotherapy agents. During my thesis, we showed that claudin 1 overexpression and the compound Δ2-TGZ induce apoptosis of TNBC « claudin 1-low » MDA-MB-231 and Hs578T cells. Claudin 1 is involved in the pro-apoptotic effect of Δ2-TGZ in MDA-MB-231 cells. Then, we demonstrated that Δ2-TGZ and AB186 lead to early action through a modification of cell morphology followed an expression of claudin 1 at the membrane and an inhibition of cell migration before the apoptosis process. In addition, claudin 1 overexpression decreases the cell migration through the loss of stress fibers and the formation of cell junctions. We showed that claudin 1 overexpression potentialize the pro-apoptotic effect of Δ2-TGZ in MDA-MB-231 cells. Finally, we observed that claudin 1 sensitize the MDA-MB-231 cells to 5-FU. In fine, our data allowed a better understanding of Δ2-TGZ and AB186 mechanism of action and identification of claudin 1 as a promising target in TNBC « claudin 1-low »

Introdução: A dermatite atópica (DA) é uma doença cutânea inflamatória crônica que cursa em surtos. Possui manifestação clínica variável, mas o prurido e a xerose são características frequentes, e pode estar associada a outras manifestações extra-cutâneas de atopia. Pacientes com DA apresentam maior risco de infecções por bactérias e vírus, destacando-se a erupção variceliforme de Kaposi, causada por herpes simples. A DA mostra-se como exemplo de dermatose com comprometimento da barreira cutânea, aliado a disfunção imunológica. São descritas alterações das proteínas da barreira cutânea na DA (filagrina e claudinas ), relacionadas ao maior risco de infecção . Objetivo: Avaliar a expressão de proteínas relacionadas à barreira cutânea como a filagrina, e as claudinas -1 e -4 na pele de pacientes adultos com dermatite atópica, acompanhados no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Métodos: 32 indivíduos com diagnóstico de DA (estabelecido pelos critérios de Hanifin & Rajka) e 23 controles (indivíduos sem DA), maiores de 18 anos, foram submetidos a biópsias cutâneas. Os indivíduos com DA foram biopsiados em dois pontos, tanto na pele lesada, quanto na pele não-lesada. O material obtido foi analisado por imuno-histoquímica, através de marcadores específicos para filagrina, claudina-1 e claudina-4. As lâminas foram digitalizadas pelo Panoramic Scan - 3DHistech - Hungria, e as imagens analisadas pelo software Image Pro Plus 4,5, quanto à intensidade da expressão do marcador. A espessura média da epiderme do local estudado foi também avaliada. O grupo com DA foi também analisado quanto à gravidade da doença (EASI), níveis séricos de IgE e grau de eosinofilia. Resultados: Houve redução da expressão da filagrina na pele de doentes de DA em relação aos controles, tanto na pele com lesão quanto na pele sem lesão. Demonstrou-se correlação inversa na expressão da filagrina, tanto com relação à gravidade da doença quanto à espessura da epiderme. A análise das claudinas -1 e -4 demonstrou redução de ambas na pele dos doentes de DA, mas não houve correlação com a gravidade, espessura da epiderme, níveis de IgE sérica ou eosinofilia. Conclusão: No adulto com dermatite atópica, existe redução da expressão das proteínas relacionadas à barreira cutânea, como a filagrina e as claudinas -1 e -4. A redução da expressão da filagrina relacionou-se inversamente com a gravidade da doença, e com a espessura da epiderme, sugerindo cronicidade das lesões. Houve redução da expressão das claudinas -1 e -4, sem relação com a gravidade da doença, espessura da epiderme, eosinofilia ou com os níveis séricos de IgE / Introduction: Atopic dermatitis (AD) is a chronic, inflammatory dermatosis with ocasional flares. Its clinical features are variable, but pruritus and xerosis are frequent, and the disease may be associated to extracutaneous atopy. Patients with AD have increased risk for bacterial or viral infection, with emphasis on eczema herpeticum due to herpes simplex. AD is an example of a compromised skin barrier, allied to na imune dysfunction. There are reports on efective proteins of the skin barrier (filaggrin and claudins), related to increased risk for infection. Objectives: To evaluate the expression of proteins related to the skin barrier, such filaggrin and claudins-1 and-4 in the skin of adults with AD, followed at the Department of Dermatology, University of Sao Paulo Medical School. Methods: 32 individuals diagnosed as AD, according to Hanifin & Rajka\'s criteria, and 23 non-atopic controls, above the age of 18, were biopsied. Individuals with AD were biopsied in two different sites (lesional and nonlesional skin). The specimens were analyzed by immunohistochemistry through specific markers for filaggrin, claudins 1 and 4. The slides were scanned utilizing Panoramic Scan - 3DHistech - Hungary, and images analyzed by Image Pro Plus 4,5 for the intensity of each marker. The mean epidermal thickness was also evaluated. AD patients were also analyzed for disease severity (EASI), circulating IgE levels and eosinophilia. Results: In lesional and nonlesional skin of AD patients there was a reduced expression of filaggrin, when compared to nonatopic controls. There was an inverse correlation of filaggrin expression with disease severity and epidermal thickness. In the skin of AD individuals, there was reduced expression of claudins 1-and-4, which did not correlate with disease severity, epidermal thickness or eosinophilia. Conclusion: In adults with AD, there is reduced expression of skin barrier proteins, such as filaggrin, claudins 1 and 4. The reduction of filaggrin expression had an inverse correlation with disease severity and epidermal thickness, suggesting disease chronicity. There was reduction of claudins 1 and 4, with no relation with disease severity, epidermal thickness, circulating IgE levels or eosinophilia

Introdução: A dermatite atópica (DA) é uma doença cutânea inflamatória crônica que cursa em surtos. Possui manifestação clínica variável, mas o prurido e a xerose são características frequentes, e pode estar associada a outras manifestações extra-cutâneas de atopia. Pacientes com DA apresentam maior risco de infecções por bactérias e vírus, destacando-se a erupção variceliforme de Kaposi, causada por herpes simples. A DA mostra-se como exemplo de dermatose com comprometimento da barreira cutânea, aliado a disfunção imunológica. São descritas alterações das proteínas da barreira cutânea na DA (filagrina e claudinas ), relacionadas ao maior risco de infecção . Objetivo: Avaliar a expressão de proteínas relacionadas à barreira cutânea como a filagrina, e as claudinas -1 e -4 na pele de pacientes adultos com dermatite atópica, acompanhados no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Métodos: 32 indivíduos com diagnóstico de DA (estabelecido pelos critérios de Hanifin & Rajka) e 23 controles (indivíduos sem DA), maiores de 18 anos, foram submetidos a biópsias cutâneas. Os indivíduos com DA foram biopsiados em dois pontos, tanto na pele lesada, quanto na pele não-lesada. O material obtido foi analisado por imuno-histoquímica, através de marcadores específicos para filagrina, claudina-1 e claudina-4. As lâminas foram digitalizadas pelo Panoramic Scan - 3DHistech - Hungria, e as imagens analisadas pelo software Image Pro Plus 4,5, quanto à intensidade da expressão do marcador. A espessura média da epiderme do local estudado foi também avaliada. O grupo com DA foi também analisado quanto à gravidade da doença (EASI), níveis séricos de IgE e grau de eosinofilia. Resultados: Houve redução da expressão da filagrina na pele de doentes de DA em relação aos controles, tanto na pele com lesão quanto na pele sem lesão. Demonstrou-se correlação inversa na expressão da filagrina, tanto com relação à gravidade da doença quanto à espessura da epiderme. A análise das claudinas -1 e -4 demonstrou redução de ambas na pele dos doentes de DA, mas não houve correlação com a gravidade, espessura da epiderme, níveis de IgE sérica ou eosinofilia. Conclusão: No adulto com dermatite atópica, existe redução da expressão das proteínas relacionadas à barreira cutânea, como a filagrina e as claudinas -1 e -4. A redução da expressão da filagrina relacionou-se inversamente com a gravidade da doença, e com a espessura da epiderme, sugerindo cronicidade das lesões. Houve redução da expressão das claudinas -1 e -4, sem relação com a gravidade da doença, espessura da epiderme, eosinofilia ou com os níveis séricos de IgE / Introduction: Atopic dermatitis (AD) is a chronic, inflammatory dermatosis with ocasional flares. Its clinical features are variable, but pruritus and xerosis are frequent, and the disease may be associated to extracutaneous atopy. Patients with AD have increased risk for bacterial or viral infection, with emphasis on eczema herpeticum due to herpes simplex. AD is an example of a compromised skin barrier, allied to na imune dysfunction. There are reports on efective proteins of the skin barrier (filaggrin and claudins), related to increased risk for infection. Objectives: To evaluate the expression of proteins related to the skin barrier, such filaggrin and claudins-1 and-4 in the skin of adults with AD, followed at the Department of Dermatology, University of Sao Paulo Medical School. Methods: 32 individuals diagnosed as AD, according to Hanifin & Rajka\'s criteria, and 23 non-atopic controls, above the age of 18, were biopsied. Individuals with AD were biopsied in two different sites (lesional and nonlesional skin). The specimens were analyzed by immunohistochemistry through specific markers for filaggrin, claudins 1 and 4. The slides were scanned utilizing Panoramic Scan - 3DHistech - Hungary, and images analyzed by Image Pro Plus 4,5 for the intensity of each marker. The mean epidermal thickness was also evaluated. AD patients were also analyzed for disease severity (EASI), circulating IgE levels and eosinophilia. Results: In lesional and nonlesional skin of AD patients there was a reduced expression of filaggrin, when compared to nonatopic controls. There was an inverse correlation of filaggrin expression with disease severity and epidermal thickness. In the skin of AD individuals, there was reduced expression of claudins 1-and-4, which did not correlate with disease severity, epidermal thickness or eosinophilia. Conclusion: In adults with AD, there is reduced expression of skin barrier proteins, such as filaggrin, claudins 1 and 4. The reduction of filaggrin expression had an inverse correlation with disease severity and epidermal thickness, suggesting disease chronicity. There was reduction of claudins 1 and 4, with no relation with disease severity, epidermal thickness, circulating IgE levels or eosinophilia

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3β e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e β-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de β-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3β de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3β and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and β-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of β-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3β. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3β e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e β-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de β-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3β de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR. / Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3β and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and β-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of β-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3β. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment.

La découverte d’un candidat médicament repose sur l’identification de hits, présentant des propriétés physico-chimiques adéquates pour leur optimisation. Le criblage à haut débit et l’approche par fragments sont deux techniques couramment utilisées lors de cette étape d’identification et elles ont été mises en œuvre au cours de ma thèse dans le but de découvrir de nouveaux composés ciblant d’une part le complexe CD81/CLDN-1 pour empêcher l’entrée du virus de l’hépatite C (VHC) dans les hépatocytes et d’autre part EthR2, un régulateur transcriptionnel mycobactérien, afin de potentialiser l’activité d’un antituberculeux sur les souches résistantes de M. tuberculosis.Dans une première partie, un criblage à haut débit sur le complexe CD81/CLDN-1 a permis d’identifier des modulateurs en série thiéno[2,3-c]pyrazole. Ces composés ont été pharmacomodulés et un composé spécifique de l’étape d’entrée du VHC, non toxique et présentant une activité submicromolaire a pu être ainsi identifié. Cette sonde pharmacologique permettra de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le processus d’entrée virale.Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à la conception de nouveaux fragments dits privilégiés. Ainsi, le développement des voies de synthèse, sous irradiation micro-onde, de deux entités moléculaires, le noyau 1,4-benzodiazepine-2,5-dione et le noyau spirohydantoïne, nous a permis d’obtenir 34 composés originaux. Afin d’évaluer le potentiel de cette stratégie, une librairie virtuelle de fragments a été générée et son criblage in silico sur la protéine MDM2 a été effectué. La mesure in vitro de l’activité des hits identifiés permettra de valider l’intérêt de cette approche pour la découverte de nouveaux ligands ciblant les interactions protéine-protéine.Dans une troisième partie, des inhibiteurs d’un répresseur transcriptionnel mycobactérien impliqué dans la potentialisation de l’activité de l’éthionamide ont été développés. A l’issue d’un criblage de 960 fragments, l’identification d’un hit en série tropinone, et sa cocristallisation avec la protéine EthR2, a permis d’entamer une optimisation rationnelle qui a conduit à l’obtention rapide de composés présentant de meilleures activités. / The discovery of drug candidates is based on the identification of hits with appropriated physico-chemical properties for further development. High throughput screening and fragment-based drug discovery approaches are two strategies commonly used for this identification. These strategies were applied during my PhD research work for identifying not only new modulators of the CD81/CLDN-1 complex to prevent entry of the Hepatitis C virus (HCV) into hepatocytes but also inhibitors of the mycobacterial transcriptional repressor, called EthR2, to boost ethionamide antibacterial activity against resistant strains of M. tuberculosis.Firstly, a high throughput screening assay was developed to identify molecules bearing a thieno[2,3-c]pyrazole scaffold that modulate the CD81/CLDN-1 complex. The structure-activity relationships allowed us to design and synthesize one non-toxic compound that inhibits viral entry with an IC50 in the submicromolar range. This best analog will be used as pharmacological tool to understand the molecular mechanism involving the CD81/CLDN-1 interaction during virus entry.Secondary, we worked on the design and synthesis of a new generation of fragments called privileged fragments. We focused our interest on the 1,4-benzodiazepine-2,5-dione and spirohydantoin scaffolds and using microwave-assisted conditions 44 original privileged fragments have been synthesized. To further illustrate the potential of our privileged fragments, a virtual focused library has been generated and screened in silico on MDM2 protein. The in vitro evaluation of the identified hits will allow us to validate our approach and to show the potential of our privileged fragments for the discovery of new hits against protein-protein interactions.Finally, inhibitors of a new mycobacterial transcriptional repressor involved in the boosting of ethionamide activity have been developed. Screening of 960 fragments allowed us to identify a hit bearing a tropinone scaffold which was cocrystallized with EthR2. A rational design from this cocrystal structure led rapidly to more potent ligands.