L’imagerie moléculaire est aujourd’hui un outil non-invasif essentiel pour le diagnostic de nombreuses pathologies. Les traceurs technétiés sont actuellement les plus répandus car le 99mTc est facilement disponible, abordable et présente des caractéristiques idéales pour l’imagerie. Néanmoins, le développement de traceurs efficaces nécessite un long et coûteux processus d’optimisation souvent empirique. Dans ce contexte, nous avons entrepris le développement d’une plateforme technétiée conçue pour présenter au sein de sa structure de nombreux sites potentiels de fonctionnalisation et compatible avec une approche combinatoire.Dans un premier temps, un ensemble de 12 ligands N3X (X = N, O, S) a été préparé. Chacun d’entre eux présente dans sa structure un motif triazole introduit par chimie-click et intervenant dans la complexation du métal par un de ses atomes d’azote. Nous avons ensuite évalué l’aptitude de ces ligands à chélater le cœur oxotechnétium dans des conditions douces (5 min, température ambiante) compatible avec une utilisation en milieu hospitalier. Le complexe TriaS-99mTc a été formé quantitativement et sa stabilité en plasma murin a été étudiée. Il s’est révélé stable à plus de 90% dans le plasma murin après 6h d’incubation. L’étude in vivo de ce complexe a par la suite révélé une élimination efficace du milieu circulant par la voie urinaire avec une dégradation minoritaire.A titre d’illustration, nous avons ensuite engagé la structure TriaS dans deux approches distinctes pour le développement de traceurs de la néoangiogenèse tumorale en ciblant l’intégrine αvβ3. D’une part, dans le cadre d’une approche intégrée, plusieurs complexes fonctionnalisés, mimes de RGD, ont été obtenus. Dans chaque cas, l’adjonction de groupements fonctionnels n’a pas affecté l’efficacité de la chélation. En outre la stabilité en plasma est maintenue à un niveau très correct. D’autre part, nous avons développé une approche bifonctionnelle dans laquelle le motif c(RGDfK) joue le rôle de molécule ciblante. Dans ce cas, un motif variable (ici un PEG) peut être introduit par chimie combinatoire pour moduler la solubilité, la biodistribution, et l’excrétion des traceurs. / Molecular imaging is an essential non-invasive tool usable for diagnosis and characterisation of many diseases. Technetium-based tracers are the most popular ones due to disponibility, cost and radiochemical properties of 99mTc. Nevertheless, effective tracers development requires a long, expensive, and mainly empirical optimisation process. This context prompted us tu carry on the development of a new technetium structure which exhibits lots of potential functionalisation spots compatible with a combinatorial approach. We synthesised 12 N3X (X = N, O, S) different ligands. Each of them includes a triazole moiety, (formed via a click-chemistry reaction), which is involved in the metal complexation that implies one of its nitrogen atoms. Then we evaluated their ability to readily form oxotechnetium complexes in conditions that are compatible with medical use in hospital. One complex was formed in quantitative yields and its stability in mice plasma was investigated. A complex called TriaS-99mTc, stable to more than 90% after 6h incubation, was selected. In vivo study of TriaS-99mTc revealed an efficient blood clearance via the urinary excretion pathway with very low degradation. As an application, we used this structure for the development of tracers that target integrin αvβ3, a known biomarker of tumor neoangiogenesis. First, we synthesised functionnalised TriaS-based integrated complexes. Fonctionnal modification of TriaS by addition of side chains and substituents did not affect its ability to chelate oxotechnetium quantitatively. In addition, its stability in mice plasma was satisfactory. We also developped a bifonctionnal approach using c(RGDfK) peptide as the targeting biomolecule. In this way, a variable moiety (herein a PEG moiety) can be inserted in the structure through click-chemistry in order to modulate tracers solubility, biodistribution and excretion.

No capítulo 1 apresentamos uma síntese eficiente de compostos 5-organoteluro-1H- 1,2,3-triazóis realizada via reação de cicloadição [3+2] entre azidas orgânicas e alquinos substituídos com organotelúrio. Além disso, os 5-organoteluro-1H-1,2,3-triazóis foram funcionalizados na posição 5 do anel triazólico por reação de acoplamento cruzado de Sonogashira. A regioquímica dos produtos de cicloadição foram descritas com base em experimentos de RMN, cálculos teóricos e cristalografia de raio-x. Apresentamos uma proposta mecanística para a cicloadição mediada por cobre, baseada em experimentos de espectrometria de massas de alta resolução. No capítulo 2, investigamos a eficiência de reações one-pot com indol, cloreto de oxalila e diferentes nucleófilos para obtermos derivados do indol-3-glioxila em condições adequadas. Do mesmo modo, envolvendo a adição de azidas orgânicas, levando à síntese de indol-3-glioxil-1,2,3-triazóis, os produtos foram obtidos com rendimentos que variaram de 59 a 85%. / In chapter 1 we present an efficient synthesis of 5-organotelluro-1H-1,2,3-triazole compounds that was accomplished via the [3+2]-cycloaddition reaction of organoazides and organotelluro alkynes. Additionally, 5-organotelluro-1H-1,2,3-triazoles were readily functionalized at the 5-position via the Sonogashira cross-coupling reaction, leading to highly functionalised triazoles. The regiochemistry of the products was assessed by bidimensional NMR experiments, theoretical calculations and x-ray crystallography. We presented a mechanistic proposal for the cycloaddition mediated by copper, based on high resolution mass spectrometry experiments. In chapter 2 we investigated a general and efficient reaction of indole with oxalyl chloride and nucleophiles providing indole-3-glyoxyl derivatives which has been developed in mild conditions. In the same fashion, the other reaction involved the addition of organic azides leading to the synthesis of indole-3-glyoxyl-1,2,3-triazoles, which proceeds smoothly generating the products in moderate to high yields.

Cette étude concerne le développement d’un dispositif innovant de type biocapteur, pour le diagnostic et le traitement local de cancers précoces. Cette technologie vise à diagnostiquer au plus tôt certains cancers, afin de les traiter de façon beaucoup plus efficace, en comparaison avec les techniques actuelles, souvent longues et mutilantes. Des microplots de silice mésoporeuse, fonctionnalisés azotures, sont déposés par impression jet d’encre (IJP) à la surface de fibres optiques. Le matériau présente une porosité auto-organisée, grâce au mécanisme d’auto-assemblage induit par évaporation (EISA). Par la suite, les microplots azotures sont fonctionnalisés spécifiquement par chimie click (click chemistry) par reaction avec des molécules alcynes. Dans le cas du diagnostic, cette fonctionnalisation permet le greffage de protéines et d’anticorps capables de reconnaître les marqueurs surexprimés à la surface des cellules cancéreuses. Les protéines et anticorps sont préalablement marqués par des fluorochromes, pour induire un transfert d’énergie (effet FRET ou Fluorescence Resonance Energy Transfer) lors de la reconnaissance des marqueurs cancéreux. Le principe de détection du dispositif repose ainsi sur une modification de la signature de fluorescence. Dans le cas de la thérapie, des photosensibilisateurs (PS) sont greffés sur les microplots pour permettre un traitement local par photothérapie dynamique (PDT).L’objectif global de l’étude vise à améliorer la sensibilité de détection du dispositif pour le diagnostic et à montrer l’efficacité de traitement dans le cas de la thérapie. Pour cela, les protocoles de réaction click et de greffage des protéines ont été optimisés et l’influence de la structuration de la porosité a été étudiée. Enfin, la sensibilité du dispositif a été caractérisée en fonction de plusieurs paramètres (type de matériaux, type de cellules cancéreuses, etc.). / This study focuses on the development of a new biosensor device for the diagnosis and local treatment of precocious tumors. This technology aims to diagnose cancers at an early stage to increase the treatment efficiency compared to existing techniques that are usually damaging. Mesoporous silica microdots with azide functions are deposited onto the surface of optical fibers using the inkjet-printing (IJP) process. The material shows a self-organized porosity, due to the evaporation-induced self-assembly (EISA) mechanism. Then, the azide microdots can be further functionalized specifically using click chemistry by reaction with alkyne precursors. For the diagnosis, the functionalization allows the grafting of proteins and antibodies capable of recognizing the increase in marker concentration at the surface of cancerous cells. These proteins and antibodies are labelled with fluorophores to induce a fluorescence energy transfer (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) with the recognition of tumorous markers. The detection principle is based on the modification change of the fluorescence signature. For the therapy, photosensitizers (PS) are anchored onto the microdots to allow the local treatment using photodynamic therapy (PDT). The main aim of this study was to optimize the device sensitivity concerning the diagnosis step, and to show the treatment efficiency concerning the therapy step. On that purpose, the protocols of click reaction and the grafting of proteins have been optimized, which are also influenced by the porosity organization that has been studied. Finally, the device sensitivity has been characterized as a function of multiple factors (materials, cancer cells type, etc.).

Le design et l’ingénierie de nanoparticules d’or (AuNPs) polyfonctionnelles suscitent un intérêt considérable en vue d’applications en nanomédecine, reconnaissance moléculaire, dans le domaine des capteurs et en catalyse dans un environnement aqueux. Cette thèse a été dédiée à une variété de fonctionnalisations, en particulier à l’aide de la méthode “click” impliquant la catalyse par le cui vre (I) de lacycloaddition des alcynes terminaux avec les azotures avec le catalyseur [Cu(hexabenzyltren)] Br pour l’introduction de polyéthylène glycol, carborane,ferrocène, coumarine, cyclodextrine, médicaments et molécules fluorescentes sur les AuNPs. Les ligands dits “click”, c’est-à-dire des 1,2,3-triazoles fonctionnalisés en positions 1,4 et formés de cette façon ont été ici largement utilisés afin de stabiliser des AuNPs pour des applications biomédicales et catalytiques en collaboration. / The design and molecular engineering of multi-functional gold nanoparticles (AuNPs) is of considerable interest towards applications in nanomedicine, molecular recognition, sensing and catalysis in aqueous environments. This thesis has been devoted to a variety of functionnalizations, in particular with the copper(I)-catalyzed Alkyne Azide cycloaddition (CuAAC) using thecatalyst [Cu(I)(hexabenzyltren] Br for the introduction of polyethylene glycol,carborane, ferrocene, coumarin, cyclodextrin, drugs and fluorescent probes. The so called “clicked” ligands, 1,4 -bifunctional triazoles, that were formed in this way have been exensively used to stabilize AuNPs for biomedical and catalytic collaborative applications.

In der vorliegenden Dissertation wurden mittels kontrolliert radikalischer Polymerisationstechniken alkinhaltige Blockcopolymere synthetisiert. In effizienten Cu(I)-katalyisierten 1,3-dipolaren Cycloadditionen (Click-Chemie) wurde diese modifiziert. Insbesondere durch die Addition dendritischer Verbindungen gelang die Darstellung nanosopischer Objekte. Darüber hinaus konnten dünne Filme phasenseparierten Blockcopolymere selektiv und ortsaufgelöst funktionalisiert werden. Die Arbeit liefert somit Beiträge zur Entwicklung neuartiger Nanomaterialien sowie ihrer Modifizierung.

Die Radiomarkierung biologisch relevanter Verbindungen mit dem Radionuklid 18F erlaubt Untersuchungen mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Mit Hilfe der PET werden quantitative Informationen über die räumliche und zeitliche Verteilung von Radiotracern im lebenden Organismus erhalten. Diese Radiotracer sind Grundlage für die in vivo-Erforschung der Physiologie des menschlichen Organismus, sowie zur Aufklärung und Nachverfolgung pathologischer Prozesse. Neben bekannten Ansätzen der Acylierung, Thioetherbildung und Hydrazonbildung ist es notwendig neue Markierungsmethoden zu entwickeln, um Probleme bei Markierungsreaktionen, wie niedrige Ausbeuten und Denaturierung empfindlicher biologisch relevanter Moleküle, zu umgehen. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluation der Click-Chemie, speziell der 1,3 dipolaren [3+2]Cycloaddition von Alkin- und Azid-Derivaten als neue, alternative Reaktion zur Markierung von biologisch relevanten Molekülen. Ziel der Arbeit war es einen 18F markierten, bifunktionellen Markierungsbaustein, versehen mit einer Alkinfunktion durch eine vollautomatisierte Synthese (Modulsynthese) herzustellen. Ein Peptid, ein Protein und ein Oligonukleotid als biologisch relevante Moleküle, sollten mit einer Azidfunktionalität versehen werden. Mit Hilfe eines geeigneten Katalysator-Ligandsystems sollten ein bifunktioneller Markierungsbaustein, sowie ein azidfunktionalisiertes biologisch relevantes Molekül miteinander gekuppelt werden unter Verwendung der 1,3-dipolaren [3+2]Cycloaddition. Die untersuchte Methode sollte mit anderen Markierungsmethoden verglichen werden. Es wurde eine Modulsynthese zur einfachen, schnellen und vollautomatisierten Herstellung eines alkinfunktionalisierten Synthesebausteins, 4-[18F]Fluor-N-methyl-N-(prop-2-inyl)benzolsulfonamid, p[18F]F SA, entwickelt. Dieser basiert auf einem Sulfonamid-Derivat und ist mit dem Positronenstrahler 18F gekuppelt. Ausgehend von einer Trimethylammonium-Markierungsvorstufe kann das p[18F]F SA mit einer radiochemischen Ausbeute von 27-40% und einer radiochemischen Reinheit >99% innerhalb von 80 min hergestellt werden. Die Reaktion läuft in Sulfolan bei 80°C innerhalb von 10 min ab. Das Produkt liegt aufgrund der HPLC-Reinigung mit einem hohen Reinheitsgrad (RCR >99%) vor und weist eine spezifische Aktivität von 120 570 GBq/µmol auf. p[18F]F SA eignet sich zur Markierung von biologisch relevanten Molekülen, da es unter den Markierungsbedingungen der Cycloaddition stabil ist und eine für das Arbeiten im wässrigen Milieu günstige Lipophilie (logP = 1,7) aufweist. Die verschiedenen Beispiele der drei Verbindungsklassen werden mit einer Azidfunktion versehen. Ein Phosphopeptid (H-MQSpTPL-OH), HSA und ein Aminohexylspacer tragendes Oligonukleotid (NH2 (CH2)6 pCCG CAC CGC ACA GCC GC) werden mit Succinimidyl-5-azidvalerat umgesetzt, wodurch eine Funktionalisierung an den Aminogruppen erfolgt. Während das Phosphopeptid und das Oligonukleotid einfach azidfunktionalisiert vorliegen, werden durch diese Methode 27 Azidreste an das HSA angebracht. Damit stehen Alkin- und Azid-Derivat für die Cycloaddition zur Verfügung. Das Phosphopeptid konnte mit einer Ausbeute von 29% innerhalb von 45 min hergestellt werden. Als Katalysator-Ligandsystem wird ein Gemisch aus Kupfersulfat und Natriumascorbat in Boratpuffer (pH = 8,4) eingesetzt. Man geht von 0,3-0,4 mg der peptidischen Markierungsvorstufe aus. Die Methode wurde mit der [18F]SFB-Markierung des Phosphopeptids verglichen. Man erhält ähnliche Ausbeuten und Reinheiten bei ähnlichen Reaktionsbedingungen. Ein wesentlicher Vorteil ist die Höhe der spezifischen Aktivität des eingesetzten p[18F]F SA, die bis zu zehnfach höher ist, als die des [18F]SFB. Das führt vermutlich zu einem ähnlichen Unterschied der spezifischen Aktivitäten der markierten Peptide, die jedoch nicht genau bestimmt wurden. Auch sind die Reaktionszeiten zur Peptidmarkierung bei Nutzung von p[18F]F SA um ein Drittel geringer. Das führt zur Verminderung der gesamten Synthesezeit. Die Markierung von azidfunktionalisiertem HSA (Beispielprotein) erfolgt mit einer radiochemischen Ausbeute von 57% innerhalb von ca. 45 min. Als Katalysator-Ligandsystem wird ein Komplex aus TBTA und Kupfer(I)-Ionen in Phosphatpuffer (pH = 7,4) / Dimethylsulfoxid verwendet. Die Masse der eingesetzten Markierungsvorstufe beträgt 0,3 mg. Ein Vergleich der Markierungsmethode erfolgte mit der Markierung mit den bifunktionellen Markierungsbausteinen [18F]SFB und [18F]FBA. Bei gleicher Proteinkonzentration ist der Umsatz von p[18F]F SA mit 94% am höchsten. Die Reaktion des hydrazinfunktionalisierten HSA mit [18F]FBA erfordert Temperaturen von 50-60°C, um einen Umsatz des Markierungsbausteins in ähnlicher Höhe wie bei Markierungen mit p[18F]F SA und [18F]SFB zu erreichen. Die Bedingungen für die Markierung mit [18F]SFB weicht dahingehend ab, dass ein pH Wert von 8,4 angewandt wird um eine Markierung zu erreichen. Grund ist die Notwendigkeit der Deprotonierung der im HSA vorhandenen, bei niedrigeren pH Werten protonierten Aminogruppen. Das limitiert die Reaktion auf einen Bereich um diesen pH-Wert. Die Untersuchung der Markierung von Oligonukleotiden ergab, dass ebenfalls ein Komplex aus TBTA und Kupfer(I)-Ionen notwendig ist. Als Lösungsmittel dient ein Gemisch aus 1 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung, Acetonitril und Dimethylsulfoxid (14:5:1). Nach 20 min Reaktionszeit bei 10°C kann das Produkt mit einem Anteil von 30% im Reaktionsgemisch nachgewiesen werden. Damit ist nachgewiesen, dass auch die Markierung von Oligonukleotiden unter milden Bedingungen mit dieser Reaktion möglich ist. Zusammenfassend kann man feststellen, dass sich die Click-Reaktion hervorragend für die schonende Markierung der biologisch relevanten Moleküle Phosphopeptid, HSA und Oligonukleotid eignet. TBTA wirkt während der Reaktion als Chelatbildner für die Kupfer(I)-Ionen und verhindert somit eine Bindung an die zu markierenden Moleküle oder deren Zersetzung. Damit wird die Stabilität der biologisch relevanten Moleküle gewährleistet und bei in vivo-Anwendung, das Einbringen cytotoxischen Kupfers verhindert. Im Zuge der Untersuchungen wurde ein Vergleich der Markierungsreaktionen Acylierung, Thioetherbildung, sowie Hydrazon- und Oximbildung durchgeführt. Die bifunktionellen Markierungsbausteine [18F]SFB, [18F]FBAM und [18F]FBA wurden dafür herangezogen. Die 1,3-dipolare [3+2]Cycloaddition unterscheidet sich von den zum Vergleich herangezogenen Reaktionen. Sie vereint die positiven Eigenschaften der anderen Markierungsreaktionen in sich: • Die Reaktion läuft unter milden Reaktionsbedingungen ab. • Der verwendete Markierungsbaustein p[18F]F SA ist unter den Markierungsbedingungen stabil und lässt sich in einer Einschrittsynthese mit Hilfe eines vollautomatisierten Synthesemoduls einfach in hohen Ausbeuten und Reinheiten, sowie mit einer hohen spezifischen Aktivität herstellen. Damit erweitert die 1,3 dipolare [3+2]Cycloaddition das Spektrum der Markierungsreaktionen und bietet das Potential zur Markierung verschiedenster biologisch relevanter Moleküle.

Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research. / Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą]

Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą] / Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research.

Cette thèse de doctorat a été réalisée au Centre de Recherche sur les Macromolécules Végétales (CERMAV) sous la direction du Dr Sébastien Fort, responsable de l'équipe Chimie et Biotechnologie des Oligosaccharides (CBO) et du Dr Sami Halila de l'équipe PhysicoChimie des Glycopolymères (PCG). Cette thèse intitulée « Synthèse par chimie click non metallo-catalysée de glycoconjugués macromoléculaires pour des applications médicales» est financée par le ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche (bourse MESR). L'objectif de ce travail était de développer de nouvelles méthodes de modification et de couplage regiosélectif d'oligosaccharides pour la préparation de glycoconjugués par une chimie « click » sans catalyse métallique. Ces travaux s'appuient sur l'expertise de l'équipe CBO pour la synthèse chimio-enzymatique d'oligosaccharides complexes ainsi que sur les méthodes de modification sélective de la position réductrice des oses.Un premier aspect concerne l'utilisation des propriétés physico-chimiques des oligosaccharides pour l'obtention de nanoparticules de taille contrôlée. Ces particules sont constituées de copolymères à blocs hybrides obtenus par couplage entre un polymère de synthèse et un oligosaccharide. La structure des nano-objets préparés sera analysée au sein de l'équipe PCG.Le deuxième aspect concerne l'utilisation des propriétés de reconnaissance biochimique des oligosaccharides. Cette partie sera focalisée sur le couplage efficace d'oligosaccharides d'intérêt biologiques sur support solide pour la purification de protéines. / The aim of the project is to develop new anomeric modification of oligosaccharides for the synthesis of glycoconjugates by metal-free click chemistry. Synthetic glycans have shown a great potential in medical and nanotechnology related fields. The current use of metallic catalyst during synthesis and the risk of contamination of the final product represent a drawback which could restrain their applications. Therefore an efficient metal free synthesis of glycoconjugates could be of great interest to circumvent this obstacle.Two distinct synthetic strategies have been explored for the metal free coupling of complex oligosaccharides on polymers to yield block-copolymers and glycoadsorbants. The glycopolymers were synthetized by a Michael addition between a thiol functionalized oligosaccharide and a maleimide or bromo-maleimide functionalized polymer. The nanoparticles obtained from the self-assembly of theses amphiphilic copolymers in water were characterized. The polycaprolactone-b-xylooligosaccharides copolymers presenting a reducible linkage were self-assembled into nanoparticles and assessed as model for the delivery of hydrophobic drugs. This system showed a selective release of the entrapped molecules in reducing environment making it an interesting system for the intra-tumoral delivery of anti-cancer drugs. Glycoadsorbents were prepared by a Diels Alder reaction between a solid matrix displaying a maleimide moiety and furyl functionalized oligosaccharides. The affinity matrixes obtained allowed the selective purification of lectins. The blood group antigen (A;B) grafted matrixes displayed good properties for the trapping of corresponding anti-A or anti-B antibodies. These types of immunoadsorbants have great potential for the treatment of immune diseases like the Guillain-Barré syndrome.To conclude, two efficient anomeric modification and coupling strategies of oligosaccharides have been developed, opening the way to the metal free synthesis of various glycoconjugates.

Dans ce travail, nous avons développé différentes méthodes pour la co-immobilisation sur des électrodes poreuses de carbone de déshydrogénases NAD-dépendantes avec le complexe (2,2'-bipyridyle)(pentaméthylcyclopentadiényl)-rhodium ([Cp*Rh(bpy)Cl]+) pour des applications de synthèse électroenzymatique d’alcools et de sucres chiraux. L'objectif était d'éviter la dégradation de l'activité enzymatique provenant de l'interaction entre les groupes fonctionnels de surface de l'enzyme (-SH, -NH2) et le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+, et également de permettre le recyclage des catalyseurs. L’électrogreffage de sels de diazonium a été utilisé pour introduire des fonctions alcène et/ou azoture sur une surface de carbone (carbone vitreux plan, feutre de carbone poreux ou couches de nanotubes de carbone). La chimie click « thiol-ène » a été utilisée pour lier de manière covalente une D-sorbitol déshydrogénase modifiée par un tag cystéine (soit 1 ou 2 fragments cystéine à l'extrémité N-terminale de la chaîne polypeptidique) à des électrodes de carbone. Ensuite, la réaction de cyclo-addition de Huisgen alcyne-azoture a été utilisée pour lier le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ à l’électrode. Ensuite la co-immobilisation des enzymes redox (D-sorbitol et galactitol déshydrogénases) avec le complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ a été testée par l'encapsulation des protéines dans une couche de gel de silice, à l'intérieur d'un feutre de carbone poreux préalablement fonctionnalisé par le complexe de rhodium. Le catalyseur est alors stable pendant plusieurs semaines pour la réaction de régénération de NADH, mais cette architecture d'électrode conduit à l'inhibition de l'activité enzymatique, probablement causée par un microenvironnement local (augmentation du pH et de la concentration du produit). La combinaison des chimies clicks « thiol-ène » et cyclo-addition de Huisgen a ensuite été étudiée pour l'immobilisation séquentielle de [Cp*Rh(bpy)Cl]+ et d’une D-sorbitol déshydrogénase porteuse d’un tag cystéine, sur une électrode poreuse bi-fonctionnalisée par les groupes azoture et alcène. Enfin, compte tenu de la différence de durée de vie des enzymes et du complexe [Cp*Rh(bpy)Cl]+ et de la nécessité d'améliorer la séparation de ces éléments du système bioélectrochimique, l’assemblage optimal a été obtenu en associant une couche poreuse de silice dans laquelle est immobilisée l’enzyme avec un papier de nanotubes de carbone fonctionnalisé par le complexe de rhodium. Le catalyseur [Cp*Rh(bpy)Cl]+ pour la régénération de NADH peut être réutilisé successivement avec plusieurs couches de protéines. Ce système optimal a finalement été appliqué à la conversion bioélectrochimique du D-fructose en D-sorbitol / In this work we developed methods for the co-immobilization of NAD-dependent dehydrogenases and the (2,2'-bipyridyl) (pentamethylcyclopentadienyl)-rhodium complex ([Cp*Rh(bpy)Cl]+) on porous carbon electrodes for application in the electroenzymatic synthesis of chiral alcohols and sugars. The goal was to avoid the degradation of the enzymatic activity coming from the interaction of functional groups from the enzyme surface (eg.-SH, -NH2) with [Cp*Rh(bpy)Cl]+ and to promote the recyclability of the catalyst. Diazonium electrografting was used to introduce alkene and azide groups on a carbon surface (flat glassy carbon, porous carbon felt or carbon nanotubes layers). Thiol-ene click chemistry was applied to bind a D-sorbitol dehydrogenase with cysteine tags (either 1 or 2 cysteine moieties at the N terminus of the polypeptide chain) onto carbon electrodes. Azide-alkyne Huisgen cyclo-addition reaction was used to bind an alkyne-modified [Cp*Rh(bpy)Cl]+. Then co-immobilization of the redox enzymes (D-sorbitol and galactitol dehydrogenase) with the complex [Cp*Rh(bpy)Cl]+ was tested by encapsulation of the proteins in a silica gel layer, inside a rhodium-functionalized porous carbon felt. The immobilized [Cp*Rh(bpy)Cl]+ was stable over weeks for NADH regeneration, but this electrode architecture led to the inhibition of the enzymatic activity, possibly because of the local environment (increase of pH and product accumulation in the porous electrode). The combination of ‘thiol-ene’ and Huisgen cyclo-addition was then investigated for sequential immobilization of [Cp*Rh(bpy)Cl]+ and cysteine-tagged D-sorbitol dehydrogenase on an azide-alkene bi-functionalized electrode. Finally, considering the different lifetime of enzymes and [Cp*Rh(bpy)Cl]+ catalyst, and the need for a better separation of these elements from the bioelectrochemical system, the best configuration was achieved by associating a porous silica layer with the immobilized enzyme with a bucky paper of carbon nanotubes functionalized with [Cp*Rh(bpy)Cl]+. The reusability of this functionalized electrode was proved and the designed bioelectrode was successfully applied to a bioelectrochemical conversion of D-fructose to D-sorbitol