D.L. A 229-2008

A ocorrência de trombose está freqüentemente associada com a presença de um ou mais fatores de riscos, os quais podem ser genéticos e/ou adquiridos, tais como as mudanças hormonais que ocorrem durante a gravidez, a terapia de reposição hormonal e o uso de contraceptivos hormonais combinados (CHC). A inflamação, por sua vez, é uma importante resposta do organismo às agressões e envolve vários mecanismos biológicos relacionados entre si e altamente regulados, tais como: coagulação, fibrinólise, ativação do sistema complemento (SC), antioxidação e regulação hormonal. Fisiologicamente, os sistemas complemento e da coagulação compartilham componentes. A ativação do fator XII da coagulação é controlada pela mesma proteína reguladora da ativação do sistema complemento, o inibidor de C1. A deficiência do inibidor de C1 leva a uma patologia conhecida como angioedema hereditário. No entanto, uma manifestação clínica similar ao angioedema tem sido descrita em mulheres que usam CHC ou recebem terapia de reposição hormonal com estrogênio (E). Esta influência do estrogênio na coagulação e no SC também é evidenciada pela ação regulatória do E sobre a expressão do fator XII e dos seus níveis plasmáticos. Considerando o efeito pleiotrópico do E, e as interações do SC e da hemostasia, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes CHC sobre: a) a atividade hemolítica (AH) do SC e ativação das vias clássica/lectina e alternativa; b) a atividade opsonizante do SC em mediar o burst oxidativo dos neutrófilos; e c) a função dos receptores para complemento (CR) em mediar o burst oxidativo dos neutrófilos. Nós estudamos 5 CHC diferentes e observamos que a) drospirenona + 30g E mostrou uma tendência a aumentar o burst oxidativo mediado por CR; b) gestodeno + 20g E mostrou redução da capacidade opsonizante do SC; c) levonorgestrel + 30g E e gestodeno + 20g E promoveram uma redução no número de neutrófilos positivos para a expressão de CR1; d) drospirenona + 30g E e drospirenona + 20g E promoveram um aumento da AH da via clássica (VC) do SC; e) levonorgestrel + 30g E promoveu uma redução da AH da VC do SC; f) drospirenona + 30g E, gestodeno + 20g E e levonorgestrel + 30g E promoveram uma diminuição do nível sérico de C4d, produto da ativação das vias clássica/lectina do SC; g) levonorgestrel + 30g E apresentou um aumento da concentração sérica de inibidor de C1; h) nenhum dos CHC mostrou diferenças na ativação da via alternativa do SC. Os resultados mostram a importância de considerar os diferentes grupos de CHC nas comparações com o Grupo Controle, uma vez que algumas diferenças foram significativas apenas para CHC em particular. Estas observações podem contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia dos processos inflamatórios associados ao uso de estrogênios. / The occurrence of thrombosis is often associated with the presence of one or more risk factors, which may be genetic and/or acquired, such as hormonal changes that occur during pregnancy, hormone replacement therapy and the use of combined hormonal contraceptives (CHC). The inflammation in turn, is an important body\'s response to the aggression and involves several biological mechanisms related and highly regulated, such as coagulation, fibrinolysis, activation of the complement system (CS), oxidation and hormonal regulation. Physiologically, the complement and coagulation systems share components. Activation of coagulation factor XII is controlled by the same regulatory protein activation of the complement inhibitor C1. The deficiency of C1 inhibitor leads to a condition known as hereditary angioedema. However, a clinical manifestation similar to angioedema has been reported in women using CHC or receiving hormone replacement therapy with estrogen (E). The influence of E on coagulation and the CS is also evidenced by the regulatory action of E on the expression of factor XII and its plasma levels. Considering the pleiotropic effects of E, and the interactions of CS and hemostasis, the goal of this study was to evaluate the effect of different CHC on: a) hemolytic activity (HA) CS and activation of classical/lectin and alternative pathways, b) the opsonizing activity of the CS in mediating the oxidative burst of neutrophils, and c) the function of receptors for complement (CR) in mediating the oxidative burst (OB) of neutrophils. We studied 5 different CHC and data showed: a) drospirenone + 30g E increase of the OB neutrophils mediated by CR; b) gestodene + 20g E had a reduced opsonizing ability; c) levonorgestrel + 30g E and gestodene + 20g E promoted a reduction of neutrophils positive for the expression of CR1, d) drospirenone + 30g E and drospirenone + 20g E promoted an increase in HA for classical pathway (CP); e) levonorgestrel + 30g E reduced the HA for CP; f) drospirenone + 30g E and gestodene + 20g E and levonorgestrel + 30g E reduced the serum level of C4d; g) levonorgestrel + 30g E showed an increase of the serum level of C1 inhibitor; h) none of CHC showed differences in activation of the alternative pathway in CS. The results show the importance of considering the different groups of CHC in comparison with the control group, since some differences were significant only for CHC in particular. These observations may contribute to the understanding of the mechanisms involved in the pathophysiology of inflammatory processes associated with estrogen use.

A inflamação envolve vários mecanismos biológicos relacionados entre si e altamente regulados: coagulação, fibrinólise, sistema complemento (SC), antioxidação e regulação hormonal. Fisiologicamente, o SC e a coagulação compartilham componentes regulatórios e várias interações entre o SC e a hemostasia têm sido propostas, mas não elucidadas. O interesse científico sobre as interações do SC com a hemostasia é crescente, devido ao risco de tromboembolismo venoso (TEV) associado ao uso de contraceptivos orais combinados (COC). Nosso grupo tem investigado os efeitos de COC sobre o SC, hemostasia e moléculas de adesão. Os resultados confirmam vantagens do etinilestradiol (EE)/levonorgestrel (LNG), um COC de 2ª geração sobre os de 3ª geração, mantendo-o como referência para comparação com novos COC, os quais buscam componentes mais naturais. Os componentes hormonais nos COC podem influenciar as interações entre o endotélio e o SC, as quais medeiam adesão de neutrófilos ao endotélio, podendo favorecer o TEV. Desde o advento dos COC busca-se constantemente minimizar seus efeitos indesejáveis com redução das doses, diferentes combinações de progestógenos/estrógenos e vias de administração. O 17? estradiol (E2) é o estrógeno natural e encontra-se combinado com o progestógeno acetato de nomegestrol (NOMAC), mais seletivo para o receptor de progesterona, minimizando efeitos indesejáveis sobre o metabolismo. Considerando-se os benefícios do EE/LNG e a aprovação do E2/NOMAC, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito destes COC sobre: 1) o SC por ativação das Via Clássica (VC) e Via das Lectinas (VL), concentração de C4d e concentração sérica e atividade do inibidor de C1 (C1inh) e 2) os níveis séricos de moléculas de adesão intercelular (ICAM)-1 e vascular (VCAM)-1 e E-selectina. A atividade hemolítica (AH) sérica da VC foi avaliada por ensaio cinético nos grupos de usuárias ou não dos COC e em pool de soro humano normal (SHN) exposto aos componentes dos COC. Os demais parâmetros (VL, C4d, C1inh e moléculas de adesão) foram avaliados por ensaios imunoenzimáticos. Os resultados foram: 1) não houve diferenças na AH sérica da VC; 2) exceto para EE+LNG, a AH da VC in vitro foi menor quando o pool de SHN foi exposto aos componentes individuais das formulações dos COC (EE, LNG, E2 e NOMAC) e à combinação E2+NOMAC comparada ao controle (pool SHN sem componentes das formulações dos COC), menor para E2+NOMAC comparada ao EE+LNG e menor para o NOMAC comparado ao LNG; 3) não houve diferenças na ativação da VL; 4) não houve diferenças na concentração sérica do fragmento C4d; 5) a concentração sérica do C1inh foi maior para o grupo EE/LNG, enquanto a atividade do mesmo foi maior para o grupo E2/NOMAC quando comparadas ao grupo controle; 6) a concentração sérica de E-selectina foi maior para o grupo E2/NOMAC comparada ao grupo controle e 7) não houve diferenças para ICAM-1 e VCAM-1. E2/NOMAC teve efeito sobre maior número de parâmetros comparados ao grupo controle, significativos para a maior atividade do C1inh e maior concentração de E-selectina. Este é o primeiro resultado, ao nosso conhecimento, sobre a relação do NOMAC e E-selectina. Observaram-se tendências para redução da AH da VC em consonância com a redução do C4d. Esta observação deve ser destacada uma vez que E2+NOMAC e seus componentes individualizados promoveram redução significativa na AH in vitro do SHN. Juntos estes dados sugerem ao E2/NOMAC um efeito sobre a regulação negativa da atividade do SC, enquanto o aumento de E-selectina sugere um efeito pró-inflamatório. Quanto ao EE/LNG, a maioria dos parâmetros manteve-se sem diferenças em relação ao grupo controle. O impacto destas observações depende de aprofundamento na investigação dos efeitos dos COC sobre os sistemas biológicos e de estudos clínicos controlados, os quais juntos podem refletir benefícios em muitos aspectos para a saúde humana, em particular, a contracepção e terapias de reposição hormonal / Inflammation involves several biologically related and highly regulated biological mechanisms: coagulation, fibrinolysis, complement system (CS), antioxidation and hormonal regulation. Physiologically, CS and coagulation share regulatory components and various interactions between CS and hemostasis have been proposed but not elucidated. The scientific interest in CS interactions with hemostasis is increasing because of the risk of venous thromboembolism (VTE) associated with combined oral contraceptive (COC) use. Our group has investigated the effects of COC on CS, hemostasis and adhesion molecules. Results confirm the advantages of ethinylestradiol (EE)/levonorgestrel (LNG), a 2nd generation COC over the 3rd generation, maintaining it as a reference for comparison with new COC, which seek more natural components. Hormonal components in COC can influence the interactions between the endothelium and the CS, which mediates neutrophil adhesion to the endothelium and may favor VTE. Since the advent of COC, it has been consistently sought to minimize its undesirable effects by reducing dosages, different combinations of progestogens/estrogens and routes of administration. E2 or 17? estradiol is the natural estrogen and is combined with a new progestin, the nomegestrol acetate (NOMAC), which is more selective for the progesterone receptor, minimizing undesirable effects on metabolism. Considering the benefits of EE/LNG and the approval of E2/NOMAC, the objective of this study was to evaluate the effect of these COC on: 1) CS by measurement of activation of Classical Pathway (CP) and Lectin Pathway (LP), serum concentration of C4d fragment, serum concentration and activity of C1 inhibitor (C1inh) and 2) serum levels of soluble adhesion molecules: intercellular adhesion molecule (ICAM)-1, vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 and E-selectin. The serum hemolytic activity (HA) of CP was assessed by kinetic assay in the COC and non-COC users and in normal human serum (NHS) groups exposed to COC components. Other parameters (LP, C4d, C1inh and soluble adhesion molecules) were evaluated by immunoenzymatic assays. The results were: 1) there was no difference in serum HA of CP; 2) except for EE + LNG, the HA of CP in vitro was lower when the pool of NHS was exposed to the individual components of the COC formulations (EE, LNG, E2 and NOMAC) and the E2+NOMAC combination compared to the control group (pool of NHS without hormonal components), lower for E2+NOMAC compared to EE+LNG and lower for NOMAC compared to LNG; 3) there was no difference in the activation of the LP; 4) there was no difference in the serum concentration of the C4d fragment; 5) the serum concentration of the C1inh was higher for EE/LNG group, whereas its activity was higher for E2/NOMAC group when compared to the control group; 6) the serum concentration of E-selectin was higher for E2/NOMAC group compared to the control group and 7) there was no difference for ICAM-1 and VCAM-1. E2/NOMAC had an effect on a higher number of parameters compared to control group, significant for the higher activity of C1inh and higher concentration of E-selectin. This is the first result, to our knowledge, about the association of NOMAC wiht E-selectin. Tendencies to reduce the HA of the CP were observed in consonance with the reduction of C4d. This observation should be highlighted since E2+NOMAC and its individualized components promoted a significant reduction in the HA in vitro of NHS. Together these data suggest to E2/NOMAC an effect on the down-regulation of CS activity, while the increase of soluble E-selectin suggests a pro-inflammatory effect. Regarding EE/LNG, most of the parameters have no difference compared to control group. The impact of these observations depends on further research into the effects of COC on biological systems and on controlled clinical studies, which together may reflect benefits in many respects to human health, in particular contraception and hormone replacement therapies

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A ocorrência de trombose está freqüentemente associada com a presença de um ou mais fatores de riscos, os quais podem ser genéticos e/ou adquiridos, tais como as mudanças hormonais que ocorrem durante a gravidez, a terapia de reposição hormonal e o uso de contraceptivos hormonais combinados (CHC). A inflamação, por sua vez, é uma importante resposta do organismo às agressões e envolve vários mecanismos biológicos relacionados entre si e altamente regulados, tais como: coagulação, fibrinólise, ativação do sistema complemento (SC), antioxidação e regulação hormonal. Fisiologicamente, os sistemas complemento e da coagulação compartilham componentes. A ativação do fator XII da coagulação é controlada pela mesma proteína reguladora da ativação do sistema complemento, o inibidor de C1. A deficiência do inibidor de C1 leva a uma patologia conhecida como angioedema hereditário. No entanto, uma manifestação clínica similar ao angioedema tem sido descrita em mulheres que usam CHC ou recebem terapia de reposição hormonal com estrogênio (E). Esta influência do estrogênio na coagulação e no SC também é evidenciada pela ação regulatória do E sobre a expressão do fator XII e dos seus níveis plasmáticos. Considerando o efeito pleiotrópico do E, e as interações do SC e da hemostasia, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de diferentes CHC sobre: a) a atividade hemolítica (AH) do SC e ativação das vias clássica/lectina e alternativa; b) a atividade opsonizante do SC em mediar o burst oxidativo dos neutrófilos; e c) a função dos receptores para complemento (CR) em mediar o burst oxidativo dos neutrófilos. Nós estudamos 5 CHC diferentes e observamos que a) drospirenona + 30g E mostrou uma tendência a aumentar o burst oxidativo mediado por CR; b) gestodeno + 20g E mostrou redução da capacidade opsonizante do SC; c) levonorgestrel + 30g E e gestodeno + 20g E promoveram uma redução no número de neutrófilos positivos para a expressão de CR1; d) drospirenona + 30g E e drospirenona + 20g E promoveram um aumento da AH da via clássica (VC) do SC; e) levonorgestrel + 30g E promoveu uma redução da AH da VC do SC; f) drospirenona + 30g E, gestodeno + 20g E e levonorgestrel + 30g E promoveram uma diminuição do nível sérico de C4d, produto da ativação das vias clássica/lectina do SC; g) levonorgestrel + 30g E apresentou um aumento da concentração sérica de inibidor de C1; h) nenhum dos CHC mostrou diferenças na ativação da via alternativa do SC. Os resultados mostram a importância de considerar os diferentes grupos de CHC nas comparações com o Grupo Controle, uma vez que algumas diferenças foram significativas apenas para CHC em particular. Estas observações podem contribuir para o entendimento dos mecanismos envolvidos na fisiopatologia dos processos inflamatórios associados ao uso de estrogênios. / The occurrence of thrombosis is often associated with the presence of one or more risk factors, which may be genetic and/or acquired, such as hormonal changes that occur during pregnancy, hormone replacement therapy and the use of combined hormonal contraceptives (CHC). The inflammation in turn, is an important body\'s response to the aggression and involves several biological mechanisms related and highly regulated, such as coagulation, fibrinolysis, activation of the complement system (CS), oxidation and hormonal regulation. Physiologically, the complement and coagulation systems share components. Activation of coagulation factor XII is controlled by the same regulatory protein activation of the complement inhibitor C1. The deficiency of C1 inhibitor leads to a condition known as hereditary angioedema. However, a clinical manifestation similar to angioedema has been reported in women using CHC or receiving hormone replacement therapy with estrogen (E). The influence of E on coagulation and the CS is also evidenced by the regulatory action of E on the expression of factor XII and its plasma levels. Considering the pleiotropic effects of E, and the interactions of CS and hemostasis, the goal of this study was to evaluate the effect of different CHC on: a) hemolytic activity (HA) CS and activation of classical/lectin and alternative pathways, b) the opsonizing activity of the CS in mediating the oxidative burst of neutrophils, and c) the function of receptors for complement (CR) in mediating the oxidative burst (OB) of neutrophils. We studied 5 different CHC and data showed: a) drospirenone + 30g E increase of the OB neutrophils mediated by CR; b) gestodene + 20g E had a reduced opsonizing ability; c) levonorgestrel + 30g E and gestodene + 20g E promoted a reduction of neutrophils positive for the expression of CR1, d) drospirenone + 30g E and drospirenone + 20g E promoted an increase in HA for classical pathway (CP); e) levonorgestrel + 30g E reduced the HA for CP; f) drospirenone + 30g E and gestodene + 20g E and levonorgestrel + 30g E reduced the serum level of C4d; g) levonorgestrel + 30g E showed an increase of the serum level of C1 inhibitor; h) none of CHC showed differences in activation of the alternative pathway in CS. The results show the importance of considering the different groups of CHC in comparison with the control group, since some differences were significant only for CHC in particular. These observations may contribute to the understanding of the mechanisms involved in the pathophysiology of inflammatory processes associated with estrogen use.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial, com maior incidência nas regiões tropicais. As bactérias que causam a doença pertencem ao gênero Leptospira, família Leptospiracea e ordem Spirochaetales. A leptospirose é mantida na natureza pela colonização persistente dos túbulos renais proximais dos animais portadores. Uma estratégia adotada por estas espiroquetas para sobreviver à ação do sistema imune inato do hospedeiro é a capacidade que possuem de interagir com os reguladores do sistema complemento Fator H (FH) e proteína de ligação a C4b (C4BP). O sistema complemento é um componente vital da imunidade inata, uma vez que desempenha um papel crucial na defesa do hospedeiro, particularmente contra bactérias Gram-negativas. Dados recentes gerados por nosso grupo mostraram que C4BP interage com a proteína de superfície LcpA de Leptospira. Com cerca de 20 kDa, essa proteína é capaz de se ligar a C4BP purificado ou solúvel no soro de maneira dose-dependente. Uma vez ligado à proteína, C4BP permanece funcional agindo como cofator de Fator I na clivagem de C4b. O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a interação da proteína LcpA com FH humano, principal regulador solúvel da via alternativa do sistema complemento. A proteína LcpA e suas porções N-Terminal, Intermediária e CTerminal recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal a partir da fração insolúvel. A interação dessas proteínas com FH foi avaliada por dois métodos distintos: ELISA e Western blot com overlay. Os resultados indicaram que a porção C-Terminal da proteína LcpA é responsável pela interação com FH. Curiosamente, C4BP também se liga a esse domínio da proteína. Uma vez que esses dois reguladores solúveis do sistema complemento interagem com o mesmo segmento da LcpA, realizaram-se, a seguir, ensaios de competição com o objetivo de avaliar se ambos compartilhariam os mesmos sítios de interação. Os dados mostraram que FH e C4BP devem se ligar a sequências distintas desta proteína. Com o objetivo de se avaliar a funcionalidade de FH ligado à LcpA, realizou-se um ensaio para investigar sua atividade de co-fator de Fator I na clivagem de C3b. Produtos de degradação de 46 kDa e 43 kDa da cadeia α' de C3b foram detectados, indicando que FH permanece funcional. Em se tratando de uma proteína com funções relacionadas ao processo de evasão ao sistema imune inato, decidiu-se realizar ensaios de desafio em modelo de hamster com a finalidade de se avaliar seu potencial imunoprotetor. Os três ensaios realizados indicaram que a proteína não é capaz de conferir proteção. Os ensaios de ELISA visando à avaliação dos títulos de anticorpos mostraram que LcpA não é imunogênica, fato que explica os resultados dos ensaios de desafio observados. Portanto, embora interaja com moléculas do hospedeiro e pareça contribuir para o processo de evasão ao sistema imune inato, essa proteína de membrana não se mostrou promissora como candidato vacinal contra leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of global distribution, with higher incidence in tropical areas. The bacteria that cause the disease belong to the genus Leptospira, family Leptospiracea and order Spirochaetales. Leptospirosis is maintained in nature by persistent colonization of proximal renal tubules of carrier animals. One strategy adopted by these spirochetes to escape from host´s innate immune system is the ability to interact with the complement regulators Factor H (FH) and C4b Binding Protein (C4BP). The complement system is a vital component of the innate immune system, being crucial for host´s defense, particularly against Gram-negative bacteria. According to our recent published data, C4BP interacts with the leptospiral surface protein LcpA. This 20 kDa outer membrane protein binds both purified and serum C4BP in a dose-dependent manner. Once bound, C4BP remains functional acting as a cofactor for Factor I in the cleavage of C4b. In the present study we evaluated the interaction of LcpA with human FH, the main soluble regulator of the alternative pathway of complement. The intact protein as well as its N-terminal, intermediate and C-terminal portions were purified by metal-affinity chromatography from the insoluble pellet. The interaction of these proteins with FH was evaluated by two distinct methods: ELISA and Western blot overlay. Our results indicate that the C-terminal domain of LcpA mediates interaction with FH, and also with C4BP. Since both complement regulators interact with the same fragment of LcpA, we next performed competition assays to assess if they would share binding sites. According to our data, FH and C4BP have distinct binding sites on LcpA. Cofactor activity of FH bound to immobilized LcpA was confirmed by detecting the C3b α' chain cleavage fragments of 46 and 43 kDa upon incubation with Factor I, thus indicating that it remains functionally active. Given the LcpA´s role in host´s innate immune evasion, we also evaluated its vaccine potential in a hamster model. Data from three challenge assays indicated that the protein can not afford protection. Low ELISA antibody titers of hamsters immunized with LcpA were observed, which strongly suggests that this protein is not immunogenic. In conclusion, LcpA interacts with host´s molecules and seems to contribute to the bacterial immune evasion. Nevertheless, this outer membrane protein is not a promising vaccine candidate against leptospirosis.

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger.Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer.

A ativação dos sistemas complemento e de contato resulta na formação de peptídeos vasoativos tais como a bradicinina e anafilatoxinas. O inibidor de C1-esterase (C1-INH) é o principal regulador desses dois sistemas e a deficiência desta proteína resulta no Angioedema Hereditário (AEH). Trata-se de uma doença rara, de herança autossômica dominante, caracterizada pela deficiência de C1-INH, a qual ocorre devido a mutações no seu gene estrutural, levando a episódios graves de edema em tecido subcutâneo, gastrointestinal e respiratório, potencialmente fatais. Existem dois fenótipos variantes: AEH do tipo I, com reduzidos níveis antigênicos de C1-INH no plasma e AEH tipo II com níveis reduzidos ou normais de C1-INH e atividade disfuncional. Várias mutações já foram descritas no gene de inibidor de C1 esterase (SERPING1), porém, não há estudos que avaliem a relevância desta doença e as mutações gênicas em nosso meio. O objetivo do presente estudo foi avaliar as alterações moleculares em pacientes com AEH, correlacionando-as com as manifestações clínico-laboratoriais. Amostras de plasma, soro e DNA de quinze pacientes de uma mesma família foram coletadas. O ensaio hemolítico CH50 para avaliação da integridade da via clássica do sistema complemento e avaliação quantitativa de C4 e C1-INH por nefelometria foram os ensaios realizados para confirmação do diagnóstico da doença. A atividade funcional da proteína foi avaliada através de ensaio colorimétrico e a relação existente entre possíveis mutações na proteína e o fenótipo da doença foi avaliada por meio de reação de polimerase em cadeia (PCR) e seqüenciamento do DNA genômico. A atividade hemolítica de complemento total e a dosagem de C3 foram normais nos pacientes e controles analisados, os níveis da atividade antigênica de C1-INH e C4 mostraram-se diminuídos na maioria dos avaliados (13/15). A avaliação funcional detectou baixa atividade (<50%) do valor normal (70% - 130%) em todos os pacientes analisados. A distribuição das mutações entre os 8 éxons relativos ao gene de C1- INH concentraram-se nos éxons 4 (g.4706-88A>G) , 7 (g.14145+20A>G) e 8 (Val480Met). Duas dessas mutações nunca foram descritas ainda, o que contribui para a compreensão da função das serpinas e também ajuda a definir mais completamente o papel biológico do inibidor de C1 / Activation of complement and contact systems results in the formation of vasoactive peptides such as bradykinin and anafilatoxinas. The C1 esterase inhibitor (C1-INH) is the main regulator of these two systems and the deficiency of this protein results in hereditary angioedema (HAE). It is a rare disease of autosomal dominant inheritance, characterized by deficiency of C1-INH, which is due to mutations in its structural gene, leading with severe episodes of edema in subcutaneous tissue, gastrointestinal and respiratory tract, potentially fatal. There are two phenotypic variants: HAE type I, with reduced plasma antigen levels and HAE type II with normal or low levels of C1-INH and dysfunctional activity. Several mutations have been described in the gene of the C1 esterase inhibitor (SERPING1), however, no studies to assess the relevance of this disease and the gene mutations in our population. The purpose of this study was to evaluate the molecular changes in patients with HAE, correlating it with clinical and laboratory manifestations. Samples of plasma, serum and DNA from fifteen patients from the same family were collected. CH50 hemolytic assay for assessing the integrity of the classical pathway of the complement system and quantitative evaluation of C1-INH and C4 by nephelometry tests were performed to confirm the diagnosis of disease. The functional activity of the protein was assessed by colorimetric assay and the possible relationship between mutations in the protein and the phenotype of the disease was assessed by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing of genomic DNA. Hemolytic activity of complement and the total dosage of C3 were normal in patients and controls. Levels of antigenic activity of C1-INH and C4 were shown to be less valued in most (13/15). Functional evaluation found low activity (<50%) of normal (70% - 130%) in all patients examined. The distribution of mutations among the 8 exons of the gene for C1-INH concentrate in the exons 4 (g.4706-88A> G) and 7 (g.14145 +20 A> G) and 8 (Val480Met). Two of these mutations have not been described yet, which contributes to understanding the function of serpins and also helps to define more fully the biological role of the C1 inhibitor

A ativação dos sistemas complemento e de contato resulta na formação de peptídeos vasoativos tais como a bradicinina e anafilatoxinas. O inibidor de C1-esterase (C1-INH) é o principal regulador desses dois sistemas e a deficiência desta proteína resulta no Angioedema Hereditário (AEH). Trata-se de uma doença rara, de herança autossômica dominante, caracterizada pela deficiência de C1-INH, a qual ocorre devido a mutações no seu gene estrutural, levando a episódios graves de edema em tecido subcutâneo, gastrointestinal e respiratório, potencialmente fatais. Existem dois fenótipos variantes: AEH do tipo I, com reduzidos níveis antigênicos de C1-INH no plasma e AEH tipo II com níveis reduzidos ou normais de C1-INH e atividade disfuncional. Várias mutações já foram descritas no gene de inibidor de C1 esterase (SERPING1), porém, não há estudos que avaliem a relevância desta doença e as mutações gênicas em nosso meio. O objetivo do presente estudo foi avaliar as alterações moleculares em pacientes com AEH, correlacionando-as com as manifestações clínico-laboratoriais. Amostras de plasma, soro e DNA de quinze pacientes de uma mesma família foram coletadas. O ensaio hemolítico CH50 para avaliação da integridade da via clássica do sistema complemento e avaliação quantitativa de C4 e C1-INH por nefelometria foram os ensaios realizados para confirmação do diagnóstico da doença. A atividade funcional da proteína foi avaliada através de ensaio colorimétrico e a relação existente entre possíveis mutações na proteína e o fenótipo da doença foi avaliada por meio de reação de polimerase em cadeia (PCR) e seqüenciamento do DNA genômico. A atividade hemolítica de complemento total e a dosagem de C3 foram normais nos pacientes e controles analisados, os níveis da atividade antigênica de C1-INH e C4 mostraram-se diminuídos na maioria dos avaliados (13/15). A avaliação funcional detectou baixa atividade (<50%) do valor normal (70% - 130%) em todos os pacientes analisados. A distribuição das mutações entre os 8 éxons relativos ao gene de C1- INH concentraram-se nos éxons 4 (g.4706-88A>G) , 7 (g.14145+20A>G) e 8 (Val480Met). Duas dessas mutações nunca foram descritas ainda, o que contribui para a compreensão da função das serpinas e também ajuda a definir mais completamente o papel biológico do inibidor de C1 / Activation of complement and contact systems results in the formation of vasoactive peptides such as bradykinin and anafilatoxinas. The C1 esterase inhibitor (C1-INH) is the main regulator of these two systems and the deficiency of this protein results in hereditary angioedema (HAE). It is a rare disease of autosomal dominant inheritance, characterized by deficiency of C1-INH, which is due to mutations in its structural gene, leading with severe episodes of edema in subcutaneous tissue, gastrointestinal and respiratory tract, potentially fatal. There are two phenotypic variants: HAE type I, with reduced plasma antigen levels and HAE type II with normal or low levels of C1-INH and dysfunctional activity. Several mutations have been described in the gene of the C1 esterase inhibitor (SERPING1), however, no studies to assess the relevance of this disease and the gene mutations in our population. The purpose of this study was to evaluate the molecular changes in patients with HAE, correlating it with clinical and laboratory manifestations. Samples of plasma, serum and DNA from fifteen patients from the same family were collected. CH50 hemolytic assay for assessing the integrity of the classical pathway of the complement system and quantitative evaluation of C1-INH and C4 by nephelometry tests were performed to confirm the diagnosis of disease. The functional activity of the protein was assessed by colorimetric assay and the possible relationship between mutations in the protein and the phenotype of the disease was assessed by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing of genomic DNA. Hemolytic activity of complement and the total dosage of C3 were normal in patients and controls. Levels of antigenic activity of C1-INH and C4 were shown to be less valued in most (13/15). Functional evaluation found low activity (<50%) of normal (70% - 130%) in all patients examined. The distribution of mutations among the 8 exons of the gene for C1-INH concentrate in the exons 4 (g.4706-88A> G) and 7 (g.14145 +20 A> G) and 8 (Val480Met). Two of these mutations have not been described yet, which contributes to understanding the function of serpins and also helps to define more fully the biological role of the C1 inhibitor

INTRODUÇÃO: Indivíduos com SZ (esquizofrenia) fumam até três vezes mais que a taxa da população em geral. Constatou-se que fumantes com esquizofrenia fumam mais intensamente do que comparados com fumantes não esquizofrênicos. Adicionalmente, existem relatos não sistemáticos de que apesar de alta taxa de tabagismo, os esquizofrênicos apresentam proporcionalmente pouca lesão pulmonar comparado com tabagistas de igual consumo sem esquizofrenia. Esta diferença, se confirmada, poderia sugerir mecanismos diferentes de reação a agentes exógenos nos sistema respiratório, e entre estes mecanismos diferentes poderia estar o sistema de complemento, já evidenciado em estudos do grupo de pesquisa, porém sem controle para tabagismo. Este estudo investigou se a capacidade de difusão pulmonar em SZ é maior que em NSZ, e se o sistema complemento C3 e C4 é diferente entre SZ e NSZ e ao mesmo tempo está associado a difusão pulmonar de forma diferente em SZ e NSZ. OBJETIVOS: comparar a capacidade de difusão pulmonar e complemento C3 e C4 em pacientes fumantes com e sem esquizofrenia e analisar se existe evidência de mecanismos diferentes mediando prejuízo na capacidade de difusão em tabagistas com e sem SZ. MÉTODOS: esse é um estudo caso controle pareado, desenhado para ser multicêntrico, no momento descrevendo resultados de um centro. Recrutados 30 tabagistas sendo 15 SZ e 15 NSZ pareados por sexo, idade e tempo de tabagismo. Foram medidos complemento C3 e C4, espirometria e difusão pulmonar, dependência de nicotina pelo Teste de Fargerstrom e psicopatologia psiquiátrica nos portadores de esquizofrenia pelo Escala Breve de Avaliação Psiquiátrica (BPRS). Os pacientes foram oriundos do centro colaborador do estudo no HCPA. RESULTADOS: C3 foi significantemente maior em SZ quando comparado com controles (p=0,041), e C4 não mostrou diferença. Houve associação negativa entre o C4 e a capacidade de difusão somente no grupo controle (r=-0,692; p=0,009), sem diferença significativa no grupo de esquizofrênicos (r=0,451; p=0,141). Os grupos foram equivalentes em idade, grau de dependência de nicotina, porém foram diferentes em relação a ocupação (p=0,001). O grupo de esquizofrênicos apresenta maior proporção de desempregados e em benefício do que os controles. Desta forma, apesar de C3 mais aumentado em esquizofrênicos, este sistema aparentemente não media perda de difusão pulmonar, enquanto que aparentemente C4 mostra diferença quanto a prejuízo de difusão em esquizofrênicos tabagistas (maior C4 associado a menor capacidade de difusão somente nos tabagistas sem esquizofrenia). CONCLUSÃO: Quanto ao sistema complemento, houve maior ativação do C3 em tabagistas portadores de esquizofrenia comparados com tabagistas sem esquizofrenia, o que corrobora pesquisas anteriores que descrevem ativação do sistema complemento na SZ indicado pelo aumento dos níveis de C3. Curiosamente, somente nos controles tabagistas foi identificada associação entre aumento de C4 e redução da capacidade de difusão pulmonar. Nos pacientes com esquizofrenia não houve relação entre ativação de C4 e prejuÍzo de difusão pulmonar, o que sugere um padrão de ativação do sistema de complemento diferente dos sujeitos normais, preferencialmente pela via C3 e não pela via C4. Este fator não parece estar afetado pela diferença em escolaridade e trabalho, visto que era esperado que o aumento fosse maior nos esquizofrênicos devido a maior gravidade representada por menor índice de trabalho e menor escolaridade. Este estudo, se confirmado em amostras maiores envolvendo os outros centros colaboradores, pode confirmar existência de mecanismos diferentes de reação inflamatória em esquizofrenia. / Background: Subjects with SZ (schizophrenia) smoke up to three times the rate of the general population. It was found that smokers with schizophrenia smoke more intensely than smokers compared with non-psychiatric. Additionally, there are no systematic reports that despite high rates of smoking, people with schizophrenia have proportionately less lung injury compared with smokers without schizophrenia equal consumption. This difference, if confirmed, would suggest different mechanisms of response to exogenous agents in the respiratory system, and between these different mechanisms could be the complement system, as evidenced in studies of the research group, but not control for smoking. This study investigated whether the pulmonary diffusion capacity in SZ is higher than in non-SZ, and the complement C3 and C4 is different between SZ and NSZ and if at the same time is associated with pulmonary diffusion differently in SZ and NSZ. OBJECTIVES: To compare the pulmonary diffusion capacity and complement C3 and C4 in smokers with and without schizophrenia and examine whether there is evidence of different mechanisms mediating impaired diffusion capacity in smokers with and without SZ. METHODS: This is a matched case-control study, designed as a multicenter, when describing the results of a center. Recruited 30 smokers and 15 non-schizophrenics and 15 schizophrenics matched for sex, age and duration of smoking. We measured C3 and C4 complement, spirometry and DLCO, nicotine dependence and the test Fargerstrom psychiatric psychopathology in patients with schizophrenia by Brief Psychiatric Rating Scale (BPRS). The patients came from the study's collaborating center at HCPA. RESULTS: C3 was significantly higher in SZ compared to controls (p = 0.041), and C4 showed no difference. There was a negative association between C4 and the ability to broadcast only in the control group (r =- 0.692, p = 0.009), no significant difference in the schizophrenic group (r = 0.451, p = 0.141). The groups were equivalent in age, degree of nicotine dependence, but were different in relation to occupation (p = 0.001). The schizophrenic group has a higher proportion of unemployed and for the benefit of the controls. Thus, although most of C3 increased in schizophrenics, this system apparently did not measure loss of pulmonary diffusion, while C4 shows apparent difference in the loss of diffusion in schizophrenic smokers (greater C4 associated with a lower diffusion capacity in smokers without schizophrenia only) . CONCLUSION: As the complement system, activation of C3 was higher in smokers with schizophrenia compared with smokers without schizophrenia, which corroborates previous studies that describe activation of the complement system in SZ indicated by increased levels of C3. Interestingly, only smokers in controls been identified association between increased C4 and reduction of pulmonary diffusion capacity. In patients with schizophrenia there was no relationship between activation of C4 and prejuízo pulmonary diffusion, which suggests a pattern of activation of the complement system different from normal subjects, preferably through C3 and not via C4. This factor does not seem to be affected by the difference in schooling and work, as it was expected that the increase was greater in schizophrenics because of greater severity represented by lower rates of work and less schooling. This study, if confirmed in larger samples involving other collaborating centers, can confirm the existence of different mechanisms of inflammatory response in schizophrenia.