Orientadores: Edi Lucia Sartorato, Andrea Trevas Maciel Guerra / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T04:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CamilaAndreade_D.pdf: 6184929 bytes, checksum: 343aabf85591bdfc5c5902b95eefa5d0 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Tendo em vista a complexidade do mecanismo da audição, não é difícil compreender que a surdez possa resultar de ampla variedade de anomalias geneticamente determinadas, bem como de diversos fatores ambientais. Assim sendo, frente a um indivíduo com deficiência auditiva, o diagnóstico etiológico é freqüentemente difícil de ser estabelecido.No Brasil, a importância da deficiência auditiva entre as anomalias congênitasé considerável,uma vez que está presente numa freqüência que varia, dependendo da região estudada, de 2 a 7 em cada 1.000 nascimentos. Nos últimos cinco anos houve um enorme progresso na localização e clonagem de genes associadosà deficiência auditiva. Mutações no gene GJB2, que codifica a proteína conexina26, representam a principal causa de surdez hereditária. Este gene é responsável por aproximadamente80% dos casos de surdez com padrão de herança recessivo. Cerca de 70% dos indivíduos em diferentes populações com mutações no gene GJB2 apresentam uma mutação especifica, denominada 35de1G,com uma freqüência de portadores que pode chegar a 4% em determinados países. Neste trabalho, a freqüência de heterozigotos para a mutação 35delG foi determinada utilizando DNA genõmico extraído de manchas de sangue contidas em papel filtro, obtidas de 1856 recém-nascidos de diferentes regiões do Brasil. Esta mutação foi encontrada em 25 indivíduos (1,35%), representando uma freqüência geral de portadores de 1 em cada 74 nascimentos. De qualquer forma, essa freqüência varia de acordo com a região do país, na dependência de sua composição étnica e do fluxo gênico recebido de populações migrantes, em particular aqueles oriundos de países da Europa, onde a freqüência de heterozigotos da mutação 35delG é, em média, de 1 em cada 51 indivíduos. O conhecimento da variação da freqüência da mutação 35delG na população brasileira auxilia no aconselhamento genético e facilita na intervenção precoce apropriada, de acordo com a porcentagem de crianças afetadas pela deficiência auditiva. Devido à alta freqüência de portadores da mutação 35delG no Brasil, somada a facilidade para a sua detecção, tornou possível o desenvolvimento de testes genéticos rápidos, práticos e baratos, apropriados para o rastreamento neonatal. Desta forma, a investigação da mutação 35delG na triagem neonatal juntamente com outras doenças congênitas, em conjunto aos testes audiológicos, ajudarão na detecção precoce da surdez, o que é de extrema importância no manejo desses pacientes, em particular nos casos de surdez progressiva, pois a estimulação da linguagem em seu período crítico faz com que as crianças aprendam a se comunicar antes que a surdez se torne mais grave / anomalies as well as from several environmental factors. In Brazil, the importance of hearing loss among congenital diseases is considerable, since it is present in 2 to 7 per 1,000 births, depending on the studied region. In the last 5 years enormous progress has occurred in localizind and cloning genes associated with inherited hearing loss. Mutations in GJB2 gene, which encode the protein connexin 26, represent a major cause of congenital deafness. This gene is responsible for approximately 80% of the recessive hearing loss. Around 70% of the individuais in different populations with mutations in the GJB2 gene have one specific mutation, namely 35de1G, with a carrier frequency as high as 4% in determined countries. The 35delG carriers frequency was determinated using a method to extract DNAfrom dried-blood filter paper samples obtained from 1,856 newbomsfrom different regions in Brazil. The 35delG mutation was found in 25 individuais (1.35%), wich represent the general frequency of symptom-free 35delG of 1 in 74 births. Besides, the frequency of 35delG carriers depends on the predominant immigration in different regions of the country, particularly from European countries of wich 35delG heterozygous frequency of 1 in 51. The knowledge of 35delGfrequency variation must be useful for genetic counseling and may facilitate an early intervention for a substantial percentage of deaf infants. Due to carriers frequency high of 35delG mutation in Brazil, end the feasibility and benefit of screening for this mutations, it is possible the incorporation of rapid and accurate molecular test appropriate the neonatal screening. Therefore, the investigation of 35delG mutation in neonatal screening for congenital diseases combined with audiologycs tests could be helpful in early identification and management of deafness, wich is important for language development and social skills / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Memoria para optar al título de Bioquímico / El correcto funcionamiento celular requiere condiciones físicas específicas, como pH, temperatura y fuerza iónica. Cualquier alteración de estos parámetros puede producir consecuencias graves para las células. La mantención del volumen celular es otro de los parámetros importantes para la célula ya que regula la fuerza iónica y las concentraciones de osmolitos y segundos mensajeros intracelulares. En patologías como la diabetes o isquémicas como el infarto agudo al miocardio, ocurren alteraciones del volumen celular. Durante la isquemia disminuye el aporte de nutrientes y oxígeno a las células por lo que aumenta el catabolismo de nutrientes para obtener energía. Como consecuencia, aumenta la osmolaridad intracelular y con ello, la entrada de agua a la célula produciéndose un aumento de su volumen. Pero las células han desarrollado mecanismos para regular su volumen y volver a la normalidad frente a cambios en la osmolaridad del medio. En el caso del estrés hiposmótico, la estrategia consiste en sacar iones de la célula, lo que disminuye su contenido de agua. Se ha descrito que los cardiomiocitos no regulan espontáneamente su volumen en condiciones de estrés hiposmótico, lo que se ha asociado a muerte. Este hecho es importante si consideramos que el corazón es uno de los órganos más afectados por enfermedades que incluyen episodios isquémicos. Las conexinas son proteínas de transmembrana que forman hexámeros (hemicanal) y se insertan en la membrana plasmática de las células. Si dos hemicanales de células adyacentes se unen forman un canal de una unión en hendidura, y permiten la comunicación de los citoplasmas de las células vecinas. Se ha propuesto que los hemicanales formados por la conexina 43 (Hcs-Cx43) podrían participar en la regulación de volumen de las células, ya que forman verdaderos poros en la superficie celular que permite el paso de agua e iones por difusión simple. El objetivo de esta tesis consistió en determinar si los hemicanales formados por conexinas participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico. Para este fin cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se expusieron a estrés hiposmótico y se estudió: • Si el estrés hiposmótico modifica el estado funcional de los Hcs-Cx43 a través de la técnica de captación de etidio • Si los cambios en el estado funcional de los Hcs-Cx obedecen a modificaciones en la cantidad de los Hcs-Cx43 expuestos en la membrana o cambios en su estado de fosforilación, mediante la técnica de biotinilación de proteínas de superficie • Si los Hcs-Cx43 participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico, mediante el uso de calceina-AM y microscopía confocal como indicador de los cambios de volumen de la célula e interviniendo el sistema con el inhibidor específico de Hcs-Cx43, Gap26. Los resultados muestran que los Hcs-Cx aumentan su estado funcional al exponer las células a estrés hiposmótico, lo que impide la regulación de volumen del cardiomiocito, ya que al inhibirlos con Gap26 recuperan su volumen. Además se sugiere que el aumento funcional de los Hcs-Cx no se podría explicar por cambios en el estado de fosforilación o alteraciones de la cantidad de Hcs-Cx expuestos en la membrana celular. De estos resultados se concluye que los hemicanales formados por conexinas participan en el control del volumen del cardiomiocito / The cell homeostasis requires specific physical conditions such as pH, temperature and ionic strength. Any alteration in these parameters may produce serious consequences to the cell. The maintenance of cell volume is key parameter because is involved in the regulation of ionic strength, and concentration of osmolyte and intracellular second messengers. Alterations in cell volume have been described in pathologies such as diabetes, stroke and acute myocardial infarction. During ischemia the nutrients and oxygen availability to the cells diminishes, resulting in an increased catabolism in order to obtain energy. As a consequence, intracellular osmolarity increases leading to water influx into the cell and an increase in cell volume. Cells have developed different compensatory mechanisms to restore their volume when they are exposed to changes in external osmolarity. In the case of hyposmotic stress, ions are pumped out the cell to diminish water content. It has been shown that cardiac myocytes are unable to spontaneously regulate their volume when exposed to osmotic stress, and this event has been associated with increased cell death susceptibility. This is important if we consider that cardiac tissue is one of the most affected organs by ischemic diseases. Connexins are transmembrane proteins forming hexamers (hemichannels) at the cell membrane. When two hemichannels from adjacent cells reach each other, they form a gap junction channel, which allow communication of both cytoplasms. It has been proposed that hemichannels formed by connexin 43 (Hcs-Cx43) may participate in cell volume regulation because they form pores in the cell surface allowing the passage of water and ions by simple diffusion. The aim of this work was to evaluate whether Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocytes exposed to hyposmotic stress. To this end, cultured neonatal rat cardiac myocytes were exposed to hyposmotic stress and we study whether: • Hyposmotic stress modifies the functional state of Hcs-Cx43 assessing the ethidium uptake by the cells • Changes in Hcs-Cx functional state are explained by the number of Hcs-Cx43 present in the cell membrane or by changes in their phosphorylation status. • Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocyte exposed to hyposmotic stress. This was evaluated using calcein-AM and confocal microscopy to measure changes in cell volume and Gap26 to inhibit Hcs-Cx43. The results showed that the functional state of Hcs-Cx is enhanced in cells exposed to hyposmotic stress. Such increase in the functional state of Hcs-Cx could not be explained by changes in the phosphorylation state or alterations in the amount of Hcs- Cx exposed in the cell surface. The increase in cardiac myocyte volume induced by hyposmostic stress was inhibited by Gap26. These results collectively show that connexin hemichannels participates in the regulation of cardiac myocyte volume

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el bulbo olfatorio (BO) se encuentra la primera sinapsis de la vía sensorial olfatoria cuya activación se distribuye posteriormente a los centros de integración sensorial, posibilitando la identificación y discriminación de las sustancias odoríferas. En el BO, existen las neuronas granulares de tipo inhibitorio cuya activación, inducida por estimulación olfatoria, genera oscilaciones del campo eléctrico en la banda gamma (30-100 Hz), permitiendo la discriminación de sustancias químicas de estructura similar. En la corteza cerebral, la actividad eléctrica oscilatoria depende de la presencia de sinapsis eléctricas entre las interneuronas inhibitorias conformadas por uniones en hendidura. Las conexinas (Cxs) son las unidades estructurales de las uniones en hendidura, de las cuales el tipo Cx 36 está involucrada en la generación de oscilaciones eléctricas en el sistema nervioso central. En conjunto, esta evidencia permite postular que las oscilaciones eléctricas en el BO podrían ser generadas por las uniones en hendidura formadas por conexina 36 entre las células granulares. El propósito de esta memoria fue determinar la presencia de la proteína conexina 36 en el BO y su distribución en las distintas capas del BO, a través de técnicas de inmunohistoquímica e hibridización in situ. Contrariamente a lo esperado, los resultados muestran que la proteína Cx 36 se observa principalmente en las capas glomerular, plexiforme externa y mitral, para todas las muestras analizadas. Más aún, la distribución de la proteína entre animales juveniles y adultos es cualitativamente similar. Estos resultados indican que la proteína Cx 36 no se expresa en las células granulares y por lo tanto, no contribuyen a la formación de uniones en hendidura entre estas células que permitan explicar el origen de las oscilaciones de campo eléctrico en el BO. Sin embargo, estos resultados no descartan la posibilidad de que uniones en hendidura entre las células de proyección y/o glomerulares, en las cuales sí se observa la expresión de la Cx 36, formen uniones en hendidura que permitan la interconexión eléctrica y por lo tanto la generación de oscilaciones del campo eléctrico en el BO / Proyecto Milenio ICM P01-007 F

As junções comunicantes são estruturas celulares que permitem o trânsito de moléculas entre as células, desempenhando funções de sinalização e transporte intercelular. São formadas por proteínas denominadas conexinas e representam estruturas-chave no funcionamento de tecidos altamente complexos e integrados, como o sistema nervoso central (SNC). O presente estudo avalia os efeitos da deleção da conexina 32 (Cx32) na inflamação e regeneração/cicatrização do SNC após 1, 3, 7, 10 e 20 dias pós-injeção intracerebral de brometo de etídio em camundongos deletados para Cx32 e camundongos normais. Para tanto, quantificou-se a expressão dos genes para fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de crescimento transformador beta 1 (TGFβ), metaloproteinase 3 (MMP3), metaloproteinase 9 (MMP9) e inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP1), através de PCR em tempo real. Os resultados indicam variáveis diferenças no padrão de expressão, incluindo variação na expressão de todos os genes pesquisados no período de 3 dias pós-injeção, ápice dos mecanismos de inflamação aguda. Estes resultados sugerem que a conexina 32 pode desempenhar funções importantes na sinalização molecular do processo inflamatório e regenerativo/cicatricial do sistema nervoso central. / Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, performing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and egeneration/cicatrization after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed uppon tumour necrosis factor alpha (TNFα), transforming growth factor beta 1 (TGFβ), metalloproteinase 3 (MMP3), metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP1) genes. Results indicate variable differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days after injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular inflammatory and regenerative/cicatrization signalling in the CNS.

As junções comunicantes são estruturas celulares que permitem o trânsito de moléculas entre as células, desempenhando funções de sinalização e transporte intercelular. São formadas por proteínas denominadas conexinas e representam estruturas-chave no funcionamento de tecidos altamente complexos e integrados, como o sistema nervoso central (SNC). O presente estudo avalia os efeitos da deleção da conexina 32 (Cx32) na inflamação e regeneração/cicatrização do SNC após 1, 3, 7, 10 e 20 dias pós-injeção intracerebral de brometo de etídio em camundongos deletados para Cx32 e camundongos normais. Para tanto, quantificou-se a expressão dos genes para fator de necrose tumoral alfa (TNFα), fator de crescimento transformador beta 1 (TGFβ), metaloproteinase 3 (MMP3), metaloproteinase 9 (MMP9) e inibidor tecidual de metaloproteinases 1 (TIMP1), através de PCR em tempo real. Os resultados indicam variáveis diferenças no padrão de expressão, incluindo variação na expressão de todos os genes pesquisados no período de 3 dias pós-injeção, ápice dos mecanismos de inflamação aguda. Estes resultados sugerem que a conexina 32 pode desempenhar funções importantes na sinalização molecular do processo inflamatório e regenerativo/cicatricial do sistema nervoso central. / Gap junctions are cellular structures that allow transit of molecules between cells, performing intercellular signaling and transportation. They are formed by proteins denominated connexins and represent key structures in highly complex and integrated tissues, such as the central nervous system (CNS). The present study evaluates the effects of connexin 32 (Cx32) deletion upon CNS inflammation and egeneration/cicatrization after 1, 3, 7, 10 and 20 days after intracerebral injection of ethidium bromide in Cx32 Knock Out and normal mice. To accomplish so, Real Time PCR gene expression quantification was performed uppon tumour necrosis factor alpha (TNFα), transforming growth factor beta 1 (TGFβ), metalloproteinase 3 (MMP3), metalloproteinase 9 (MMP9) and tissue inhibitor of metalloproteinases 1(TIMP1) genes. Results indicate variable differences in the expression pattern, including difference in expression of all evaluated genes in the 3 days after injection period, apex of the acute inflammation mechanisms. These results suggest that Cx32 may perform important functions on molecular inflammatory and regenerative/cicatrization signalling in the CNS.

Melanoma é uma neoplasia maligna com comportamento agressivo considerado o câncer mais comum da cavidade bucal de cães. Ele pode ser classificado quanto a morfologia celular em epitelióide, fusiforme e misto ou quanto ao fenótipo: melânico ou amelânico. Estudos têm sugerido que os melanomas amelânicos são mais agressivos. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento dos melanomas da cavidade bucal dos cães, quantificando a expressão das Cx26 e 43, caderina-E, MMPs 2 e 9 e proliferação celular. Para tanto foram coletados 25 melanomas provenientes de cães atendidos no HOVET FMVZ-USP (16 melânicos e 9 amelânicos). Após a cirurgia os animais foram acompanhados até a morte, sendo que 5 animais foram eutanasiados (2 antes da cirurgia e 3 após o procedimento cirúrgico, devido ao sofrimento físico). Os tumores eram diagnosticados através do histopatológico e classificados de acordo com OMS (1998). Para confirmação dos melanomas amelânicos foi utilizado à técnica de imuno-histoquímica com o perfil de anticorpos pré-estabelecidos. A proliferação celular foi quantificada através do uso de PCNA, índice apoptótico e caspase-3. O comportamento tumoral foi avaliado através da técnica de imuno-histoquímica para caderina-E e MMPs 2 e 9. E a expressão das Cxs foram avaliadas através da imunofluorescência e western blot. Cães com melanma amelânico apresentaram menor sobrevida, com aumento do número de metástase, fraca marcação para caderina-E e alta intensidade para as MMPs 2 e 9, aumento de células positivas para PCNA e índice mitótico, e diminuição da caspase-3, não havendo diferença significante quanto aos tipos histotógicos. Houve diminuição de expressão das Cxs entre os amelânicos, no entanto, aumento da síntese do gene de CX 26 entre o mesmo grupo, o que se verificou através do PCR em Tempo Real. Nossos achados sugerem que os melanomas da cavidade bucal de cães apresentam um comportamento mais agressivo / Melanoma is a malignant neoplasm with aggressive behavior considered the most common cancer of the buccal cavity in dogs. It can be classified as cell morphology in epithelioid, spindle and mixed or on the phenotype, in melanotic or amelanotic. Studies have suggested that amelanotic melanomas are more aggressive. The aim of this study was to evaluate the behavior of melanoma of the buccal cavity of dogs, quantifying the expression of Connexins 26 and 43, E-cadherin, MMPs 2 and 9 and cell proliferation. For both melanomas were collected from 25 dogs attended at HOVET FMVZ (USP) (16 melanotic and 9 amelanotic melanomas). After the surgery, the animals were followed until death, so 5 animals were euthanized (2 before surgery and 3 after surgery, due to physical suffering). The tumors were diagnosed by histopathology and classified according to WHO (1998). For confirmation of amelanotic melanomas it was used the technique of immune-histochemistry with the antibody profile pre-established. Cell proliferation was quantified by using PCNA, apoptotic index and caspase-3. The tumor behavior was evaluated using the technique of immune-histochemistry for E-cadherin and MMPs 2 and 9. And the expression of Cxs was evaluated by immune-fluorescence and western blot. Dogs with amelanotic melanoma had lower survival with increasing number of metastatic, weak immunoreactivity for E-cadherin and high intensity for MMP 2 and 9, an increase of cells positive for PCNA and mitotic index, and decreased caspase-3, no significant difference in the morphologic subtypes. There was a decrease of expression of Cxs between amelanotic, however, increased synthesis of CX 26 gene among the same group, which was verified by real time PCR. Our findings suggest that melanomas of the buccal cavity of dogs exhibited more aggressive behavior.

A eletroporação é um fenômeno que promove a formação de poros na membrana citoplasmática quando esta é submetida à exposição de um campo elétrico específico. Dentre as principais aplicações da eletroporação podemos citar a eletroquimioterapia, uma nova terapia contra o câncer, e a terapia gênica, ainda em desenvolvimento. As conexinas são unidades formadoras das junções gap, canais transmembrana responsáveis pela comunicação intercelular e que participam de uma serie de eventos fisiológicos como o crescimento e diferenciação celular. A importância desta família de genes na oncologia está cada vez mais clara dadas às evidencias de seu comportamento de supressor de tumor ou como facilitador da disseminação e metástases de acordo com a fase de em que o câncer se apresenta. A eletroporação como um fenômeno que promove perturbação em membrana poderia interferir de alguma forma na expressão das conexinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos de interferência na expressão gênica das células promovidos pela eletroporação em especial na família de genes das conexinas. Para tanto as células foram expostas a um campo semelhante a o utilizado para eletroquimioterapia e avaliadas em diferentes tempos após a exposição. Três linhagens, duas neoplásicas (melanoma B16/BL6 e E9) e uma linhagem não neoplásica (E10) foram utilizadas como modelo experimental para que pudesse ser feita uma analise comparativa e a avaliação dos possíveis diferentes comportamentos das mesmas frente à eletroporação. O estudo da expressão gênica foi realizado pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e PCR em tempo real. A Cx 26 foi avaliada na linhagem B16/BL6 e a Cx 43 nas linhagens E9 e E10. Os resultados da imunofluorescência apontaram uma marcação no citoplasma em B16/BL6, predominantemente em núcleo para a linhagem E9 e em núcleo e citoplasma em E10. Somente a linhagem E9 apresentou diferentes marcações entre os grupos, com uma marcação em citoplasma no grupo t1/2 (30 minutos apos a eletroporacao) O western blot mostrou diminuição transiente para as Cxs apenas nas linhagens neoplásicas nos grupos t1/2 e t1 (1 hora apos a eletroporacao). A linhagem E10 apresentou aumento de expressão nos mesmos grupos. O PCR em tempo real apresentou diferenças significativas nos tempos t1/2 e t1 para as linhagens B16/BL6 e E10. A linhagem B16/BL6 teve diminuição de RNAm enquanto a linhagem E10 apresentou aumento de transcrição de RNAm. A linhagem E9 apresentou padrão de expressão bastante heterogêneo. Frente aos resultados apresentados podemos concluir que a eletroporação interferiu de maneira transiente na expressão de conexinas. / Electroporation is a phenomenon that promotes the formation of pores in the cytoplasmic membrane when it is exposed to a specific electric field. The main applications of electroporation include the electrochemotherapy, a new cancer therapy, and gene therapy, still in development. Connexins are forming units of gap junctions, transmembrane channels responsible for intercellular communication and participating in a series of physiological events such as cell growth and differentiation. The importance of this gene family in oncology is increasing. The evidence of its behavior as a tumor suppressor or facilitator of dissemination and metastases according to the stage where the cancer presents itself. Electroporation as a phenomenon that promotes membrane disruption could interfere somehow in the expression of connexins. The aim of this study was to evaluate the possible effects of interference in gene expression. of cells promoted by electroporation in particular gene family of connexins. For this purpose cells were exposed to a electric field similar to that used for Electrochemotherapy and evaluated at different times after exposure. Three cell lines, two neoplastic (melanoma B16/BL6 and E9) and one line non-neoplastic (E10) were used as experimental models that could provide a comparative analysis between the lines and an assessment of the possible different behaviors due to electroporation. Its expression was assessed by immunofluorescence, western blot and real-time PCR. Cx 26 was evaluated in the melanoma cell line B16/BL6 and Cx 43 in the cell lines E9 and E10. The results showed a cytoplasm immunofluorescence staining pattern in the in B16/BL6, predominantly in the nucleus in line E9 and in the nucleus and cytoplasm for cell line E10. Only the cell line E9 had different immunoflurescence stainings between the groups, with a positivity in the cytoplasm in the group t1/2. The western blot showed transient decrease of Cxs only in cell lines neoplastic in the times t1/2 and t1. The lung cell line E10 showed increased expression in the same time points. The real-time PCR showed significant differences in t1/2 and t1 for the cell lines B16/BL6 and E10. The melanoma cell line B16/BL6 had mRNA decreased while the cell line E10 showed increased transcription of mRNA. The cell line E9 showed a very heterogeneous expression pattern. According to our results, we can conclude that electroporation interfered transiently in the expression of connexins.

Melanoma é uma neoplasia maligna com comportamento agressivo considerado o câncer mais comum da cavidade bucal de cães. Ele pode ser classificado quanto a morfologia celular em epitelióide, fusiforme e misto ou quanto ao fenótipo: melânico ou amelânico. Estudos têm sugerido que os melanomas amelânicos são mais agressivos. O objetivo deste estudo foi avaliar o comportamento dos melanomas da cavidade bucal dos cães, quantificando a expressão das Cx26 e 43, caderina-E, MMPs 2 e 9 e proliferação celular. Para tanto foram coletados 25 melanomas provenientes de cães atendidos no HOVET FMVZ-USP (16 melânicos e 9 amelânicos). Após a cirurgia os animais foram acompanhados até a morte, sendo que 5 animais foram eutanasiados (2 antes da cirurgia e 3 após o procedimento cirúrgico, devido ao sofrimento físico). Os tumores eram diagnosticados através do histopatológico e classificados de acordo com OMS (1998). Para confirmação dos melanomas amelânicos foi utilizado à técnica de imuno-histoquímica com o perfil de anticorpos pré-estabelecidos. A proliferação celular foi quantificada através do uso de PCNA, índice apoptótico e caspase-3. O comportamento tumoral foi avaliado através da técnica de imuno-histoquímica para caderina-E e MMPs 2 e 9. E a expressão das Cxs foram avaliadas através da imunofluorescência e western blot. Cães com melanma amelânico apresentaram menor sobrevida, com aumento do número de metástase, fraca marcação para caderina-E e alta intensidade para as MMPs 2 e 9, aumento de células positivas para PCNA e índice mitótico, e diminuição da caspase-3, não havendo diferença significante quanto aos tipos histotógicos. Houve diminuição de expressão das Cxs entre os amelânicos, no entanto, aumento da síntese do gene de CX 26 entre o mesmo grupo, o que se verificou através do PCR em Tempo Real. Nossos achados sugerem que os melanomas da cavidade bucal de cães apresentam um comportamento mais agressivo / Melanoma is a malignant neoplasm with aggressive behavior considered the most common cancer of the buccal cavity in dogs. It can be classified as cell morphology in epithelioid, spindle and mixed or on the phenotype, in melanotic or amelanotic. Studies have suggested that amelanotic melanomas are more aggressive. The aim of this study was to evaluate the behavior of melanoma of the buccal cavity of dogs, quantifying the expression of Connexins 26 and 43, E-cadherin, MMPs 2 and 9 and cell proliferation. For both melanomas were collected from 25 dogs attended at HOVET FMVZ (USP) (16 melanotic and 9 amelanotic melanomas). After the surgery, the animals were followed until death, so 5 animals were euthanized (2 before surgery and 3 after surgery, due to physical suffering). The tumors were diagnosed by histopathology and classified according to WHO (1998). For confirmation of amelanotic melanomas it was used the technique of immune-histochemistry with the antibody profile pre-established. Cell proliferation was quantified by using PCNA, apoptotic index and caspase-3. The tumor behavior was evaluated using the technique of immune-histochemistry for E-cadherin and MMPs 2 and 9. And the expression of Cxs was evaluated by immune-fluorescence and western blot. Dogs with amelanotic melanoma had lower survival with increasing number of metastatic, weak immunoreactivity for E-cadherin and high intensity for MMP 2 and 9, an increase of cells positive for PCNA and mitotic index, and decreased caspase-3, no significant difference in the morphologic subtypes. There was a decrease of expression of Cxs between amelanotic, however, increased synthesis of CX 26 gene among the same group, which was verified by real time PCR. Our findings suggest that melanomas of the buccal cavity of dogs exhibited more aggressive behavior.

A eletroporação é um fenômeno que promove a formação de poros na membrana citoplasmática quando esta é submetida à exposição de um campo elétrico específico. Dentre as principais aplicações da eletroporação podemos citar a eletroquimioterapia, uma nova terapia contra o câncer, e a terapia gênica, ainda em desenvolvimento. As conexinas são unidades formadoras das junções gap, canais transmembrana responsáveis pela comunicação intercelular e que participam de uma serie de eventos fisiológicos como o crescimento e diferenciação celular. A importância desta família de genes na oncologia está cada vez mais clara dadas às evidencias de seu comportamento de supressor de tumor ou como facilitador da disseminação e metástases de acordo com a fase de em que o câncer se apresenta. A eletroporação como um fenômeno que promove perturbação em membrana poderia interferir de alguma forma na expressão das conexinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos de interferência na expressão gênica das células promovidos pela eletroporação em especial na família de genes das conexinas. Para tanto as células foram expostas a um campo semelhante a o utilizado para eletroquimioterapia e avaliadas em diferentes tempos após a exposição. Três linhagens, duas neoplásicas (melanoma B16/BL6 e E9) e uma linhagem não neoplásica (E10) foram utilizadas como modelo experimental para que pudesse ser feita uma analise comparativa e a avaliação dos possíveis diferentes comportamentos das mesmas frente à eletroporação. O estudo da expressão gênica foi realizado pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e PCR em tempo real. A Cx 26 foi avaliada na linhagem B16/BL6 e a Cx 43 nas linhagens E9 e E10. Os resultados da imunofluorescência apontaram uma marcação no citoplasma em B16/BL6, predominantemente em núcleo para a linhagem E9 e em núcleo e citoplasma em E10. Somente a linhagem E9 apresentou diferentes marcações entre os grupos, com uma marcação em citoplasma no grupo t1/2 (30 minutos apos a eletroporacao) O western blot mostrou diminuição transiente para as Cxs apenas nas linhagens neoplásicas nos grupos t1/2 e t1 (1 hora apos a eletroporacao). A linhagem E10 apresentou aumento de expressão nos mesmos grupos. O PCR em tempo real apresentou diferenças significativas nos tempos t1/2 e t1 para as linhagens B16/BL6 e E10. A linhagem B16/BL6 teve diminuição de RNAm enquanto a linhagem E10 apresentou aumento de transcrição de RNAm. A linhagem E9 apresentou padrão de expressão bastante heterogêneo. Frente aos resultados apresentados podemos concluir que a eletroporação interferiu de maneira transiente na expressão de conexinas. / Electroporation is a phenomenon that promotes the formation of pores in the cytoplasmic membrane when it is exposed to a specific electric field. The main applications of electroporation include the electrochemotherapy, a new cancer therapy, and gene therapy, still in development. Connexins are forming units of gap junctions, transmembrane channels responsible for intercellular communication and participating in a series of physiological events such as cell growth and differentiation. The importance of this gene family in oncology is increasing. The evidence of its behavior as a tumor suppressor or facilitator of dissemination and metastases according to the stage where the cancer presents itself. Electroporation as a phenomenon that promotes membrane disruption could interfere somehow in the expression of connexins. The aim of this study was to evaluate the possible effects of interference in gene expression. of cells promoted by electroporation in particular gene family of connexins. For this purpose cells were exposed to a electric field similar to that used for Electrochemotherapy and evaluated at different times after exposure. Three cell lines, two neoplastic (melanoma B16/BL6 and E9) and one line non-neoplastic (E10) were used as experimental models that could provide a comparative analysis between the lines and an assessment of the possible different behaviors due to electroporation. Its expression was assessed by immunofluorescence, western blot and real-time PCR. Cx 26 was evaluated in the melanoma cell line B16/BL6 and Cx 43 in the cell lines E9 and E10. The results showed a cytoplasm immunofluorescence staining pattern in the in B16/BL6, predominantly in the nucleus in line E9 and in the nucleus and cytoplasm for cell line E10. Only the cell line E9 had different immunoflurescence stainings between the groups, with a positivity in the cytoplasm in the group t1/2. The western blot showed transient decrease of Cxs only in cell lines neoplastic in the times t1/2 and t1. The lung cell line E10 showed increased expression in the same time points. The real-time PCR showed significant differences in t1/2 and t1 for the cell lines B16/BL6 and E10. The melanoma cell line B16/BL6 had mRNA decreased while the cell line E10 showed increased transcription of mRNA. The cell line E9 showed a very heterogeneous expression pattern. According to our results, we can conclude that electroporation interfered transiently in the expression of connexins.

Orientador: Edi Lucia Sartorato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T04:28:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva-Costa_SueliMatildeda_M.pdf: 4568147 bytes, checksum: d8aadad3b82357deab2dec0ee176e6ed (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Mutações no gene GJB2 (Cx26) são as causas mais comuns de perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva. Contudo, 10 a 40% dos casos com mutações no gene da Cx26 são detectadas em apenas um dos alelos, causando um problema no diagnóstico molecular. Estes achados podem ser atribuídos à existência de mutações em regiões não codificantes do gene ou mutações em outros genes cujos produtos protéicos estão envolvidos em interações com a Cx26. O principal objetivo deste trabalho foi esclarecer a causa genética da perda auditiva de 45 pacientes com surdez sensorioneural não-sindrômica monoalélicos para mutações patogênicas na região codificante do gene GJB2. Mutações incluindo deleções e duplicações nos genes GJB2, GJB3 e GJB6 foram investigadas nesses pacientes. A mutação IVS1+ lG>A no sítio de splice na região não codificante do gene GJB2, que pode contribuir para o fenótipo de surdez, foi também investigada em todos os 45 pacientes. A fim de avaliar a freqüência da mutação IVS1+1G>A em pacientes brasileiros foram analisados 142 pacientes com perda auditiva sensorioneural não-sindrômica que não apresentavam nenhuma mutação patogência na região codificante do gene GJB2. Além disso, o método de MLP A (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) foi utilizado neste estudo para avaliar sua eficiência em detectar deleções e duplicações em genes envolvidos na perda auditiva. Analisando todos os pacientes, dez diferentes mutações no gene GJB2 e uma deleção no gene GJB6 foram encontradas.. Esses achados explicaram a perda auditiva de aproximadamente 27% dos pacientes monoalélicos para mutações no gene GJB2. A mutação IVSl+IG>A foi encontrada em dois pacientes monoalélicos. Essa alteração não foi encontrada nos pacientes sem mutações na região codificante do gene GJB2. Essa mutação parece ser rara entre pacientes surdos brasileiros. Na região promotora do gene, em um paciente, uma deleção foi encontrada e no outro uma duplicação foi observada por meio do método de MLP A. Essas possíveis alterações na região não codificante do gene ainda não foram descritas. Outras análises moleculares e estudos funcionais são necessários para confirmar uma possível associação desses achados com a perda auditiva. A técnica de MLP A se mostrou eficiente para detectar deleções e duplicações no genoma. Portanto, demonstramos no presente estudo que essa técnica pode contribuir para explicar a surdez em pacientes monoalélicos. / Abstract: Mutations in the GJB2 gene (Cx26) are the most common cause of autosomal recessive nonsyndromic hearing loss. However, in 10 to 40% of these cases, mutations in Cx26 gene are detected in on1y one allele which causes a problem in molecular diagnostico These findings could be attributed to the existence of mutations in non-coding regions of the gene or mutations in other genes of which protein products are involved in interaction with Cx26. The aim of this study was to clarifying the genetic cause of the hearing loss of 45 patients with non-syndromic sensorioneural deafness, monoallelics for pathogenic mutations in the coding region of the GJB2 gene. Mutations including deletions and duplications in the GJB2, GJB3 and GJB6 genes were investigated in these patients. 'The IVSl+ 1G>A splice site mutation in the non-coding region of the GJB2 gene which can contribute to the deafuess phenotype was also investigated in all 45 patients. In order to evaluate the frequency of the IVSl+ 1G>A mutation were tested 142 Brazilian patients with non-syndromic sensorineural hearing loss without any pathogenic mutation ín the GJB2 coding region. Furthermore, the MLP A method (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) was used to evaluate its usefulness in detecting deletions/duplications in genes involved in hearing loss. Ten different mutations in the GJB2 gene and one deletion in the GJB6 gene were found. These findings eXplained the hearing loss about 27% ofGJB2 monoallelic patients. The IVSl+ 1G>A mutation was found in two monoallelics patients. This alteration was not found in patients without mutations in the GJB2 coding region. This mutation seems to be rare in deaf Brazilian patients. One patient a deletion was found in the promoter region of GJB2 gene and in another patients a duplication was observed by the MLP A method. These possible alterations were not described in noncoding region of GJB2 gene yet. Additional molecular and functional studies are needed to assess a possible association of these findings with hearing loss. MLP A proved to be a highly accurate method to detected deletions and duplications in the genome. Therefore, we have shown in the present study that this technique can explain the deafness in monoallelics patients. / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular