Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias / La hembra canina presenta características reproductivas particulares comparado con las otras especies de mamíferos domésticos, donde destaca el arresto meiótico prolongado del ovocito reanudando la meiosis posterior a la ovulación. El desarrollo del ovocito es regulado por señales entre el ovocito y las células foliculares que le rodean mediante conexones constituidos por conexinas, de ellas la Conexina 43 es la proteína con mayor expresión en el ovario. El objetivo de este trabajo fue estudiar la expresión génica de Cx43 y de su proteína en células foliculares de perra durante el desarrollo folicular y a lo largo del ciclo estral. Usando un lupa estereoscópica se aislaron células de folículos preantrales y antrales de ovarios de perra en anestro, proestro, estro y diestro. Se utilizó q-PCR para la evaluación de los niveles de mARN y Western Blot e lnmunohistoquímica para la cuantificación y localización de la proteína respectivamente. Los valores de expresión génica y densidad óptica de las bandas de Western Blot se analizaron con ANOVA; además, se hicieron correlaciones de Pearson. La Cx43 se encontró en todos los folículos desde folículo primordial hasta preovulatorio, la expresión del gen de Cx43 y su proteína codificante varió a lo largo del ciclo estral, presentando los mayores niveles de mARN en anestro (P<0,05) y los mayores niveles de Cx43 en diestro (P<0,05), adicionalmente la expresión de mRNA y de Cx43 no disminuyeron en folículos preovulatorios, sugiriendo que la comunicación entre el ovocito y las células foliculares se mantienen, lo que podría explicar el arresto meiótico prolongado de la perra. La correlación entre mARN y proteína fue negativa en la mayoría de etapas del ciclo, lo que se podría asociar a los mecanismos de control traduccional a las que son sometidas las conexinas. / The female canine has particular reproductive characteristics compared to the other species of domestic mammals, where it stands out the prolonged meiotic arrest of the oocyte that resumes meiosis after ovulation. Oocyte development is regulated by signals between the oocyte and follicular cells that sorround it by connexons constituted of connexins, of these, Connexin 43 is the protein with the highest expression in the ovary. The objective of this work was to study the gene expression of Cx43 and its protein in dog follicular cells during follicular development and throughout the estrous cycle. Using a stereoscopic magnifying glass, cells were isolated from preantral and antral follicles of the ovaries of bitches in anestrus, proestrus, estrus and diestrus. q-PCR was used for the evaluation of mRNA levels and Western Blot and lmmunohistochemistry for the quantification and localization of the protein respectively. The values of gene expression and optical density of the Western Blot bands were analyzed with ANOVA; in addition , Pearson correlations were made. The Cx43 was found in all the follicles from primordial to preovulatory, the expression of the Cx43 gene and its coding protein varied throughout the estrous cycle, presenting the highest levels of mRNA in anoestrus (P <0.05) and the highest levels of Cx43 in diestrus (P <0.05), additionally the expression of mRNA and Cx43 did not decrease in preovulatory follicles, suggesting that communication between the oocyte and follicular cells is maintained, which could explain the prolonged meiotic arrest of the dog. The correlation between mRNA and protein was negative in most stages of the cycle, which could be associated with the mechanisms of translational control to which connexins are subjected. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1171670

As junções GAP são canais intercelulares responsáveis pela comunicação de células vizinhas, por onde passam pequenas moléculas e íons que mantêm a homeostasia celular. A junção GAP é formada seis proteínas, as conexinas. Na célula endotelial encontram-se as conexinas 37, 40 e 43. Nesse estudo, estimulamos a angiogênese em córnea de camundongos, através da cauterização com cristal de nitrato de prata. Foram utilizados camundongos heterozigotos para o gene da conexina 43 (Cx43+/-) e camundongos selvagens (Cx43+/+). As córneas foram analisadas 2 e 6 dias após a cauterização atravéspor meio da morfologia vascular, detecção das Cx37, Cx40, Cx43, PCNA por meio de Western Blot e avaliação ultraestrutural das células endoteliais. Como resultado obtivemos uma menor área de preenchimento vascular nos animais Cx43+/- em 2 e 6 dias após a lesão corneal, porém, em relação a extensão dos vasos não foi observado diferenças entre os grupos. Uma menor proliferação celular foi verificada através da detecção do PCNA, nos animais heterozigotos, somente após 2 dias da lesão corneal. Não houve alteração da Cx37 e Cx40 entres os grupos. A Cx43 parece ser uma conexina importante para a célula endotelial durante o processo de angiogênese. / The GAP junctions are intercellular streams responsible for the communication between close cells, which allow small molecules and ions to pass through them maintaining the cellular homeostasis. The GAP junction is formed of six proteins, the connexin. In the endothelial cell, there are the connexin 37, 40 and 43. In this study, we stimulated the angiogenesis in the mice\'s cornea through its cauterization using silver\'s crystal glass. It was used heterozygote mice to the gene of connexin 43 (Cx43+/-) and wild mice (Cx43+/+). The corneas were analyzed 2 and 6 days after the cauterization through the vascular morphology, detection of Cx37, Cx40, Cx43, PCNA through Western Blot and ultrastructural evaluation of the endothelial cells. As a result, we obtained a smaller area of vascular fillness in the animals Cx43+/- with 2 and 6 days of corneal injury, however, in regard to the extensions of the vessels, it wasn\'t observed any changes between the groups. A smaller proliferation of cells was verified, through the detection of PCNA, in the heterozygote animals only 2 days after the corneal injury. There wasn\'t any modification of the Cx37 and Cx40 between groups. The Cx43 seems to be an important connexin to the endothelial cell during the process of angiogenesis.

A conexina 32 (Cx32) é uma estrutura protéica que constitui os canais que promovem as comunicações intercelulares via junções comunicantes (GJIC), permitindo difusão de pequenas moléculas citoplasmáticas de uma célula à outra. Este trabalho objetivou os estudos destas estruturas devido a sua importância em processos hepáticos, mais especificamente, a fibrose hepática. O presente estudo foi realizado através da administração oral da droga hepatotoxica dimetilnitrosamina (DMN) em ratas Wistar duas vezes por semana em dias consecutivos no prazo de cinco semanas. A necropsia destes animais foi realizada após cinco semanas da última administração da droga e revelou um quadro de fibrose hepática, em contra partida aos resultados obtidos em um grupo controle com a mesma quantidade de animais. O material fibrótico foi submetido à análise imunohistoquímica que revelou uma presença preferencial de Cx32 dispersa no citoplasma, o que pode levar à hipótese de problemas no mecanismo de transporte citoplasmático destas estruturas, em contrapartida ao material pertencente ao grupo controle que evidenciou a presença das Cx32 na membrana plasmática formando placas juncionais. Quando submetido à análises moleculares o fígado fibrótico revelou uma diminuição da expressão gênica embora o produto protéico deste material quando comparado ao grupo controle não tenha se mostrado diminuído. / The connexin 32 (Cx32) is a proteic structure that constitute the channels that promote the cell communication by means of the gap junction (GJIC), allowing the diffusion of short cytoplasmic molecules from a cell to another. This work aimed to study these structures due to their importance in the hepatic metabolic processes. The hepatic fibrosis was triggered by the oral administration of dimethylnitrosamine (DMN) in the female rat Wistars twice a week in consecutive days during five weeks. The necropsy of these animals was carried out after the last drug administration. They presented a hepatic fibrosis state. The fibrotic material was submitted to the imunohistochemical analysis, which showed a preferencial presence of Cx32 in the cytoplasm, whereas in the control group the Cx32 was located at the membranes, in the junctional plaques. The molecular analysis showed a decrease of the genic expresson of the fibrotic material, however the proteic product wasn? t reduced in comparison with the control group as it was shown by western blot. We concluded that the fibrotic state introduced a disturbance in the intracellular distribution and genic expression of the connexin 32.

As junções GAP são canais intercelulares responsáveis pela comunicação de células vizinhas, por onde passam pequenas moléculas e íons que mantêm a homeostasia celular. A junção GAP é formada seis proteínas, as conexinas. Na célula endotelial encontram-se as conexinas 37, 40 e 43. Nesse estudo, estimulamos a angiogênese em córnea de camundongos, através da cauterização com cristal de nitrato de prata. Foram utilizados camundongos heterozigotos para o gene da conexina 43 (Cx43+/-) e camundongos selvagens (Cx43+/+). As córneas foram analisadas 2 e 6 dias após a cauterização atravéspor meio da morfologia vascular, detecção das Cx37, Cx40, Cx43, PCNA por meio de Western Blot e avaliação ultraestrutural das células endoteliais. Como resultado obtivemos uma menor área de preenchimento vascular nos animais Cx43+/- em 2 e 6 dias após a lesão corneal, porém, em relação a extensão dos vasos não foi observado diferenças entre os grupos. Uma menor proliferação celular foi verificada através da detecção do PCNA, nos animais heterozigotos, somente após 2 dias da lesão corneal. Não houve alteração da Cx37 e Cx40 entres os grupos. A Cx43 parece ser uma conexina importante para a célula endotelial durante o processo de angiogênese. / The GAP junctions are intercellular streams responsible for the communication between close cells, which allow small molecules and ions to pass through them maintaining the cellular homeostasis. The GAP junction is formed of six proteins, the connexin. In the endothelial cell, there are the connexin 37, 40 and 43. In this study, we stimulated the angiogenesis in the mice\'s cornea through its cauterization using silver\'s crystal glass. It was used heterozygote mice to the gene of connexin 43 (Cx43+/-) and wild mice (Cx43+/+). The corneas were analyzed 2 and 6 days after the cauterization through the vascular morphology, detection of Cx37, Cx40, Cx43, PCNA through Western Blot and ultrastructural evaluation of the endothelial cells. As a result, we obtained a smaller area of vascular fillness in the animals Cx43+/- with 2 and 6 days of corneal injury, however, in regard to the extensions of the vessels, it wasn\'t observed any changes between the groups. A smaller proliferation of cells was verified, through the detection of PCNA, in the heterozygote animals only 2 days after the corneal injury. There wasn\'t any modification of the Cx37 and Cx40 between groups. The Cx43 seems to be an important connexin to the endothelial cell during the process of angiogenesis.

A conexina 32 (Cx32) é uma estrutura protéica que constitui os canais que promovem as comunicações intercelulares via junções comunicantes (GJIC), permitindo difusão de pequenas moléculas citoplasmáticas de uma célula à outra. Este trabalho objetivou os estudos destas estruturas devido a sua importância em processos hepáticos, mais especificamente, a fibrose hepática. O presente estudo foi realizado através da administração oral da droga hepatotoxica dimetilnitrosamina (DMN) em ratas Wistar duas vezes por semana em dias consecutivos no prazo de cinco semanas. A necropsia destes animais foi realizada após cinco semanas da última administração da droga e revelou um quadro de fibrose hepática, em contra partida aos resultados obtidos em um grupo controle com a mesma quantidade de animais. O material fibrótico foi submetido à análise imunohistoquímica que revelou uma presença preferencial de Cx32 dispersa no citoplasma, o que pode levar à hipótese de problemas no mecanismo de transporte citoplasmático destas estruturas, em contrapartida ao material pertencente ao grupo controle que evidenciou a presença das Cx32 na membrana plasmática formando placas juncionais. Quando submetido à análises moleculares o fígado fibrótico revelou uma diminuição da expressão gênica embora o produto protéico deste material quando comparado ao grupo controle não tenha se mostrado diminuído. / The connexin 32 (Cx32) is a proteic structure that constitute the channels that promote the cell communication by means of the gap junction (GJIC), allowing the diffusion of short cytoplasmic molecules from a cell to another. This work aimed to study these structures due to their importance in the hepatic metabolic processes. The hepatic fibrosis was triggered by the oral administration of dimethylnitrosamine (DMN) in the female rat Wistars twice a week in consecutive days during five weeks. The necropsy of these animals was carried out after the last drug administration. They presented a hepatic fibrosis state. The fibrotic material was submitted to the imunohistochemical analysis, which showed a preferencial presence of Cx32 in the cytoplasm, whereas in the control group the Cx32 was located at the membranes, in the junctional plaques. The molecular analysis showed a decrease of the genic expresson of the fibrotic material, however the proteic product wasn? t reduced in comparison with the control group as it was shown by western blot. We concluded that the fibrotic state introduced a disturbance in the intracellular distribution and genic expression of the connexin 32.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:32:40Z No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES; FACEPE / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:37:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) Previous issue date: 2012 / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos. / Bovine papillomavirus (BPV) are double-stranded circular DNA oncovirus and usually species-specific. Although BPV causes diseases of veterinary importance, knowledge about their biology and diversity is still limited. This study investigated the natural history of BPV infection in cattle and cutaneous epithelial sites of cattle and horses. In Chapter I, we sought to evaluate the diversity of PV in cutaneous lesions. We found BPV 1, 2, 3, 6 and papillomavirus associated with feline sarcoid (FeSarPV) and co-infections. In Chapter II, we detected the BPV DNA in sperm and seminal fluid of trade bull semen and its effect on sperm function. The DNA of BPV2 was found in all samples, without causing a reduction in sperm function. In Chapter III, we evaluated etiopathogenic mechanisms of BPV induced lesions. We observed the expression of E5 oncoprotein in all analyzed fibropapillomas and an overexpression of connexin 26 in fibropapillomas compared to normal tissue. In Chapter IV, we evaluated the presence and expression of BPV in blood of healthy and affected cattle by papillomatosis. The BPV 1 and 2 were found in asymptomatic and papillomatosisaffected animals as well as its expression. In Chapter V, we detected the presence and expression of BPV in fresh semen of healthy bulls. BPV2 DNA was found in 35% of samples and the expression of E2 and E5 proteins was found in 55% of BPV2- positive semen. In Chapter VI was investigated the presence and expression of BPV genes in blood and semen cells of healthy horses by PCR and RT-PCR. BPV 1 and 2 were found in 20% of blood horses and in 35% of semen evaluated. Expression of E5 oncoprotein was found in 36% of blood and semen samples positive for BPV. In Chapter VII, we compared two PCR methods for BPV detection in skin lesions and fluids: the use of BPV type-specific and consensus primers. The type-specific primers for detection of BPV were more sensitive than consensus primers and could detect co-infection of BPV in the samples. Consensus primers amplified a high diversity of BPV, and probable new BPV types in the samples studied. Thus, this thesis allowed describing the diversity of BPV in the skin lesions of Brazillian cattle and one of its possible mechanisms of action and also contributes to strengthen the hypothesis that BPV may infect non-epithelial sites, by verifying the presence and expression of viral genes in blood and semen cells of cattle and horses. The results obtained in this thesis contribute to a better understanding of molecular tools that can be employed in studies of presence and characterization of BPV in various bovine tissues.

Mais de 200 mutações patogênicas já foram descritas no gene que codifica a Cx26 (GJB2) que levam à surdez hereditária. A mais frequente destas mutações é a c.35delG. Ela é a principal causa de surdez não sindrômica com padrão de herança autossômico recessivo na população brasileira e em diversas populações do mundo. O genoma humano contém 21 diferentes genes de proteínas da família das conexinas que são expressos em diversos tecidos. Os canais comunicantes e hemicanais formados por conexinas facilitam a passagem de pequenos metabólitos entre as células adjacentes e entre a célula e o meio extracelular, promovendo a homeostasia celular. Este estudo teve o objetivo de avaliar os efeitos da mutação c.35delG em homozigose no gene GJB2 em SHEDs sobre a diferenciação celular e sobre a expressão das Cx26 (GJB2), Cx30 (GJB6), Cx31 (GJB3), Cx43 (GJA1) e Cx50 (GJA8) em SHEDs (Stem cells from human exfoliated deciduous teeth). Para isso, obtivemos linhagens de SHEDs a partir de 3 indivíduos portadores da mutação c.35delG em homozigose e de 3 indivíduos controle, sem a mutação. Nossos resultados indicaram que SHEDs portadoras da mutação apresentam maiores taxas de diferenciação em adipócitos e em osteócitos do que SHEDs de indivíduos controle. Por meio de RT-PCR, RT-PCR quantitativa e citometria de fluxo identificamos a expressão dos genes GJB2 (Cx26), GJB6 (Cx30) e GJA1 (Cx43) e suas respectivas proteínas, tanto em SHEDs dos indivíduos com a mutação como em SHEDs de indivíduos controle. Não há expressão dos genes GJA8 (Cx50) e GJB3 (Cx31) e suas respectivas proteínas em SHEDs. Por meio de RT-PCR quantitativa observamos aumento dos níveis de expressão do RNAm de GJA1 e redução de RNAm de GJB2 em SHEDs oriundas de pacientes com c.35delG, quando comparadas às de amostras controle. Resultados obtidos por meio de Western Blotting mostraram aumento de aproximadamente 50% na expressão da Cx43 corroborando os resultados obtidos por meio de RT-PCR quantitativo. Detectamos que a expressão da Cx26 em células de indivíduos com mutação é 50% menor do que em células de indivíduos controle. Os aumentos observados das taxas de diferenciação em adipócitos e em osteócitos podem estar relacionados ao aumento da expressão da Cx43. Sabe-se que a Cx43 possui importante papel na manutenção de pré-adipócitos durante a fase de expansão clonal na adipogênese. A Cx43 também está relacionada à sinalização celular nas vias de proliferação e diferenciação durante a osteogênese. Indivíduos portadores da mutação c.35delG apresentam surdez sem outros fenótipos associados sugerem que ocorra redundância funcional entre as conexinas. Além disso, o aumento da expressão de GJA1 (Cx43) nas SHEDs oriundas dos indivíduos surdos com a mutação c.35delG falam a favor da existência de um mecanismo de regulação compensatório a ser esclarecido, que aumenta a síntese de Cx43 na redução ou ausência da Cx26 funcional / More than 200 patogenic mutations in the connexin 26 gene (GJB2) were associated to deafness. The most frequent is the c.35delG mutation, which is the most common cause of nonsydromic recessive hearing loss in the Brazilian population, and also in several populations in the world. The human genome contains 21 genes that comprise the gene family of the connexins, expressed in many different tissues. Connexins are components of gap junctions and hemichannels, which facilitate the transference of small metabolites between cells and between cells and the extracelular medium. The aim of this study was to investigate the effects of the c.35delG mutation on adipogenesis, chondrogenesis and osteogenesis, and also its effects on mRNA and protein expression related to Cx26 (GJB2), Cx30(GJB6), Cx31 (GJB3), Cx43 (GJA1) and Cx50 (GJA8) in SHEDs (stem cells from human exfoliated deciduous teeth). For this purpose, 3 SHED lines from patients with c.35delG mutation in homozygosis and 3 lines from individuals without mutation were established. We observed that the rates of induced differentiation into adipocytes and osteocytes were higher in SHEDs from individuals with the c.35delG mutation than in SHEDs from control individuals. By RT-PCR, real time RT-PCR and flow cytometry were detected the expression of GJB2, GJB6 and GJA1 genes and their respective proteins Cx26, Cx30 and Cx43 in SHEDs from control samples and in SHEDs with the mutation. The expression of GJA8 (Cx50) and of GJB3 (Cx31) were not detected in SHEDS from both groups. Quantitative gene expression analysis using real-time RT-PCR revealed significantly elevated levels of GJA1 mRNA expression and decreased GJB2 mRNA expression in cells from patients with c.35delG, when compared to cells from normal controls. Western Blotting analysis showed an increase of about of 50% of the protein Cx43 in cells with c.35delG mutation, in comparison to cells from normal controls, in accordance with the real-time RT-PCR results. We detected that Cx26 protein expression in samples with c.35delG mutation is approximately 50% lower than in SHEDs from normal controls. The observed increase in differentiation rates related to adipogenesis and osteogenesis may be explained by the higher levels of Cx43 expression. This is supported by the fact that Cx43 was reported to play an important role in the maintenance of pre-adipocytes during clonal expansion and it was also related to cell signaling pathways in proliferation and differentiation during osteogenesis. Individuals with c.35delG in homozygosis present only deafness, without other symptoms, which suggests that functional redundancy between connexins may exist. The increase of Cx43 expression in SHEDs from deaf patients with c.35delG mutation found by us may be related to a compensation mechanism to be clarified, which results in increase of the production of Cx43 when functional connexin Cx26 is reduced or absent

As células necessitam do contato com outras células e com a matriz extracelular, para a formação de tecidos. As junções gap são estreitos canais que conectam o citoplasma de células adjacentes, promovendo a passagem de íons orgânicos, aminoácidos, nucleotídeos e outros metabólitos. Estas junções são compostas por dois conexons ou hemicanais, que atravessam a membrana plasmática da célula a que pertencem, e são compostos por seis proteínas integrais de membrana denominadas conexinas (Cxs). A Cx43 é a mais expressa, e é fosforilada ao longo do ciclo de vida, sofrendo mudanças conformacionais, resultando em diferentes isoformas (P0, P1 e P2), apresentando propriedades distintas. A Cx43 apresenta-se distribuída em todo o rim adulto. A injúria renal aguda (IRA) é uma síndrome metabólica em que ocorre redução aguda da função renal e rápida diminuição da taxa de filtração glomerular, sendo hipóxia decorrente da isquemia sua causa principal. A restrição de oxigênio e nutrientes, e o acúmulo de metabólitos, resultam na injúria das células epiteliais tubulares. A depleção dos níveis de ATP, aumento nos níveis de cálcio intracelular, alterações na membrana e deformações no citoesqueleto caracterizam esta injúria. A reoxigenação tecidual atua como agressão adicional devido à liberação de radicais livres. Estudos sugerem que a ativação de hemicanais de Cx43, resultante da desfosforilação da proteína, durante depleção de ATP, esteja envolvida na IRA. Este trabalho verificou o envolvimento da Cx43 em modelo murino desta injúria, ocasionada por isquemia/reperfusão. Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6J. A isquemia foi induzida por clampeamento das artérias renais por 45 minutos. A reperfusão ocorreu durante 24 horas após cirurgia. Foram utilizados 6 animais por grupo (isquêmicos, reperfundidos e controle). Após sacrifício, fragmentos dos rins foram submetidos a ensaios de western blot, PCR em tempo real, imuno-histoquímica e imunofluorescência. O modelo experimental foi validado através da dosagem de uréia e creatinina plasmática. As análises estatísticas foram realizadas pela análise de variância (ANOVA), seguido do teste de Bonferroni. Observou-se aumento significativo dos níveis de uréia e creatinina nos animais isquêmicos e reperfundidos, em relação ao controle. A expressão gênica apresentou aumento significativo apenas nos rins de camundongos reperfundidos (1,9 vezes; P<0,01 vs controle). No western blot verificou-se aumento na quantidade da isoforma hiperfosforilada da Cx43 (P2) em rins isquêmicos (2,73 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição significativa nos reperfundidos (2,37 vezes; P<0,05 vs isquêmico). Nas isoformas menos fosforiladas (P1/P0), observou-se aumento nos rins isquêmicos (2,33 vezes; P<0,05 vs controle), com diminuição nos reperfundidos (10 vezes; P<0,01 vs isquêmico). Nos ensaios imuno-histológicos verificou-se diferentes localizações da Cx43 nas células epiteliais de túbulos corticais nos grupos comparados. Nos controles verificou-se distribuição difusa, e nos isquêmicos observou-se intensa marcação em superfície celular apical. Nos rins reperfundidos, a distribuição da Cx43 foi basolateral. As alterações observadas na expressão gênica, fosforilação protéica e distribuição da Cx43 nos rins foram semelhantes às mudanças observadas na isquemia cardíaca. Este estudo mostrou pela primeira vez a regulação da Cx43 em níveis transcricionais e pós-traducionais, e sua localização celular na IRA ocasionada por isquemia/reperfusão, indicando sua participação neste processo. / The cells require contact with other cells and the extracellular matrix for tissue formation. Gap junctions are narrow channels connecting the cytoplasm of two adjacent cells, promoting the passage of inorganic ions, amino acids, nucleotides and other metabolites. These junctions are composed of two conexons or hemichannels, crossing the cell plasma membrane where they belong, and consist of six integral membrane proteins called connexins (Cxs). The Cx43 is the most expressed, and is phosphorylated throughout the life cycle, undergoing conformational changes, resulting in different isoforms (P0, P1 and P2) that have different properties. The Cx43 is distributed throughout the adult kidney. The acute kidney injury (AKI) is a metabolic syndrome that occurs in acute reduction of renal function and rapid decline in glomerular filtration rate. Hypoxia resulting from ischemia is its principal cause. The restriction of oxygen and nutrients, and accumulation of metabolites, result in the injury of tubular epithelial cells. The depletion of ATP levels, increased levels of intracellular calcium, changes in the membrane and cytoskeleton deformation characterize this injury. Reoxygenation tissue acts as additional injury due to release of free radicals. Studies suggest that activation of Cx43 hemichannels, resulting from dephosphorylation of the protein during ATP depletion, is involved in the AKI. This study investigated the involvement of Cx43 in a murine model of this injury, caused by ischemia/ reperfusion. We used male mice of strain C57BL/6J. Ischemia was induced by clamping the renal arteries for 45 minutes. Reperfusion occurred 24 hours after surgery. We used six animals per group (ischemic, reperfused, and sham). After sacrifice, kidney fragments were tested for western blot, real-time PCR, immunohistochemistry and immunofluorescence. The levels of plasma urea and creatinine were measured to validate the experimental model. Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni test. We observed significant increase in serum urea and creatinine in ischemic and reperfused animals compared to sham. Gene expression increased significantly only in the reperfused kidneys (1.9 fold, P <0.01 vs sham). The western blot showed an increase in the amount of hyperphosphorylated isoform of Cx43 (P2) in ischemic kidneys (2.73 times, P <0.05 vs sham), with significant reduction in reperfused (2.37 times, P <0 05 vs ischemic). In the less phosphorylated isoforms (P1/P0), we observed an increase in ischemic kidneys (2.33 times, P <0.05 vs sham), with a decrease in reperfused (10 times, P <0.01 vs ischemic). In immuno-histological tests we verified different locations of Cx43 in the epithelial cells of cortical tubules. In normal kidneys there was patchy distribution, while in ischemic there was intense staining in the apical cell surface. In the reperfused kidney, the distribution of Cx43 was basolateral. The changes in gene expression, protein phosphorylation and distribution of Cx43 in the kidney observed in this study were similar to changes observed in cardiac ischemia. This study showed for the first time the regulation of Cx43 in transcriptional and post-translational levels, and its cellular localization in acute renal failure caused by ischemia/reperfusion, indicating its involvement in this injury.

A circulação extracorpórea (CEC) substitui as funções do coração e pulmões durante o tempo principal da cirurgia cardíaca, permitindo que o cirurgião acesse o interior do órgão por longo período de tempo e assegurando a oxigenação dos tecidos e eliminação dos seus produtos finais. Entretanto, tal técnica não é utilizada rotineiramente em medicina veterinária devido aos elevados custos e também em decorrência das alterações deletérias que promove no organismo dos animais. Visando uma melhor compreensão das complicações decorrentes da CEC, possibilitando amenizá-las, aventou-se o estudo da conexina 43 (Cx43), proteína presente no miocárdio e responsável pela formação das junções intercelulares do tipo gap. O presente estudo avaliou cinco cães indenes, SRD, não submetidos à CEC, procedendo-se a colheita de amostras correspondentes à região do septo interventricular, átrios direito e esquerdo, ventrículos direito e esquerdo e posterior análise da Cx43 através da imunofluorescência, western blot e RT-PCR. Avaliou também cinco cães indenes, SRD, submetidos à toracotomia intercostal direita convencional e posterior instituição da CEC. Amostras de miocárdio foram colhidas em três distintos momentos, quais sejam: T0 (antes da CEC), T1 (após duas horas de CEC) e T2 (após uma hora de desmame da CEC), para verificar as possíveis alterações na (Cx43) decorrentes da CEC, pela técnica de imunofluorescência. Ao final do procedimento experimental, os animais foram sacrificados. Os resultados mostraram que nos animais indenes não operados, a Cx43 apresenta localização em todas as regiões estudadas, não apresentando diferença significativa com relação à expressão nas diferentes regiões. Porém, nos animais submetidos à CEC, a referida conexina apresentou-se diminuída. Por fim, concluímos que em cães a CEC por duas horas com uma hora de circulação espontânea é técnica exeqüível, porém determina sérias alterações clínicas e induz a processos patológicos. / Cardiopulmonary bypass (CPB) replaces the heart and lung function during the main period of cardiac surgery, and it allows the access of the surgeon inside the organ for a long time, ensuring tissue oxygenation and the elimination of end products. However, this procedure isn´t used as a routine in veterinary medicine because of the high costs, and besides it causes damage in the animal organism. In order to promote a better comprehension of the complications caused by CPB, and perhaps to assuage them, this work was designed to study the connexin 43 (Cx43), a protein present in myocardium which forms intercellular communications like gap junctions. To do so five health mongrel dogs not submitted to CPB were evaluated and tissue samples were taken from specific locals as ventricular septal, right and left atrium, right and left ventricle, to perform Cx43 analyses by immunofluorescence, western blot and RT-PCR. Were also studied others five health mongrel dogs submitted to a conventional right intercostal thoracotomy for CPB procedure. Samples of myocardium were taken in three different moments: T0 (before CPB), T1 (after two hours of CPB) and T2 (after one hour the end of CPB) to check possible alterations in Cx43 caused by CPB using immunofluorescence technique. The euthanasia of the animals was performed at the end of the experimental period. The results shown that in health animals not operated, the Cx43 is located in every studied local and there is no significant difference in the protein expression areas. Nevertheless, the CPB technique reduced the connexin expressions in the operated animals. Finally, we may conclude that the cardiopulmonary bypass for two hours and a spontaneous perfusion for one hour is a feasible procedure in dogs, but it determines serious clinical alterations and may induce pathophisyological process.