Tem sido demonstrado que a capacidade de comunicação intercelular via junções do tipo gap tem relevância na formação óssea. A principal conexina envolvida no desenvolvimento, na diferenciação e na regulação de crescimento de tecidos ósseos é a conexina 43. Contudo, outras duas conexinas expressas, são a Cx 45, que aparece em menor número em relação a Cx43, e a Cx46 que é caracterizada por ser detectada freqüentemente associada à região transi-Golgi. Alterações no perfil de expressão e localização aberrante das conexinas têm sido associadas a oncogênese, demonstrando uma diminuição da expressão destas conexinas em tecidos neoplásicos. Escassos são os estudo que avaliaram a expressão das conexinas 43, 45 e 46 em células de osteossarcoma, e nenhum estudo enfocando este aspecto foi realizado em osteossarcoma canino. No presente foram avaliados os tecidos ósseos normais e neoplásico de cães quanto à expressão das Cx43, e 46 por meio de imunofluorescência, os níveis de expressão das mesmas conexinas por meio de Western blot e por PCR em tempo real, assim como sua correlação com o tipo de tumor ósseo, associado ao exame histopatológico de rotina. Os resultados mostraram que os níveis de expressão gênica da Cx43 foram semelhantes entre o tecido ósseo normal e neoplásico, sendo as mesmas encontradas no citoplasma e membrana citoplasmática. A conexina 46 foi encontrada retida em região perinuclear, tendo níveis diferentes de expressão gênica entre os tecidos ósseo normal e neoplásico. Concluímos então que a conexina 43 é expressa por osteoblastos normais e neoplásicos em níveis semelhantes, porém há diferenças na expressão de Cx46. Concluímos também que existem diferenças quanto à localização subcelular destas duas conexinas em tecidos ósseos normais e neoplásicos de cães. Estes resultados indicam um possivel envolvimento das conexinas 43 e 46 em tumores ósseos de cães. / Increasing evidence indicates that junctional communiction by gap juctions has a critical role in a bone physiology. The main connexin (Cx) express involved in development, differentiation and regulation of tissue growth, is the called Cx43. However, other, two connexis are expressed: Cx45 and Cx46. Cx46 is retained as monomers in a trans-golgi compartment of osteoblastic cells. Alterations in the expression profile and aberrant localization of the conexinas have been associated to oncogenesis, demonstrating a reduction of the expression of these conexins in neoplastic tissues. In the present study, we aimed at evaluating the expression of Cx43 and Cx46 in normal and neoplastic osseous tissues from dogs, by means of immunofluorescence, Western blot and Real time- PCR. These results were correlated with the routine histological evaluation of the bone tumor. Results showed that the levels of genetic expression of Cx43 were similar in both normal and neoplastic osseous tissues from dogs, and the Cx43 were found both in the cytoplasm and in the cytoplasmic membrane. Connexin 46 was found in the perinuclear region of neoplastic osteoblasts, and different levels of genic expression were found between normal and neoplastic osseous tissues. We can conclude that the Cx43 is similarly expressed by both normal and neoplastic osteoblasts from dogs, however there are differences in the expression of Cx46. These results point to a possible role of connexins 43 and 46 in dog bone tumors.

Os mastocitomas são formações cutâneas neoplásicas que mais acometem os cães, por isso inúmeras pesquisas estão sendo direcionadas no descobrimento de novas opções de tratamento, diagnóstico e prognóstico desta doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de um conjunto de proteínas que estão interligadas ou interligam vias de sinalização, na tentativa de identificar proteínas que se apresentem diferencialmente expressas nos mastocitomas caninos de diferentes graus. Realizamos um estudo da expressão deste conjunto de proteínas em 18 tumores oriundos dos arquivos do Serviço de patologia animal do Departamento de Patologia da FMVZ-USP. Realizamos coleta de material fresco de outras 18 amostras de mastocitomas cutâneos caninos, as quais foram submetidas ao cultivo celular, e então foram estabelecidas 10 linhagens de mastocitomas cutâneos caninos a fim de se avaliar este mesmo grupo de marcadores moleculares in vitro. As amostras do arquivo foram submetidas à imunomarcação das seguintes proteínas: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7. Nas linhagens tumorais estabelecidas analisamos o ciclo celular, ploidia de DNA, proliferação celular pelo CFSE, análise ultraestrutural pela microscopia eletrônica de transmissão, análise mutacional do gene c-Kit, e análise por imunocitoquímica e imunofluorescência dos seguintes marcadores moleculares: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7, CX32, CX43, vimentina, triptase. Os resultados demonstram a alteração da expressão das proteínas do complexo E-caderina/catenina, do c-Kit, da proteína PTEN e MMP-7 de acordo com o grau do mastocitoma canino. Observamos além da redução de expressão uma localização subcelular de todas estas proteínas nos tumores mais agressivos como nos mastocitomas de grau 3. O mesmo foi observado para as proteínas Cx 43 e 32. Realizamos levantamento do histórico clínico dos 18 casos de mastocitoma caninos oriundos do arquivo, e os parâmetros clínicos avaliados foram: idade, raça, gênero, localização, tempo de evolução, alteração linfonodo, metástases, tempo sobrevida, intervalo recidiva, óbito. Foram associados a um pior prognóstico os pacientes que apresentaram os seguintes parâmetros: animais idosos, presença de metástase, localização no tórax e graduação tumoral. Nas linhagens tumorais estabelecidas, a análise da ploidia revelou que todas as linhagens de mastocitomas são diploides e o CFSE mostrou que a proliferação máxima ocorre dentro de 24hs de cultivo. A análise ultraestrutural comprova que as células das linhagens são mastócitos tumorais. A análise pela imunocitoquimica dos marcadores em estudo revelaram padrões similares aos encontrados na imunoistoquimica. Pela expressão da vimentina e da triptase confirmamos mais uma vez se tratar de linhagens de mastócitos em cultivo. Na análise mutacional do gene c-kit encontramos mutações no éxon 8 e 11, mas não no éxon 17. Nossos resultados revelam a ocorrência simultânea de inúmeras alterações moleculares nos mastocitoma caninos. As proteínas avaliadas têm funções e vias distintas, mas, que se interligam podendo regular ou serem reguladas, dependendo do momento em que se encontra a célula. A desestabilização do complexo E-caderina-cateninas parece ser o programa efetor na progressão dos mastocitomas caninos. A finalidade maior de se realizar estudos morfológicos, funcionais e moleculares das neoplasias é contribuir, mais cedo ou mais tarde, para o controle destas doenças. Esperamos, com este trabalho, ter fornecido informações importantes que favorecerão a busca por melhores tratamentos dos mastocitomas caninos. / Mast cell tumors are malignant skin formations that most affect dogs, so many research projects are being directed at the discovery of new treatment options, diagnosis and prognosis of this disease. The objective of this study was to evaluate the expression of a set of proteins that are interlinked or interconnected signaling pathways, in an attempt to identify proteins that show differentially expressed in canine mast cell tumors of different grades. We performed a study of the expression of this set of 18 proteins in tumors originating from the files of the Service of Animal Pathology, Department of Pathology of the FMVZ - USP. We collected other 18 new samples of canine cutaneous mast cell tumors , which were subjected to cell culture , and 10 strains of canine cutaneous mast cell tumors were established in order to evaluate in vitro this same group of molecular markers. The samples were subjected to immunostainings the following proteins: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7. In established tumor cell lines we analyzed the cell cycle, DNA ploidy, cell proliferation by CFSE, ultrastructural analysis by transmission electron microscopy , mutational analysis of c-kit gene, and analysis by immunocytochemistry and immunofluorescence of the following molecular markers: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7, CX32, Cx43, vimentin, tryptase. The results demonstrate the altered expression of the proteins, c- Kit, MM7 and PTEN proteins according to the level of the canine mastocytoma E-caderina/catenina complex. It has been observed a reduced expression as well as alterations in subcellular localization of all these proteins in more aggressive tumors as in grade 3 mast cell tumors. The same was observed for Cx 43 and 32 proteins. It has been performed a survey of the medical records of 18 cases of canine mast cell tumors retrieved from the archives, and clinical parameters evaluated were age, race, gender, location, time of evolution, change lymph node metastasis, survival time, recurrence interval, death. Older animals, metastasis, and tumor location in the chest, and mast cell tumor grade: patients who had the following parameters were associated with a worse prognosis. In the established tumor cell lines, ploidy analysis revealed that all lines are diploid mastocytoma and CFSE proliferation showed that the maximum occurs within 24 hours of cultivation. The ultrastructural analysis showed that the tumor cells are mast cell lineages. Analysis by immunocytochemistry markers studied showed similar patterns to those found in immunohistochemistry. By expression of vimentin and tryptase confirmed once again the case of mast cell lines in culture. In mutational analysis of the c kit, mutations were found in exon 8 and 11, but not in exon 17. Our results show the simultaneous occurrence of numerous molecular alterations in canine mast cell tumors. Proteins have different functions and evaluated pathways, but that interlock may regulate or be regulated, depending on the moment of the cell. The destabilization of the complex E-cadherin-catenins seems to be the effector program in the progression of canine mast cell tumors. The main purpose of performing morphological, functional and molecular studies of tumors is to contribute, sooner or later, to the control of these diseases. Hopefully, with this work, we have provided important information which will facilitate the search for better treatment of canine mast cell tumors

Tem sido demonstrado que a capacidade de comunicação intercelular via junções do tipo gap tem relevância na formação óssea. A principal conexina envolvida no desenvolvimento, na diferenciação e na regulação de crescimento de tecidos ósseos é a conexina 43. Contudo, outras duas conexinas expressas, são a Cx 45, que aparece em menor número em relação a Cx43, e a Cx46 que é caracterizada por ser detectada freqüentemente associada à região transi-Golgi. Alterações no perfil de expressão e localização aberrante das conexinas têm sido associadas a oncogênese, demonstrando uma diminuição da expressão destas conexinas em tecidos neoplásicos. Escassos são os estudo que avaliaram a expressão das conexinas 43, 45 e 46 em células de osteossarcoma, e nenhum estudo enfocando este aspecto foi realizado em osteossarcoma canino. No presente foram avaliados os tecidos ósseos normais e neoplásico de cães quanto à expressão das Cx43, e 46 por meio de imunofluorescência, os níveis de expressão das mesmas conexinas por meio de Western blot e por PCR em tempo real, assim como sua correlação com o tipo de tumor ósseo, associado ao exame histopatológico de rotina. Os resultados mostraram que os níveis de expressão gênica da Cx43 foram semelhantes entre o tecido ósseo normal e neoplásico, sendo as mesmas encontradas no citoplasma e membrana citoplasmática. A conexina 46 foi encontrada retida em região perinuclear, tendo níveis diferentes de expressão gênica entre os tecidos ósseo normal e neoplásico. Concluímos então que a conexina 43 é expressa por osteoblastos normais e neoplásicos em níveis semelhantes, porém há diferenças na expressão de Cx46. Concluímos também que existem diferenças quanto à localização subcelular destas duas conexinas em tecidos ósseos normais e neoplásicos de cães. Estes resultados indicam um possivel envolvimento das conexinas 43 e 46 em tumores ósseos de cães. / Increasing evidence indicates that junctional communiction by gap juctions has a critical role in a bone physiology. The main connexin (Cx) express involved in development, differentiation and regulation of tissue growth, is the called Cx43. However, other, two connexis are expressed: Cx45 and Cx46. Cx46 is retained as monomers in a trans-golgi compartment of osteoblastic cells. Alterations in the expression profile and aberrant localization of the conexinas have been associated to oncogenesis, demonstrating a reduction of the expression of these conexins in neoplastic tissues. In the present study, we aimed at evaluating the expression of Cx43 and Cx46 in normal and neoplastic osseous tissues from dogs, by means of immunofluorescence, Western blot and Real time- PCR. These results were correlated with the routine histological evaluation of the bone tumor. Results showed that the levels of genetic expression of Cx43 were similar in both normal and neoplastic osseous tissues from dogs, and the Cx43 were found both in the cytoplasm and in the cytoplasmic membrane. Connexin 46 was found in the perinuclear region of neoplastic osteoblasts, and different levels of genic expression were found between normal and neoplastic osseous tissues. We can conclude that the Cx43 is similarly expressed by both normal and neoplastic osteoblasts from dogs, however there are differences in the expression of Cx46. These results point to a possible role of connexins 43 and 46 in dog bone tumors.

Os mastocitomas são formações cutâneas neoplásicas que mais acometem os cães, por isso inúmeras pesquisas estão sendo direcionadas no descobrimento de novas opções de tratamento, diagnóstico e prognóstico desta doença. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de um conjunto de proteínas que estão interligadas ou interligam vias de sinalização, na tentativa de identificar proteínas que se apresentem diferencialmente expressas nos mastocitomas caninos de diferentes graus. Realizamos um estudo da expressão deste conjunto de proteínas em 18 tumores oriundos dos arquivos do Serviço de patologia animal do Departamento de Patologia da FMVZ-USP. Realizamos coleta de material fresco de outras 18 amostras de mastocitomas cutâneos caninos, as quais foram submetidas ao cultivo celular, e então foram estabelecidas 10 linhagens de mastocitomas cutâneos caninos a fim de se avaliar este mesmo grupo de marcadores moleculares in vitro. As amostras do arquivo foram submetidas à imunomarcação das seguintes proteínas: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7. Nas linhagens tumorais estabelecidas analisamos o ciclo celular, ploidia de DNA, proliferação celular pelo CFSE, análise ultraestrutural pela microscopia eletrônica de transmissão, análise mutacional do gene c-Kit, e análise por imunocitoquímica e imunofluorescência dos seguintes marcadores moleculares: PTEN, c-kit, E-caderina, β-catenina, α-catenina, p120-catenina, MMP-7, CX32, CX43, vimentina, triptase. Os resultados demonstram a alteração da expressão das proteínas do complexo E-caderina/catenina, do c-Kit, da proteína PTEN e MMP-7 de acordo com o grau do mastocitoma canino. Observamos além da redução de expressão uma localização subcelular de todas estas proteínas nos tumores mais agressivos como nos mastocitomas de grau 3. O mesmo foi observado para as proteínas Cx 43 e 32. Realizamos levantamento do histórico clínico dos 18 casos de mastocitoma caninos oriundos do arquivo, e os parâmetros clínicos avaliados foram: idade, raça, gênero, localização, tempo de evolução, alteração linfonodo, metástases, tempo sobrevida, intervalo recidiva, óbito. Foram associados a um pior prognóstico os pacientes que apresentaram os seguintes parâmetros: animais idosos, presença de metástase, localização no tórax e graduação tumoral. Nas linhagens tumorais estabelecidas, a análise da ploidia revelou que todas as linhagens de mastocitomas são diploides e o CFSE mostrou que a proliferação máxima ocorre dentro de 24hs de cultivo. A análise ultraestrutural comprova que as células das linhagens são mastócitos tumorais. A análise pela imunocitoquimica dos marcadores em estudo revelaram padrões similares aos encontrados na imunoistoquimica. Pela expressão da vimentina e da triptase confirmamos mais uma vez se tratar de linhagens de mastócitos em cultivo. Na análise mutacional do gene c-kit encontramos mutações no éxon 8 e 11, mas não no éxon 17. Nossos resultados revelam a ocorrência simultânea de inúmeras alterações moleculares nos mastocitoma caninos. As proteínas avaliadas têm funções e vias distintas, mas, que se interligam podendo regular ou serem reguladas, dependendo do momento em que se encontra a célula. A desestabilização do complexo E-caderina-cateninas parece ser o programa efetor na progressão dos mastocitomas caninos. A finalidade maior de se realizar estudos morfológicos, funcionais e moleculares das neoplasias é contribuir, mais cedo ou mais tarde, para o controle destas doenças. Esperamos, com este trabalho, ter fornecido informações importantes que favorecerão a busca por melhores tratamentos dos mastocitomas caninos. / Mast cell tumors are malignant skin formations that most affect dogs, so many research projects are being directed at the discovery of new treatment options, diagnosis and prognosis of this disease. The objective of this study was to evaluate the expression of a set of proteins that are interlinked or interconnected signaling pathways, in an attempt to identify proteins that show differentially expressed in canine mast cell tumors of different grades. We performed a study of the expression of this set of 18 proteins in tumors originating from the files of the Service of Animal Pathology, Department of Pathology of the FMVZ - USP. We collected other 18 new samples of canine cutaneous mast cell tumors , which were subjected to cell culture , and 10 strains of canine cutaneous mast cell tumors were established in order to evaluate in vitro this same group of molecular markers. The samples were subjected to immunostainings the following proteins: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7. In established tumor cell lines we analyzed the cell cycle, DNA ploidy, cell proliferation by CFSE, ultrastructural analysis by transmission electron microscopy , mutational analysis of c-kit gene, and analysis by immunocytochemistry and immunofluorescence of the following molecular markers: PTEN, c-kit, E-cadherin, β-catenin, α-catenin, p120-catenin, MMP-7, CX32, Cx43, vimentin, tryptase. The results demonstrate the altered expression of the proteins, c- Kit, MM7 and PTEN proteins according to the level of the canine mastocytoma E-caderina/catenina complex. It has been observed a reduced expression as well as alterations in subcellular localization of all these proteins in more aggressive tumors as in grade 3 mast cell tumors. The same was observed for Cx 43 and 32 proteins. It has been performed a survey of the medical records of 18 cases of canine mast cell tumors retrieved from the archives, and clinical parameters evaluated were age, race, gender, location, time of evolution, change lymph node metastasis, survival time, recurrence interval, death. Older animals, metastasis, and tumor location in the chest, and mast cell tumor grade: patients who had the following parameters were associated with a worse prognosis. In the established tumor cell lines, ploidy analysis revealed that all lines are diploid mastocytoma and CFSE proliferation showed that the maximum occurs within 24 hours of cultivation. The ultrastructural analysis showed that the tumor cells are mast cell lineages. Analysis by immunocytochemistry markers studied showed similar patterns to those found in immunohistochemistry. By expression of vimentin and tryptase confirmed once again the case of mast cell lines in culture. In mutational analysis of the c kit, mutations were found in exon 8 and 11, but not in exon 17. Our results show the simultaneous occurrence of numerous molecular alterations in canine mast cell tumors. Proteins have different functions and evaluated pathways, but that interlock may regulate or be regulated, depending on the moment of the cell. The destabilization of the complex E-cadherin-catenins seems to be the effector program in the progression of canine mast cell tumors. The main purpose of performing morphological, functional and molecular studies of tumors is to contribute, sooner or later, to the control of these diseases. Hopefully, with this work, we have provided important information which will facilitate the search for better treatment of canine mast cell tumors

Os canais de junções comunicantes (gap junctions, JC) são formados por subunidades chamadas de conexinas (Cx). Estas proteínas têm papel relevante no acoplamento celular, participando da condutância de células nervosas ou gliais e modulando vários processos fisiológicos e fisiopatológicos. O objetivo deste trabalho é avaliar o envolvimento das conexinas na nocicepção aguda, por meio de ensaios comportamentais e estudos de mapeamento da sua expressão em células do gânglio da raiz dorsal de ratos. Para tanto, foi analisado o efeito de carbenoxolone (CBX) e quinina (bloqueadores de JCs), assim como de oligonucleotídeos antisense para conexinas 36 e 43 na indução e manutenção de hiperalgesia induzida por carragenina em ratos. Os resultados mostraram que a carragenina induz uma diminuição do limiar nociceptivo em ratos e que esse efeito hiperalgésico da carragenina foi bloqueado pelo tratamento com carbenoxolone (nas doses 20-50mg) e significantemente inibido por quinina (nas doses 20-50mg), sugerindo uma participação das junções comunicantes (JC) no processo. / Gap junctions channels (GJ) are formed by proteic subunits called connexins (Cx). These proteins have an important role in cellular coupling, participating in the conductance of glial and nerve cells or modulating various physiological and pathophysiological processes. The aim of this study is to evaluate Cx36 and Cx43 involvement in acute nociception through behavioral assays, mapping studies of its expression in rat dorsal root ganglion cells. For this purpose, we analyzed the effect of intrathecal treatment with carbenoxolone (CBX) and quinine (GJs blockers), as well as antisense oligonucleotides for connexins 36 and 43 in the induction and maintenance of carrageenan-induced hyperalgesia in rats. The results show that carrageenan induces a nociceptive threshold decrease in rats. The hyperalgesic effect was blocked by treatment with carbenoxolone (20-50mg doses), Cx43 antisense and inhibited significantly by quinine (at doses 20 -50mg) but no with Cx36 antisense, suggesting an involvement of gap junctions (JC) in the process.

As junções comunicantes formadas por conexinas (Cx) ligam o citoplasma de células adjacentes e permitem a passagem de moléculas e íons entre elas. No sistema nervoso, esses canais constituem as sinapses elétricas e são fundamentais para a fisiologia glial. No desenvolvimento, as conexinas estão envolvidas nos processos de migração, proliferação e diferenciação celular. Caracterizamos a expressão gênica (RNAm) e protéica de duas importantes conexinas no cerebelo de aves: Cx36 (neuronal) e Cx43 (glial). Houve um aumento protéico e na expressão de RNAm tanto para a Cx36 quanto para a Cx43. Para a Cx43 esse aumento foi associado a sinaptogênese. A Cx36 foi observada em estágios mais precoces, na camada proliferativa cerebelar. No cerebelo pós-natal, A Cx36 foi observada nos dendritos das células de Golgi. A Cx43 encontra-se principalmente em astrócitos da camada granular e substância branca. Em conclusão, nós observamos uma padrão de expressão espaço-temporal distinto entre as duas conexinas, relacionado a papéis específicos na função de desenvolvimento cerebelares. / Gap junction channels composed of connexins (Cxs) connect the cytoplasm of adjacent cells and allow the flow of ions and molecules between them. In the nervous system, these channels constitute the electrical synapses and are fundamental for the glial physiology. In the development, Cx channels are involved in the processes of cell proliferation, migration and differentiation. We characterized the gene (mRNA) and protein expression of Cx36 (neuronal) and Cx43 (glial) in the embryonic and postnatal avian cerebellum. Cx36 and Cx43 mRNA and protein levels were upregulated during development. For Cx43 this increase was clearly associated with the synaptogenesis process. Cx36 was observed in earlier stages, localized in the cerebellar proliferative layer. In the postnatal period, Cx36 was observed in the dendrites of Golgi cells. Cx43 was localized in the astrocytes of the grey and white matter. In conclusion, we observed a distinct spatio-temporal expression pattern for Cx36 and Cx43, wich is likely related to particular roles in cerebellar development and function.

A sinalização no sistema nervoso pode ocorrer pelo acoplamento direto entre células, via canais de junção comunicantes (JCs). Estes canais permitem a passagem de moléculas de até 1 kDa, e são formados por subunidades proteicas denominadas conexinas (Cxs). A comunicação celular via JCs desempenha um importante papel durante o desenvolvimento e a sinalização visual. Além disso, o acoplamento celular provido pelas JCs tem sido relacionado a processos de sobrevivência/morte celular. Do mesmo modo, ciclinas e cinases dependentes de ciclinas (CDKs), além de seu papel clássico na regulação do ciclo e diferenciação celular, estão envolvidas em processos neurodegenerativos. Estudos recentes têm observado a reentrada no ciclo celular de células neuronais pós-mitóticas em apoptose. Neste contexto, analisamos a expressão gênica e proteica das Cxs e ciclinas em resposta às lesões no sistema visual, especificamente na retina. Estas análises foram realizadas após a indução de trauma mecânico, modelo experimental que permite a visualização do foco, penumbra e áreas adjacentes à lesão. Utilizando técnicas combinadas, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real-Time), Western Blot e imuno-histoquímica, avaliamos a expressão espaço-temporal destes genes e as proteínas por eles codificadas, em diferentes tempos pós-lesão. Os resultados da PCR Real-Time revelaram uma ausência de modulação da expressão gênica de Cx36 para os diferentes tempos pós-lesão analisados. A Cx43 mostrou aumento dos transcritos, após três e sete dias pós-lesão. A ciclina D1 e B1 apresentaram modulação significativa após um, três e sete dias pós-lesão. As análises de imuno-histoquímica revelaram uma redistribuição da Cx36 em resposta à lesão em diferentes tempos pós-lesão. A Cx43, por sua vez, apresentou um aumento aparente de sua expressão no foco e zona de penumbra da lesão, nos período de um, três e sete dias pós-lesão. Em retinas, após um e três dias de lesão, a ciclina D1 encontrou-se presente em células próximas ao foco da lesão. Observamos a presença de ciclina B1 no foco da lesão após um dia de lesão. Por meio de análises de Western Blot não foi possível detectar alterações das diferentes proteínas estudadas nas retinas, em períodos variados de exposição à lesão. Os dados deste estudo sugerem que i) possivelmente, as células afetadas pela lesão se encontram acopladas; ii) expressam proteínas reguladoras do ciclo celular. Levando em consideração o conjunto de resultados, sugerimos que é possível induzir ou prevenir a reentrada do ciclo celular em células pós-mitóticas da retina, controlando o acoplamento mediado pelas proteínas formadoras das JC. / Communication in the nervous system can occur directly between the cells through structures known as gap junction (GJ) channels. These channels allow the passage of small molecules up to 1 kDa and are composed of protein subunits named connexins (Cxs). Cell communication through GJ plays an important role during the development and visual signaling. Furthermore, cell coupling provided by the GJs has been related to processes of survival/cell death. Similarly, in addition to the classic role of cyclins and cyclins dependent kinases (CDKs) in the cell cycle regulation and differentiation, they are also involved in neurodegenerative processes. Recent studies have demonstrated the reentry of apoptotic post mitotic neurons in the cell cycle. In this context, we analyzed the gene and protein expression of Cxs and cyclins after lesions in the visual system, specifically in the retina. For this purpose, a mechanic trauma was induced in the retina, which represents a model that allows us to visualize the lesion focus, penumbra and adjacent areas. Using combined techniques, such as the real time polymerase chain reaction (real-time PCR), Western blot and immunohistochemistry, we evaluated the spatio-temporal expression of these genes and their encoded proteins at different times post-lesion. The real-time PCR revealed no modulation of the Cx36 gene expression for all the times post-lesion analyzed. Our results showed increase in the Cx43 transcripts one, three and seven days post-lesion. The immunohistochemistry analysis indicated redistribution of Cx36 in response to the lesion in different times. On the other hand, Cx43 presented evident increased expression in the focus and penumbra areas of the lesion one, three and seven days post-lesion. In our experiments we could observe that cyclin D1 is expressed in cells located close to the lesion focus one and three days post-lesion, while cyclin B1 is expressed in these cells only one day post-lesion. The Western blot analysis did not show changes on the protein levels evaluated in this study in any of the post-lesion times analyzed. Data obtained from this study suggest i) the cells affected by the lesion are possibly coupled by GJ; ii) these cells express protein regulators of cell cycle. Altogether, the results indicate that it is possible to induce or prevent the reentry of post mitotic cells of the retina in the cell cycle, by controlling cell coupling provided by GJ.

As conexinas são proteínas essenciais e estão diretamente relacionadas à propagação do impulso elétrico no coração, à velocidade de condução bem como à gênese de muitas afecções cardíacas. Em face da circulação extracorpórea (CEC) ainda ser utilizada de forma inconsistente na medicina veterinária e devido aos poucos estudos observados na literatura sobre os efeitos provocados pelo emprego da CEC na expressão da conexina 43 (Cx43) no miocárdio, objetivou-se avaliá-la em 15 animais da espécie canina, distribuidos em três grupos (C, CEC-1 e CEC -2) sendo, respectivamente, antes de realizada a CEC, com 60 minutos após esta e 60 minutos de CEC seguida de 30 minutos de restauração da perfusão espontânea. Avaliou-se a Cx43 pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e RT-PCR em tempo real no tecido muscular cardíaco de regiões correspondentes aos átrios direito (AD) e esquerdo (AE), ventrículos direito (VD) e esquerdo (VE) e septo transverso. Os resultados indicaram a presença da Cx43 em todas as regiões do miocárdio nos grupos C, CEC-1 e CEC-2. A expressão da Cx43 variou significativamente em CEC-2 no AE e VD em relação ao grupo C (p<0,05). A expressão gênica de Gja1 (gene da Cx43) não apresentou diferença significativa entre os grupos estudados. Em CEC-2 identificou-se a presença de vacuolização na túnica média de artérias de pequeno calibre do miocárdio. Concluiu-se também que a canulação da aorta bem como a instalação do circuito de CEC no modo aorto-bicaval constitui técnica exequível / Connexins are essential proteins that are directly associated with electrical impulse propagation and speed of propagation in the heart. They also play a major role in numerous heart conditions. The use of cardiopulmonary bypass (CPB) in veterinary medicine is inconsistent and few studies describe the effect of cardiopulmonary bypass on the expression of connexin 43 (Cx43) in the myocardium. The objective of this study was to evaluate myocardial expression of Cx43. Connexin 43 of 15 dogs was assessed at 3 moments: prior to CPB (Group C); 60 minutes after CPB (Group CPB1); and 60 minutes after CPB followed by 30 minutes of spontaneous perfusion (Group CPB2). Assessment of Cx43 included immunofluorescence, western blot and RT-PCR real time of heart tissue samples from the right atrium (RA), left atrium (LA), right ventricle (LV), right ventricle (RV) and transverse septum. Our results showed the presence of Cx43 in all 5 areas of the myocardium in groups C, CPB1 and CPB2. A significant variation on the expression of Cx43 was observed when CPB2 LA and CPB2 RV were compared to group C (p<0,05). Expression of Gja1 (gene for Cx43) did not vary significantly among the study groups. Group CBP2 presented vacuolation of the tunica media of small myocardial arteries. We conclude that cannulation of the aorta and aorto-bicaval setup of the CPB circuit is feasible technique

Orientador: Edi Lucia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T12:01:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva-Costa_SueliMatildeda_D.pdf: 3629847 bytes, checksum: 5dcc278ff8f0cd9eda6627d011e23a06 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A deficiência auditiva é dos defeitos sensoriais o mais comum, afetando cerca de um em cada quinhentos recém-nascidos. Mais de 60% dos casos de perda auditiva congênita são causadas por fatores genéticos. Apesar da grande heterogeneidade da perda auditiva genética, mais de 50% estão associadas a mutações no locus DFNB1 no cromossomo 13q12. Este locus contém os genes GJB2 e GJB6 que codificam as proteínas conexina 26 e 30 respectivamente. A alta prevalência de indivíduos com perda auditiva apresentando mutações recessivas no locus DFNB1 em apenas um alelo tem dificultado o diagnóstico molecular e consequentemente o aconselhamento genético. Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi elucidar a causa genética da perda auditiva em quarenta e oito indivíduos monoalélicos para mutações recessivas no gene GJB2 (46) ou no gene GJB6 (2). Prováveis novas deleções no locus DFNB1 foram encontradas em quatro indivíduos heterozigotos para mutações no gene GJB2. Além disso, entre os quarenta e oito indivíduos estudados foram detectadas duas mutações no gene SLC26A4 (p.V609G, p.C282Y) em três deles e ainda, duas mutações no gene CDH23, p.R1746Q e p.R301Q, em dois indivíduos. As mutações, p.V609G, p.C282Y e p.R1746Q, foram encontradas em heterozigose e, portanto, não é possível afirmar que, de fato, essas alterações sejam a causa da surdez. Contudo, a mutação p.R301Q, encontrada em homozigose em um dos pacientes estudados, trata-se de uma mutação missense e poderia explicar o fenótipo. Entre os quarenta e oito indivíduos estudados foram ainda detectadas oito alterações mitocondriais em dezoito casos. Quatro delas podem estar envolvidas com a perda auditiva justificando assim a surdez. Quanto a análise do cluster miR-183, nenhuma mutação patogênica foi encontrada em nenhum dos quinhentos e vinte e um indivíduos analisados, o que corrobora com dados da literatura onde mutações nos microRNAs, miR-96-183-182 não são uma causa comum de surdez. Concluiu-se que, a pesquisa de mutações em outros genes diminui o número de casos com diagnóstico inconclusivo. Entretanto, devido à grande heterogeneidade genética e clínica da perda auditiva muitos permanecem ainda com diagnóstico indefinido / Abstract: Hearing impairment is the most common sensory impairment, affecting approximately one in five hundred newborns. More than 60% of the congenital hearing loss cases are caused by genetics factors. Despite the enormous heterogeneity of genetic hearing loss, up to 50% of the cases are associated with mutations in the DFNB1 locus on chromosome 13q12. This locus contains the GJB2 and GJB6 genes, which code for the gap junction (GJ) proteins connexin 26 (Cx26) and connexin 30 (Cx30) respectively. A large number of affected individuals carry only a single identified recessive mutation in locus DFNB1, making the molecular diagnostic and genetic counseling difficult. The aim of this study was to elucidate the genetic cause of hearing loss in forty eight individuals monoallelic for recessive mutations in the GJB2 gene (46) or in GJB6 gene (2). Probable new DFNB1 locus deletions were found in four individuals heterozygous for mutations in GJB2 however. Moreover, among the forty eight heterozygous individuals studied, two mutations were detected in the SLC26A4 gene (p.V609G, p.C282Y) in three of them and two mutations in CDH23 gene (p.R1746Q p.R301Q) were identified in two individuals. Mutations, p.V609G, and p.C282Y p.R1746Q were found in heterozygous and therefore could not be considered the cause of deafness in the patients studied. However, the mutation p.R301Q was present as homozygous in one individual. This alteration is a missense mutation, and may explain the deafness in this patient. Among the forty eight subjects studied, we detected eight mitochondrial alterations in eighteen cases. Four of them may be involved with hearing loss, thus justifying deafness. As the analysis of the miR-183 cluster, no pathogenic mutation was found in any of the five hundred twenty-one individuals analyzed, which agrees with literature data where mutations in microRNAs, miR-96-183-182 are not a common cause of deafness. We conclude that the detection of mutations in other genes reduces the number of cases with inconclusive diagnostic. However, due to high clinical and genetic heterogeneity of hearing loss with many still remains undefined diagnosis / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

As conexinas (Cx) compõem as junções comunicantes do tipo gap, entre elas a Cx43 é a mais prevalente. A diminuição de sua expressão está relacionada com diversas alterações fisiológicas. Sua importância in vivo foi relatada em camundongos com deleção de um dos alelos de Cx43 (Cx43+/-), pois os animais Cx43-/- não são viáveis. Devido esta inviabilidade técnica, os estudos com essa proteína foram realizados com animais Cx43+/-. Assim, este trabalho propõe a criação de um modelo transgênico para o estudo da Cx43. Para isso, o gene Cx43 foi reintroduzido ao genoma murino, porém regulado pelo sistema induzido por doxiciclina TetOn. Vetores de expressão gênica foram construídos e validados quanto sua funcionalidade in vitro e posterior transferencia para zigotos murinos por meio de microinjeção pronuclear. Obtivemos sucesso na construção do sistema de expressão. A funcionalidade dos vetores foi confirmada in vitro utilizando células HeLa e E10. Nos experimentos in vivo, apesar das taxas adequadas de nascimento nenhum deles apresentou genótipo positivo para o transgene. / The connexins (Cx) comprise gap junctions type, and the Cx43 is the most prevalent. The decrease of its expression is related to various physiological changes. Its importance in vivo has been reported in mice with deletion of one allele of Cx43 (Cx43+/-), because the animals Cx43-/- are not viable. So all studies with this protein were performed with animals Cx43+/-. Thus, this paper proposes the creation of new a transgenic model for the study of Cx43 protein. For this, the Cx43 gene was reintegrated to the murine genome, but drived by doxycycline Teton inducible system. Gene expression vectors were constructed and validated in vitro and subsequent transfer to mouse zygotes by pronuclear microinjection. We got success in vector construction and functionality. The functionality of the vectors was confirmed in vitro using HeLa cells and E10. In experiments in vivo, despite adequate rates of birth, no one animal showed positive genotype for the transgene.