Orientador: Sony Dimas Bicudo / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi avaliar os corpos lúteos (CL) formados em decorrência da aspiração folicular guiada por laparoscopia (LOPU) na espécie ovina, quanto ao desenvolvimento morfológico, funcionalidade e potencial de desenvolvimento gestacional. Foram realizados dois experimentos, em ambos o estro das ovelhas foi sincronizado utilizando dispositivo intravaginal de acetato de medroxiprogesterona por 14 dias, aplicação de 140 μg cloprostenol no quarto dia e retirada do dispositivo no décimo quarto dia com concomitante administração de gonadotrofina coriônica equina (eCG). No Experimento I, 48 horas após a remoção do dispositivo realizou-se a LOPU dos folículos ovarinos em seis ovelhas (Grupo LOPU – LG), ou a LOPU associada com reposição de células em sete animais (Grupo reposição – RG) em cinco animais a ovulação foi espontânea (Grupo controle – CG). Foi realizada avaliação ultrassonográfica ovariana dos animais diariamente até o momento de uma nova ovulação e coleta de sangue para dosagem de progesterona (P4) plasmática a cada 48 horas até o decimo quinto dia. Os animais do LG (1,7±0,5) e RG (1,4±0,5) formaram mais CLs do que os animais do CG (1,0±0,0). A área lútea individual dos CLs foi menor no LG (0,69±0,30 cm2), em comparação ao RG (0,79±0,25 cm2) e CG (0,85±0,32 cm2). A área lútea total foi semelhante entre o LG (1,2±0,4 cm2) e RG (1,1±0,5 cm2), sendo ambas maiores que a do CG (0,9±0,3 cm2). A concentração de P4 plasmática não diferiu entre os grupos, fican... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of the present study was to evaluate the corpus luteum (CL) formed as a result of laparoscopic ovum pick-up (LOPU) in the ovine, regarding the morphological development, functionality and potential of gestational development. Two experiments were carried out, in both of them, the oestrous of the ewes was synchronized using a 14-day intravaginal device of medroxyprogesterone acetate, 140 μg cloprostenol on the fourth day and withdrawal of the device on the fourteenth day with concomitant administration of equine chorionic gonadotrophin (eCG). In Experiment I, 48 hours after the removal of the device, was realized a LOPU of the ovarian follicles in six sheep (LOPU Group - LG), or LOPU associated with cell replacement in seven animals (Replacement Group - RG) was performed in five animals a ovulation was spontaneous (Control Group - CG). Ultrasonographic evaluation of the animals was performed daily until the time of ovulation and blood collection for progesterone plasma concentration (P4) every 48 hours until the 15th day. LG animals (1.7 ± 0.5) and RG (1.4 ± 0.5) formed more CLs than CG animals (1.0 ± 0.0). The individual luteal area of CLs was lower in LG (0.69 ± 0.30 cm2), compared to RG (0.79 ± 0.25 cm2) and CG (0.85 ± 0.32 cm2). The total luteal area was similar between LG (1.2 ± 0.4 cm2) and RG (1.1 ± 0.5 cm2), both larger than CG (0.9 ± 0.3 cm2). Plasma P4 concentration did not differ between groups, being above 2 ng / mL in the static phase of CLs development. I... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O presente estudo visou avaliar o efeito das características morfológicas e da dinâmica vascular do folículo e corpo lúteo sobre a fertilidade de vacas de corte submetidas à protocolo de sincronização de estro e ovulação. Para isso o estudo foi dividido em três experimentos sendo: No primeiro experimento foi avaliado, no momento da transferência de embriões (TE), a vascularização do corpo lúteo e sua relação com as taxas de prenhez em vacas multíparas Nelore utilizadas como receptoras de embriões. No segundo experimento analisou-se a área e vascularização do folículo no momento da inseminação artificial em vacas, novilhas e primíparas Nelore e vacas Tabapuã multíparas submetidas a protocolo de sincronização de estro e ovulação. No dia 11 após as inseminações foram avaliados a área, diâmetro e vascularização do corpo lúteo e no dia 30 realizou-se o diagnóstico gestacional dos animais. No terceiro experimento foram utilizadas vacas multíparas Nelore e cruzadas submetidas ao mesmo protocolo de sincronização de estro e ovulação do experimento 2. Neste experimento foi analisada a área dos folículos no momento da inseminação artificial e aplicados 400 UI de eCG 14 dias após, quando então avaliou-se o tamanho do corpo lúteo e dos folículos existentes. No dia 30 após a IA foi realizado o diagnóstico gestacional e análise da vascularização do corpo lúteo permitindo avaliar a relação da aplicação do eCG com o aumento da vascularização e taxas de prenhez. No presente estudo foi encontrada uma provável correlação positiva em relação à vascularização e tamanho do folículo pré-ovulatório com o tamanho e vascularização do corpo lúteo, porém apenas nos experimentos 1 e 3 houve um aumento nas taxas de prenhez conforme o aumento na vascularização. / The present study evaluated the effect of the morphological characteristics and the vascular dynamics of the follicle and corpus luteum in the fertility of beef cows submitted to a protocol of estrus synchronization and ovulation. Three experiments were done. In the first experiment, the corpus luteum vascular perfusion and its relationship with the pregnancy rates of Nelore recipient cows after embryo transfer (ET) were evaluated. In the second experiment, the area and vascular perfusion of the follicle at the time of artificial insemination (AI), the area, diameter and vascular perfusion of the corpus luteum on Day 11 after ovulation of Nelore cows submitted to a protocol of estrus synchronization and ovulation were evaluated. In the third experiment, Nelore cows were submitted to the same protocol of estrus synchronization and ovulation used in experiment 2 and the area of the follicle was measured at the time of the AI. After 14 days of the AI, 400 UI de eCG was given to the cows and the size of the corpus Luteum and the largest follicle were evaluated. On Day 30 after AI the size and vascular perfusion of the corpus luteum was evaluated. The pregnancy diagnosis was done on Day 30 after ovulation for all the three experiments. In the present study, it was found a positive correlation between the vascular perfusion and the size of the pre-ovulatory follicle, and the size and vascular perfusion of the corpus luteum. However, only in the experiments 1 and 3 the pregnancy rates increased with the increase in the corpus luteum vascular perfusion.

Biotécnicas aplicadas à reprodução animal são empregadas com o intuito de melhorar qualitativa e quantitativamente os rebanhos. A superovulação assim como a estimulação do folículo dominante utilizando-se doses suprafisiológicas de eCG (gonadotrofina coriônica eqüina) são empregadas em bovinos e bubalinos, mas nem sempre alcançam os resultados esperados. Entretanto, foram relatadas alterações morfofuncionais em corpos lúteos (CL) de animais submetidos a estes tratamentos, o que implica, necessariamente, em levantamento de hipóteses relativas ao(s) mecanismo(s) pelo(s) qual(is) as gonadotrofinas exógenas alteram as funções celulares nos folículos e corpos lúteos resultantes. Com o intuito de melhor compreensão do papel exercido pelo eCG sobre a célula luteínica bovina, 16 vacas foram sincronizadas e submetidas (grupos tratados) ou não (grupo controle) ao tratamento com eCG. O tratamento foi realizado previamente (superovulação) ou posteriormente (estimulação do folículo dominante) ao desvio folicular. No dia 6 após a ovulação, estes animais foram abatidos e os CL coletados para realização de análises histológicas e ultra-estruturais, assim como o sangue coletado para dosagem de progesterona. Para comparação dos dados obtidos entre os diferentes grupos utilizou-se o programa GraphPrism e as médias foram consideradas diferentes quando p < 0.05. Em relação à densidade de mitocôndrias e densidade numérica das mitocôndrias elipsóides não houve diferença significativa entre os grupos estudados. Quando se calculou o volume total das mitocôndrias no CL bovino, houve diferença significativa do grupo superovulado em relação aos outros grupos. Já para as mitocôndrias esferóides observou-se diferença significativa do grupo estimulado comparado aos grupos controle e superovulado. À imunofluorescência os animais do grupo superovulado apresentaram visualmente uma marcação mais fluorescente intensa para mitocôndrias quando comparados aos grupos controle e estimulado; e o grupo estimulado apresentou uma marcação mais intensa em relação ao grupo controle. Houve diferença significativa entre os três grupos em relação à quantidade das células luteínicas grandes. Quando se corrigiu o número de células luteínicas grandes pelo volume do CL, os mesmos resultados foram encontrados. Quanto às medidas do maior diâmetro das células luteínicas grandes houve uma diferença significativa quando comparado o grupo estimulado com os demais. Aspectos qualitativos da microvascularização do CL em animais controle e superovulados revelam vascularização mais abundante no grupo tratado. Estes dados apontam para modificações morfológicas da célula luteínica e do CL bovino direcionadas à maior produção hormonal após tratamento com eCG e indicam que doses diferentes aplicadas em momentos diferentes do ciclo estral levam à respostas diversas da célula luteínica e do próprio CL. / Biotechnologies applied to animal reproduction are employed in order to improve livestock quality and quantity. Superovulation and the stimulation of the dominant follicle using supraphysiological doses of eCG (equine chorionic gonadotropin) are used in cattle and buffaloes, but not always achieve the expected results. However, morphofunctional changes in corpora lutea (CL) derived from animals submitted to these treatments were reported, which necessarily implies a survey of hypotheses regarding the mechanism(s) by which exogenous gonadotrophins result in altered cellular functions in the follicles and corpora lutea. In order to better understand the role played by eCG on bovine luteal cells, 16 cows were synchronized and submitted (treated groups) or not (control group) to treatment with eCG. The treatment was performed previously (superovulation) or after (stimulation of the dominant follicle) follicular deviation. At 6 days after ovulation, animals were slaughtered and the CL collected for histological and ultrastructural analysis, as well as blood for determining plasmaprogesterone.For statistical analysis the program Graph Prism was used and mean considered significant different when p < 0.05. In relation to mitochondria number and volume density there were no differences among the studied groups. Values of mitochondria total volume in CL were different if stimulated was compared to the other groups. Imunofluoresce for mitochondria showed a more intensive signal for animals from the superovulated group, followed by animals belonging to the stimulated group. The number of large luteal cells was different among all groups. Even though this number was corrected by CL volume, the same results were found. The biggest diameter of large luteal cells was compared among the groups and stimulated group showed higher values. Qualitative aspects of CL microvascularization in control and superovulated animals reveal more abundant vascularization in treated group. These data point towards morphological modification of bovine CL and luteal cell directed to increased hormonal production after eCG treatment. Moreover, results indicate that different eCG dosis applied in different time points of estrous cycle lead to different responses from CL and luteal cells.

O diestro é a fase luteínica na cadela caracterizada pelo aumento de progesterona (P4) sérica na primeira metade e por flutuações de 17&#946;-estradiol (E2) na segunda metade. O corpo lúteo (CL) é uma glândula endócrina temporária, que passa por um processo de desenvolvimento, manutenção e regressão, atingindo atividade secretória plena quando sua formação está completa. A insulina é o hormônio anabólico essencial para a manutenção da homeostase de glicose e do crescimento e diferenciação celular, sendo secretado pelas células &#946; pancreáticas. A sinalização intracelular da insulina começa com a sua ligação a um receptor de membrana específico, o que desencadeia uma série de ações metabólicas. Sabe-se que uma das consequências desta ligação é a translocação de transportadores de glicose 4 (GLUT4; gene SLC2A4) para que ocorra a captação de glicose. Nosso grupo demonstrou a expressão de GLUT4 no corpo lúteo de cadelas, expressão esta regulada diferencialmente ao longo do diestro. A presença deste transportador levou-nos a hipotetizar que a insulina seja importante para regulação da função luteínica. Para testar tal hipótese, utilizamos imuno-histoquímica para localizar o receptor de insulina (RI) e outros fatores regulatórios (NFKB e IL6) de GLUT4 no CL canino durante o diestro (dias 10 a >70 pós-ovulação, po) e western blotting para quantificar estas proteínas; investigamos a expressão gênica dos fatores acima mencionados por PCR em tempo real; e por fim, analisamos os efeitos da insulina sobre a expressão gênica de RI e SLC2A4 em células luteínicas nos dias 20 e 40 po e também sobre a captação de glicose destas células. No presente estudo, observou-se que o corpo lúteo canino expressa as proteínas do RI, NFKB e IL6 de maneira distinta ao longo do diestro. A expressão do RNAm do RI apresentou maior expressão nos dias 20 e 70, e diminuição no dia 40. O NFKB apresentou maior expressão no dia 40, enquanto o IL6 apresentou maior expressão do dia 10 ao 40. Observou-se correlação negativa entre o gene RI e os níveis de insulina (r = -0,69; P = 0,006) e positiva com SLC2A4 (r = 0,89; P = 0,01) em todo o diestro, enquanto o IL6 correlacionou-se de maneira positiva com o RI apenas na primeira metade (r = 0,96; P <0,0001) e o NFKB, negativamente com o RI nos dias 30, 40 e 50 (r = -0,57 P <0,05). Após a adição de insulina no meio de cultivo, observou-se que as expressões gênicas de RI e SLC2A4 se comportaram de maneira oposta de acordo com a fase do diestro estudada: células do dia 20 po apresentaram um aumento desta expressão e do dia 40 um declínio. Por fim, através da 12 captação de glicose, observou-se que as células luteínicas caninas são capazes de responder à insulina, aumentando a captação na ordem de 4 vezes (basal: 2,05 ± 0,8; insulina: 5,73 ± 0,5; valor de P <0,01 em cpm/ug proteína; basal: 79,6 ± 35,3; insulina: 212,5 ± 34,5, valor de P <0,05 em cpm/106 células). Esses resultados apontam a insulina, bem como o IL6 e o NFKB como fatores importantes que desempenham um papel na função do CL canino e trazem o CL para o grupo de tecidos que respondem ao estímulo insulínico aumentando a expressão de GLUT4 e consequentemente a captação de glicose. Além disso, estes eventos parecem sofrer controle adicional pelos hormônios esteróides. / Diestrus is the luteal phase in dogs characterized by an increase in progesterone (P4) levels in the first half and fluctuations of 17&#946;-estradiol (E2) in the second half. The corpus luteum (CL) is a temporary endocrine gland, which undergoes a process of development, maintenance and regression, reaching full secretory activity when its formation is complete. Insulin is an anabolic hormone essential for the maintenance of glucose homeostasis, cell growth and differentiation, and is secreted by pancreatic beta cells. Intracellular signaling of insulin begins with its binding to a specific membrane receptor, which triggers a series of metabolic actions. It is known that one consequence of this connection is the translocation of glucose transporters 4 (GLUT4; gene SLC2A4) for glucose uptake. Our group demonstrated the expression of GLUT4 in the canine corpus luteum in a time-related manner throughout diestrus. The presence of this transporter led us to hypothesize that insulin is important for the regulation of luteal function. To test this hypothesis, we used immunohistochemistry to detect the insulin receptor (IR) and possible regulatory factors (IL6 and NFKB) of GLUT4 in canine CL during diestrus (days 10 to > 70 after ovulation, po) and western blotting to quantify these proteins. In addition, we investigated the gene expression of the above mentioned factors by real-time PCR and analyzed the effects of insulin on IR and SLC2A4 gene expression in canine luteal cells at days 20 and 40 po and also on glucose uptake by these cells. Canine CL differentialy expressed RI, NFKB and IL6 during diestrus. The IR expression was higher on days 20 and 70, with and decreased at day 40. NFKB expression was higher on day 40 and IL6 increased on days 10 to 40 po. It was observed a negative correlation between IR expression and insulin levels (r = -0.69 P = 0.006) and positive with SLC2A4 (r = 0.89, P = 0.01) throughout diestrus. IR was positively correlated with IL6 only in the first half of diestrus (r = 0.96, P <0.0001), while it was negatively correlated with NFKB on days 30, 40 and 50 (r = -0.57 P <0.05). After insulin treatment, RI and SLC2A4 expressions behave differently according to the diestrus phase: on day 20, they increased and on day 40 they declined. Finally, we could observe through glucose uptake method that canine luteal cells are able to respond to insulin stimuli, increasing glucose uptake by approximately four folds (basal: 2.05 ± 0.8; insulin: 5.73 ± 0.5 cpm / ug protein, P < 0.01; basal: 79.6 ± 35.3; insulin: 212.5 ± 34.5 cpm/106 cells, P < 0.05). These results point towards a regulatory function 14 exerted by insulin, IL6 and NFKB in the canine CL and place this organ among the insulin sensitive ones, which respond to insulin stimuli increasing GLUT4 expression and glucose uptake. Moreover, these events seems to undergo a further control by steroid hormones.

O uso da gonadotrofina coriônica equina (eCG) tem sido considerado uma potencial ferramenta nos protocolos de estimulação e superovulação para melhorarem o desempenho reprodutivo dos rebanhos. Este fato levou a hipótese de que o tratamento com eCG altera as vias de sinalização intracelular no corpo lúteo (CL) formado. Para testá-la, 18 vacas mestiças de Nelore (Bos indicus) foram divididas em três grupos: controle, estimulado e superovulado. O protocolo de sincronização da ovulação com o uso do dispositivo de P4 foi descrito anteriormente (FÁTIMA et al., 2013). O grupo estimulado recebeu 400 UI de eCG no dia da remoção do dispositivo de P4 e o superovulado recebeu 2000 UI de eCG 4 dias antes. Os animais dos grupos controle e estimulado receberam GnRH no dia 10, enquanto os animais superovulados receberam no dia 8. No sétimo dia após após a administração do GnRH, todos os animais foram abatidos e os CL foram coletados. Foi realizada análise de microarranjo, a partir da qual foram eleitos genes envolvidos na sinalização da esteroidogênese (ADM, MMP9, NOS2), da ativação das metaloproteinases da matriz e do receptor ativado de protease que regula a homeostase e inflamação (PRSS2, PLAU) e da angiogênese (ANG e ANGPT1) e validados por qPCR, western blotting e imuno-histoquímica. A expressão gênica e proteica do PRSS2 e MMP9 foi menor e as células luteínicas grandes e pequenas positivas apresentaram marcação menos intensa nos grupos estimulado e superovulado (P <0,05). A expressão proteica da ANG foi maior no estimulado (P=0,01) e superovulado (P=0,03) e da proteína ANGPT1 foi maior no estimulado (P=0,008). O número de células luteínicas grandes e pequenas positivas para ANG e ANGPT1 foram maiores nos grupos tratados (P <0,05). No estimulado, houve correlação negativa entre os níveis de progesterona e o MMP9 (r = -0,66 e P = 0,03) e com a proteína do PRSS2 (r = -0,63 e P = 0,04). No entanto, houve correlação positiva com a proteína ANG (r = 0,69 e P = 0,03). No superovulado, houve correlação positiva entre a ANG e ANGPT1 (r = 0,96 e P = 0,001). Não houve diferença na expressão de ADM, NOS2 e PLAU nos grupos tratados em relação ao controle. Em resumo, os resultados obtidos são indicativos de que a eCG altera a expressão relativa de genes e proteínas envolvidas nas vias de sinalização de inflamação e a modelação da membrana celular com uma diminuição na expressão do MMP9 e da PRSS2 e na via da angiogênese com maior expressão de ANG em ambos os tratamentos e ANGPT1 em vacas estimuladas. / The use of equine chorionic gonadotropin (eCG) have been considered a potential tool in stimulation and superovulation protocols to improve the reproductive performance of the herd. This fact led to the hypothesis that eCG treatment alters the intracellular signaling pathways in the formed CL. To test that, 18 crossbred Nellore (Bos indicus) cows were divided into three groups: control, stimulated and superovulated. The synchronization protocol with the use of P4 device was previously described (FÁTIMA et al., 2013). The stimulated group received 400 IU eCG at the P4 device removal and superovulated received 2000 IU eCG 4 days before it. Both control and stimulated animals received GnRH on day 10, while superovulated ones received it on day 8. On the seventh day after GnRH administration, CL were collected by slaughter. Microarray analysis was preformed, from which were selected genes involved in the signaling of steroidogenesis (ADM, MMP9, NOS2), activation of matrix metalloproteinases and protease activated receptor that regulates homeostasis and inflammation (PRSS2, PLAU), and angiogenesis (ANG and ANGPT1). They were evaluated by qPCR, western blot and immunohistochemistry. The gene and protein expression of MMP9 and PRSS2 decreased and large and small luteal cells showed weaker staining in stimulated and superovulated groups related to the control group (P <0.05). ANG protein expression was higher on superovulated (P=0.01) and stimulated (P=0.03) and ANGPT1 protein was higher only in stimulated (P=0.008). The number of positive large and small luteal cells for ANG and ANGPT1 were higher in treated groups (P<0.05). In stimulated, there were a negative correlation between progesterone levels and MMP9 (r = 0.03 and P = -0.66) and the PRSS2 protein expression (r = 0.04 and P = -0.63). However, there were a positive correlation with ANG protein expression (r = 0.69 and P = 0.03). In superovulated, there were a positive correlation between ANG and ANGPT1 (r = 0.96 and P = 0.001) and PRSS2 protein expression was negatively correlated with the ANG protein (r = 0.04 and P = -0.96). There was no difference in ADM, NOS2 and PLAU expression in treated groups compared to control. In summary, these findings indicate that eCG alters the relative expression of genes and proteins involved in inflammation and cell modeling signaling pathways by decreasing MMP9 and PRSS2 expression, and on angiogenesis pathway, increasing ANG expression in both stimulated and superovulated animals and ANGPT1 in stimulated cows.

O corpo lúteo (CL) canino é responsável pela síntese de E2 durante o diestro. O E2 atua de forma autócrina e/ou parácrina sobre essa glândula. O mecanismo de atuação do E2 depende da razão entre receptor alfa (ER&#945;) e receptor beta (ER&#946;). A ligação ao ER&#945; tem efeito proliferativo e ao ER&#946; antiproliferativo. O objetivo deste trabalho foi entender a sinalização mediada pelo ER&#945; e ER&#946; no processo de formação e regressão do CL. CLs foram obtidos de cadelas não prenhes (n=30) nos dias 10, 20, 30, 40, 50 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação (po). No dia da ovariossalpingohisterectomia foi colhido sangue para mensuração das concentrações de P4 e E2. Dezoito CLs (n=3/grupo) foram submetidos ao sequenciamento de RNA (RNAseq). Os genes diferencialmente expressos (DE) identificados pelo RNAseq foram submetidos ao software oPOSSUM3 para identificação das regiões de ligação mais representadas nos fatores de transcrição relacionados aos genes do ER&#945; (ESR1) e ER&#946; (ESR2). A análise de expressão temporal revelou a presença de 5.116 diferencialmente expressos (DE) em pelo menos uma comparação e 1.106 não foram anotados ainda no genoma canino, destes genes DE 295 apresentavam regiões de ligação de fatores de transcrição em comum com ESR1 e ESR2. Dez genes DE foram selecionados para validação dos resultados de RNAseq através do qPCR; usando o GAPDH como gene de referência. Desses genes, quatro apresentaram regioes em comum com ESR2 (LEF-1; PAPPA; NDGR2 ATP1A1) e um com ESR1 (CAV1) e os demais controlam proliferação celular (CTNNB1; CCND1; IGFBP 3, 4 e 5). A expressão proteíca de PAPPA e IGFBP 3, 4 e 5 (componentes do sistema IGF) foi avaliada também por imunohistoquímica. Durante a primeira metade do diestro, nossos resultados indicam que a sinalização mediada pelo E2 ocorre via interação do ER&#945; com CAV-1 (sinalização não genômica), ativando as vias de sinalização IGF e WNT/&#946;catenina, regulando o processo de proliferação celular. Enquanto na segunda metade, o ER&#946; regularia a expressão gênica de NDGR2 e ATP1A1, contribuindo para a regressão do CL. Assim nos resultados sugerem que o E2 atue tanto como um fator luteotrófico e quanto regulador da regressão do CL canino. / The canine corpus luteum (CL) is responsible for E2 synthesis during diestrus, which acts in an autocrine and / or paracrine manner in this gland. The E2 mechanism of action depends on the ratio between alpha (ER&#945;) and beta (ER&#946;) receptor The binding to ER&#945; has a proliferative effect whereas to ER&#946; an antiproliferative. The objective of this study was to understand the signaling mediated by ER&#945; and ER&#946; in the formation and regression of the CL. CLs were obtained from non-pregnant bitches (n = 30) on days 10, 20, 30, 40, 50 and 60 (n = 5 / group) post-ovulation (po). On the day of ovariohysterectomy blood was collected for measurement of P4 and E2 concentrations. Eighteen CLs (n = 3 / group) were subjected to RNA sequencing (RNA-Seq). Genes differentially expressed (DE) identified by RNA-Seq were submitted to oPOSSUM3 software for detection of over-represented transcription factors binding sites (TFBS) related to the ER&#945; (ESR1) and ER&#946; (ESR2) genes. The temporal expression analysis revealed the presence of 5116 differentially expressed (DE) genes in at least one comparison, and 1106 genes, which have not been recorded to the canine genome yet From these, 295 genes showed TFBS in common with ESR1 and ESR2. Ten DE genes were selected to validate the results of RNA-Seq by qPCR; using GAPDH as reference gene. Of these genes, four had TFBS in common with ESR2 (LEF-1; PAPPA; NDGR2; ATP1A1) and one with ESR1 (CAV1) and others genes were chosen because they control cell proliferation (CTNNB1; CCND1, IGFBP 3, 4 and 5). Protein expression of the IGF related genes (PAPPA and IGFBP 3, 4 and 5) was also evaluated by immunohistochemistry. During the first half of diestrus, it appears that E2 mediated signaling occurs via interaction of ER&#945; with CAV-1 (non-genomic signaling), activating signaling pathways of IGF and WNT / &#946;catenin, then regulating the cell proliferation process. Whereas in the second half, ER&#946; appears to regulate NDGR2 and ATP1A1 gene expression, contributing to the regression of the CL. Thus our results suggest that E2 may act as a luteotrophic and also a luteolytic factor in the canine CL.

Vacas leiteira de alta produção têm apresentado declínio da eficiência reprodutiva. Essa redução é devido a causas multifatoriais, entre elas a baixa concentração de estradiol (E2) no proestro e a baixa concentração de progesterona (P4) no ciclo estral subsequentente. O objetivo deste trabalho foi comparar o uso de gonadotrofina exógena na dinâmica folicular e na taxa de prenhez de vacas submetidas ao protocolo Ovsynch (Experimento 1) ou a protocolos utilizando P4 e E2 (Experimento 2). No Experimento 1, animais de primeiro serviço foram pré-sincronizados com dois protocolos (Presynch ou Double-Ovsynch). Já os animais de segundo ou mais serviços foram resincronizados com o protocolo Resynch. Os animais receberam GnRH (1&ordm; GnRH), seguido 7 dias depois pela adiministração de prostaglandina F2&alpha; (PGF2&alpha;). Nesse momento os animais foram divididos homogeneamente por paridade e número de inseminação em um de dois tratamentos: sem FSH (Ovsynch, n = 561) ou com FSH (Ovsynch + FSH, n = 571). O segundo GnRH (2&ordm; GnRH) foi administrado 56 horas após a PGF2&alpha; e a inseminação em tempo fixo foi realizada 16 horas após. Amostras de sangue foram colhidas no 1&ordm; e no 2&ordm; GnRH, na PGF2&alpha; e 6 e 13 dias após o 2&ordm; GnRH para dosagem de P4. Ainda, no 2&ordm; GnRH dosou-se também E2 No Experimento 2, os animais foram sincronizados no dia 0 com um dispositivo de P4 associado a 2 mg de benzoato de estradiol. Oito dias após o dispositivo foi removido e os animais receberam uma dose de PGF2&alpha;. Neste mesmo momento, as vacas foram divididas homogeneamente por paridade, número de serviços prévios, escore de condição corporal e presença de CL no inicio do protocolo em três tratamentos: Controle (sem tratamento adicional; n = 232); eCG (400 UI de eCG; n = 232) e FSH (20 mg de FSH; n = 230). Todos os animais receberam GnRH e foram insemados 56h após a retirada do dispositivo. Foram colhidas amostras de sangue a cada 48h do dia 11 ao dia 22. No Experimento 1, não houve efeito do FSH na concetração sérica de E2 no 2&ordm; GnRH (P = 0,88), no tamanho do maior folículo no 2 &ordm; GnRH (P = 0,63), na taxa de ovulação ao 2&ordm; GnRH (P = 0,69) ou na concentração sérica de P4 no 6&ordm; (P = 0,15) e 13&ordm; (P = 0,36) dia após o 2&ordm; GnRH. A taxa de prenhez foi semelhante (P&gt; 0,05) entre os animais tratados com Ovsynch (36,2%) e Ovsynch + FSH (39,1%). No Experimento 2, os tratamentos não alteraram o diâmetro do folículo ovulatório (P = 0,15), o intervalo entre a remoção do dispositivo de P4 e a ovulação (P = 0,30) e a taxa de ovulação (P = 0,44). Não houve efeito de tratamento na concentração sérica de P4 (P = 0,15). A taxa de prenhez foi diferente entre os tratamentos aos 30 dias após a IATF (Controle = 28,0a vs FSH = 18,7b vs eCG = 29,7a %; P = 0,01), mas não aos 60 dias (Controle = 21,6 vs FSH = 16,1 vs eCG = 24,1%; P = 0,08) e na perda de gestacional (Controle = 18,8 vs FSH = 14,0 vs eCG = 18,4%; P = 0,39). Assim, o tratamento com FSH não estimulou o crescimento folicular final e a função luteínica de vacas leiteiras de alta produção sincronizadas com os protocolos Ovsynch e P4/E2. / Fertility in high-producing dairy cows has decreased over the years, which has been associated with reduced estradiol (E2) concentrations during proestrus and suboptimal progesterone (P4) concentrations during early stages of gestation. The objectives of the present study were to evaluate the effects of exogenous gonadotropins on follicular dynamics and risk of pregnancy per artificial insemination (P/AI) in cows subjected to the Ovsynch protocol (Experiment 1) or to a P4/E2-based timed AI protocol (experiment 2). In experiment 1, cows were enrolled in the Ovsynch protocol (GnRH, 7 d PGF2&alpha;, 56 h GnRH, 16 h IA) either after presynchronization (Presynch or Double-Ovsynch; first AI postpartum) or 32 d after previous AI. At the PGF2&alpha; injection, cows were blocked by parity and number of AI and, within each block, randomly allocated to eitherreceive 20 mg of FSH at the moment of the PGF2&alpha;(Ovsynch + FSH, n = 571) or to remain as untreated control (Ovsynch, n = 561). Blood was sampled at the 1st and 2nd GnRH and PGF2&alpha; injections, as well as on d 6 and 13 after the 2nd GnRH to access P4 and E2 (at the 2nd GnRH only) concentrations. In experiment 2, cows were received a P4 device and 2 mg of estradiol benzoate. The device was removed 8 d later concurrently with an injection of PGF2&alpha;, followed by an injection of GnRH and AI at 56 h.At the PGF2&alpha; injection, cows were blocked by parity, number of AI, body condition score, and presence of a CL at device insertion.Within each block, cows were randomly allocated to receive either 20 mg of FSH (FSH, n = 230), 400 IU of eCG (eCG, n = 232), or no additional treatment at the moment of the PGF2&alpha; (Control, n = 232). Blood was sampled at every 48 h from 1 to 12 d after AI. In experiment 1, there was no effect of FSH on serum E2 at the 2nd GnRH (P = 0.88), follicle diameter at the 2nd GnRH (P = 0.63), ovulatory response to the 2nd GnRH (P = 0.69), or serum P4 on d 6 (P = 0.15) and 13 (P = 0.36) after the 2nd GnRH. Also, P/AI was similar (P &gt; 0.05) between Ovsynch (36.2%) and Ovsynch + FSH (39.1%). In experiment 2, treatment did not affect ovulatory diameter (P = 0.15), interval from P4 device removal and ovulation (P = 0.30), ovulatory response to the 2nd GnRH (P = 0.44), and serum P4 (P = 0.15). Interestingly, treatment with FSH reduced (P = 0.01) P/AI on d 30 (Control = 28.0a vs. FSH = 18.7b vs. eCG = 29.7a %), but not on d 60after timed AI (Control = 21.6 vs. FSH = 16.1 vs. eCG = 24.1%; P = 0.08).The risk of pregnancy loss was not affected by treatment (Control = 18.8 vs. FSH = 14.0 vs. eCG = 18.4%; P = 0.39). In conclusion, treatment with FSH failed to enhance the final growth of the ovulatory follicle and did not improve luteal function after AI in high-producing dairy cows synchronized with either the Ovsynch or P4/E2-based timed AI protocols.

O 17&beta;-estradiol (E2) desempenha um papel importante na função reprodutora e na fertilidade feminina, porém, sua ação é estendida para a maioria dos tecidos. Sabendo que o E2 tem funções pleiotrópicas em diferentes tecidos e órgãos, e que pode estar envolvido tanto na proliferação como na morte celular, nossa hipótese é que o E2 seja um dos iniciadores de regressão luteínica em cadelas não prenhes. Para testar nossa hipótese, foram usados corpos lúteos (CL) provenientes de 28 cadelas nos dias 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e >70 após a ovulação (n = 4/grupo) para os experimentos ex vivo. Nesta etapa foram analisadas as proteínas pró-apoptóticas (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) por imuno-histoquímica e western blotting, além da expressão dos genes CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1, ESR2m por PCR em tempo real. Na segunda etapa deste trabalho, utilizamos CL de 12 cadelas nos dias 20, 40 e 60 após a ovulação (n=4 por grupo), cujas células foram cultivadas e divididas em seis tratamentos: Controle, E2 (tratado com E2), bloqueador de ER&alpha; (tratado com MPP), bloqueador de ER&beta; (tratado com PHTPP), E2 + bloqueador de ER&alpha; (tratado com E2 + MPP) e E2 + bloqueador de ER&beta; (tratado com E2 + PHTPP). Foram avaliados os mesmos genes do experimento ex vivo, bem como os genes CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 e SLC2A4. De modo geral a expressão dos fatores pró-apoptóticos foi mais alta a partir do dia 40 e atingiu valores máximos nos dias 60 e 70 após a ovulação, assim como a expressão de ERS2. Essa correlação foi observada também nas células do grupo E2 + bloqueador de ER&alpha;, que também apresentaram regulação negativa de HSD3B1. Quando do bloqueio do ER&beta;, as células luteínicas responderam com aumento dos genes relacionados à esteroidogênese e à proliferação celular, principalmente quando oriundas dos dias 20 e 40 p.o. Dessa forma, conclui-se que o bloqueio do ER&alpha; levou ao aumento dos genes pró-apoptóticos, e o bloqueio do ER&beta; possibilitou aumento dos genes luteotróficos. Estes achados confirmam o papel pleiotrópico do estradiol no CL canino e incluem este hormônio, assim como o balanço entre seus receptores, dentre os atores principais da regulação da meia vida do CL canino. / The 17&beta;-estradiol (E2) plays an important role in the reproductive function and female fertility, however, its action is extended to most tissues. Knowing that E2 has pleiotropic roles in different organs and tissues, and that might be involved in both cell death and proliferation, our hypothesis is that E2 is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. To test our hypothesis, corpora lutea (CL) from 28 dogs on days 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 and >70 after ovulation (n = 4/group) were used for ex vivo experiments. Pro-apoptotic proteins expression (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) were analyzed by immunohistochemistry and western blotting, and the gene expression of CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1 and ESR2 were analyzed by real-time PCR. In the second step of this study, CL from 12 bitches on days 20, 40 and 60 (n = 4 per group) were used. Luteal cells were isolated and divided into six treatments: Control, E2 (treated with E2), ER&alpha; Blocker (treated with MPP), ER&beta; Blocker (treated with PHTPP), ER&alpha; + E2 Blocker (treated with E2 + MPP) and E2 + ER&beta; Blocker (treated with E2 + PHTPP). The expression of the same genes from the in vivo experiment was evaluated, as well as that of CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 and SLC2A4. In general, the expression of pro-apoptotic factors was higher from day 40 and reached highest expression on days 60 and 70 after ovulation, coinciding with increasing in expression of ERS2. This correlation was also observed in the cells from the group E2 + ER&alpha; blockade, which also showed HSD3B1down-regulation. When ER&beta; was blocked, cells of days 20 and 40 post ovulation responded increasing the expression of steroidogenesis and proliferation related genes. Thus, we deduce that the ER&alpha; blockade promotes the increase of pro-apoptotic and that o ER&beta; of luteotrophic genes expression. Our findings confirm the pleiotropic role of estradiol in canine CL and include this hormone, as well as the balance between its two receptors, among the factors controlling canine CL lifespan.

Com o intuito de investigar se a hipóxia representa um dos desencadeadores da regressão luteínica em cadelas não prenhes, o presente estudo foi delineado para analisar a expressão do fator transcricional indutível por hipóxia HIF1A e a de seus genes-alvo relacionados à angiogênese, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGFA) e à captação de glicose, como as proteínas transportadoras facilitadoras GLUT1/SLC2A1 e GLUT4/SLC2A4 no corpo lúteo canino ao longo do diestro (dias 10 a 70 após a ovulação). Para tal, utilizou-se imuno-histoquímica e western blotting para localizar e quantificar as proteínas do HIF1A, GLUT1 e GLUT4 e PCR em tempo real para quantificar a expressão do RNAm de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR. Além disso, células luteínicas nas fases inicial (dia 10), média (dia 30) e final (dia 60) foram submetidas ao tratamento com cloreto de cobalto (CoCl2) a 500 &micro;M para avaliar os efeitos da hipóxia sobre a expressão gênica dos fatores acima citados, bem como sobre a produção de progesterona e 17&beta;-estradiol. Nossos resultados demonstraram que o HIF1A é expresso pelo corpo lúteo canino de maneira tempo-dependente ao longo do diestro, e que a expressão de seu RNAm está diretamente correlacionada a expressão gênica de SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 e KDR e com as concentrações de progesterona periférica. No cultivo primário de células luteínicas, a hipóxia induzida pelo CoCl2 diminuiu a produção de progesterona e de 17&beta;-estradiol e estimulou significativamente a expressão de HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 e VEGFA. Esses resultados sugerem que o HIF1A constitui um dos fatores regulatórios da função do corpo lúteo canino participando da modulação de processos como esteroidogêne, angiogênese e da captação de glicose, atuando como fator luteolítico. / This study was designed to investigate if hypoxia is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. For that, we analyzed the hypoxia- inducible factor (HIF1A) expression as well as the expression of its target genes related to angiogenesis (vascular endothelial growth factor VEGFA) and to glucose uptake (glucose transporters GLUT/SLC2A 1 and 4) in canine corpus luteum throughout diestrus (days 10 to 70 after ovulation). We used immunohistochemistry and western blotting to localize and quantify the protein expression of HIF1A, GLUT1 and GLUT4, respectively, and real time PCR to analyze HIF1A, SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression. Moreover, luteal cells from early (day 10), mid (day 30) and late luteal phase (day 60) were submitted to 500 &micro;M cobalt chloride (CoCl2) treatment to verify hypoxia effects on gene expression of the above cited genes and on progesterone and 17&beta;-estradiol production. Our results showed that luteal cells expressed HIF1A in a time-dependent manner over diestrus and that its expression was directly correlated to both SLC2A1, SLC2A4, VEGFA, FLT1 and KDR gene expression and progesterone production. The protein expression of the studied genes also changed over diestrus and was correlated with the respective gene expression. In primary luteal cells culture, cobalt chloride-induced hypoxia downregulated progesterone and 17&beta;-estradiol production, but upregulated HIF1A, SLC2A1, SLC2A4 and VEGFA gene expression. These findings suggest that HIF1A is one of the factors regulating canine luteal function by modulating important process as steroidogenesis, angiogenesis and glucose uptake, acting as a pro-survival factor.

Grande parte das perdas embrionárias ocorrem nas três primeiras semanas após a inseminação e grande parte pode-se atribuir a baixas concentrações de progesterona. Desta maneira, o objetivo do presente experimento foi avaliar os efeitos e a interação entre o escore de condição corporal (ECC) e condição ovariana (EO) em vacas suplementadas com progesterona de longa ação (P4) após IATF sobre a taxa de prenhez em vacas de corte. Neste experimento foram utilizados 1573 vacas de corte, lactantes entre 30 e 60 dias pós-parto. As vacas tiveram a ovulação sincronizada iniciando-se no dia - 10 e foram inseminadas no dia 0. No dia 4, os animais foram blocados de acordo com ECC e EO e ordem de parto e divididos em dois tratamentos: (P4, n = 786) e (Controle, n = 787). Foram feitas avaliações ultrassonograficas dos ovários nos dias -10, 0 e 4, para mensurações de tamanho de folículo e corpo lúteo e no dia -10 foi feita a avaliação do ECC. A taxa de prenhez (P/IA) entre os grupos P4 vs CONTROLE não apresentou diferenças P=0,49. Vacas com ECC &gt; 2,75 tiveram melhora P/IA (P&lt;0,05) comparadas com vacas com ECC &le; 2,5. Vacas com presença de folículo &ge; 8 mm no dia -10 apresentou melhor P/IA (P&lt;0,05) comparadas com vacas com presença de CL ou folículo &lt; 8 mm. Vacas com folículo &ge;8 mm e CL apresentaram maior tamanho de folículo, maior área de CL, no entanto, os animais com presença de folículo &ge; 8 mm apresentaram maior taxa de concepção comparado com os animais com folículo &lt; 8 mm e com presença de CL. Concluimos que a suplementação com P4 após a IATF não melhora as taxas de prenhez, independente do ECC e do EO, no entanto, o ECC e o EO apresentam influências nas taxas de prenhez, onde os animais com melhor ECC no início do protocolo apresentaram melhor EO e maior taxa de prenhez. / Embryo loss commonly occurs in the first three weeks after insemination due to low progesterone (P4) concentrations. Therefore, this study evaluates the effects of body condition score (BCS) and ovarian condition (OC) on pregnancy rates (P/AI) in beef cows supplemented with long-acting P4 after timed artificial insemination (TAI). We used 1573 lactating Nellore cows at 30-60 days postpartum. The animals were pre-synchronized on Day -10 and inseminated on Day 0. On Day 4, they were evaluated for BCS, OC and parturition order and divided into two treatment groups: P4 supplementation (N= 786) and control group (N = 787). Ultrasound exams were performed on Days -10 and 0 to measure follicle diameter and on Day 4 to evaluate corpus luteum (CL) area. BCS was determined on Day -10. P/AI did not vary between P4 supplementation and control treatments (P = 0.49). Cows with BCS &gt; 2.75 had better P/AI than cows with BCS &le; 2.5 (P &lt; 0.05). Cows without CL and with follicle diameter &ge; 8 mm on Day -10 presented better P/AI than cows with follicle &lt; 8 mm or CL (P &lt; 0.05). In conclusion, P4 supplementation after TAI did not improve P/AI. However, BCS and OC affected P/AI and the animals with better BCS at the beginning of the experiment had better OC and P/AI.