La prostaglandine E2 est une hormone lipidique produite abondamment dans le corps, incluant dans le rein où elle agit localement pour réguler les fonctions rénales. Un couplage à la protéine Gαs menant à une production d’AMPc a classiquement été attribué au récepteur EP4 de PGE2. La signalisation d’EP4 s’est cependant avérée plus complexe et implique aussi un couplage aux protéines sensibles à la PTX Gαi et des effets reliés aux β-arrestines. Il y a maintenant plusieurs exemples de l’activation sélective de voies de signalisation indépendantes par des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), et ce concept désigné sélectivité fonctionnelle pourrait être exploité dans le développement de nouveaux médicaments plus spécifiques et efficaces. Dans une première étude, la puissance et l’activité intrinsèque d’une série de ligands d’EP4 pour l’activation de Gαs, Gαi et de la ß-arrestine ont été systématiquement déterminées relativement au ligand endogène PGE2. Dans ce but, trois essais de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ont été adaptés pour évaluer les différentes voies dans des cellules vivantes. Nos résultats montrent une sélectivité fonctionnelle importante parmi les agonistes évalués et ont une implication pour l’utilisation d’analogues de la PGE2 dans un contexte expérimental et possiblement clinique, puisque leur spectre d’activité diffère de l’agoniste naturel. La méthodologie basée sur le BRET utilisée lors de cette première évaluation systématique d’une série d’agonistes d’EP4 devrait être applicable à l’étude d’autres RCPG. Dans une deuxième étude, des peptides reproduisant des régions juxtamembranaires extracellulaires du récepteur EP4 ont été conçus selon le raisonnement que des peptides ciblant des régions éloignées du site de liaison du ligand naturel ont le potentiel de ne moduler qu’une partie des activités du récepteur. L’insuffisance rénale aiguë est une complication médicale grave caractérisée par un déclin brusque et soutenu de la fonction rénale et pour laquelle il n’y a pas de traitement efficace à l’heure actuelle. Nos résultats montrent que le peptidomimétique dérivé d’EP4 optimisé (THG213.29) améliore significativement les fonctions rénales et les changements histologiques dans une insuffisance rénale aiguë induite par cisplatine ou par occlusion des artères rénales dans des rats Sprague-Dawley. Le THG213.29 ne compétitionnait pas la liaison de la PGE2 à EP4, mais modulait la cinétique de dissociation de la PGE2, suggérant une liaison à un site allostérique d’EP4. Le THG213.29 démontrait une sélectivité fonctionnelle, puisqu’il inhibait partiellement la production d’AMPc induite par EP4 mais n’affectait pas l’activation de Gαi ou le recrutement de la ß-arrestine. Nos résultats indiquent que le THG213.29 représente une nouvelle classe d’agent diurétique possédant les propriétés d’un modulateur allostérique non-compétitif des fonctions du récepteur EP4 pour l’amélioration des fonctions rénales suite à une insuffisance rénale aiguë. / Prostaglandin E2 (PGE2) is a lipid hormone mediator widely produced in the body, including in the kidney where it acts locally to regulate renal function. Classically, the PGE2 receptor EP4 has been classified as coupling to the Gαs subunit, leading to intracellular cAMP increases. However EP4 signaling has been revealed to be more complex and also involves coupling to PTX-sensitive Gαi proteins and ß-arrestin mediated effects. There are now many examples of selective activation of independent pathways by G-protein coupled receptor (GPCR) ligands, a concept referred to as functional selectivity that could be exploited for the development of more specific and efficacious drugs. In a first study, the potencies and efficacies of a panel of EP4 ligands were systematically determined for the activation of Gαs, Gαi and ß-arrestin relative to the endogenous ligand PGE2. For this purpose, three bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays were adapted to evaluate the respective pathways in living cells. Our results suggest considerable functional selectivity among the tested, structurally related agonists and have implications for the use of PGE2 analogues in experimental and possibly clinical settings, as their activity spectra on EP4 differ from that of the native agonist. The BRET-based methodology used for this first systematic assessment of a set of EP4 agonists should be applicable for the study of other GPCRs. In a second study, peptides were derived from extracellular juxtamembranous regions of the EP4 receptor following the rationale that peptides that target regions of the receptor remote of the ligand-binding site might modulate a subset of the EP4-mediated activities. Acute renal failure is a serious medical complication characterized by an abrupt and sustained decline in renal function and for which there is currently no effective treatment. Our results show that the optimized EP4-derived peptidomimetic THG213.29 significantly improved renal functions and histological changes in acute renal failure induced by either cisplatin or renal artery occlusion in Sprague-Dawley rats. THG213.29 did not displace PGE2 binding to EP4, but modulated PGE2 binding dissociation kinetics, indicative of an allosteric binding mode. THG213.29 exhibited functional selectivity, as it partially inhibited EP4-mediated cAMP production but did not affect Gαi activation or ß-arrestin recruitment. Our results demonstrate that THG213.29 represents a novel class of diuretic agent with noncompetitive allosteric modulator effects on EP4 receptor function for improving renal function following acute renal failure.

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins. / The vasopressin type 2 receptor (V2R) plays an important role in water homeostasis. Mainly expressed in the collecting ducts of the kidney, V2R activation by the antidiuretic hormone arginine-vasopressin (AVP) leads to water reabsorption, resulting in a decrease urine output. More than 200 mutations in the V2R gene have been link to the aetiology of the congenital form of nephrogenic diabetes insipidus (cNDI), resulting from a receptor loss-of-function. In contrast, three recently identified mutations have been shown to cause a gain-of-function of the V2R leading to the nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis (NSIAD). The work presented herein is focussed on a better understanding of the molecular determinants leading to the loss- or gain -of-function of V2R mutants. More than 50% of missense mutations affecting the V2R were shown to hamper the receptor’s ability to adopt its native conformation and to cause its intracellular retention by the endoplasmic reticulum quality control system. We thus looked at the role of N-glycosylation and calnexin (Cnx) in the maturation process of mutant V2R, and their importance for receptor rescue by pharmacological chaperones (PC). Our results have shown that N-glycosylation is required for Cnx binding to the receptors and that the duration of this interaction is correlated to the severity of the misfolded state of the mutant. The importance of N-glycosylation and to sugar-mediated interactions in the maturation process of a given V2R mutant was found to be an intrinsic property, as it had no significant repercussion on the mild phenotype-associated Y128S mutant, while it completely abolished maturation of the W164S mutant, associated with a severe phenotype. Moreover, we have shown that pharmacological chaperoning can occur at different steps during the maturation process, according to the mutant studied. These mutant-specific differences indicate that the biosynthetic processing of mutant V2R is highly influenced by the nature of the mutation itself and could partially explain the variations in the clinical outcome severity among NDI-causing mutant V2Rs. Although a functionality rescue of W164S and Y128S mutants was obtained upon exposure to PC, it is not the case for all V2R mutants with a maturation defect. The V88M-V2R was found affected both in its maturation and its affinity toward AVP. In this case, and despite a significant increase in maturation and cell surface expression, the PC treatment led to a further loss in the receptor’s affinity for AVP, preventing its activation at physiological AVP concentrations. The R137C and R137L mutants are endowed with a high constitutive activity leading to NSIAD. Stunningly, substitution of this arginine by histidine (R137H) was associated with cNDI. These three mutant V2R were found to share many characteristics, of which a compromised maturation and elevated spontaneous desensitization. The only difference between these mutants relies on their constitutive activity levels. The PC used in our studies is also an inverse agonist, but failed to reduce the constitutive activity of the R137C/L mutants, entailing a ‘locked’ active conformation. Instead, the chaperoning property of the compound led to an increase in the number of constitutively active receptor at the cell surface. We have thus proposed the use of AVP as a treatment, as it was shown to cause receptor’s endocytosis without promoting their activation, leading to a reduced active receptor number at the cell surface. We have identified a new gain-of-function mutation affecting the V2R, the first not involving arginine 137. The F229V substitution was shown to confer high constitutive activity to the receptor, but unlike the two other NSIAD-causing mutants, it does not undergo elevated spontaneous desensitization. The observation that inverse agonists are efficient at inhibiting the constitutive activity of the F229V mutant is an important discovery since the unfruitful attempts obtained with the other constitutively active mutants led some investigators to the erroneous conclusion that inverse agonists were not useful for the treatment of NSIAD. Taken together, these findings underline the ‘individuality’ of V2R mutants and the importance of their functional characterization in order to bring personalized therapeutic strategies for patients with cNDI or NSIAD, and to develop new therapeutics adapted to the patients’ needs.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance. / G protein coupled receptors (GPCRs) are one of the largest families of membrane receptor coded by the human genome and certainly the biggest family of receptors. Localized at the plasma membrane, they are responsible for a wide variety of cellular responses. Activation of GPCRs by ligands has been traditionally associated with change in protein conformation, switching from an inactive to an active state. However, some observations were inconsistent with this theory suggesting the presence of several active conformations of the receptor. These different conformations could be active in some signalling or regulatory pathways and inactive in others. This phenomenon, originally called biased agonism, is now described as the functional selectivity of GPCRs ligands. In theory, this type of selectivity could lead to the development of drugs that therapeutic action without activating signalling pathways responsible for side effect. The delta opioid receptor (DOR) is a GPCR involved in chronic pain management. However, analgesic action of its ligands is subject to tolerance that develops over the course of long-term treatment, limiting their clinical use. This thesis focuses on functional selectivity of DOR ligands to assess the possibility of reducing the effects of tolerance produced by these molecules. First, we determined that DORs adopt ligand-specific active conformations with distinct ability to activate different signalling pathways and regulatory responses. Second, we established that DORs constitutively associate with Gαi heterotrimeric subunits, and that different receptor ligands induce distinct conformational changes within these signalling complexes. These observations are inconsistent with a two-state model of receptor activation, pointing instead the presence of multiple active conformations. Finally, we demonstrated that conformations stabilized by different agonists distinctively interact with βarrestin2, such that the agonist who promoted a transient receptor interaction with this regulatory protein produced more recycling, less desensitization and less acute analgesic tolerance than the ligand who promoted a stable DOR-βarrestin2 interaction. Taken together, the results presented in this thesis show DORs adopt ligand-specific conformations that support ligand-specific profiles of analgesic tolerance. This type of functional selectivity of opioid ligands could be eventually exploited in the development of novel therapeutic agents with longer analgesic actions.

Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs. / Vasopressin V2 receptor is a G protein coupled receptor (GPCR) responsible for the homeostatic regulation of water and sodium recapture from the urine to the bloodstream. Akin to numerous GPCRs, this receptor can interact with more than one heterotrimeric G protein subtype, and is still associated with some poorly explored signaling pathways with indefinite mechanisms. These non-canonical pathways are the focus of this project. This work aims at unveiling the characteristics and mechanisms underlying G12 mediated signaling by V2R and ERK 1/2 activation through the transactivation of the tyrosine kinase Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R). Using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) experiments, we reveal V2R’s ability to interact with the Gα12 subunit, as well as the modulation of G12 heterotrimer’s conformation in response to V2R agonist arginine vasopressin (AVP). AVP-induced modulation of Gα12’s interaction with its classical effector RhoA upon stimulation with AVP suggests the engagement of RhoA, and our data also reveals that Gα12 potentiates AVP-induced cAMP production. Using diverse selective inhibition strategies, our results further define the mechanism of transactivation. Our data support a starter position of AVP-induced Src activation and discard IGF1R known agonists as the potential autocrine/paracrine factor responsible for IGF1R activation. Furthermore, our results suggest that the metalloproteinase MMP 3 is a good candidate for IGF1R transactivation. This project sheds light on lesser known signaling pathways involving V2R, which could reveal important on a physiological and pathophysiological scale, besides bringing a better understanding of the principles of GPCR signaling.

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique. / γ-aminobutyric acid (GABA) is the principal inhibitory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in diverse pathologies such as epilepsy, anxiety, depression and drug addiction. GABAergic modulation of neuronal activity involves two different subsets of receptors: the GABAA receptor chlorine channel and the heterodimer of G protein coupled receptors (GPCR) GABAB. Each of these receptors is responsible for mediating distinct parts of the GABA-induced signaling. Upon stimulation, it is vital for the cell to control the signaling input and prevent overstimulation, using mechanisms such as functional desensitization and down-regulation to achieve this. The processes controlling GABAB receptor activity are atypical for a GPCR and have yet to be fully characterized. The aim of this thesis is to elucidate the mechanisms controlling GABAB activity by discovering novel proteins interactions mediating receptor desensitization, internalization and ubiquitination. In the first study, we identified the N-ethylmaleimide sensitive factor (NSF) as a GABAB interacting protein and characterized its interaction site as the coiled-coil structure on both GABAB sub-units. We also showed that this interaction is sensitive to the ATPase state of NSF and that agonist treatment of GABAB led to dissociation of NSF from the receptor in a protein kinase C (PKC) dependent manner. Interestingly, GABA-induced PKC activation was dependent on the NSF-GABAB interaction, suggesting a feedback mechanism for PKC. Both PKC and NSF were involved in mediating receptor desensitization, suggesting a novel role of NSF in receptor signaling regulation. In the proposed model, NSF interacts with GABAB at the basal state, and upon agonist stimulation, PKC is activated and can phosphorylate the receptor, promoting NSF dissociation and GABAB desensitization. We then studied constitutive GABAB ubiquitination and degradation and its regulation by PKC and the deubiquitinating enzyme USP14 (Ubiquitin-specific protease 14). GABAB shows a high constitutive ubiquitination and internalization level. Activation of PKC promotes both phenomena and accelerates the rate of lysosomal receptor degradation. In contrast, USP14 promotes post-endocytic deubiquitination of the receptor, but also accelerates receptor degradation in a catalytically-independent manner. Our results suggest a mechanism where PKC-induced cell surface ubiquitination promotes GABAB endocytosis and USP14 interaction promotes endosomal sorting toward lysosomal degradation. In the third study, we identified the growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) as a protein interacting with the PEST (proline, glutamate, serine, threonine rich) sequence of GABAB1 through a SH3-domain interaction and forming a ternary complex with the functional GABAB heterodimer. We showed that Grb2 can regulate cell surface density of GABAB by decreasing constitutive endocytosis, suggesting that this interaction can compete for binding of the PEST sequence with proteins such as the GABAA γ2S sub-unit or the COPI complex (1, 2), promoting higher cell surface stability. In proposing novel molecular mechanisms controlling GABAB signaling and cell surface expression through NSF, PKC, USP14 and Grb2, this thesis highlights the complex regulation of GABAB activity by its functional desensitization, ubiquitination, endocytosis and degradation.

In addition to a central circadian clock in the suprachiasmatic nucleus (SCN), zebrafish (Danio rerio) have local clock systems in their peripheral tissues. These peripheral tissues express a complement of clock genes that can be synchronized with the 24 h light/dark cycle and thus may be entrained by light. To date, teleost multiple tissue (tmt) opsin identified from Fugu rubripes and Danio rerio is the only opsin that has been proposed as a candidate to mediate this cellular photoentrainment (Moutsaki et al., 2003). Here we report the discovery of a multigene family of tmt opsins found not only in the teleost fishes, but in vertebrates,including amphibians, birds, reptiles, and some mammals. Phylogenetic analysis demonstrated that this gene family consists of three main classes, tmtI, tmtII and tmtIII, with each duplicating further to give two paralogues in the zebrafish genome. Their predicted amino acid sequences contain most of the characteristic features for the function of a photopigment opsin, as well as seven transmembrane segments indicative of a G protein coupled receptor (GPCR) superfamily. Significantly, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) reveals that the tmt opsin genes in zebrafish are both temporally and spatially regulated. To investigate if these tmt photopigments mediate light-activated currents in cells, each opsin was expressed in vitro and the responses characterised by calcium imaging, whole-cell patch clamp electrophysiology, UV-Vis spectrophotometric analysis, and bioluminescence reporter assay. Collectively, these data suggest that some of the opsin photoproteins signal via Gi-type G protein pathway. Interestingly, the spectral analysis obtained shows that most tmt opsins tested are UV-sensitive when reconstituted in vitro with 11-cis and all-trans retinal, indicating an intrinsic bistable dynamics. Using site directed mutagenesis on one of the tmt opsins, tmt10, the potential spectral tuning sites involved in UV detection were tested. As part of this study, tmt opsin cDNAs were isolated from three populations of Mexican tetra (Astyanax mexicanus): surface, Pachon and Steinhardt. This allowed for a direct comparison between the tmt opsins present in the dark adapted species (cavefish) versus those of the light adapted species (zebrafish). It is hoped that the findings from this project will contribute to our understanding of non-visual light detection in fish and the evolution of their non-image forming photoreception.

L'adaptation à l'environnement est essentielle à la survie cellulaire et des organismes en général. La capacité d'adaptation aux variations en oxygène repose sur des mécanismes de détection de l'hypoxie et une capacité à répondre en amorçant un programme d'angiogenèse. Bien que la contribution du facteur induit par l'hypoxie (HIF) est bien définie dans l'induction d'une telle réponse, d'autres mécanismes sont susceptibles d'être impliqués. Dans cette optique, les études démontrant l'influence du métabolisme énergétique sur le développement vasculaire sont de plus en plus nombreuses. L'un de ces composés, le succinate, a récemment été démontré comme étant le ligand du GPR91, un récepteur couplé aux protéines G. Parmi les différents rôles attribués à ce récepteur, notre laboratoire s'intéressa aux rôles du GPR91 dans la revascularisation observée suite à des situations d'hypoxie dont ceux affectant la rétine. Il existe cependant d'autres conditions pour lesquelles une revascularisation serait bénéfique notamment suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral. Nos travaux ont pour objectifs de mieux comprendre le rôle et le fonctionnement de ce récepteur durant le développement et dans le cadre de pathologies affectant la formation de vaisseaux sanguins. Dans un premier temps, nous avons déterminé le rôle du GPR91 dans la guérison suite à un stress hypoxique-ischémique cérébral chez le nouveau-né. Nous montrons que ce récepteur est exprimé dans le cerveau et en utilisant des souris n'exprimant pas le GPR91, nous démontrons que dans un modèle d'hypoxie-ischémie cérébrale néonatal l'angiogenèse prenant place au cours de la phase de guérison dépend largement du récepteur. L'injection intracérébrale de succinate induit également l'expression de nombreux facteurs proangiogéniques et les résultats suggèrent que le GPR91 contrôle la production de ces facteurs. De plus, l'injection de ce métabolite avant le modèle d'hypoxie-ischémie réduit substantiellement la taille de l'infarctus. In vitro, des essaies de transcription génique démontrent qu'à la fois les neurones et les astrocytes répondent au succinate en induisant l'expression de facteurs bénéfiques à la revascularisation. En considérant le rôle physiologique important du GPR91, une seconde étude a été entreprise afin de comprendre les déterminants moléculaires régissant son activité. Bien que la localisation subcellulaire des RCPG ait traditionnellement été considérée comme étant la membrane plasmique, un nombre de publications indique la présence de ces récepteurs à l'intérieur de la cellule. En effet, tel qu'observé par microscopie confocale, le récepteur colocalise avec plusieurs marqueurs du réticulum endoplasmique, que celui-ci soit exprimé de façon endogène ou transfecté transitoirement. De plus, l’activation des gènes par stimulation avec le succinate est fortement affectée en présence d'inhibiteur du transport d'acides organiques. Nous montrons que le profil de facteurs angiogéniques est influencé selon la localisation ce qui affecte directement l'organisation du réseau tubulaire ex vivo. Finalement, nous avons identifié une région conservée du GPR91 qui agit de signal de rétention. De plus, nous avons découvert l'effet de l'hypoxie sur la localisation. Ces travaux confirment le rôle de régulateur maître de l'angiogenèse du GPR91 lors d'accumulation de succinate en condition hypoxique et démontrent pour la première fois l'existence, et l'importance, d'un récepteur intracellulaire activé par un intermédiaire du métabolisme. Ces données pavent donc la voie à une nouvelle avenue de traitement ciblant GPR91 dans des pathologies hypoxiques ischémiques cérébrales et soulèvent l'importance de tenir compte de la localisation subcellulaire de la cible dans le processus de découverte du médicament. / The ability to adapt to the changing environment is essential for the survival of cells and organisms in general. The capacity to adjust to variations in oxygen content not only relies on the ability to sense hypoxia but also depends the time required to induce an angiogenic process. Notwithstanding the important contribution of the hypoxia inducible factor (HIF) in this response, other mechanisms are likely to be involved. Studies that have demonstrated the influence of metabolic compounds on vascular development are increasingly abundant. One of those compounds, succinate, has recently been indentified as the ligand of GPR91, a G-protein-coupled receptor. Amongst the roles of this receptor, our group has been interested in determining its contribution in revascularisation observed following hypoxic events in the retina. Other pathological conditions could benefit from the contribution of GPR91 including cerebral hypoxia-ischemia. Our objective is to better understand the role of this receptor during development and in pathological conditions affecting blood vessel formation. We first, determined the role of GPR91 in revascularisation following cerebral hypoxia-ischemia in the newborn. We show the expression of the receptor in the cerebral cortex. Using mice devoid of GPR91, we demonstrate that angiogenesis normally taking place during the recovery phase is largely dependent upon GPR91. Intracerebral injection of succinate induces the expression of several proangiogenic growth factors by activating GPR91. Furthermore, injection of succinate before cerebral H-I model substantially reduces the infarct size. In vitro, gene transcription shows that neurons and astrocytes respond to succinate and produce factors beneficial to revascularisation. Considering the important physiological role of GPR91, a second study was initiated to better determine the molecular determinants controlling the receptor's activity. The plasma membrane has classically been considered the typical GPCR's location of action but several new publications indicate the presence of such receptors within the cell. We observe, by confocal microscopy, the colocalisation of GPR91 (endogenous or transfected) with several marker of the endoplasmic reticulum. In addition, the gene induction observed when stimulated with succinate is severely affected in presence of the compound probenicid, an organic anion transporter inhibitor. We also demonstrate that the profile of genes expressed is largely dependent on the localisation of the receptor and consequently affects the organization of the tubular network ex vivo. Finally, we have identified a conserved region of GPR91 that acts as a retention signal. Lastly, we have uncovered the consequence of hypoxia affecting the post-translational modification of GPR91 and its change in location from the ER to the plasma membrane. This work confirms the role of GPR91 as a master regulator of angiogenesis in situations where succinate accumulates and demonstrated for the first time the existence, and importance, of an intracellular receptor activated by a metabolic intermediate. These results pave the way for future treatment targeting GPR91 in cerebral hypoxic ischemic pathologies and demonstrate the importance of taking into account the subcellular localisation in the drug discovery process.

La caractérisation géochimique et isotopique des eaux souterraines de la « zone minéralisée de l’Entre-Deux-Mers » indique une origine commune de la minéralisation, directement liée à la minéralogie des formations captées par les forages.La géochimie montre que les interactions eau-roche sont majoritairement influencées par la présence d’évaporites, mais que d’autres interactions mettant en jeu des carbonates, des silicates et des argiles existent. Un modèle géochimique d’acquisition de la minéralisation reconstitue parfaitement la chimie des eaux souterraines à l’échelle de la zone d’étude. Ce modèle, construit en se basant sur la géochimie des eaux et sur la minéralogie des formations tertiaires du nord du Bassin aquitain, met à l’équilibre des eaux avec des formations carbonatées et évaporitiques. Afin de mieux comprendre la distribution latérale et verticale des formations tertiaires et leur minéralogie, une approche paléogéographique et sédimentologique a permis de localiser les différents horizons riches en sulfates et/ou en fluorures, mais aussi de comprendre leur origine de dépôt. En se basant sur l’hydrogéologie, la paléogéographie, la minéralogie et la géochimie, des hypothèses de répartition de la minéralisation à l’échelle du forage ont pu être testées. Les résultats de la modélisation couplée hydrodynamique–transport reconstituent la chimie des eaux prélevées par les forages de la « zone minéralisée de l’Entre-Deux-Mers ». Au vu de ces résultats, un modèle avec obturation des horizons riches en sulfates et en fluorures a été testé et les résultats obtenus ouvrent des perspectives pour des futures recherches. Ce travail a donc permis de comprendre l’origine de la minéralisation des eaux de « la zone minéralisée de l’Entre-Deux-Mers », mais aussi de proposer des améliorations et des perspectives pour une meilleure gestion d’une des principales ressources en eau potable de la Gironde. / Geochemical and isotopic characterizations of groundwaters in the "mineralized Entre-Deux-Mers area" indicate a common origin of the mineralization, directly linked to the mineralogy of the formations abstracted by drilling.Geochemistry shows that water-rock interactions are mainly influenced by the presence of evaporites, and that but that other interactions involving carbonates, silicates and clays exist. A geochemical model based on the water geochemistry and mineralogy of the Tertiary formations of northern Aquitaine Basin fix waters in equilibrium with evaporitic and carbonated formations. This model reconstitutes perfectly the groundwaters’ chemistry across the study area and explains the mineralization acquisition. Improving the understanding of the lateral and vertical distribution of tertiary formations and their mineralogy requires a sedimentological and paleogeographical approach. This approach allowed to locate the different layers rich in sulphates and/or fluoride and to understand also their origin.Based on hydrogeology, paleogeography, mineralogy and geochemistry, the distribution of the mineralization has been tested at the borehole scale. The results of this coupled hydrodynamic-transport modeling reconstitute the chemistry of the groundwaters in the "mineralized Entre-Deux-Mers area." A model, that considers the sealing of sulphates- and fluorides-rich layers has been tested and its results highlights future research perspectives. This work has allowed understanding the origin of the mineralization of the waters "of the mineralized Entre-Deux-Mers area" and also suggests improvements and prospects for sustainable management of a major drinking water resource in Gironde.

Cette thèse, motivée par le développement récent des techniques d’obtention de molécules froides, présente une étude théorique assez complète du système collisionnel ionique 3,4He + N2+. La relaxation rotationnelle de l’ion moléculaire a été décrite dans les régimes froid et ultrafroid, pour lesquels l’interaction spin-rotation du radical paramagnétique joue un rôle crucial. L’apparition de nouvelles résonances spécifiques de cette interaction a été analysée. Un autre phénomène directement lié à cette interaction, celui de la réorientation du moment magnétique associé au spin électronique du diatome induite par collision avec l’hélium, a été étudié d’abord en l’absence puis en présence d’un champ magnétique externe. Les mêmes méthodes de dynamique quantique inélastique ont été utilisées pour l’étude de la collision H2 + HF d’intérêt astrochimique. / Abstract