La prostaglandine E2 est une hormone lipidique produite abondamment dans le corps, incluant dans le rein où elle agit localement pour réguler les fonctions rénales. Un couplage à la protéine Gαs menant à une production d’AMPc a classiquement été attribué au récepteur EP4 de PGE2. La signalisation d’EP4 s’est cependant avérée plus complexe et implique aussi un couplage aux protéines sensibles à la PTX Gαi et des effets reliés aux β-arrestines. Il y a maintenant plusieurs exemples de l’activation sélective de voies de signalisation indépendantes par des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), et ce concept désigné sélectivité fonctionnelle pourrait être exploité dans le développement de nouveaux médicaments plus spécifiques et efficaces. Dans une première étude, la puissance et l’activité intrinsèque d’une série de ligands d’EP4 pour l’activation de Gαs, Gαi et de la ß-arrestine ont été systématiquement déterminées relativement au ligand endogène PGE2. Dans ce but, trois essais de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ont été adaptés pour évaluer les différentes voies dans des cellules vivantes. Nos résultats montrent une sélectivité fonctionnelle importante parmi les agonistes évalués et ont une implication pour l’utilisation d’analogues de la PGE2 dans un contexte expérimental et possiblement clinique, puisque leur spectre d’activité diffère de l’agoniste naturel. La méthodologie basée sur le BRET utilisée lors de cette première évaluation systématique d’une série d’agonistes d’EP4 devrait être applicable à l’étude d’autres RCPG. Dans une deuxième étude, des peptides reproduisant des régions juxtamembranaires extracellulaires du récepteur EP4 ont été conçus selon le raisonnement que des peptides ciblant des régions éloignées du site de liaison du ligand naturel ont le potentiel de ne moduler qu’une partie des activités du récepteur. L’insuffisance rénale aiguë est une complication médicale grave caractérisée par un déclin brusque et soutenu de la fonction rénale et pour laquelle il n’y a pas de traitement efficace à l’heure actuelle. Nos résultats montrent que le peptidomimétique dérivé d’EP4 optimisé (THG213.29) améliore significativement les fonctions rénales et les changements histologiques dans une insuffisance rénale aiguë induite par cisplatine ou par occlusion des artères rénales dans des rats Sprague-Dawley. Le THG213.29 ne compétitionnait pas la liaison de la PGE2 à EP4, mais modulait la cinétique de dissociation de la PGE2, suggérant une liaison à un site allostérique d’EP4. Le THG213.29 démontrait une sélectivité fonctionnelle, puisqu’il inhibait partiellement la production d’AMPc induite par EP4 mais n’affectait pas l’activation de Gαi ou le recrutement de la ß-arrestine. Nos résultats indiquent que le THG213.29 représente une nouvelle classe d’agent diurétique possédant les propriétés d’un modulateur allostérique non-compétitif des fonctions du récepteur EP4 pour l’amélioration des fonctions rénales suite à une insuffisance rénale aiguë. / Prostaglandin E2 (PGE2) is a lipid hormone mediator widely produced in the body, including in the kidney where it acts locally to regulate renal function. Classically, the PGE2 receptor EP4 has been classified as coupling to the Gαs subunit, leading to intracellular cAMP increases. However EP4 signaling has been revealed to be more complex and also involves coupling to PTX-sensitive Gαi proteins and ß-arrestin mediated effects. There are now many examples of selective activation of independent pathways by G-protein coupled receptor (GPCR) ligands, a concept referred to as functional selectivity that could be exploited for the development of more specific and efficacious drugs. In a first study, the potencies and efficacies of a panel of EP4 ligands were systematically determined for the activation of Gαs, Gαi and ß-arrestin relative to the endogenous ligand PGE2. For this purpose, three bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays were adapted to evaluate the respective pathways in living cells. Our results suggest considerable functional selectivity among the tested, structurally related agonists and have implications for the use of PGE2 analogues in experimental and possibly clinical settings, as their activity spectra on EP4 differ from that of the native agonist. The BRET-based methodology used for this first systematic assessment of a set of EP4 agonists should be applicable for the study of other GPCRs. In a second study, peptides were derived from extracellular juxtamembranous regions of the EP4 receptor following the rationale that peptides that target regions of the receptor remote of the ligand-binding site might modulate a subset of the EP4-mediated activities. Acute renal failure is a serious medical complication characterized by an abrupt and sustained decline in renal function and for which there is currently no effective treatment. Our results show that the optimized EP4-derived peptidomimetic THG213.29 significantly improved renal functions and histological changes in acute renal failure induced by either cisplatin or renal artery occlusion in Sprague-Dawley rats. THG213.29 did not displace PGE2 binding to EP4, but modulated PGE2 binding dissociation kinetics, indicative of an allosteric binding mode. THG213.29 exhibited functional selectivity, as it partially inhibited EP4-mediated cAMP production but did not affect Gαi activation or ß-arrestin recruitment. Our results demonstrate that THG213.29 represents a novel class of diuretic agent with noncompetitive allosteric modulator effects on EP4 receptor function for improving renal function following acute renal failure.

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins. / The vasopressin type 2 receptor (V2R) plays an important role in water homeostasis. Mainly expressed in the collecting ducts of the kidney, V2R activation by the antidiuretic hormone arginine-vasopressin (AVP) leads to water reabsorption, resulting in a decrease urine output. More than 200 mutations in the V2R gene have been link to the aetiology of the congenital form of nephrogenic diabetes insipidus (cNDI), resulting from a receptor loss-of-function. In contrast, three recently identified mutations have been shown to cause a gain-of-function of the V2R leading to the nephrogenic syndrome of inappropriate antidiuresis (NSIAD). The work presented herein is focussed on a better understanding of the molecular determinants leading to the loss- or gain -of-function of V2R mutants. More than 50% of missense mutations affecting the V2R were shown to hamper the receptor’s ability to adopt its native conformation and to cause its intracellular retention by the endoplasmic reticulum quality control system. We thus looked at the role of N-glycosylation and calnexin (Cnx) in the maturation process of mutant V2R, and their importance for receptor rescue by pharmacological chaperones (PC). Our results have shown that N-glycosylation is required for Cnx binding to the receptors and that the duration of this interaction is correlated to the severity of the misfolded state of the mutant. The importance of N-glycosylation and to sugar-mediated interactions in the maturation process of a given V2R mutant was found to be an intrinsic property, as it had no significant repercussion on the mild phenotype-associated Y128S mutant, while it completely abolished maturation of the W164S mutant, associated with a severe phenotype. Moreover, we have shown that pharmacological chaperoning can occur at different steps during the maturation process, according to the mutant studied. These mutant-specific differences indicate that the biosynthetic processing of mutant V2R is highly influenced by the nature of the mutation itself and could partially explain the variations in the clinical outcome severity among NDI-causing mutant V2Rs. Although a functionality rescue of W164S and Y128S mutants was obtained upon exposure to PC, it is not the case for all V2R mutants with a maturation defect. The V88M-V2R was found affected both in its maturation and its affinity toward AVP. In this case, and despite a significant increase in maturation and cell surface expression, the PC treatment led to a further loss in the receptor’s affinity for AVP, preventing its activation at physiological AVP concentrations. The R137C and R137L mutants are endowed with a high constitutive activity leading to NSIAD. Stunningly, substitution of this arginine by histidine (R137H) was associated with cNDI. These three mutant V2R were found to share many characteristics, of which a compromised maturation and elevated spontaneous desensitization. The only difference between these mutants relies on their constitutive activity levels. The PC used in our studies is also an inverse agonist, but failed to reduce the constitutive activity of the R137C/L mutants, entailing a ‘locked’ active conformation. Instead, the chaperoning property of the compound led to an increase in the number of constitutively active receptor at the cell surface. We have thus proposed the use of AVP as a treatment, as it was shown to cause receptor’s endocytosis without promoting their activation, leading to a reduced active receptor number at the cell surface. We have identified a new gain-of-function mutation affecting the V2R, the first not involving arginine 137. The F229V substitution was shown to confer high constitutive activity to the receptor, but unlike the two other NSIAD-causing mutants, it does not undergo elevated spontaneous desensitization. The observation that inverse agonists are efficient at inhibiting the constitutive activity of the F229V mutant is an important discovery since the unfruitful attempts obtained with the other constitutively active mutants led some investigators to the erroneous conclusion that inverse agonists were not useful for the treatment of NSIAD. Taken together, these findings underline the ‘individuality’ of V2R mutants and the importance of their functional characterization in order to bring personalized therapeutic strategies for patients with cNDI or NSIAD, and to develop new therapeutics adapted to the patients’ needs.

La majorité des hyperplasies macronodulaires bilatérales des surrénales avec syndrome de Cushing ACTH-indépendant (AIMAH) est due à l’expression aberrante de divers récepteurs hormonaux au niveau du cortex surrénalien. Les gènes responsables des AIMAH familiales avec récepteurs aberrants n’ont pas été identifiés. Le but de ce projet est de les identifier. Une étude de liaison, visant à identifier la ou les régions du génome comprenant le ou les gènes pouvant être en cause dans les AIMAH familiales, a été réalisée en utilisant l’ADN des membres d’une famille (10 malades et 7 sains) originaire du Québec, atteinte d’AIMAH et syndrome de Cushing et caractérisée par l’expression des récepteurs β-adrénergique et V1-vasopressine. Diverses régions chromosomiques entre les personnes atteintes et non-atteintes de la famille ont été soulignées. Un total de 707453 SNPs a été obtenu, et après analyse statistique, 159 SNPs significatifs, pouvant être associés au phénotype, ont été mis en évidence entre les deux groupes. Il a été constaté que la majorité de ces SNPs se situaient sur les régions chromosomiques 1q32.1 et 16q12.2. Une étude du transcriptome a aussi été réalisée en utilisant l’ADN des tumeurs de deux patients de la famille, ainsi que l’ADN d'autres tumeurs surrénaliennes. Les analyses statistiques ont permis d’identifier 15 gènes susceptibles d’être reliés à la maladie (11 surexprimés et 4 sous-exprimés). En utilisant les données de ces deux études, nous avons ciblé six gènes du chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3), un du chromosome 16 (CHD9) et un du chromosome 13 (SPRY2), afin de rechercher la présence de mutations. Le séquençage n’a révélé aucun changement de nucléotide dans les gènes PPP1R12B et SOX13. Dans les gènes ATP2B4, CACNA1S, ADORA1et PHLDA3, le séquençage a révélé des changements de nucléotides n’entrainant soit pas de changement d’acide aminé soit un changement d’acide aminé jugé « non pertinent », du fait qu’il ne permettait pas de différencier les sujets sains des sujets atteints. Pour ce qui est de CHD9 et SPRY2, le séquençage a permis d’identifier des changements de nucléotides entrainant des changements d’acides aminés de façon plus fréquente chez les sujets atteints par rapport aux sujets sains. En conclusion, nos travaux nous ont donc permis d’identifier, par étude de liaison et par analyse du transcriptome, des gènes candidats qui pourraient être responsables de cette pathologie. Le séquençage de ces gènes candidats a révélé des mutations de CHD9 et SPRY2. Ces résultats s’avèrent prometteurs puisque ces deux gènes produisent des protéines impliquées dans le remodelage de la chromatine et dans la régulation de la signalisation des protéines kinases. Le phénotypage et le génotypage des patients atteints doivent être poursuivis pour vérification. / The majority of ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia with Cushing's syndrome (AIMAH) is due to the aberrant expression of various receptors in the adrenal cortex. The genes responsible for familial AIMAH with aberrant receptors have not been identified. The aim of this project is to characterize them. A linkage study to identify the region or regions of the genome comprising the gene or genes that may be involved in familial AIMAH was performed using DNA of family members (10 affected and 7 non affected) born in Quebec and harboring AIMAH and Cushing's syndrome, under the aberrant regulation of B-adrenergic and V1-vasopressin receptors. Various chromosomal regions between patients and non-affected family were highlighted. A total of 707,453 SNPs were obtained, and after statistical analysis, 159 significant SNPs, possibly associated with phenotype, were found between the two groups. It was found that the majority of these SNPs were located on chromosomal regions 1q32.1 and 16q12.2. A transcriptome analysis was conducted using DNA from tumours of two patients of the family, as well as DNA from other adrenal tumours; Statistical analysis identified 15 genes that may be linked to disease (11 up-regulated and 4 under-expressed). Using data from these two studies, we identified six genes on chromosome 1 (ATP2B4, PPP1R12B, SOX13, ADORA1, CACNA1S and PHLDA3), one on chromosome 16 (CHD9) and one on chromosome 13 (SPRY2), to investigate the presence of mutations. The sequencing revealed no nucleotide changes in gene PPP1R12B and SOX13. In ATP2B4, CACNA1S, ADORA1 and PHLDA3, the sequencing not revealed nucleotides changes leading to either amino acid changes or an amino acid changes considered “not-relevant”, because they do not differentiate healthy individuals from affected. The sequencing of CHD9 and SPRY2 identified nucleotide changes causing amino acid changes more frequently in patients compared to healthy subjects. In conclusion, our work has therefore identified by linkage analysis and DNA microarray candidate genes that can be responsible to this disease, and mutations in two of these genes, CHD9 and SPRY2. These results are promising because these genes produce proteins involved in chromatin remodeling and regulation of signaling protein kinases. Phenotyping and genotyping of patients should be pursued further.

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance. / G protein coupled receptors (GPCRs) are one of the largest families of membrane receptor coded by the human genome and certainly the biggest family of receptors. Localized at the plasma membrane, they are responsible for a wide variety of cellular responses. Activation of GPCRs by ligands has been traditionally associated with change in protein conformation, switching from an inactive to an active state. However, some observations were inconsistent with this theory suggesting the presence of several active conformations of the receptor. These different conformations could be active in some signalling or regulatory pathways and inactive in others. This phenomenon, originally called biased agonism, is now described as the functional selectivity of GPCRs ligands. In theory, this type of selectivity could lead to the development of drugs that therapeutic action without activating signalling pathways responsible for side effect. The delta opioid receptor (DOR) is a GPCR involved in chronic pain management. However, analgesic action of its ligands is subject to tolerance that develops over the course of long-term treatment, limiting their clinical use. This thesis focuses on functional selectivity of DOR ligands to assess the possibility of reducing the effects of tolerance produced by these molecules. First, we determined that DORs adopt ligand-specific active conformations with distinct ability to activate different signalling pathways and regulatory responses. Second, we established that DORs constitutively associate with Gαi heterotrimeric subunits, and that different receptor ligands induce distinct conformational changes within these signalling complexes. These observations are inconsistent with a two-state model of receptor activation, pointing instead the presence of multiple active conformations. Finally, we demonstrated that conformations stabilized by different agonists distinctively interact with βarrestin2, such that the agonist who promoted a transient receptor interaction with this regulatory protein produced more recycling, less desensitization and less acute analgesic tolerance than the ligand who promoted a stable DOR-βarrestin2 interaction. Taken together, the results presented in this thesis show DORs adopt ligand-specific conformations that support ligand-specific profiles of analgesic tolerance. This type of functional selectivity of opioid ligands could be eventually exploited in the development of novel therapeutic agents with longer analgesic actions.

This research investigates the realization of parametric amplification in superconducting circuits and structures where nonlinearity is provided by Josephson junction (JJ) elements. We aim to develop a systematic analysis over JJ-based devices toward design of novel traveling-wave Josephson parametric amplifiers (TW-JPA). Chapters of this thesis fall into three categories: lumped JPA, superconducting periodic structures and discrete Josephson transmission lines (DJTL). The unbiased Josephson junction (JJ) is a nonlinear element suitable for parametric amplification through a four-photon process. Two circuit topologies are introduced to capture the unique property of the JJ in order to efficiently mix signal, pump and idler signals for the purpose of signal amplification. Closed-form expressions are derived for gain characteristics, bandwidth determination, noise properties and impedance for this kind of parametric power amplifier. The concept of negative resistance in the gain formulation is observed. A design process is also introduced to find the regimes of operation for gain achievement. Two regimes of operation, oscillation and amplification, are highlighted and distinguished in the result section. Optimization of the circuits to enhance the bandwidth is also carried out. Moving toward TW-JPA, the second part is devoted to modelling the linear wave propagation in a periodic superconducting structure. We derive closed-form equations for dispersion and s-parameters of infinite and finite periodic structures, respectively. Band gap formation is highlighted and its potential applications in the design of passive filters and resonators are discussed. The superconducting structures are fabricated using YBCO and measured, illustrating a good correlation with the numerical results. A novel superconducting Transmission Line (TL), which is periodically loaded by Josephson junctions (JJ) and assisted by open stubs, is proposed as a platform to realize a traveling-wave parametric device. Using the TL model, this structure is modeled by a system of nonlinear partial differential equations (PDE) with a driving source and mixed-boundary conditions at the input and output terminals, respectively. This model successfully emulates parametric and nonlinear microwave propagation when long-wave approximation is applicable. The influence of dispersion to sustain three non-degenerate phased-locked waves through the TL is highlighted. A rigorous and robust Finite Difference Time Domain (FDTD) solver based on the explicit Lax-Wendroff and implicit Crank-Nicolson schemes has been developed to investigate the device responses under various excitations. Linearization of the wave equation, under small-amplitude assumption, dispersion and impedance analysis is performed to explore more aspects of the device for the purpose of efficient design of a traveling-wave parametric amplifier. Knowing all microwave characteristics and identifying different regimes of operation, which include impedance properties, cut-off propagation, dispersive behaviour and shock-wave formation, we exploit perturbation theory accompanied by the method of multiple scale to derive the three nonlinear coupled amplitude equations to describe the parametric interaction. A graphical technique is suggested to find three waves on the dispersion diagram satisfying the phase-matching conditions. Both cases of perfect phase-matching and slight mismatching are addressed in this work. The incorporation of two numerical techniques, spectral method in space and multistep Adams-Bashforth in time domain, is employed to monitor the unilateral gain, superior stability and bandwidth of this structure. Two types of functionality, mixing and amplification, with their requirements are described. These properties make this structure desirable for applications ranging from superconducting optoelectronics to dispersive readout of superconducting qubits where high sensitivity and ultra-low noise operation is required.

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique. / γ-aminobutyric acid (GABA) is the principal inhibitory neurotransmitter of the central nervous system and is involved in diverse pathologies such as epilepsy, anxiety, depression and drug addiction. GABAergic modulation of neuronal activity involves two different subsets of receptors: the GABAA receptor chlorine channel and the heterodimer of G protein coupled receptors (GPCR) GABAB. Each of these receptors is responsible for mediating distinct parts of the GABA-induced signaling. Upon stimulation, it is vital for the cell to control the signaling input and prevent overstimulation, using mechanisms such as functional desensitization and down-regulation to achieve this. The processes controlling GABAB receptor activity are atypical for a GPCR and have yet to be fully characterized. The aim of this thesis is to elucidate the mechanisms controlling GABAB activity by discovering novel proteins interactions mediating receptor desensitization, internalization and ubiquitination. In the first study, we identified the N-ethylmaleimide sensitive factor (NSF) as a GABAB interacting protein and characterized its interaction site as the coiled-coil structure on both GABAB sub-units. We also showed that this interaction is sensitive to the ATPase state of NSF and that agonist treatment of GABAB led to dissociation of NSF from the receptor in a protein kinase C (PKC) dependent manner. Interestingly, GABA-induced PKC activation was dependent on the NSF-GABAB interaction, suggesting a feedback mechanism for PKC. Both PKC and NSF were involved in mediating receptor desensitization, suggesting a novel role of NSF in receptor signaling regulation. In the proposed model, NSF interacts with GABAB at the basal state, and upon agonist stimulation, PKC is activated and can phosphorylate the receptor, promoting NSF dissociation and GABAB desensitization. We then studied constitutive GABAB ubiquitination and degradation and its regulation by PKC and the deubiquitinating enzyme USP14 (Ubiquitin-specific protease 14). GABAB shows a high constitutive ubiquitination and internalization level. Activation of PKC promotes both phenomena and accelerates the rate of lysosomal receptor degradation. In contrast, USP14 promotes post-endocytic deubiquitination of the receptor, but also accelerates receptor degradation in a catalytically-independent manner. Our results suggest a mechanism where PKC-induced cell surface ubiquitination promotes GABAB endocytosis and USP14 interaction promotes endosomal sorting toward lysosomal degradation. In the third study, we identified the growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) as a protein interacting with the PEST (proline, glutamate, serine, threonine rich) sequence of GABAB1 through a SH3-domain interaction and forming a ternary complex with the functional GABAB heterodimer. We showed that Grb2 can regulate cell surface density of GABAB by decreasing constitutive endocytosis, suggesting that this interaction can compete for binding of the PEST sequence with proteins such as the GABAA γ2S sub-unit or the COPI complex (1, 2), promoting higher cell surface stability. In proposing novel molecular mechanisms controlling GABAB signaling and cell surface expression through NSF, PKC, USP14 and Grb2, this thesis highlights the complex regulation of GABAB activity by its functional desensitization, ubiquitination, endocytosis and degradation.

Many irreversible antagonists are known to bind irreversibly to pharmacological receptors. However, few studies suggest that these irreversible antagonists may also display irreversible non-specific antagonism by binding irreversibly to non-syntopic binding sites on the receptor macromolecule, whereby they modulate the signal transduction of these receptors or reduce the agonist binding affmity. The aim of this study was to investigate whether the classical irreversible antagonists phenoxybenzamine, benextramine and 4-DAMP mustard display irreversible nonspecific antagonism at various G protein-coupled receptor (GPCR) types. In addition, the subcellular mechanism whereby benextramine displays irreversible non-specific antagonism was investigated. Three cell lines were employed to investigate the antagonism by these irreversible antagonists: Chinese hamster ovary (CHO-K1) cells transfected to express the porcine a2A-adrenoceptor (a2A-AR) at higher (a2A-H) or lower (a2A-L) numbers, human neuroblastoma (SH-SY5Y) cells that endogenously express muscarinic acetylcholine receptors (mACh-Rs), and SH-SY5Y cells transfected (5HT2A-SH-SY5Y)o express the human 5HT2A-serotonirne ceptor (5HTZA-R).C ells of the appropriate cell line were pre-treated at the appropriate concentrations and incubation times with an appropriate irreversible antagonist, with or without an appropriate reversible competitive antagonist at a sufficient concentration to protect the specific receptors. This was followed by washing procedures with drug-free media to rinse any unbound or reversibly bound drugs from the cells. When appropriate, cell membranes were prepared. Receptor function was evaluated by measuring whole-cell [3H]-cAMP or [3H]-IPx acumulation, or the binding of [35S]-GTPyS to membraness. Receptor concentrations were determined from radioligand-binding assays. In addition, the constitutive [35S]-GTPyS binding to Go protein before and after pre-treatment with benextramine was investigated. Results suggest that phenoxybenzamine (100 uM, 20 minutes) and benextramine (10 uM, 20 minutes) display irreversible non-specific antagonism at a2A-ARs when measuring Gi-mediated effects in a2A-L cells, but the affinity for a2A-ARs in a2A-H cells was not changed. In addition, it was found that the observed irreversible nonspecific antagonism by benextramine appears to be time- and concentration-dependent. When the mechanism of irreversible antagonism by benextramine was further investigated, benextramine reduced the binding of [35S]-GTPyS to a2A-H membranes with protected a2A-ARs, but did not modulate the constitutive binding of [35S]-GTPyS to Go. In addition, benextramine displays irreversible non-specific antagonism by inhibiting the G,-mediated effects of a2A-ARs in a2A-H cells and the Gq-mediated effects of mACh-Rs or 5HT2A-Rs in SH-SY5Y or 5HT2A-SH-SY5Y cells respectively. 4-DAMP mustard (100 uM, 20 minutes) did not display irreversible non-specific antagonism at mACh-Rs in SH-SY5Y cells, but irreversible non-specific antagonism was observed when the incubation time was increased (100 uM, 60 minutes). In conclusion it was found that phenoxybenzamine, benextramine and 4-DAMP mustard display irreversible non-specific antagonism at typical experimental conditions. These findings confirm concerns in literature and supports the possibility that more irreversible antagonists could display irreversible non-specific antagonism, and that could influence the interpretation of data obtained with such drugs. In addition, benextramine may prove to be a useful experimental drug in studying GPCR signalling. / Thesis (Ph.D. (Pharmacology))--North-West University, Potchefstroom Campus, 2004.

The aim of this thesis is to investigate the dynamical behaviors of spatially extended systems with fluctuating time delays. In recent years, the study of spatially extended systems and systems with fluctuating delays has experienced a fast growth. In ubiquitous natural and laboratory situations, understanding the action of time-delayed signals is a crucial for understanding the dynamical behavior of these systems. Frequently, the length of the delay is found to change with time. Spatially extended systems are widely studied in many fields, such as chemistry, ecology, and biology. Self-organization, turbulence, and related nonlinear dynamic phenomena in spatially extended systems have developed into one of the most exciting topics in modern science. The first part of this thesis considers the discrete system. Diffusively coupled map lattices with a fluctuating delay are used in the study. The uncoupled local dynamics of the considered system are represented by the delayed logistic map. In particular, the influences of diffusive coupling and fluctuating delay are studied. To observe and understand the influences, the results for the considered system are compared with coupled map lattices without delay and with a constant delay as well as with the uncoupled logistic map with fluctuating delays. Identifying different patterns, determining the existence of traveling wave solutions, and specifying the fully synchronized stable state are the focus of this part of the study. The Lyapunov exponent, the master stability function, spectrum analysis, and the structure factor are used to characterize the different states and the transitions between them. The second part examines the continuous system. The delay is introduced into the reactionterm of the Fisher-KPP equation. The focus of this part of study is the time-delay-induced Turing instability in one-component reaction-diffusion systems. Turing instability has previously only been found in multiple-component reaction-diffusion systems. However, this work demonstrates with the help of the stability exponent that fluctuating delay can result in Turing instability in one-component reaction-diffusion systems as well. / Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung der Einflüsse der zeitlich fluktuierenden Verzögerungen in räumlich ausgedehnten diffusiven Systemen. Durch den Vergleich von Systemen mit konstanter Verzögerung bzw. Systemen ohne räumliche Kopplung erhält man ein tieferes Verständnis und eine bessere Beschreibungsweise der Dynamik des räumlich ausgedehnten diffusiven Systems mit fluktuierenden Verzögerungen. Im ersten Teil werden diskrete Systeme in Form von diffusiven Coupled Map Lattices untersucht. Als die lokale iterierte Abbildung des betrachteten Systems wird die logistische Abbildung mit Verzögerung gewählt. In diesem Teil liegt der Fokus auf Musterbildung, Existenz von Multiattraktoren und laufenden Wellen sowie der Möglichkeit der vollen Synchronisation. Masterstabilitätsfunktion, Lyapunov Exponent und Spektrumsanalyse werden benutzt, um das dynamische Verhalten zu verstehen. Im zweiten Teil betrachten wir kontinuierliche Systeme. Hier wird die Fisher-KPP Gleichung mit Verzögerungen im Reaktionsteil untersucht. In diesem Teil liegt der Fokus auf der Existenz der Turing Instabilität. Mit Hilfe von analytischen und numerischen Berechnungen wird gezeigt, dass bei fluktuierenden Verzögerungen eine Turing Instabilität auch in 1-Komponenten-Reaktions-Diffusionsgleichungen gefunden werden kann

Dans cette thèse, nous présentons une nouvelle méthode smoothed particle hydrodynamics (SPH) pour la résolution des équations de Navier-Stokes incompressibles, même en présence des forces singulières. Les termes de sources singulières sont traités d'une manière similaire à celle que l'on retrouve dans la méthode Immersed Boundary (IB) de Peskin (2002) ou de la méthode régularisée de Stokeslets (Cortez, 2001). Dans notre schéma numérique, nous mettons en oeuvre une méthode de projection sans pression de second ordre inspirée de Kim et Moin (1985). Ce schéma évite complètement les difficultés qui peuvent être rencontrées avec la prescription des conditions aux frontières de Neumann sur la pression. Nous présentons deux variantes de cette approche: l'une, Lagrangienne, qui est communément utilisée et l'autre, Eulerienne, car nous considérons simplement que les particules SPH sont des points de quadrature où les propriétés du fluide sont calculées, donc, ces points peuvent être laissés fixes dans le temps. Notre méthode SPH est d'abord testée à la résolution du problème de Poiseuille bidimensionnel entre deux plaques infinies et nous effectuons une analyse détaillée de l'erreur des calculs. Pour ce problème, les résultats sont similaires autant lorsque les particules SPH sont libres de se déplacer que lorsqu'elles sont fixes. Nous traitons, par ailleurs, du problème de la dynamique d'une membrane immergée dans un fluide visqueux et incompressible avec notre méthode SPH. La membrane est représentée par une spline cubique le long de laquelle la tension présente dans la membrane est calculée et transmise au fluide environnant. Les équations de Navier-Stokes, avec une force singulière issue de la membrane sont ensuite résolues pour déterminer la vitesse du fluide dans lequel est immergée la membrane. La vitesse du fluide, ainsi obtenue, est interpolée sur l'interface, afin de déterminer son déplacement. Nous discutons des avantages à maintenir les particules SPH fixes au lieu de les laisser libres de se déplacer. Nous appliquons ensuite notre méthode SPH à la simulation des écoulements confinés des solutions de polymères non dilués avec une interaction hydrodynamique et des forces d'exclusion de volume. Le point de départ de l'algorithme est le système couplé des équations de Langevin pour les polymères et le solvant (CLEPS) (voir par exemple Oono et Freed (1981) et Öttinger et Rabin (1989)) décrivant, dans le cas présent, les dynamiques microscopiques d'une solution de polymère en écoulement avec une représentation bille-ressort des macromolécules. Des tests numériques de certains écoulements dans des canaux bidimensionnels révèlent que l'utilisation de la méthode de projection d'ordre deux couplée à des points de quadrature SPH fixes conduit à un ordre de convergence de la vitesse qui est de deux et à une convergence d'ordre sensiblement égale à deux pour la pression, pourvu que la solution soit suffisamment lisse. Dans le cas des calculs à grandes échelles pour les altères et pour les chaînes de bille-ressort, un choix approprié du nombre de particules SPH en fonction du nombre des billes N permet, en l'absence des forces d'exclusion de volume, de montrer que le coût de notre algorithme est d'ordre O(N). Enfin, nous amorçons des calculs tridimensionnels avec notre modèle SPH. Dans cette optique, nous résolvons le problème de l'écoulement de Poiseuille tridimensionnel entre deux plaques parallèles infinies et le problème de l'écoulement de Poiseuille dans une conduite rectangulaire infiniment longue. De plus, nous simulons en dimension trois des écoulements confinés entre deux plaques infinies des solutions de polymères non diluées avec une interaction hydrodynamique et des forces d'exclusion de volume. / In this thesis we develop a new smoothed particle hydrodynamics (SPH) method suitable for solving the incompressible Navier-Stokes equations, even with singular forces. Singular source terms are handled in a manner similar to that in the immersed boundary (IB) method of Peskin (2002) or in the method of regularized Stokeslets (Cortez, 2001). The numerical scheme implements a second-order pressure-free projection method due to Kim and Moin (1985) and completely obviates the difficulties that may be faced in prescribing Neumann pressure boundary conditions. We present two variants of this approach, one Langrangian which is commonly used and one Eulerian, simply because we consider that the SPH particles are quadrature points on which the fluid properties are calculated, therefore, these points can be kept fixed in time. The proposed SPH method is first tested on the planar start-up Poiseuille problem and a detailed error analysis is performed. For this problem, the results are similar whether the SPH particles are free to move or fixed on a regular grid. Our hybrid SPH-IB method is then used to calculate the dynamics of a stretched immersed elastic membrane. The membrane is represented by a cubic spline along which the tension in the membrane is computed and transmitted to the surrounding fluid. The Navier-Stokes equations with singular force due to the membrane are then solved to determine the velocity of the fluid in which the membrane is immersed. The fluid velocity thus obtained is interpolated on the interface, to determine its displacement. We discuss the advantages, in this problem, of fixing the SPH particles, rather than allowing them to move with the fluid. A new coupled Brownian dynamics-SPH method for the computation of confined flows of non-dilute polymer solutions with full hydrodynamic interaction and excluded volume forces is next presented. The starting point for the algorithm is the system of coupled Langevin equations for polymer and solvent (CLEPS) (see Oono and Freed (1981) and Öttinger and Rabin (1989), for example) describing, in the present case, the microscopic dynamics of a flowing polymer solution with a bead-spring representation of the macromolecules. Numerical tests of some two-dimensional channel flows reveal that use of a second-order projection scheme coupled with fixed SPH quadrature points leads to second-order velocity convergence and almost second-order pressure convergence, provided that the solution is sufficiently smooth. In the case of large-scale dumbbell and bead-spring chain calculations, an appropriate scaling of the number of grid points as a function of the number of beads N ensures, in the absence of excluded volume forces, that the cost of our algorithm is O(N) flops. Finally, we begin calculations in three dimensions with our SPH model. To this end, we solve in three dimensions the problem of Poiseuille flow between two infinite and parallel plates and the problem of Poiseuille flow in a rectangular infinitely long duct. In addition, we carry out three dimensional computations of confined flows of non-dilute polymer solutions with full hydrodynamic interaction and excluded volume forces.

This thesis describes two different sample preparation strategies for inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES), and their ability regarding multi element quantification in complex samples. Sensitivity, repeatability, reproducibility and accuracy were investigated. The aim was to increase the over all efficiency, the speed of analysis, and/or the sensitivity of the analytical method. The intention was to measure analytes with concentrations ranging from ng/g to mg/g simultaneously. The aim was additionally to study chemical and physical processes occurring during the sample preparation, the sample transport to the plasma, and the atomization therein. In the first sample preparation strategy, a hydrophilic highly cross-linked iminodiacetate-agarose adsorbent, IDA-Novarose, was used for preconcentration of metal ions, and matrix elimination in natural water samples. The sorbent was synthesized with different binding capacities. The effect of the capacity on preconcentration, matrix elimination, and uptake capability at high flow rates was studied. For a high capacity IDA-Novarose (≥ 45 µmole/ml) quantitative uptake was seen even at high flow rates (100 ml/min) for Cu2+ with a high affinity to the adsorbent, and for Cd2+ with a moderate affinity. For lower capacities the uptake of Cd2+ was affected by the sample matrix and the flow rate. A method based on the determination of the conditional stability constant of the metal sorbent complex was suggested for the prediction of the sorbent capacity needed to obtain quantitative recovery and optimal matrix elimination. The sorbent was used in a flow system with online buffering for the analysis of a certified riverine water (SLRS-3), tap water and lake water. With few exceptions the results obtained by ICP-AES after preconcentration agreed well with the certified concentrations and results obtained by ICP-MS. The other sample preparation strategy discussed is a method for non digested biological samples from different animal organs for the multi element analysis by ICP-AES. This “mix and measure method” consists of a simple homogenization of the sample with a mixing rod in a small amount of neutral media, followed by dilution and direct measurement with ICP-AES. The total time of analysis is only a few minutes. The ability of this fast method to accurately quantify some elements of toxic, environmental, and/or physiological concern with the lowest possible sample dilution and the highest possible plasma load was evaluated. In 10 % liver slurry Cd, Co, and Sr, at concentration levels around 0.05 µg/g were quantified simultaneously with P and K around 2000 µg/g and with several other elements in between (Al, Ca, Cu, Fe, Mg, Mn, Pb, and Zn). The relative standard deviation of repeated measurements of samples was around 5 - 6 % for regardless of the concentration of the element. The method was also used for fast screening of the elemental distribution in mice organs (brain, heart, kidney, liver, lung and spleen).