Les récepteurs couplés aux protéines G constituent la plus grande famille de protéines membranaires et interviennent dans de nombreux processus physiologiques. La compréhension de l’interaction ligand-récepteur d’un point de vue mécanistique mais également thérapeutique est cruciale. Appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs de la vasopressine et de l’ocytocine ont été choisis comme modèle d’étude. Ces hormones jouent un rôle important dans la modulation de l’attachement et de l’affect chez les mammifères. Afin d’accélérer la découverte de ligands ocytocinergiques et d’explorer les mécanismes fondamentaux de leurs interactions, nous avons conçu les premiers ligands fluorescents non peptidiques des récepteurs de la vasopressine V1a et de l’ocytocine. Ces ligands ont été utilisés pour développer des tests de liaisons par TR-FRET et démontrer la dimérisation des récepteurs de la vasopressine V1a et V2 sur cellules. Des études autour de petites plates-formes dérivées d’aza-dicétopipérazine ont permis d’accéder à un nouvel antagoniste non peptidique du récepteur de l’ocytocine. L’optimisation de dérivés benzodiazépines ocytocinergiques par des études de relations structure-activité a permis d’identifier les meilleurs agonistes non peptidiques du récepteur de l’ocytocine à ce jour. Une étude in vivo chez la souris et chez le singe est amorcée pour apporter dans un futur, une solution thérapeutique aux problèmes d’interaction sociale en général et d’autisme en particulier. / G protein coupled receptors are the largest membrane protein family and play an important role in a large number ofphysiological processes. The comprehension of the ligand-receptor interaction from a mechanistic point of view but alsofor therapeutic use is crucial. Belonging to the G protein coupled receptors, the oxytocin and vasopressin receptors havebeen used as a model system. These two hormones play an important role in the modulation of attachment and affectin mammals. To accelerate the discovery of new ligands for oxytocin and vasopressin receptors and to explore thefundamental role of their interactions, we designed the first non-peptide fluorescent ligands for oxytocin and vasopressin V1a receptors. These ligands have been used to develop new binding tests based on TR-FRET technology and to prove the V1a and V2 receptor dimerisation. In parallel, we developed a new non-peptide oxytocin antagonist around an aza-diketopiperazine platform. . Optimization of benzodiazepine derivatives enables us to identify the best non peptideoxytocin agonists to date. In vivo studies in mice and monkeys are initiated to bring in the future a therapeuticsolution to social interaction problems in general and autism in particular

La création de nouvelles enzymes pour l’hydrolyse de la biomasse est une stratégie clé pour ledéveloppement du bioraffinage. Dans ce contexte, les xylanases de la famille GH11 sont déjàdéployées dans de nombreux procédés industriels et donc bien positionnées pour jouer un rôleimportant dans ces procédés. La cible de cette étude, la xylanase GH11 (Tx-Xyl) de la bactérieThermobacillus xylanilyticus, est une enzyme thermostable et donc une bonne candidate pour destravaux d’ingénierie visant l’amélioration de son activité sur des substrats ligno-cellulosiques.Dans cette étude, deux stratégies d’ingénierie des enzymes ont été employées afin d’obtenir denouvelles informations portants sur les relations structure-fonction au sein de Tx-Xyl. La premièrestratégie a consisté en l’utilisation d’une approche de mutagenèse aléatoire, couplée à l’emploi deméthodes de recombinaison in vitro. Ces travaux avaient pour objectif d’améliorer la capacitéhydrolytique de Tx-Xyl sur la paille de blé. La deuxième stratégie mise en oeuvre s’est appuyée surune approche semi-rationnelle visant la création d’une enzyme chimérique, qui bénéficierait d’uneamélioration des interactions enzyme-substrat au niveau du sous-site -3.Le premier résultat majeur de cette thèse concerne le développement d’une méthode de criblagequi permet l’analyse à haut débit de banques de mutants pour la détection de variants quiprésentent une activité hydrolytique accrue directement sur paille de blé. A l’aide de ce crible, nousavons pu analyser plusieurs banques de mutants, représentant un total de six générations demutants, et identifier une série de combinaisons de mutations différentes. D’un côté, un variant,comportant deux mutations silencieuses, permet une meilleure expression de Tx-Xyl, alors qued’autres enzymes mutées présentent des modifications intrinsèques de leurs aptitudes catalytiques.Comparés à l’enzyme parentale Tx-Xyl, certains mutants solubilisent davantage les arabinoxylanes dela paille et, lorsqu’ils sont déployés avec un cocktail de cellulases, participent à une réactionsynergique qui permet un accroissement du rendement des pentoses et du glucose libérés.A l’aide d’une approche semi-rationnelle, une séquence de 17 acides aminés en provenance d’unexylanase GH11 fongique a été ajoutée à l’extrémité N-terminale de Tx-Xyl, afin de créer de nouveauxbrins β. L’enzyme chimérique a pu être exprimée avec succès et caractérisée. Néanmoins, l’analysede ses propriétés catalytiques a révélé que celle-ci ne présente pas davantage d’interactions avec sonsubstrat dans le sous-site -3, mais les résultats obtenus fournissent de nombreux renseignements surles relations structure-fonction au sein de l’enzyme. De plus, ces travaux nous permettent depostuler que Tx-Xyl posséderait un site de fixation secondaire pour les xylanes, un élement jusqu’iciinsoupçonné dans cette enzyme. Par ailleurs, l’analyse de nos résultats nous permet de proposer uneexplication rationnelle pour l’échec de notre stratégie initiale / Engineering new and powerful enzymes for biomass hydrolysis is one area that will facilitate thefuture development of biorefining. In this respect, xylanases from family GH11 are already importantindustrial biocatalysts that can contribute to 2nd generation biorefining. The target of this study, theGH11 xylanase (Tx-Xyl) from Thermobacillus xylanilyticus is thermostable, and is thus an interestingtarget for enzyme engineering, aiming at increasing its specific activity on lignocellulosic biomass,such as wheat straw. Nevertheless, the action of xylanases on complex biomass is not yet wellunderstood, and thus the use of a rational engineering approach is not really feasible.In this doctoral study, to gain new insight into structure-function relationships, two enzymeengineering strategies have been deployed. The first concerns the development of a randommutagenesis and in vitro DNA shuffling approach, which was used in order to improve the hydrolyticpotency of Tx-Xyl on wheat straw, while the second strategy consisted in the creation of a chimericenzyme, with the aim of probing and improving -3 subsite binding, and ultimately improvinghydrolytic activity.The first key results that has been obtained is the development of a novel high-throughputscreening method, which was devised in order to reliably pinpoint mutants that can better hydrolyzewheat straw. Using this screening method, several generations of mutant libraries have beenanalyzed and a series of improved enzyme variants have been identified. One mutant, bearing silentmutations, actually leads to higher gene expression, while others have intrinsically altered catalyticproperties. Testing of mutants has shown that some of the enzyme variants can improve thesolubilization of wheat straw arabinoxylans and can work in synergy with cellulose cocktails torelease both pentose sugars and glucose.Using a semi-rational approach, 17 amino acids have been added to the N-terminal of Tx-Xyl, withthe aim of adding two extra β-strands coming from a GH11 fungal xylanase. A chimeric enzyme hasbeen successfully expressed and purified and its catalytic properties have been investigated.Although this approach has failed to create increased -3 subsite binding, the data presented revealsimportant information on structure-function relationships and suggest that Tx-Xyl may possess ahitherto unknown secondary substrate binding site. Moreover, a rational explanation for the failureof the original strategy is proposed.

Le système immunitaire adaptatif joue un rôle de premier plan dans la défense contre les infections. La réponse humorale, impliquant la production d'anticorps, est un élément important de la réponse immunitaire adaptative. Au cours d'une infection, des cellules B spécifiques du système immunitaire prolifèrent et libèrent de grandes quantités d'anticorps qui se lient sélectivement à la protéine cible (antigène) trouvée sur le pathogène invasif, induisant la destruction du pathogène.Cependant, le système immunitaire ne répond pas toujours suffisamment efficacement pour détruire les agents pathogènes, et les mécanismes de tolérance empêchent la génération d'anticorps contre les protéines humaines - comme les marqueurs de surface cellulaire sur les cellules cancéreuses ou les cytokines impliquées dans des maladies inflammatoires et auto-immunes - qui pourraient être des cibles thérapeutiques importantes. Par conséquent, il existe un grand intérêt pour la recherche et le développement d'anticorps spécifiques qui peuvent être utilisés pour le traitement des patients par immunothérapie. En raison de leur grande affinité et de leur liaison sélective aux antigènes, les anticorps monoclonaux (mAbs) sont apparus comme des agents thérapeutiques puissants. Les anticorps monoclonaux dérivés de cellules B individuelles ont une séquence unique et présentent une affinité de liaison pour un antigène spécifique. Cependant, jusqu'à maintenant, la découverte des mAbs a été limitée par l'absence de méthodes à haut débit pour le criblage direct et à grande échelle de cellules B primaires non immortalisées pour découvrir les rares cellules B qui produisent des anticorps spécifiques d'intérêt clinique. Ceci est maintenant possible avec l'émergence et l'amélioration des méthodes de compartimentation in vitro pour l'encapsulation et le criblage de cellules uniques dans des gouttelettes picolitriques. Dans mon projet de doctorat, je décris le développement d'immunodosages et de dispositifs microfluidiques pour le criblage phénotypique direct de cellules individuelles à partir de populations de cellules B enrichies. Ce développement a permis une analyse détaillée de la réponse immunitaire humorale, avec une résolution à l’échelle de la cellule unique. C’est aussi un élément essentiel d'un pipeline de détection d'anticorps couplant le criblage phénotypique de cellules individuelles au séquençage d'anticorps sur cellules uniques. Il est maintenant possible, pour la première fois, de cribler des millions de cellules B individuelles en fonction de l'activité de liaison des anticorps sécrétés et de récupérer les séquences d'anticorps / The adaptive immune system plays a leading role in defense against infection. The humoral response, involving the production of antibodies, is an important component of the adaptive immune response. During an infection, specific B cells of the immune system proliferate and release large amounts of antibodies which bind selectively to the target protein (antigen) found on the invading pathogen, inducing destruction of the pathogen. However, the immune system does not always respond efficiently enough to destroy pathogens, and tolerance mechanisms prevent the generation of antibodies against human protein - such as cell surface markers on cancer cells or cytokines involved in inflammatory and autoimmune disease - that could be important therapeutic targets. Hence, there is great interest in research and development of specific antibodies that can be used for immunotherapy of patients. Due to their high affinity and selective binding to antigens, monoclonal antibodies (mAbs) have emerged as powerful therapeutic agents. Monoclonal antibodies derived from single B cells have a unique sequence and display binding affinity for a specific antigen. However, until now, the discovery of mAbs has been limited by the lack of high-throughput methods for the direct and large-scale screening of non-immortalized primary B cells to uncover rare B cells which produce the specific antibodies of clinical interest. This is now becoming possible with the emergence and improvement of in vitro compartmentalization methods for single-cell encapsulation and screening in picoliter droplets. In my PhD project, I describe the development of binding immunoassays and microfluidic devices for the direct phenotypic screening of single-cells from enriched B cell populations. This development has enabled detailed analysis of the humoral immune response, with single-cell resolution and is an essential component of an antibody-discovery pipeline coupling single-cell phenotypic screening to single-cell antibody sequencing. It is now possible, for the first time, to screen millions of single B cells based on the binding activity of the secreted antibodies and to recover the antibody sequences

Les cancers triple négatif (TN) représente la forme la plus agressive des cancers du sein, avec un pourcentage de décès importants. Il existe une grande hétérogénéité au sein de cette maladie en termes de présentation clinique initiale, de caractéristiques biologiques, de sensibilité au traitement et d’évolution. Aucun progrès en survie n’a été réalisé depuis l’avènement des protocoles de chimiothérapie standards. En effet, malgré une bonne réponse initiale au traitement, 65% des patientes résistent aux thérapies actuelles et récidivent ce qui leur confère un pronostic particulièrement sombre. Il y a donc urgence à identifier de nouveaux protocoles de traitement et de nouvelles molécules efficaces pour ces patientes.Une stratégie de plus en plus intéressante actuellement est celle du repositionnement de composés médicaux qui n’étaient initialement pas destinés au traitement d’une maladie donnée. Cette approche a pour avantage de profiter de l’effort de recherche et développement initial extrêmement couteux et de profiter des études pharmacologiques déjà disponibles. J’ai ainsi effectué au cours de ma thèse un criblage de composés chimiques à haut débit sur 12 lignées de cancers du sein TN afin de prendre en compte leur hétérogénéité. A l’issue de ce crible, plusieurs composés se sont avérés intéressants de par leur potentiel anti-cancéreux. Plus particulièrement, des molécules psychoactives impliquées dans le métabolisme de la sérotonine (ie antidépresseurs, et notamment les inhibiteurs de recapture de la sérotonine-SSRI) sont apparues comme des « hits » forts.Suite à ces résultats, mon travail de thèse s’est orienté plus particulièrement vers la compréhension de l’activité de ces molécules et du métabolisme de la sérotonine dans nos modèles TN afin de comprendre pourquoi ces composés pouvaient présenter un intérêt dans le traitement de ces cancers. Différents aspects biologiques ont ainsi été investigués pour ces antidépresseurs. J’ai ainsi étudié le rôle exercé par la sérotonine sur mes modèles cellulaires. D’autre part, j’ai entrepris une cartographie des acteurs du métabolisme de la sérotonine afin de caractériser mes modèles. J’ai ainsi découvert deux récepteurs à la sérotonine majoritairement présents, HTR1D et HTR1B, qui ont fait l’objet de recherches approfondies. J’ai ainsi pu démontrer l’intérêt de ces deux récepteurs comme cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers triple négatifs. Grace à une étude rétrospective j’ai pu mettre en évidence une corrélation statistiquement significative entre le niveau d’expression de chacun de ces deux récepteurs et la survie des patientes TN. Nous observons ainsi une nette discrimination entre les deux groupes de cancers exprimant peu ou fortement ces gènes. J’ai ainsi pu mettre en évidence que ces deux récepteurs représentent des biomarqueurs pronostics forts des patientes TN. L’étude immunohistochimique, a permis de confirmer la présence de ces récepteurs dans les tumeurs TN. Par ailleurs, j’ai pu identifier un micro ARN régulant l’expression de l’un des récepteurs dans les lignées TN. De façon cohérente, j’ai pu observer un effet pronostic significatif du niveau d’expression de ce micro ARN sur la survie des patientes TN. L’efficacité des composés de type SSRI et d’un antagoniste de nos deux récepteurs a pu être vérifiée sur des cultures ex vivo issues de PDX notamment résistantes aux chimiothérapies. L’évaluation préclinique de ces composés a pu être testée sur un premier modèle murin TN de type PDX mais n’a cependant pas permis de démontrer d’efficacité antitumorale in vivo. En effet, la complexité du métabolisme de la sérotonine, tout comme l’hétérogénéité biologique des TN requièrent des études plus approfondies afin de pouvoir faire la preuve de concept du ciblage thérapeutique de ces récepteurs et de la modulation du métabolisme de la sérotonine dans ces cancers. Ce travail fait l’objet d’un manuscrit en préparation pour publication dans le cadre de cette thèse. / Triple negative breast cancer (TNBC) is the most aggressive form of breast cancers. It accounts for 15-20% of breast cancers. No progress in survival has been achieved since the advent of standard chemotherapy protocols. TNBC is an important clinical challenge. They have the worst outcome among breast cancer subgroups. Given their poor prognosis, their assumed hetetogeneity, and absence of any alternative specific targeted therapy, chemotherapy remains the only TNBC treatment. Despite an often good initial response to treatment, more than a half of patients do not achieve a pathological complete response, with a frequent and fast tumor relapse. Several therapeutic approaches have been identified preclinically, but none of these molecules have been shown to be effective on all of these patients. There is a urge for the identification of new treatments.An interesting strategy is the repurposing of medical compounds that were initially not intended for the treatment of a given disease. This strategy takes advantage of the extremely expensive initial research and development effort. This process is potentially efficient and cost-effective as previous clinical trials have been performed and pharmacokinetics/pharmacodynamics and toxicity have been already explored. In order to develop new treatment schemes we addressed the following question: Is there available drugs with strong activity in TNBC? To do so, we performed a high-throughput drug screening on 12 TNBC cell lines to reflect the dramatic heterogeneity of the disease. From this drug discovery program, several interesting compounds were identified with significant anti-tumor potential against TNBC. More particularly, psychoactive compounds regulating serotonin metabolism (ie antidepressant drugs and notably serotonin selective reuptake inhibitors-SSRIs) were found to be highly effective “hits”.My thesis work turned to the comprehension of serotonin implication in TNBC physiopathology to understand if modulating its metabolism could be of therapeutic interest for TNBC management. Different biological aspects were investigated concerning serotonin effects on TNBC cellular models (serotonin adjunction in vitro or endogenous synthesis inhibition). In addition, I established a comprehensive map of the serotonergic landscape in TNBC (biosynthetic capacity, transporters, receptors) that led to the identification of therapeutic targets that would be of interest in the treatment of cancer: HTR1D and HTR1B. Indeed, by blocking these promising targets (with chemical inhibitors or siRNA knockdown) we observed a strong reduction in cell viability in our large panel of TNBC cell lines. Remarkably, we found that their expression levels were associated to poor prognosis in breast cancer, and notably in TNBC subtype with huge dichotomy observed in the outcome, allowing future stratification of TNBC patient management and selection for further targeted therapies. These results pinpoint HTR1D and HTR1B as strong prognosis biomarkers in TNBC. Immunohistochemistry staining was also conducted to confirm the presence of these targets at the protein level in tumor samples. Moreover, I could identify a microRNA regulating one of these receptors: has-miR-599. Consistently, expression levels of this microRNA demonstrated a prognostic impact on TNBC survival. While ex vivo data of one SSRI and the dual antagonist of HTR1D/HTR1D receptors shown encouraging efficacy, their preclinical evaluation assessed in a TN PDX model could not allow to demonstrate any significant effect on tumor growth in vivo. As a matter of fact, serotonin metabolism is a complex system and TNBC heterogeneity does not permit to conclude on the therapeutic proof of concept of the serotonergic modulation in TNBC with this first attempt. A scientific manuscript of this work is being prepared for publication.

La découverte de médicaments en oncologie repose encore majoritairement sur les criblages pharmacologiques à haut débit. Cependant, les modèles traditionnels de culture cellulaire en deux dimensions (2D) ne reflètent pas les conditions physiopathologiques des tumeurs solides in situ. Au laboratoire, notre hypothèse est que le manque de représentativité des cellules en culture 2D par rapport aux tumeurs in situ lors des essais de criblage pharmacologique in vitro est responsable du faible taux de succès des petites molécules lors d’essais cliniques. Pour pallier ce problème, nous avons développé une méthode de culture à long-terme en trois dimensions (3D) avec des cellules d’adénocarcinome du poumon qui permet le maintien des cellules en sphéroïdes jusqu’à 38 jours. Les cellules s’adaptent rapidement à la culture 3D en diminuant leur taille et en ralentissant significativement leur métabolisme. Au niveau épigénétique, l’expression du complexe KAT3A/KAT3B et de BRG1 est significativement diminuée, et ce de manière temps-dépendante. À l’inverse, l’expression de HDAC6 est augmentée lors du passage en 3D. Finalement, nous avons vérifié si les changements épigénétiques induits par la culture 3D influençaient significativement la réponse aux médicaments. Ainsi, nous avons traité les cellules en 2D et après 10 ou 24 jours en 3D avec une pharmacothèque de 154 médicaments épigénétiques. 60% des médicaments ont démontré une activité anticancéreuse significative sur les cellules en 2D, contrairement à 9% sur les sphéroïdes de 10 jours. Avec les sphéroïdes de 24 jours, uniquement 1 médicament, le MS023, un inhibiteur des arginines méthyltransférases (PRMT) de type I, a été efficace. L’augmentation de la sensibilité au MS023 concorde avec une augmentation de la méthylation des arginines dans les sphéroïdes. En conclusion, mon projet démontre que la culture 3D modifie l’épigénome des cellules cancéreuses du poumon de manière temps-dépendant et que ces changements sensibilisent les cellules à une inhibition des PRMT de type I. L’étude des sphéroïdes nous permet d’améliorer notre compréhension de la biologie tumorale et des processus de découverte de médicaments ce qui pourrait pallier le faible taux de succès associé aux modèles 2D classique. / Small molecule development in oncology mainly involves high-throughput drug screenings and preclinical validation studies using cancer cells grown in two-dimension (2D). However, classical cell culture methods poorly reflect tumor biology and cell epigenome. Here, our objective is to develop a 3D model that displays key epigenetic features of solid tumors in order to identify new actionable targets. First, we determined culture conditions for long-term expansion of adenocarcinoma spheroids to allow cell adaptation and the occurrence of specific epigenetic features triggered by 3D condition. Our results demonstrate that cells cultivated in 3D spheroids exhibit significant phenotypic and epigenetic changes as compared to 2D monolayers. Notably, we observed numerous expression changes of key epigenetic regulators, all taken place at a different time-point of the 3D cell culture. We observed a decrease in the expression of the KAT3A/KAT3B complex as well as BRG1. HDAC6 expression also increased in 3D. Then, we asked whether epigenetic changes triggered by 3D culture would modify drug sensitivity. We performed a screening of 154 epigenetic drugs on cancer cells cultivated in 2D and in 3D at two different time points. 60% of epigenetic drugs showed significant anticancer activity against 2D monolayers. Interestingly, A549 cells in 3D spheroids became gradually resistant over time. Against 3D spheroids cultivated for 10 days, only 9% of epigenetic drugs in the drug library showed anticancer activity. Against 3D spheroids cultivated for 24 days, only a single epigenetic compound called MS023, a selective agent against type I PRMTs, reduced cell viability significantly. This sensitivity is correlated with an increase of arginine methylation observed within spheroids. Taken together, we show that 3D spheroids trigger a time-dependent epigenetic context that increases lung cancer cells sensitivity to type I PRMT inhibition. 3D spheroids of well-characterized cancer cell lines will improve our understanding of tumor biology and drug discovery and can overcome the high false discovery rate associated with 2D classical models.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un agent causateur de maladies du foie important responsable d’une pandémie affectant près de 180 millions d’individus mondialement. L’absence de symptômes dans les premières années d’infection entraîne des diagnostics tardifs qui empêchent la prise en charge rapide des patients avant l’apparition d’une fibrose et, dans près de 16 % des cas d’infection, d’une cirrhose. En exploitant les interactions protéine-protéine membranaires, des essais utilisant la technologie BRET, dans les cellules vivantes, ont été précédemment optimisés afin d’établir le réseau complet des interactions du VHC. En utilisant les fondements de cette étude, un essai à haut débit dans les cellules vivantes a été réalisé pour identifier de nouveaux composés anti-VHC ciblant une nouvelle interaction NS3/4A-NS3/4A. Approximativement 110,000 petites molécules ont été criblées pour leurs effets sur l’homodimérization de NS3/4A et ont été classées par rapport à leur spécificité et à leur puissance contre le VHC. Au terme de cette étude, UM42811 a été identifié comme un activateur potentiel de l’interaction NS3/4A-NS3/4A offrant une activité antivirale prometteuse dotant une excellente fenêtre thérapeutique. Par la suite, un séquençage exhaustif des virus, soumis à un traitement de UM42811, a permis d’établir le profil de résistance du VHC contre ce composé. Grâce à cette fine cartographie, il a été possible d’identifier un nouveau mécanisme d’inhibition de NS3/4A qui est indépendant de son activité protéase. En utilisant les données de notre groupe sur les interactions VHC-hôte, il a été possible de continuer la caractérisation fonctionnelle du composé UM42811 en étudiant son effet sur les interactions potentiellement bénéfiques à la persistance virale. Pour ce faire, les protéines associées au transport nucléaire et mitochondriale qui sont des interactants de choix de NS3/4A ont été priorisées. Parmi ces facteurs de l’hôte, l’étude de karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) et de heat shock protein 60 (HSP60) a été priorisée. De façon intéressante, les expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que UM42811 était capable de prévenir l’interaction KPNB1-NS3/4A ainsi que l’interaction HSP60-NS3/4A. De plus, les études ii fonctionnelles et les analyses d’immunobuvardage de type western ont démontré que l’interaction KPNB1-NS3/4A avait des effets délétères sur l’induction des gènes stimulés par l’interféron (ISG). Finalement, il a été démontré que KPNB1 est possiblement clivé par NS3/4A suggérant la présence potentielle d’un mécanisme de subversion ou d’échappement. En bref, cette étude démontre la puissance des stratégies impliquant les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes pour l’identification de nouveaux composés inhibiteurs, caractérise un nouveau mécanisme d’inhibition anti-VHC et révèle la possibilité d’un nouveau mécanisme d’évasion du système immunitaire. / Hepatitis C virus (HCV) is an important causative agent for liver diseases and is responsible for a worldwide pandemic affecting roughly 180 million individuals worldwide. Late diagnosis following the progression to fibrosis and to cirrhosis, in nearly 16% of chronic infections, is attributed to the absence of symptoms in the first years of infection. By exploiting membrane protein-protein interactions (PPI), live cell assays using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology have previously been optimized to complete a comprehensive hepatitis C virus (HCV) protein interaction network. Using the groundwork laid by this network study, a high-throughput assay (HTS) cell-based assay was implemented to identify novel inhibitory compounds targeting an unreported NS3/4A-NS3/4A interaction. Approximately 110,000 compounds from a small-molecule collection were screened to monitor modulation of NS3/4A homodimerization and were discriminated based on specificity and potency. UM42811 was identified as a potential NS3/4A-NS3/4A interaction activator and found to have a promising antiviral activity boasting an excellent therapeutic window. Combined deep sequencing and mutation mapping have yielded a resistance profile based on statistical and functional probability pointing towards a novel inhibitory mechanism targeting the HCV NS3/4A independent from protease activity inhibition. Data from an HCV to host protein interaction network generated by our group was used to analyze alternative effects of UM42811 on interactions which potentially benefit viral persistence. NS3/4A-specific host interactors were heavily associated with nuclear and mitochondrial transport based on Gene Ontology (GO). Among these specific interactors, karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) and heat shock protein 60 (HSP60) were selected for further study. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments revealed that UM42811 was able to prevent both KPNB1-NS3/4A and HSP60-NS3/4A interactions. Moreover, functional and western analysis revealed the KPNB1-NS3/4A interaction to have deleterious effects on iv interferon stimulated gene (ISG) induction. Unexpectedly, analysis revealed a putative NS3/4A mediated cleavage of KPNB1. Overall, this study demonstrates the strength of cell-based PPI strategies in the identification of novel HCV antiviral compounds, characterizes a novel inhibitory mechanism for HCV and reveals a potentially novel viral immune evasion mechanism.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

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La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

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