Le bruissement enzymatiques, appelé mélanose post mortem chez les crustacés est un phénomène enzymatique catalysé par des protéines à activités phénoloxydases (tyronase, catécholase, laccase et hémocyanine). L'utilisation de conservateurs de type sulfites (E220 à E228 et E539) reste à l'heure actuelle la solution la plus répandue pour éviter le développement de cette coloration peu attrayante pour le consommateur. Mais une partie de la population développe des réactions d'hypersensibilité en consommant des aliments sulfités. Dans l'onbjectif de rechercher une alternative à ces conservateurs, deux axes de recherche ont été développés durant ces travaux de thèse : la caractérisation biochimique des protéines responsables de la mélanose post mortem chez la crevette P. monodon, puis la recherche de molécules inhibitrices. Un fractionnement sur résine Phenyl Sepahrose™ CL-4B (HIC) suivie d'une séparation par électrophorèse SDS-PAGE ont montré la présence de trois protéines de 46, 82 et 89 kDa à activité principalement laccase. Une identification par RP-HPLC-Q/TOF a mis en évidence la présence d'hémocyanine uniquement. Un pH de 7,0 et une température comprise entre 37 et 50 °C ont mis en évidence les activités les plus importantes, en utilisant le dosage enzymatique dit "test au MBTH". Par ailleurs, un criblage à haut débit de 45 molécules potentiellement inhibitrices a été réalisé dans des conditions d'analyses standardisées grâce à l'outil de robotique de la plateforme Realcat. Une inhibition a été mise en évidence pour 23 composés, certains étant suffisamment efficaces pour être utilisés seuls. D'autres pourraient être introduits dans un cocktail de molécules inhibitrices aux fonctionnalités complémentaires. Les résultats des tests de trempage réalisés sur des crevettes entières ont montré qu'il était indispensable de compléter les études in vitro avec des essais à l'échelle de la matrice alimentaire dans son intégralité. / Enzymatic browning, called post mortem melanosis in crustaceans, is an enzymatic phenomenon catalyzed by proteins with phenoloxidase activities (tyronase, catecholase, laccase and hemocyanin). The use of sulfite preservatives (E220 to E228 and E539) remains at present the most widespread solution to avoid the development of this unattractive color towards consumers. But, a part of the population develops hypersensitivity reactions by consuming sulfited foods. With the objective to find an alternative to these conversators, two research axes have been planned : the biochemical characterization of the proteins responsible for post mortem melanosis in the P. monodon shrimp, then the search for inhibitory molecules. Fractionation on Phenyl Sepahrose™ CL-4B resin (HIC) followed by SDS-PAGE electrophoresis separation showed the presence of three proteins of 46, 82 and 89 kDa with mainly laccase activity. Identification by RP-HPLC-Q / TOF revealed the presence of hemocyanin only. A pH of 7.0 and a temperature between 37 and 50 °C showed the most important activities, using the enzymatic assay called "MBTH test". On the other hand, a high throughput screening of 45 potentially inhibitory molecules could be performed under standardized analysis conditions thanks to the robotic tools of the Realcat platform

L'industrie alimentaire cherche constamment à améliorer les processus de conservation des aliments. La biopréservation s’impose comme une alternative à l’utilisation de conservateurs dits «chimiques» et fait appel à des micro-organismes sélectionnés en tant que cultures protectrices pour leurs propriétés antimicrobiennes naturels. L'objectif de cette étude était de tirer profit de la diversité de Carnobacterium maltaromaticum afin d’identifier des souches capables d'inhiber la croissance du pathogène alimentaire Listeria monocytogenes. Pour cela, une méthode de typage moléculaire permettant la reconnaissance fine de souches a été établie, puis une méthode de criblage d’activités antibactériennes à robustesse élevée a été mise au point. La méthode de typage moléculaire est une méthode MLVA (Multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis) avec 3 loci de VNTR (VNTR-A, VNTR-B, VNTR-C) permet de discriminer 15 génotypes différents au sein d’une collection de 24 souches. Cela confirme la grande diversité génotypique et phénotypique présente au sein de la population de C. maltaromaticum et la performance de la méthode. La méthode de criblage est basée sur la réalisation d’essais de compétition à haut débit où chaque membre d’une collection de C. maltaromaticum a été co-cultivé avec une souche bioluminescente de L. monocytogenes. Il a été montré que la production de luminescence est le reflet de la croissance de L. monocytogenes en micro-culture et qu’il est ainsi possible de tester la stabilité du pouvoir antagoniste de chaque membre de la collection dans de multiples conditions de cultures différentes. Cette méthode a ainsi permis d’identifier des souches de C. maltaromaticum dont la propriété anti-L. monocytogenes est peu influencée par les conditions de cultures. Outre l’intérêt fondamental que présente cette méthode pour l’étude des interactions compétitives dans l’aliment, elle a permis d’identifier des souches présentant un fort potentiel de valorisation dans le domaine de la biopréservation alimentaire / The food industry is constantly seeking to improve food preservation processes. Biopreservation imposes itself as an alternative to the use of chemical preservatives and involves micro-organisms selected as protective cultures for their natural antimicrobial properties. The aim of this study was to benefit from the diversity of Carnobacterium maltaromaticum in order to identify strains capable of inhibiting the growth of Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen. For this purpose, a molecular typing method that enables fine strain identification has been established, then a method of screening of antibacterial activities with high robustness has been developed. The molecular typing method is a MLVA (Multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis) with 3 VNTR loci (VNTR-A, VNTR-B, VNTR-C). It allowed to discriminate 15 different genotypes among a collection of 24 C. maltaromaticum strains. These results confirmed the high strain diversity within this species and showed the high performance of this method. The screening method is based on high throughput competition assays where each member of a collection of C. maltaromaticum strains was co-cultivated with a bioluminescent strain of L. monocytogenes. It was established that the bioluminescence of this strains is highly correlated to bacterial growth in micro-cultures, indicating that it is possible to investigate the stability of antagonistic properties of each collection member under multiple different culture conditions. The use of this method allowed to identify C. maltaromaticum strains with bioprotection properties that are poorly influenced by culture conditions. Besides the fundamental interest of this method for investigations of competitive interactions in food, it allowed to identify strains with high potential for bioprotection applications

Pseudomonas aeruginosa est un bacille gram négatif, ubiquiste de l'environnement. Ce pathogène opportuniste humain provoque sous sa forme planctonique des infections aiguës dont le facteur de virulence clé est le SST3. P. aeruginosa peut aussi se développer sous forme de biofilm où elle exprime entre autre le SST6-1 et induire des infections chroniques. L'expression ciblée des différents facteurs de virulence est liée à l'intégration de nombreux stimuli environnementaux transduits au moyen de systèmes à deux composants ou encore de messagers secondaires, comme le di-GMPc et l'AMPc, et conduisant à une régulation très fine, conférant une grande capacité d'adaptation à la bactérie. La nature, de même que les mécanismes impliqués dans la transduction du signal, n'ont pas encore été tous identifiés à ce jour. Le but de cette thèse était de décrypter ces mécanismes moléculaires de détection et de transduction du signal gouvernant la réponse adaptative de ce pathogène à son environnement au moyen de différentes approches : chémogénomique, mutagénèse aléatoire et d'étude d'isolat clinique. Lors de cette thèse, nous avons criblé deux chimiothèques commerciales à la recherche de molécules activatrices du SST3 et du SST6-1 et nous avons pu établir un test de criblage à haut débit robuste pour les criblages de plus larges banques de composés. En utilisant une souche avec deux rapporteurs, nous avons réalisé une banque de mutants par transposons et nous avons trouvé des mutants affectés dans leur expression du SST3, candidats intéressants pour identifier de nouveaux régulateurs du système. Enfin, grâce à l'analyse de l'isolat clinique CHA (issu d'un patient atteint de mucoviscidose), nous avons découvert qu'une délétion dans le gène codant pour le régulateur majeur GacS définissait le phénotype agressif de cette souche. / Pseudomonas aeruginosa is a gram negative bacillum present in several places. This opportunistic pathogen has the capacity to infect a wide range of hosts: plants, animals, humans. This bacterium, that shows an impressive adaptability relying on a multifactorial virulence, possesses two lifestyles. These lifestyles are associated with specific virulence patterns of expression. Under its planktonic form, P. aeruginosa can provoke acute infections thanks to the activation of T2 and T3SS or induces chronic infections in cystic fibrosis patients' lungs where it establishes a biofilm (communautary life). The expression of virulence factors is linked to the integration of several environmental cues that are transduced through two-component systems and secondary messengers like c-di-GMP and that lead to a fine tuned regulation. The nature and the mechanisms involved in this signal transduction remain largely unknown. The goal of this thesis was to decipher molecular mechanisms of signal detection and transduction that govern the adaptive pathogen response to host environment using the combination of a chemogenomics, random mutagenesis and study of clinical isolate. During this work, we screened two commercial libraries and set up a robust high throughput screening test to analyse huge molecules libraries. By setting up a double reporter-gene strain, we realized a transposon mutagenesis bank and identified interesting candidates with a down-regulated T3SS. Finally, the study of the particular clinical isolate CHA (from a cystic fibrosis patient), leads to the discovery that a deletion in the gene encoding for the important regulator GacS shapes the aggressive phenotype of this strain.

Le système RUSH, de l’anglais « Retention using selective hook » est un système développé récemment qui permet d'analyser et de quantifier en temps réel le transport d'une grande diversité de protéines. Le système RUSH permet, grâce à un excès de molécules de Streptavidine (Str.) dirigées dans différents compartiments cellulaires (appelées les hameçons), de retenir des protéines appelées les rapporteurs, comportant un biocapteur fluorescent tel que la GFP (« Green fluorescent protein ») fusionné avec un peptide SBP (« Streptavidin-binding peptide »). L’addition de biotine dans le milieu perturbe l’interaction entre SBP et la Streptavidine, libérant ainsi les rapporteurs de leur hameçon. Basé sur le système RUSH, nous avons établi une méthode de criblage pour identifier des agents pharmacologiques dotés de la capacité à induire la libération d’HMGB1 (« High Mobility Group Box 1 »). La translocation d’HMGB1 depuis le noyau vers le cytoplasme, ainsi que sa sécrétion ou libération passive dans l'espace extracellulaire à travers les membranes plasmiques perméabilisées, représente un signal de danger essentiel à l’activation du système immunitaire. Dans ce système RUSH modifié, une protéine de fusion du Str-NLS3 a été utilisée comme un hameçon nucléaire pour retenir la protéine chimère constituée d'HMGB1, SBP et GFP (HMGB1-SBP-GFP). Lorsque de la biotine est ajoutée en combinaison à des chimiothérapies inductrices de la mort cellulaire immunogène (ICD) telles que les anthracyclines, elle se lie de manière compétitive à Str-NLS3 et permet la libération et la translocation nucléo-cytoplasmique des rapporteurs HMGB1-SBP-GFP. Nous avons utilisé ce système pour des criblages à haut débit visant à identifier des agents induisant le relargage d’HMGB1. Les agents identifiés appartiennent à trois catégories différentes : les inducteurs connus de l’ICD, les inhibiteurs des microtubules et les modificateurs épigénétiques. Leur effet a été confirmé par des méthodes multiples de mesure de la quantité protéique d’HMGB1 nucléaire, cytoplasmique et extracellulaire dans des cellules humaines et murines in vitro ainsi que dans le plasma de souris. Nos données révèlent également que ces agents induisent la libération d’HMGB1 par des mécanismes distincts : arrêt du cycle cellulaire, acétylation des histones ou effets « on-target » par l'inhibition d’ADN méthyltransférase. Il serait alors intéressant d'étudier si les effets décrits ici peuvent contribuer aux effets immunostimulateurs des médicaments utilisés pour le traitement de cancers ou de maladies parasitaires.Le système RUSH permettant la synchronisation et la quantification de la sécrétion des protéines du réticulum endoplasmique (RE) vers l'appareil de Golgi, il permet de cribler un grand nombre de composés afin d’identifier des inhibiteurs des sécrétions candidates. Nous avons conçu et construit une lignée cellulaire humaine exprimant les chimères SBP-GFP sécrétables ainsi que les hameçons Str-KDEL ciblant l’ER ; la biotine permet donc la libération du rapporteur par les voies de sécrétion classiques. Nous avons identifié et validé plusieurs médicaments qui sont capables d’inhiber la sécrétion de protéines : les anti-angineux, les antidépresseurs, les anti-helminthiques, anti-psychotiques, anti-protozoaires, et agents immunosuppresseurs. Ces composés varient dans leur capacité à inhiber la synthèse des protéines et de compromettre la morphologie du RE ou l'intégrité du Golgi. Les données ont ensuite été soumises à une analyse bio-informatique et cette procédure a permis l'identification de quatre groupes en fonction de leur mode d'action. Cette partie démontre la faisabilité et l'utilité d'un nouvel essai de criblage phénotypique basé sur le système RUSH. Nous avons conçu des systèmes de HSC (« High Content Screening ») basés sur le système RUSH, qui ont permis l'identification d'agents pharmacologiques induisant la libération d’HMGB1, ainsi que des inhibiteurs de la sécrétion protéique. / The retention using selective hooks (RUSH) system allows withholding load cargoes with fluorescent biosensor such as green fluorescent proteins (GFP) fused to a streptavidin-binding peptide (SBP) by an excess of streptavidin (Str) molecules that are addressed to different subcellular localizations. Addition of biotin competitively disrupts this interaction, liberating the reporter from its hook. Based on the RUSH system, we developed a screening assay to identify pharmacological agents endowed with HMGB1 (high mobility group box 1) releasing capacities. The translocation of HMGB1 from the nucleus to the cytoplasm and its secretion or passive release through the permeabilized plasma membrane constitutes a major cellular danger signal. Extracellular HMGB1 can interact with specific pattern recognition receptors to stimulate pro-inflammatory and immunostimulatory pathways. In this modified RUSH system, a Str-NLS3 fusion protein was used as a nuclear hook to seize SBP fused with HMGB1 and GFP. When combined with biotin, which competitively binds to Stre-NLS3 to free the HMGB1-SBP-GFP, immunogenic cell death (ICD) inducers such as anthracyclines were able to cause the nucleo-cytoplasmic translocation of HMGB1-SBP-GFP. We used this system for high-content screenings (HCS) to identify HMGB1 releasing agents. Hits fell into three functional categories: known ICD inducers, microtubule inhibitors, and epigenetic modifiers. Their effective action was confirmed by multiple methods monitoring nuclear, cytoplasmic and extracellular HMGB1 pools, both in cultured human or murine cells, as well as in mouse plasma. These agents induced HMGB1 release through a whole set of distinct mechanisms, cell cycle arrest, histone acetylation, or on-target effect. It will be interesting to learn whether such effects may contribute to the immunostimulatory effects of drugs that are used to treat malignant disease or worm infection. For HCS of identification of pharmacological inhibitors of conventional protein secretion, we constructed a human cell line co-expressing soluble secretory-SBP-GFP (ss-SBP-GFP) and Str-KDEL hook within the endoplasmic reticulum (ER) lumen, and biotin addition releases the reporter, ss-SBP-GFP via the conventional Golgi-dependent protein secretion pathway into the culture supernatant. We identified and validated a series of molecularly unrelated drugs including antianginal, antidepressant, anthelmintic, antipsychotic, antiprotozoal and immunosuppressive agents that inhibit protein secretion. These compounds vary in their capacity to suppress protein synthesis and to compromise ER morphology and Golgi integrity, as well as in the degree of reversibility of such effects. These data was then subjected to bioinformatics analysis including correlation analyses, non-supervised hierarchical clustering, and principal component analysis and led to the identification of 4 clusters of agents. We demonstrate the feasibility and utility of a novel RUSH-based phenotypic screening assay. In summary, we built HCS systems based on the improved RUSH sysytem for identification of agents that induce HMGB1 release or inhibit conventional protein secretion.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d’infections nosocomiales sévères associées à un taux élevé de mortalité. Le système de sécrétion de Type III (SST3) et les effecteurs qu’il injecte sont considérés comme des facteurs de virulence prépondérants de P. aeruginosa. Récemment nous avons caractérisé, un groupe de souches ne possédant pas les gènes du SST3, mais dont la virulence repose sur la sécrétion d’une nouvelle toxine de 172 kDa, nommée Exolysine (ExlA) qui provoque la perméabilisation de la membrane des cellules hôtes. ExlA est sécrétée dans le milieu par une porine de la membrane externe, nommée ExlB, formant ainsi un nouveau système de sécrétion à deux partenaires (TPS), ExlBA. Outre le domaine TPS du coté N-terminal de la protéine, impliqué dans sa sécrétion, ExlA possède différents domaines ; des répétitions hémagglutinines, cinq motifs Arginine-Glycine-Acide Aspartique (RGD) et un domaine C-Terminal faiblement conservé. Des tests de cytotoxicité sur des cellules eucaryotes ont montrés que la délétion du domaine C-terminal abolissait l’activité toxique d’ExlA. En utilisant un modèle de liposomes et différents types de cellules eucaryotes, comme les globules rouges, nous avons démontré qu’ExlA forme des pores membranaires de 1.6 nm. De plus, par un criblage cellulaire à haut-débit d’une banque de mutants obtenus par une mutagenèse de transposition, nous avons montré qu’un facteur bactérien additionnel était requis dans la toxicité d’ExlA. En effet, parmi les 7 400 mutants, nous avons identifiés 3 transposons insérés dans des gènes codant pour le pili de type IV, démontrant ainsi que cet appendice impliqué dans l’adhésion des bactéries participe à la toxicité d’ExlA, en permettant un contact rapproché entre la bactérie et les cellules hôtes. Un criblage de macrophages primaires de souris KO pour différentes protéines impliquées dans la voie de l’activation de l’inflammasome, nous a permis de démontrer que le pore formé par ExlA est responsable de l’activation de la Caspase-1 par l’inflammasome NLRP3 conduisant à la maturation de l’interleukine-1ß. Une étude bio-informatique a révélé la présence de gènes homologues à exlA chez d’autres espèces de Pseudomonas non pathogènes, comme P. putida, P. protegens, P. entomophila. Nous avons montré que ces bactéries environnementales sont aussi capables de provoquer une mort cellulaire dépendante de la Caspase-1. Finalement, un criblage d’une banque de macrophages dont les gènes ont été invalidés par la technologie CRISPR/cas9 a révélé que plusieurs protéines du système immunitaire, indirectement liées à l’activation de la Caspase-1 sont impliquées dans la mort cellulaire médiée par ExlA. De plus, nous avons montré que plusieurs sgRNAs ciblant un microARN, mir-741, était grandement enrichi dans les macrophages ayant résisté à une infection avec ExlA. Mir-741 régule l’expression d’enzymes (St8sIa1 et Agpat5) impliquées dans la voie de biosynthèse des sphingolipides et des glycérophospholipides, suggérant ainsi que l’activité d’ExlA requiert un environnement lipidique particulier. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections associated with high mortality. The type III secretion system (T3SS) and T3SS-exported toxins have been considered as key infectivity virulence factors. Our team recently characterized a group of strains lacking T3SS, but employing a new pore-forming toxin of 172 kDa, named Exolysin (ExlA) that provokes cell membrane disruption. In this work we demonstrated that the ExlA secretion requires ExlB, a predicted outer membrane protein encoded in the same operon, showing that ExlA-ExlB define a new active Two-Partner Secretion (TPS) system. In addition to the TPS secretion signals, ExlA harbors several distinct domains, which comprise hemagglutinin domains, five Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) motifs and a non-conserved C-terminal region lacking any identifiable sequence motifs. Cytotoxic assays showed that the deletion of the C-terminal region abolishes host-cell cytolysis. Using liposomes and eukaryotic cells, including red blood cells, we demonstrated that ExlA forms membrane pores of 1.6 nm. Based on a transposon mutagenesis strategy and a high throughput cellular live-dead screen, we identified additional bacterial factors required for ExlA-mediated cell lysis. Among 7 400 mutants, we identified three transposons inserted in genes encoding components of the Type IV pili, which are adhesive extracellular appendices. Type IV pili probably mediate close contact between bacteria and host cells and facilitate ExlA cytotoxic activity. These findings represent the first example of cooperation between a pore-forming toxin of the TPS family and surface appendages to achieve host cell intoxication. Using mice primary bone marrow macrophages we showed that ExlA pores provoke activation of Caspase-1 via the NLRP3-inflamasomme followed by the maturation of the pro-interleukin-1ß. Mining of microbial genomic databases revealed the presence of exlA-like genes in other Pseudomonas species rarely associated with human infections P. putida, P. protegens and P. entomophila. Interestingly, we showed that these environmental bacteria are also able to provoke Caspase-1 cleavage and pro-inflammatory cell death of macrophages. Finally, genome-wide loss-of-function CRISPR/cas9 RAW library screen revealed that several components of the immune system response, indirectly linked to Caspase-1 are involved in the ExlA-mediated cell lysis. Moreover, we found at least three sgRNAs targeting miRNA, mir-741 were highly enriched in resistant macrophages challenged by ExlA. This miRNA regulates enzymes (St8sIa1 and Agpat5) in the sphingolipids and glycerophololipids biosynthesis pathways, suggesting that ExlA activity may require proper lipid environment.

Les leucémies myéloïdes aigües résultent d’un dérèglement du processus de l’hématopoïèse et regroupent des maladies hétérogènes qui présentent des profils cliniques et génétiques variés. La compréhension des processus cellulaires responsables de l’initiation et du maintien de ces cancers permettrait de développer des outils thérapeutiques efficaces et ciblés. Au cours des dernières années, une quantité croissante d’anomalies génétiques reliées au développement de leucémies ont été corrélées à une expression anormale des gènes HOX et de leurs cofacteurs MEIS et PBX. Des modèles expérimentaux murins ont confirmé le rôle direct joué par ces protéines dans le développement de leucémies. En effet, la protéine MEIS1 collabore avec HOXA9 dans la leucémogenèse et requiert pour ce faire trois domaines distincts. Deux de ces domaines sont conservés chez PREP1, un membre de la même classe d’homéoprotéine que MEIS1. En utilisant une approche de gain-de-fonction, j’ai confirmé l’importance du rôle joué par le domaine C-terminal de MEIS1 dans l’accélération des leucémies induites par HOXA9. J’ai également montré que l’activité de ce domaine était corrélée avec une signature transcriptionnelle associée à la prolifération cellulaire. J’ai ensuite réalisé un criblage à haut débit afin d’identifier des antagonistes de l’interaction MEIS-PBX, également essentielle à l’accélération des leucémies HOX. À cette fin, j’ai développé un essai de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permettant de détecter la dimérisation MEIS-PBX dans les cellules vivantes. Plus de 115 000 composés chimiques ont été testés et suite à une confirmation par un essai orthogonal, une vingtaine de molécules ont été identifiées comme inhibiteurs potentiels. Ces composés pourront être rapidement testés sur la prolifération de cellules leucémiques primaires dans un contexte d’étude préclinique. Finalement, deux approches protéomiques complémentaires ont permis d’identifier des partenaires potentiels de MEIS1 et PREP1. La catégorisation fonctionnelle de ces candidats suggère un nouveau rôle pour ces homéoprotéines dans l’épissage de l’ARN et dans la reconnaissance de l’ADN méthylé. / Acute myeloid leukemias are the result of a perturbed hematopoietic process and regroup heterogeneous diseases with distinct clinical and genetic profiles. Identifying and understanding the faulty cellular processes would allow the development of targeted and efficient therapeutic tools. Over the last 15 years, a growing number of disease-linked genetic anomalies have been correlated with abnormal expression levels of HOX genes and their cofactors MEIS and PBX. Mouse model experimentations revealed a direct role for these proteins in leukemogenesis. Indeed, the protein MEIS1 collaborates with HOXA9 in the acceleration of leukemia development. This specific function requires the presence of three different domains, two of which are highly conserved in PREP1, another member of the MEIS class of homeoproteins. Using a gain-of-function approach, I confirmed the importance of the C-terminal domain of MEIS1 in the acceleration of HOXA9-induced leukemias. I also correlated the activity of this domain with a transcriptional signature related to cell proliferation. Furthermore, I performed a high-throughput screen to identify antagonists of the MEIS-PBX interaction, also required for acceleration of HOX-induced leukemogenesis. In this regard I developed an assay that exploits bioluminescence resonance energy transfer (BRET) to monitor the MEIS-PBX dimerization in living cells. More than 115 000 compounds were tested and upon confirmation of their activity using an orthogonal assay, 20 small molecules were identified as potential inhibitors. These compounds will be rapidly tested on proliferation of primary leukemic cells in a preclinical setting. Finally two complementary proteomic approaches allowed the identification of new potential partners of MEIS1 and PREP1. The functional clustering of these candidates suggests a new role for homeoproteins in mRNA splicing and methylated DNA recognition.

Les études d'interaction protéine-ligand aident à mieux comprendre la structure et la fonction des protéines. Dans la première partie de la thèse, la cyt bd oxydase a été étudiée. La protéine d'E. coli a été immobilisée avec succès sur des électrodes modifiées par des nanoparticules d'or. Ainsi, un biocapteur électrochimique a été créé, permettant de tester certains inhibiteurs potentiels de cyt bd provenant d’E. coli. Le cyt bd issue de G. thermodenitrificans thermophile a également été étudié. En faisant appel aux spectroscopies IR et Raman ainsi que l’électrochimie, il a été démontré que la protéine est distincte du cyt bd d’E. coli. Une influence mutuelle du pH et de la température sur la catalyse a été aussi démontrée. La deuxième partie de la thèse portait sur la protéine mitochondriale mitoNEET. L'influence du pH et de divers ligands (pioglitazone, resvératrol, ions phosphates) a été examinée. / Protein-ligand interaction studies help to better understand the structure and function of proteins. In the first part of the thesis cyt bd oxidase was studied. The protein from E. coli was successfully immobilised at gold nanoparticles modified electrodes. Thus, an electrochemical biosensor was created allowing testing some potential inhibitors of cyt bd from E. coli. The cyt bd from thermophilic G. thermodenitrificans was also studied. By means of IR, Raman spectroscopy and electrochemistry the protein was shown to be distinct from cyt bd from E. coli. A mutual influence of pH and temperature was demonstrated on the electrochemical and catalytical properties. The second part of the thesis focused on mitochondrial mitoNEET protein. The influence of the pH and various ligands was studied.

La caractérisation de l'activité enzymatique des (phospho)lipases requiert des tests enzymatiques spécifiques, continus, utilisant des substrats lipidiques et adaptés au criblage à haut débit des activités et/ou des inhibiteurs de (phospho)lipases. Afin de développer de tels tests, la synthèse de glycérophosphatidylcholine (PC) estérifiée en position sn-1 et/ou sn-2 par l'acide alpha-éléostéarique (acide 9Z, 11E, 13E, octadécatriénoïque) a été effectuée. La triple insaturation conjuguée présente au sein de cet acide gras constitue un chromophore intrinsèque qui confère une forte absorption dans le domaine de l'ultra-violet à cet acide gras et aux lipides le contenant. Les PC contenant l'acide alpha-éléostéarique ont été adsorbées par « coating » au fond des puits d'une microplaque de titration. L'hydrolyse du substrat lipidique par une phospholipase A1 (PLA1) ou phospholipase A2 (PLA2), injectée dans le milieu réactionnel, est suivie en continu par l'augmentation de l'absorbance à 272 nm, due à la transition de l'acide alpha-éléostéarique de la phase adsorbée à la phase aqueuse. Des PC hétérogènes ont été synthétisées à partir de rac-glycidol pour effectuer un marquage sélectif de la PC par l'acide alpha-éléostéarique sur la position sn-1 (EOPC) ou sn-2 (OEPC). Pour empêcher la migration de la chaîne acyle, un lien éther non hydrolysable par les PLA1 ou PLA2 a été introduit sur l'autre position sn de la PC avec une chaîne alkyl (C18). Ces PC chimiquement définies ont permis d'élaborer une méthode de dosage en continu de l'activité enzymatique et discriminant les activités PLA1 ou PLA2, ce qui représente un caractère innovant par rapport à toutes les méthodes existantes / The characterization of the catalytic activity of (phospho)lipases requires specific assays, that are continuous, sensitive, use lipidic substrates and could be applied to high throughput screening. In order to perform these tests, several tailor-made alpha-eleostearic (9Z, 11E, 13E-octadecatrienoic acid) containing glycerophosphatidylcholines (PC) have been synthetized with the alpha-eleostearic acid at the position sn-1 and/or sn-2. The conjugated triene present in this fatty acid constitutes an intrinsic chromophore and, consequently, confers strong UV absorption properties of the fatty acid and the lipids harboring it. PC substrates were coated onto a microplate well and the phospholipase A1 (PLA1) or phospholipase A2 (PLA2) activity was measured continuously by the increase in absorbance, at 272 nm, due to the transition of alpha-eleostearic acid from the adsorbed to the soluble state. Moreover, two structured analogues of PC labeled at the sn-1 (EOPC) or sn-2 (OEPC) position with the alpha-eleostearic acid have been synthetized from rac-glycidol. A non-absorbing and non-hydrolysable by PLA1 and PLA2 O-ether alkyl(C18) was introduced at the other sn position to prevent intramolecular acyl chain migration during the synthesis and the lipolysis. These structured PC were coated onto a microplate and used in a continuous assay, to discriminate, with excellent accuracy, between PLA1 or PLA2 activities. The development of a sensitive enzymatic method using coated substrates analogues to natural lipid is a relevant improvement from current assays for measuring continuously (phosphor)lipases activities and/or their inhibitors due to the alpha-eleostearic acid UV spectroscopic properties

Moduler l’agrégation de protéines amyloïdes est thérapeutiquement pertinent (p. ex. la polyneuropathie amyloïde familiale traitée avec le Tafamidis). Cependant, pour de nombreuses amyloïdoses, il n’existe pas encore de modulateur d'agrégation efficace pour thérapie. Il a été récemment montré que combiner des composés qui modulent l’agrégation d’amyloïdes peut résulter en des effets synergiques. Une stratégie de criblage combinatoire, pour identifier des cocktails synergiques de composés, pourrait donc conduire à une percée thérapeutique pour de nombreuses amyloïdoses. Cependant, les technologies à haut débit existantes ne sont pas adaptées pour le criblage combinatoire.J’ai développé SynAggreg – une technologie in vitro à haut débit très sensible, précise, reproductible, peu coûteuse et flexible - qui permet d'identifier à la fois des inhibiteurs et des accélérateurs d'agrégation, de caractériser leur mécanisme d'action sur la cinétique d'agrégation et de les classer par leur efficacité. SynAggreg est également la première technologie adaptée au criblage combinatoire et pour l’étude d’effets synergiques de manière fiable. Enfin, cette nouvelle technologie peut être facilement adaptée à plusieurs amyloïdoses en remplaçant la partie amyloïde de la protéine de fusion par des techniques de biologie moléculaire. Ainsi, SynAggreg apparaît comme une boîte à outils pour la recherche fondamentale et appliquée et possède un fort potentiel de valorisation. / Modulating amyloid proteins aggregation is therapeutically relevant (e.g. the familial amyloid polyneuropathy treated with Tafamidis). However, for many amyloidoses, there is yet no efficient aggregation modulator for therapy. It was recently shown that combining compounds that modulate the aggregation of amyloids can result in synergistic effects. A combinatorial screening strategy to identify synergistic cocktails of compounds could thus lead to a therapeutic break through for many amyloidoses. However, existing high-throughput technologies are not adapted for combinatorial screening.I developed SynAggreg - a very sensitive, accurate, reproducible, cost effective, flexible and high-throughput in vitro technology - which allows identifying both aggregation inhibitors and accelerators, characterizing their mechanism of action on aggregation kinetics and ranking them by their efficiency. SynAggreg is also the first technology suitable for combinatorial screening and for studying reliably synergistic effects of combinations of compounds. Finally, this new technology can be easily adapted to several amyloidoses by replacing the amyloid part of the fusion protein with molecular biology techniques. Thus, SynAggreg appears as a toolbox for fundamental and applied research, and has a high potential for valorization.

L’ingénierie des protéines fonctionnelles est un processus d’amélioration des propriétés physiques ou catalytiques d’enzyme au travers d’approches rationnelles et d'évolution dirigée, aussi bien que la combinaison des deux méthodes. Malgré le progrès de la modélisation moléculaire des protéines, les méthodes de prédiction restent aléatoires et un grand nombre de variantes restent à tester. De ce fait, le développement et l’utilisation d’un système de criblage d’activité de protéines à très haut débit, comme la microfluidique en gouttes, est indispensable. Cette thèse de doctorat présente trois projets d’évolution dirigée de protéines en trois approches différentes avec expression d’enzyme in vitro et in vivo. Les plateformes microfluidiques ont été développées et validées pour chaque projet. De plus, plusieurs banques de variants ont été criblées avec, dans certains cas, isolement de molécules 5-10 fois que le clone parental. / This work describes the development of high-throughput droplet microfluidic platforms fine-tuned for protein of interest and their employment in directed evolution experiments. When not available, fluorogenic assay for monitoring desired enzyme activity (-ies) in droplets was developed. Moreover, the in vivo expression allowed the successive integration of microfluidic modules on the same chip. After a couple of evolution rounds the initial retro-aldolase variant was significantly improved. In other project, to meet industrial requirements a high-throughput screening platform for protease evolution in detergent has been assembled and validated. Two evolution rounds showed the accumulation of a certain pool of beneficial mutations over the selection rounds. The research described in this work highlighted that in vitro expression systems are sensitive to the amount of supplied DNA and reaction conditions. This observation led to the development of a multistep completely in vitro microfluidic platform.