Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-26. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:49Z : No. of bitstreams: 1 000868770.pdf: 910059 bytes, checksum: 43da44965c923449607f30f46cbebcf6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:38:44Z : No. of bitstreams: 1 freitas_cp_me_botfmvz.pdf: 357251 bytes, checksum: 6d07b31986079df6a989f919c5fd3069 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Está sendo amplamente difundida no Brasil e no mundo a sexagem de sêmen bovino através de citometria de fluxo. Considerando que não só o processo de criopreservação como também o processo de separação causam danos às células, esses danos têm sido amplamente estudados buscando-se alcançar maior proteção para o sêmen sexado durante a congelação. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia de congelação de sêmen sexado bovino com a utilização de dois diferentes diluentes. Para isso, 2 ejaculados de 10 touros em idade reprodutiva foram coletados em vagina artificial, avaliados e preparados para a separação por citometria de fluxo. Após a passagem pelo citômetro, as amostras foram divididas em 3 grupos (diferentes metodologias). Todos os grupos foram divididos em 2 subgrupos (diferentes diluentes: TRIS meio extensor padronizado pelo laboratório em questão e o diluente Botu- Bov®, meio extensor comercializado no Brasil Biotech Botucatu). Para o grupo 1 (GI) a medotologia utilizada foi a mesma padronizada pelo protocolo Sexing Technologies do Brasil; para o grupo 2 (GII), foi utilizado glicerol para o inicio da refrigeração; e para o grupo 3 (GIII) a glicerilização foi realizada a 18ºC e não a 5ºC como no controle (GI). A avaliação do sêmen foi realizada através de análise computadorizada (CASA) e por sondas fluorescentes para função mitocondrial e integridade da membrana plasmática e acrossomal. Para análise estatística utilizou-se o método Tukey com nível de significância p<0,05... / The sexed semen using flow citometry has been widely spread in Brazil and all over the world. The damage caused by the process of cryopreservation and separation is well known. Therefore, the sexed semen needs a higher protection during freezing process. The aim of the present study was to develop a bovine sexed semen freezing methodology with two different extenders. Thus 2 ejaculates of 10 bulls in reproductive age were collected with artificial vagina, analyzed and than prepared for the separation with flow citometry. After this procedure the samples were divided in 2 groups (different methodologies) and both groups were divided in 2 subgroups (different extenders: TRIS and Botu- Bov®). For group 1 (GI) the methodology applied was the same standardized by the protocol of Sexing Technologies of Brazil; for group 2 (GII) it was used glycerol for the beginning of the freezing and for group 3 (GIII) addition of glycerol was made at 18°C. The semen evaluation was made through CASA and fluorescent probes for the plasmatic and acrossomic membrane integrity and mitochondrial function. The statistic analysis was achieved using the Tukey method with significant level p < 0,05. There was no significant statistic difference for the analyzed parameters in regard to the methodology used; only the percentual of intact plasmatic membrane from GII with TRIS presented a smaller value compared to the other groups, also using TRIS. A significant difference between the extenders occurred in the main parameters evaluated, and Botu-bov® presented better results. The Botu-Bov® extender presented higher motility and higher number of cells after percoll...(Complete abstract, click electronic address below)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Cleome rosea é uma espécie nativa, de porte herbáceo, ocorrente em restingas brasileiras. Estudos recentes têm revelado o potencial medicinal da espécie para importantes propriedades farmacológicas, como por exemplo, as atividades anti-inflamatória, antigenotóxica, antiviral e antibacteriana. Porém, nos últimos anos, C. rosea não tem sido encontrada em várias regiões de seu ambiente natural, devido, principalmente, às ações antrópicas. Dessa forma, torna-se relevante o desenvolvimento de métodos de conservação que permitam o estudo e exploração das propriedades medicinais da espécie. O cultivo in vitro de raízes representa uma forma eficiente para produção de biomassa, devido ao rápido crescimento, produção estável de metabólitos, além de representar uma potencial fonte de explantes para a propagação em massa de diferentes espécies. O presente trabalho teve como objetivo a produção in vitro de culturas de raízes de C. rosea, associada à criopreservação, como forma de manutenção em longo prazo das culturas, monitorada através da análise de estabilidade genética. As culturas estabelecidas a partir de explantes radiculares de plantas propagadas in vitro de C. rosea demonstraram excelente capacidade de multiplicação de raízes em meio de cultura suplementado com o fitorregulador ANA, com manutenção dessa capacidade ao longo de sucessivas subculturas. Associado a esses resultados, o estabelecimento de protocolos de criopreservação pelo método de vitrificação resultou em elevados valores de frequência de recuperação do material após congelamento em nitrogênio líquido com as soluções de vitrificação PVS2 e PVS3. Os estudos de monitoramento da estabilidade genética, pela técnica de marcadores moleculares RAPD, revelaram a presença de polimorfismos significativos em uma das três culturas iniciadas a partir de raízes de C. rosea criopreservadas. Esses resultados demonstram as possibilidades de produção de raízes de C. rosea e conservação em longo prazo através da criopreservação, iniciando estudos inéditos para a espécie. / Cleome rosea is an herbaceous species found in the restinga vegetation of Brazil. Recent studies have reported its medicinal potential for important pharmacological properties, such as anti-inflammatory, antigenotoxic, antiviral and antibacterial activities. However, in recent years, no C. rosea plants have been found in their natural habitat, mainly due to human impact. Thus, it becomes applicable to the development of conservation methods that facilitate the study and exploration of the medicinal properties of C. rosea. The in vitro roots culture represents an efficient way to produce biomass, due to rapid growth, stable production of metabolites and represent a potential source of explants for mass propagation of different species. This study aimed to produce in vitro root cultures of C. rosea, associated with cryopreservation, as form of long-term maintenance of cultures, monitored by analysis of genetic stability. Cultures established from root explants of in vitro propagated plants of C. rosea showed excellent ability to multiplication of roots in culture medium supplemented with NAA plant regulator, maintaining this capacity during successive subcultures. Associated with these results, the establishment of protocols for cryopreservation by vitrification method resulted in high values of recovery frequency of the material after freezing in liquid nitrogen with vitrification solutions PVS2 and PVS3. Studies to monitoring the genetic stability by RAPD technique revealed the presence of significant polymorphisms in one of three cultures initiated from cryopreserved roots of C. rosea. These results demonstrate the potential production of roots of Cleome rosea and long-term conservation through cryopreservation, starting unpublished studies for the species.

Plasma rico em plaquetas (PRP) é um subproduto sanguíneo obtido por meio de centrifugações e subsequente separação dos elementos sanguíneos. As plaquetas são responsáveis pela produção e liberação de fatores que favorecem o reparo de diferentes tecidos. Este estudo teve como objetivo comparar e avaliar a viabilidade do PRP após congelamento e criopreservação. Foram utilizados 12 coelhos da raça Nova Zelândia adultos saudáveis para coleta de 12 mL de sangue de cada animal por meio de punção cardíaca. Para protocolo de congelamento foi usada centrífuga Centribio 14 cm de diâmetro, e para o protocolo de preservação em nitrogênio foi usada centrífuga fria a 4ºC 18 cm de diâmetro Centurion Scientific K3 Series. Foram feitas, para ambos os protocolos, duas centrifugações, a 2000 rpm por 20 minutos cada. O PRP obtido foi submetido a dois protocolos de preservação, sendo um o congelamento em freezer a -20°C (protocolo F) e outro a redução gradativa de temperatura à criopreservação a -196°C (protocolo N), usando DMSO a 6% como crioprotetor e analisados nos momentos zero (0) e decorridos 15, 30, 45 e 60 dias de preservadas. Foram realizadas contagens em câmara de Neubauer, análises através dos testes do 3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) para viabilidade celular, eletroforese SDS-PAGE para identificação proteica e cultura para fungos e mesófilas. Verificou-se que o PRP preservado sob protocolo N apresentou maior número de plaquetas preservadas quando comparado ao protocolo F (p<0,05). Ao teste de MTT o protocolo N exibiu maior variação metabólica, porém, maior viabilidade das plaquetas, confirmado pela eletroforese, onde observou-se prevalência de proteínas nas amostras criopreservadas. Ao teste microbiológico, todas as amostras se mostraram livres de contaminantes de origem bacteriana e fúngica. O método de preservação em nitrogênio líquido foi mais eficaz do que em freezer, mantendo as plaquetas metabolicamente mais ativas, as proteínas de ação reparadora tecidual e a esterilidade. / Platelet rich plasma (PRP) is a blood by-product obtained from centrifugations and subsequent separation of blood elements. Platelets are responsible for the production and release of factors that favor the repair of different tissues. This study aimed to compare and evaluate the viability of PRP after freezing and cryopreservation. Twelve healthy adult New Zealand rabbits were used to collect 12 mL of blood from each animal through cardiac puncture. Centribio centrifuge with 14 cm in diameter was used for the freezing protocol, and Centurion Scientific K3 Series cold centrifuge at 4 ° C 18 cm in diameter was used for the nitrogen preservation protocol. For both protocols, two centrifugations were done at 2000 rpm for 20 minutes each. The obtained PRP was submitted to two preservation protocols, one being the freezing at -20 ° C (protocol F) and the other the gradual reduction of temperature to cryopreservation at -196 ° C (protocol N). In both protocols were used 6% DMSO as cryoprotectant and analysis made at zero (0) times and after 15, 30, 45 and 60 days after preserved. Neubauer chamber counts were performed, tests of 3- (4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazoline bromide (MTT) for cell viability, SDS-PAGE electrophoresis for protein identification and culture for fungi and mesophiles. It was verified that PRP preserved under N protocol had a higher number of platelets preserved when compared to protocol F (p <0.05). In the MTT test, the N protocol showed greater metabolic variation, but a higher platelet viability, confirmed by electrophoresis, where protein prevalence was observed in the cryopreserved samples. At the microbiological test, all the samples were free of contaminants of bacterial and fungal origin. The preservation method in liquid nitrogen was more effective than in freezer, keeping platelets more active metabolically, tissues repairing proteins presents and sterility. / Dissertação (Mestrado)

O objetivo foi avaliar os efeitos da adição de diferentes concentrações dos isômeros cis-9, trans-11 e trans-10, cis-12 do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de congelação sobre a motilidade espermática, a integridade da membrana plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozoides de touros. No experimento foram utilizados 4 touros Jersey, sendo os ejaculados processados na forma de “pool” (experimento 1) e individualmente (experimento 2). O meio base (MB) era constituído de tris (Dilutris®-SEMENCOM, Brasil) + 20 % de gema de ovo. Os tratamentos com CLA (Luta-CLA®-BASF, Brasil), tinham apresentação oleosa por isso foram preparados a partir do MB com adição de 1% de lauril sulfato de sódio (MBL). Os tratamentos foram compostos por: controle positivo (CP) = MB, controle negativo (CN) = MBL; tratamento 50 (T50) = MBL+50μM CLA; tratamento 100 (T100) = MBL+100μM CLA e tratamento 150 (T150) = MBL+150μM CLA. Após o descongelamento a qualidade espermática foi analisada pelo CASA, e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e função mitocondrial através da associação das sondas PI, FITC-PSA, JC-1 e H-342. Em ambos os experimentos não foram observadas diferenças entre os tratamentos nas concentrações utilizadas, para os parâmetros avaliados, porém no experimento 2 houve diferenças entre indivíduos. / The objective was to evaluate the effects of addition of different concentrations of the isomers cis-9, trans-11 and trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid (CLA) to the freezing medium on sperm motility, the plasma membrane integrity, acrosomal and mitochondrial of bovine sperm. In the experiment, four Jersey bulls were used, and the ejaculates processed as "pool" (experiment 1) and individually (experiment 2). The diluent medium was based on tris (Dilutris®-SEMENCOM, Brazil) + 20% egg yolk (MB). The treatments with CLA (CLA-Luta®-BASF, Brazil), which had oily presentation, were prepared from MB with addition of 1% sodium lauryl sulfate (MBL). The treatments were: positive control (CP) = MB, negative control (CN) = MBL; treatment 50 (T50) = MBL+50μM CLA; treatment 100 (T100) = MBL+100μM CLA and treatment 150 (T150) = MBL+150μM CLA. After thawing the semen, the characteristics were analyzed by CASA, and the integrity of plasma and acrosomal membranes and mitochondrial function of sperm by association probes PI, FITC-PSA, JC-1 and H-342. In both experiments there were no differences between treatments and the conjugated linoleic acid (CLA), at the concentrations used, had no effect on the integrity and superior functionality of spermatozoa that underwent cryopreservation. However, but in experiment 2, there were differences between individuals.

O processo de criopreservação promove danos celulares que podem comprometer a qualidade espermática em termos de motilidade e dos índices de fertilidade, principalmente, devido ao estresse oxidativo. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de cisteína e glutamina na motilidade, morfologia, integridade da membrana, danos no DNA e índices de estresse oxidativo no sêmen de jundiá (Rhamdia quelen) pós-descongelamento. O sêmen de 5 machos (369,6 ± 71,75 g), com motilidade espermática superior a 80%, foi criopreservado em solução crioprotetora (frutose 50 g / L, leite em pó 50 g / L e metanol 100 mL / L) contendo diferentes concentrações de cisteína (0, 2,5, 5, 10 e 20 mM) e/ou glutamina (2,5 e 5,0 mM). O pool de sêmen foi diluído na proporção de 1:3, armazenado em palhetas de 0,25 mL, congelado em vapor de nitrogênio e mergulhado em nitrogênio líquido. Após o descongelamento (25°C por 10s) foram avaliados: motilidade (motilidade total, 0-100%), morfologia (Rosa de Bengala), fertilização, integridade da membrana (Eosina-Nigrosina), dano ao DNA (teste cometa), peroxidação lipídica (TBARS), atividade das enzimas SOD, CAT, GST e GPx, e a concentração de grupos carbonilas e sulfidrilas. Em relação aos parâmetros de motilidade, fertilização e morfologia espermática, nenhum tratamento apresentou diferença significativa em relação ao controle Na avaliação da integridade de membrana não foi observada diferença entre os tratamentos (P=0,7323). No ensaio do cometa e peroxidação lipídica os tratamentos que apresentaram os piores resultados foram os com maiores concentrações de cisteína e glutamina combinadas (P<0,0001) em relação ao controle. Observou-se uma maior atividade da SOD nos tratamentos 20C, 2,5G e 5G menor atividade no controle (P<0,0001). A atividade da CAT, GST e GPx foi maior no tratamento com as maiores concentrações dos antioxidantes (20C+5G; P<0,0001) e menor no controle. A concentração de grupos carbonilas foi maior no tratamento 20C+5G e menor controle (P<0,0001). Já a concentração de grupos sulfidrilas foi maior no controle e no tratamento 5C+5G (P<0,0001). Os achados deste estudo mostram que cisteína e glutamina, nas concentrações testadas, não apresentaram resultados satisfatórios e sim efeitos prejudiciais à qualidade espermática nos parâmetros de motilidade, morfologia, fertilização, peroxidação lipídica, índice de danos ao DNA e oxidação de proteínas. Portanto, as concentrações testadas não são recomendadas para a suplementação da solução crioprotetora para congelamento de sêmen de Rhamdia quelen. / The cryopreservation process promotes cellular damage that could compromise sperm quality in terms of motility and fertility rates, mainly due to oxidative stress. Thus, aim of this study was to assess the effects of different concentrations of cysteine and glutamine on post-thaw sperm motility, morphology, membrane integrity, fertility, DNA damage and indices of oxidative stress in the South American silver catfish (Rhamdia quelen). Sperm collected from five males (369.6 ± 71.75g), with sperm motility higher than 80%, was cryopreserved in cryoprotectant solution (fructose 50 g/L, powdered milk 50 g/L and methanol 100mL/L) containing different cysteine concentrations (0, 2.5, 5, 10 and 20 mM) and/or glutamine (2.5 and 5.0 mM). The semen pool was diluted 1:3, filled in 0.25 mL straws, frozen in nitrogen vapor, and plunged into liquid nitrogen. After thawing (25°C for 10 s) were measured: motility (total motile, 0-100%), morphology (Bengal Rose Staining), fertilization, membrane integrity (Eosin-Nigrosine), DNA damage (cometa assay), lipid peroxidation (TBARS), the activity of SOD, CAT, GST and GPx enzymes, and the concentration of Carbonyl and Sulfhydril groups. In relation to parameters of motility, fertilization and sperm morphology, no treatment presented a significant difference in relation to the control In the evaluation of membrane integrity, no difference was observed between treatments (P = 0.7323). In the comet and lipid peroxidation assay the treatments with the worst results were those with the highest concentrations of cysteine and glutamine combined (P <0.0001) in relation to the control. A higher activity of SOD was observed in treatments 20C, 2.5G and 5G lower activity in the control (P <0.0001). The activity of CAT, GST and GPx was higher in the treatment with the highest concentrations of antioxidants (20C + 5G; P <0.0001) and lower in the control. The concentration of carbonyl groups was higher in the 20C + 5G treatment and lower control (P <0.0001). The concentration of sulfhydryl groups was higher in control and 5C + 5G treatment (P <0.0001).The findings of this study show that cysteine and glutamine, at the concentrations tested, did not present satisfactory results, but rather, damaging effects on sperm quality in the parameters of motility, morphology, fertilization, lipid peroxidation, DNA damage and protein oxidation. Therefore, the concentrations tested are not recommended for the supplementation of the cryoprotectant solution for freezing semen of Rhamdia quelen.

As células-tronco mesenquimais (CTM) são células progenitoras indiferenciadas que apresentam altas taxas de proliferação em cultivo, capacidade de diferenciação em inúmeros tecidos e podem ser encontradas no organismo adulto e, também, em tecidos fetais, como cordão umbilical, placenta e liquido amniótico (LA). Estudos demonstraram que o LA humano obtido por amniocentese no segundo trimestre de gestação, comumente utilizado em exames de diagnóstico fetal, apresenta-se como uma fonte em potencial destas células progenitoras. Contudo, estas células necessitam de mais estudos quanto às técnicas de isolamento, expansão e, sobretudo, acerca dos protocolos de congelamento utilizados em sua criopreservação. Com isso, nos propusemos a padronizar técnicas de cultivo para as CTLA, como melhor meio de cultura e densidade de inóculo; avaliar as características biológicas como estado de indiferenciação, ciclo celular, marcadores de membrana, plasticidade e, ainda, testar dois protocolos de congelamento celular (padrão e gradual) com diferentes criopreservantes (DMSO, glicerol, trealose e sacarose) que mantivessem uma alta viabilidade e as demais características das células-tronco após períodos de 3 e 6 meses de armazenamento em nitrogênio líquido. Ao fim dos experimentos constatamos ser o líquido amniótico uma rica fonte de CTM passíveis de serem isoladas e cultivadas com meio de cultura a-MEM suplementado com 20% de SFB. Padronizamos, também, uma contagem celular inicial das amostras para otimizar o plaqueamento primário, uma densidade de inóculo ideal para as passagens posteriores (5.000 céls/cm2) e o tempo de dobramento (30 ± 4 horas) das mesmas. As CTLA expressaram genes de indiferenciação: Oct-4, Sox-2 e Nanog; apresentaram positividade para marcadores de superfície CD29, CD44, CD90 e CD105; alta taxa de proliferação in vitro e diferenciaram-se em tecido ósseo, adiposo, cartilaginoso e neuronal. Não encontramos diferenças significativas entre os dois métodos de congelamento avaliados no que diz respeito à viabilidade pós-congelamento. Todos os criopreservantes analisados mantiveram o estado de indiferenciação e plasticidade das células-tronco congeladas por 3 e 6 meses, contudo o DMSO 10% proporcionou maiores taxas de viabilidade do que os demais. As CTLA ficam desta maneira melhor caracterizadas, com protocolos de cultivo e estocagem bem estabelecidos, facilitando a produção de células-tronco funcionais em larga escala aptas a serem utilizadas em experimentos futuros / Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated progenitor cells that have high proliferation rates in culture, ability to differentiate into various tissues and can be found in adult and fetal tissues such as umbilical cord, placenta and amniotic fluid (AF). Studies showed that human AF obtained by amniocentesis in second trimester of pregnancy, commonly used in fetal diagnostic, is a potential source of progenitor cells. However, these cells require further studies above techniques of isolation, expansion and, especially, about freezing protocols used in their cryopreservation. For then, we analyzed isolation and expansion methods to AFSC as the best culture medium and inoculum density; biological characteristics such as undifferentiated state, cell cycle, membrane markers, plasticity, and also we tested two freezing protocols (standard and graduated) with different cryoprotectors (DMSO, glycerol, trehalose and sucrose) that could be able to maintain high viability and other characteristics of stem cells after 3 and 6 months of storage in liquid nitrogen. At the end of experiments we found that amniotic fluid is a rich source of mesenchymal stem cells that can be isolated and cultured with a-MEM medium supplemented with 20% FBS. Standardized an initial cell samples counting to optimize primary plating, an ideal inoculum density for the later passages (5000 cells/cm2) and doubling time (30 ± 4 hours). AFSC expressed undifferentiated genes: Oct-4, Sox-2 and Nanog, were positive for surface markers CD29, CD44, CD90 and CD105; presented high in vitro proliferation rate and capability to differentiate into bone, adipose, cartilage and neuronal tissues. There was not statistical significance in cell viability between standard and graduated freezing protocols. All evaluated cryoprotectors maintained the basic features of amniotic fluid stem cells, as Oct-4 gene expression, surface markers and plasticity. DMSO 10% showed higher rates of viability than the others. We can conclude that AF is a rich source of MSC with great capacity for expansion and differentiation and that both methods of freezing could be used for AF cells storage. All tested cryoprotectors maintains stemness of AFSC, therefore the highest viability rate is supplied by 10% DMSO. In this way, AFSC are better characterized, with cultivation and storage protocols standardized, resulting in large scale production of functional stem cells suitable for use in future experiments

A produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é uma das biotécnicas de reprodução que mais evoluíram nas últimas duas décadas. No Brasil, a associação com a técnica de aspiração folicular guiada por ultra-som determinou uma significativa disseminação do uso comercial da PIV. A produção em larga escala de embriões PIV associada à dificuldade em criopreservá-los, determinou que um número significativo desses embriões passasse a ser descartado nas atividades de campo, gerando prejuízos aos produtores e técnicos envolvidos no processo. Os experimentos realizados no âmbito desta tese tiveram como objetivo identificar e propor soluções para um aproveitamento mais eficiente dos ovócitos e embriões PIV. Em virtude da qualidade dos embriões poder ser influenciada pelo sistema de produção in vitro, foi realizado um experimento (Capítulo 1) para determinar a capacidade dos embriões derivados de dois sistemas de PIV em resistir à vitrificação. Entretanto, nas condições testadas, não foram verificadas influências significativas do efeito do sistema de PIV. No segundo experimento (Capítulo 2), buscou-se identificar a influência da solução crioprotetora sobre a taxa de sobrevivência embrionária in vitro e in vivo. Os resultados obtidos revelaram um efeito significativo da solução de vitrificação sobre a sobrevivência in vitro, por outro lado as taxas de prenhez foram semelhantes. Estes resultados também comprovaram a viabilidade do método de transferência direta desenvolvido neste experimento. Finalmente, em um terceiro grupo de experimentos (Capítulo 3), foi determinada a viabilidade da vitrificação de ovócitos imaturos usando duas estratégias de resfriamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos. Entretanto, a obtenção de produtos nascidos de embriões vitrificados, derivados de ovócitos imaturos vitrificados, confirma a viabilidade de criopreservação desses ovócitos como alternativa para programação das atividades de PIV. / The in vitro production (IVP) of bovine embryos has achieved an important development during the last two decades. In Brazil the large scale use of the follicular aspiration guided by ultrasonography has determined a significant improvement in the in vitro embryo production as a commercial tool. The difficulties to cryopreserve bovine oocytes and IVP embryos are at the moment the greatest barrier impairing the efficient application of this reproductive biotechnology which results in the disposal of large numbers of bovine IVP embryos. Considering these factors, this Thesis aimed to highlight new approaches to reduce embryo disposal and improve the pregnancies rates after the cryopreservation of bovine immature oocytes and IVP blastocysts. The first experiment (Chapter 1) was designed to observe the cryotolorance of embryos produced by two different IVP systems. The tested in-vitro systems did not show differences in the cryotolerance by in vitro production system. A second experiment (Chapter 2), was carried out to determine in vitro and in vivo embryo survival rates of IVP blastocysts cryopreserved using different vitrifications solutions. The results showed a significant vitrification solution effect on in vitro survival, however, when in vivo, the pregnancy rates were not different. This experiment also verified the feasibility of the direct transfer method for vitrified embryos. Finally, in a third experiment (Chapter 3) the viability of the vitrification of immature oocytes was determined using two cooling strategies. Differences among the treatments were not observed. However, calves born from the transfer of vitrified embryos, derived from vitrified immature oocytes, highlighted that the increase in cryopreservation efficiency of immature oocytes may be an important alternative to improve the IVP commercial application.

O objetivo foi avaliar os efeitos da adição de diferentes concentrações dos isômeros cis-9, trans-11 e trans-10, cis-12 do ácido linoleico conjugado (CLA) ao meio de congelação sobre a motilidade espermática, a integridade da membrana plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozoides de touros. No experimento foram utilizados 4 touros Jersey, sendo os ejaculados processados na forma de “pool” (experimento 1) e individualmente (experimento 2). O meio base (MB) era constituído de tris (Dilutris®-SEMENCOM, Brasil) + 20 % de gema de ovo. Os tratamentos com CLA (Luta-CLA®-BASF, Brasil), tinham apresentação oleosa por isso foram preparados a partir do MB com adição de 1% de lauril sulfato de sódio (MBL). Os tratamentos foram compostos por: controle positivo (CP) = MB, controle negativo (CN) = MBL; tratamento 50 (T50) = MBL+50μM CLA; tratamento 100 (T100) = MBL+100μM CLA e tratamento 150 (T150) = MBL+150μM CLA. Após o descongelamento a qualidade espermática foi analisada pelo CASA, e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e função mitocondrial através da associação das sondas PI, FITC-PSA, JC-1 e H-342. Em ambos os experimentos não foram observadas diferenças entre os tratamentos nas concentrações utilizadas, para os parâmetros avaliados, porém no experimento 2 houve diferenças entre indivíduos. / The objective was to evaluate the effects of addition of different concentrations of the isomers cis-9, trans-11 and trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid (CLA) to the freezing medium on sperm motility, the plasma membrane integrity, acrosomal and mitochondrial of bovine sperm. In the experiment, four Jersey bulls were used, and the ejaculates processed as "pool" (experiment 1) and individually (experiment 2). The diluent medium was based on tris (Dilutris®-SEMENCOM, Brazil) + 20% egg yolk (MB). The treatments with CLA (CLA-Luta®-BASF, Brazil), which had oily presentation, were prepared from MB with addition of 1% sodium lauryl sulfate (MBL). The treatments were: positive control (CP) = MB, negative control (CN) = MBL; treatment 50 (T50) = MBL+50μM CLA; treatment 100 (T100) = MBL+100μM CLA and treatment 150 (T150) = MBL+150μM CLA. After thawing the semen, the characteristics were analyzed by CASA, and the integrity of plasma and acrosomal membranes and mitochondrial function of sperm by association probes PI, FITC-PSA, JC-1 and H-342. In both experiments there were no differences between treatments and the conjugated linoleic acid (CLA), at the concentrations used, had no effect on the integrity and superior functionality of spermatozoa that underwent cryopreservation. However, but in experiment 2, there were differences between individuals.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-21T12:27:30Z No. of bitstreams: 1 Paula Fernanda Barbosa Araujo Lemos.pdf: 3078966 bytes, checksum: 8a115f68bff79f88ab9763ce148e7321 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-21T12:27:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula Fernanda Barbosa Araujo Lemos.pdf: 3078966 bytes, checksum: 8a115f68bff79f88ab9763ce148e7321 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The possibility of using a practical, fast and effective protocol for embryo cryopreservation such as glazing, may stimulate the application of the technique associated with embryo transfer by a larger number of teams at field level. However, it is necessary to develop specific protocols that result in increased embryonic viability. The objective of this study was to identify the damage caused by cryopreservation, assessing the morphological and ultrastructural feasibility of goat and sheep embryos undergoing cryopreservation of classic and vi trification in OPS (Open Pulled Straw). In experiment 1, embryos (N = 246) were obtained from superovulated Boer goats. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 75) - freezing the classic method, DMSO group (n = 74) - vitrification and Group DF (n = 74) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO +0.5 sucrose. The embryos ofthe third group were placed in a balanced so lution containing 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. In experiment 2, sheep embryos (N = 186) were obtained from superovulated Santa Ines ewes. The embryos were randomly divided into three groups: control group (n = 55) - freezing the classic method, DMSO group (n = 54) - vitrification and Group DF (n = 55) - vitrification. Embryos in the classic metod group were frozen using automatic freezing. Before freezing the embryos were left five minutes in the stabilizing solution of Ethylene glycol (EG). The embryos of the second group were placed in a DMSO solution containing 10% EG and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% DMSO+0.5 sucrose. The embryos of group three were placed in a balanced solution containin g 10% EG and 10% Dimethylformamide (DF) and then transferred to a vitrification solution with 20% EG and 20% sucrose +0.5 DF. The embryos were evaluated by analysis of embryonic viability by the use of fluorescent probes, in this case propidium iodide and Hoechst 33342 Results indicate that in goat embryos, the control group maintained most of its viable cells after thawing with 33 33% of samples injured. Of embryos in the DMSO group, 26.66% had totally damaged cells. The DF group had 60% of samples with lesions. The ultrastructural study by transmission electron microscopy showed that the vitrified embryos had a greater preservation of cells. The vitrified embryos with DMSO had higher rates of in vitro survival (47.36%), followd by embryos glazed with the DF with a lower in vitro survival rate (31.58%), and lastly embryos frozen by the traditional method (25%). In sheep embryos found in theanalysis by fluorescent probe, cells in t he control group remained viable in all embryos analyzed, a similar result occurred with the DF group, where 80% of samples were deemed feasible, other than the DMSO group, which had 50% viability. The ultrastructural study showed that the findings were similar between the control and DF groups. Embryos vitrified with DF had higher rates of in vitro survival (53.33%) and in vivo (45%), the glazed with DMSO had an in vitro survival rate (26.66%) and in vivo (30%) and embryos frozen by the traditional method (33.33%) in vitro and (40%) in vivo. It can be concluded that the vitrification solution containing 20% ethylene glycol + 20% dimethylsulfoxide + 0.5 M sucrose is an effective method for cryopreservation of goat embryos produced in vivo. However, in sheep embryos, the combination of 20% ethylene glycol + 20% dimethylformamide + 0.5 M sucrose was the best cryoprotectant regarding embryo viability, demonstrating to cause less damage to thecytoskeleton and cell organelles, and presenting a satisfactory pregnancy rate. / A possibilidade de utilizar um protocolo de criopreservação prático, rápido e eficaz, como a vitrificação, estimularia a aplicação da técnica associada à transferência de embriões por um maior número de equipes em nível de campo. Porém, faz-se necessário o desenvolvimento de protocolos específicos que resultem no incremento da viabilidade embrionária. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação, avaliando a viabilidade morfológica e ultra-estrutural de embriões caprinos e ovinos submetidos a criopreservação pelo método clássico e pela vitrificação em OPS (Open Pulled Straw). No experimento 1, os embriões (N=246) foram obtidos de cabras da raça Boer superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 75) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n= 74) – vitrificação e Grupo DF(n= 74) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando nasolução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20%DMSO +0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados em solução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. No experimento 2, os embriões ovinos (N=186) foram obtidos de ovelhas da raça Santa Inês superovuladas. Os embriões foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: Grupo Controle (n= 55) - congelação pelo método clássico, Grupo DMSO (n=54) – vitrificação e Grupo DF (n= 55) – vitrificação. Os embriões destinados ao congelamento clássico foram congelados utilizando congelador automático de embriões. Antes da congelação os embriões ficaram cinco minutos estabilizando na solução de Etilenoglicol (EG). Os embriões do grupo DMSO foram equilibrados em solução de 10% de EG e10% de Dimetilsulfóxido (DMSO) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DMSO+0,5 sacarose. Os embriões do grupo DF foram equilibrados emsolução de 10% de EG e 10% de Dimetilformamida (DF) e depois transferido para solução de vitrificação com 20% EG e 20% DF+0,5 sacarose. Os embriões foram avaliados por meio da análise da viabilidade embrionária pelo uso de sondas fluorescentes, utilizou-se Iodeto de Propídeo e Hoechst 33342, verificou-se nos embriões caprinos, que o grupo controle mantiveram grande parte das suas células integras após o descongelamento, 33,33% das amostras apresentaram-se lesionadas. Os embriões do grupo DMSO analisados, 26,66% estavam com suas células totalmente danificadas. O grupo DF apresentou 60% das amostras com lesões. O estudo ultra-estrutural por microscopia eletrônica de transmissão demonstrou que os embriões vitrificados revelaram uma maior preservação das células. Os embriões vitrificados com DMSO tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (47,36%), os vitrificados com DF tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (31,58%), os congelados pelo métodoclássico obtiveram in vitro (25%). Nos embriões ovinos verificamos na análise por sonda fluorescente, que as células do grupo controle mantiveram viáveis em todos os embriões analisados, resultado semelhante ocorreu com o grupo DF, onde 80% das amostram foram consideradas viáveis, diferente do grupo DMSO, que tiveram 50% de viabilidade. O estudo ultra-estrutural demonstrou que os achados foram semelhantes entre os grupos controle e DF. Os embriões vitrificados com DF tiveram maiores taxas de sobrevivência in vitro (53,33%) e in vivo (45%), os vitrificados com DMSO tiveram uma taxa de sobrevivência in vitro (26,66%) e in vivo (30%) e os congelados pelo método clássico obtiveram (33,33%) in vitro e (40%) in vivo. Podemos concluir que, a solução de vitrificação contendo 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilsulfóxido + 0,5M sacarose é um método eficiente para a vitrificação de embriões caprinosproduzidos in vivo. Entretanto em embriões ovinos, a associação de 20% de etilenoglicol + 20% de dimetilformamida + 0,5M de sacarose, foi o crioprotetor que apresentou melhor viabilidade embrionária, demonstrando causar menos lesões ao citoesqueleto e as organelas celulares, como isso apresentando um índice de gestação satisfatório.