Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-28T18:31:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Carlos Renato de Freitas Guaitolini.pdf: 792984 bytes, checksum: 55b49c255f7a7e0cb47a61520b8b1901 (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-06-06T12:42:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Carlos Renato de Freitas Guaitolini.pdf: 792984 bytes, checksum: 55b49c255f7a7e0cb47a61520b8b1901 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T12:42:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Carlos Renato de Freitas Guaitolini.pdf: 792984 bytes, checksum: 55b49c255f7a7e0cb47a61520b8b1901 (MD5) / O aumento da demanda em reprodução assistida de cães, bem como a crescente preocupação com a preservação de espécies ameaçadas de extinção têm impulsionado as pesquisas com reprodução canina, e o uso do cão como modelo experimental, em muitos casos, é um modelo mais relevante que os tradicionalmente utilizados para humanos. Além disso, a criopreservação de embriões caninos ainda é um desafio para a comunidade científica. Objetivou-se com este estudo avaliar as taxas de reexpansão da blastocele, taxas de eclosão, a viabilidade embrionária pós-descongelação e o desenvolvimento in vitro de blastocistos caninos criopreservados em glicerol 10% (GLI) e em etilenoglicol 1,5M (EG), por congelação lenta. Foram recuperadas 72 estruturas embrionárias e um total de 125 corpos lúteos foram identificados nos ovários, perfazendo uma taxa de recuperação embrionária de 57,6%. As concentrações plasmáticas de progesterona foram de 4,57±3,77 ng/mL no dia 0 (primeira cópula ou inseminação artificial) e 28,56±3,21 ng/mL no dia 12 (dia da colheita dos embriões). Cinquenta e um blastocistos foram separados aleatoriamente em dois grupos, GLI (n=26) e EG (n=25). Cada grupo foi subdividido em três (M0 = avaliação imediatamente após a descongelação, GLI = 9 e EG = 9; M3 = avaliação três dias após a descongelação e cultivo in vitro, GLI = 8 e EG = 8; e M6 = avaliação seis dias após a descongelação e cultivo in vitro, GLI = 9 e EG = 8). A criopreservação dos embriões foi realizada em máquina de congelação programável, em curva de resfriamento decrescente de 0,6°C até a temperatura de -35°C. Imediatamente após a descongelação, os embriões do M0 foram corados com a associação das sondas fluorescentes iodeto de propídeo (125 μg/ml) e Hoechst 33342 (1mg/ml) para avaliação da viabilidade celular; os embriões do M3 e M6 foram descongelados, cultivados in vitro em estufa com umidade saturada e atmosfera de 5% de CO2 em ar a uma temperatura de 38,5ºC, em meio SOFaa acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), por três e seis dias, respectivamente, e corados de forma similar. A taxa de reexpansão da blastocele após 24h de cultivo in vitro não diferiu (P = 0,6196) entre os grupos GLI (76,5%) e EG (68,8%), respectivamente. Não foi observada eclosão embrionária em ambos os grupos. As taxas de viabilidade embrionária pós-descongelação dos grupos GLI e EG foram de 60,6±9,7 e 64,4±9,9, respectivamente, e não diferiram (P = 0, 8275). Além disso, não foi verificada diferença (P = 0, 3105) na viabilidade embrionária entre os momentos M0 (61,1±11,6%), M3 (50,0±12,4%) e M6 (76,4±12,0%). Conclui-se que a taxa de reexpansão da blastocele pode ser um indicativo de viabilidade embrionária pós-descongelação; que não há eclosão de blastocistos caninos criopreservados em glicerol 10% ou etilenoglicol 1,5M por congelação lenta e cultivados in vitro em meio SOFaa por até 6 dias; que blastocistos caninos criopreservados em glicerol 10% ou etilenoglicol 1,5M, por congelação lenta, apresentam viabilidade similar pós-descongelação e mantêm-se viáveis por até seis dias em cultivo in vitro. / The raising necessity of assisted reproduction technology in dogs, as well as the increasing deep concern for preservation of endangered species has urged the research with canine species, and the use of the dog as an experimental model, in many cases, is a more relevant model than the traditionally used for human-being. Moreover, canine embryo cryopreservation is still a challenge for the scientific community. The aim of this study was to evaluate the blastocoele re-expansion rates, hatching rates, post-thawing embryonic viability and the in vitro development of canine blastocysts cryopreserved in glycerol 10% and ethylene glycol 1.5M, by slow freezing. A total of 72 embryonic structures were recovered and 125 corpora lutea were identified, performing an embryonic recovery rate of 57.6%. Plasmatic progesterone concentrations were 4.57±3.77 ng/ml on day 0 (first mating or artificial insemination) and 28.56±3.21 ng/mL on day 12 (embryo collection day). Fifty-one blastocysts were randomly allocated into two groups, GLY (n=26) and EG (n=25). Each group was subdivided into three subgroups (M0 = embryonic evaluation immediately after thawing, GLY = 9 and EG = 9; M3 = embryonic evaluation three days after thawing and in vitro culture, GLY = 8 and EG = 8; and M6 = embryonic evaluation six days after thawing and in vitro culture, GLY = 9 and EG = 8). For embryo cryopreservation, a programmable freezer was used, with a cooling-rate curve of 0.6°C/min, until -35°C. Immediately after thawing, embryos from M0 were stained with the association of the probes propidium iodide (125 μg/ml) and Hoechst 33342 (1mg/ml) for cellular viability evaluation; embryos from M3 and M6 were thawed and transferred to synthetic oviduct fluid (SOF) + 10% FCS. Dishes were incubated at 38.5ºC under an atmosphere of 5% CO2 with maximum humidity, for three and six days, respectively, and similar stained. Blastocoele re-expansion rates after 24h of in vitro culture did not differ (P = 0.6196) between GLY (76.5%) and EG (68.8%), respectively. No embryonic hatching was observed in both groups. Post-thawing embryonic viability rates were 60.6±9.7 and 64.4±9.9 for GLY and EG, respectively, without significant difference (P = 0. 8275). In addition, there was no significant difference among moments M0 (61.1±11.6%), M3 (50.0±12.4%) and M6 (76.4±12.0%) for embryonic viability. The present study indicates that blastocoele re-expansion serves as an indicator of post-thawing embryonic viability; that canine blastocysts cryopreserved in glycerol 10% or ethylene glycol 1.5M by slow freezing and cultured in SOFaa medium for 6 days do not hatch in vitro; that canine blastocysts cryopreserved in glycerol 10% or ethylene glycol 1.5M by slow freezing present similar post-thawing viability, and remain viable for up to six days on in vitro culture.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Platelet-rich plasma (PRP) is defined as a plasma volume with a higher platelet count than that of whole blood. PRP has been widely used for treatment of different lesions, both in human and in veterinary medicine. The aim of this study was to search for an effective method of storing equine PRP, without loss of viability. Blood (500 ml) was collected from 8 clinically healthy ponies, where 100 ml were used to prepare PRP; 2 ml were used to determine platelet count and mean platelet volume (MPV). Whole blood was centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to obtain plasma. The plasma obtained was centrifuged again at 1400rpm for 10 minutes to obtain 10 ml of PRP. PRP was divided into 3 samples of 2 ml, one being considered the fresh sample and the other 2 were frozen. Platelet count, determination of MPV and morphological evaluation were performed on the fresh sample. Morphologic evaluation consisted of counting 200 platelets under light-microscopy and their classification in inactive (discoid), activated (with pseudopodia) or uncertain state (who lost the discoid form but showed no pseudopodia). The samples to be cryopreserved were stored in a freezer at -80 ° C for 14 days, containing 6% dimethyl sulfoxide (DMSO) as a cryoprotectant or without any addition of cryoprotectants. After this period, samples were thawed and submitted to the same analysis of the fresh sample. The fresh and DMSO frozen samples showed no difference in the total number of platelets, activated platelets and MPV (617.9 ± 65.5 x103/μL, 5.3 ± 0.06 fL, 9.6%) However, samples frozen without DMSO showed fewer platelets (519.6 ± 66 x103/μL), higher MPV (5.71 ± 0.08 fL) and a higher percentage of activated platelets (13.87%). 6% DMSO proved be an effective cryoprotectant in storing equine PRP at -80°C for 14 days. / O plasma rico em plaquetas (PRP) é definido como plasma com quantidade de plaquetas três vezes superior ou mais à do sangue total. O PRP vem sendo largamente utilizado no tratamento de diferentes lesões, tanto na medicina humana quanto na medicina veterinária. O objetivo deste estudo foi buscar um método eficaz de armazenar o PRP eqüino, sem perda significativa de sua viabilidade. Foram coletados 500 ml de sangue de oito pôneis clinicamente saudáveis, dos quais 100 ml foram utilizados para o preparo do PRP e 2 ml foram enviados à análise laboratorial, para contagem de plaquetas e determinação do volume plaquetário médio (VPM). O sangue total passou por uma primeira centrifugação, de 1000rpm (224g) por 10 minutos para obtenção do plasma. O plasma obtido foi novamente centrifugado, a 1400rpm (440g) por mais 10 minutos para obtenção de 10 ml de PRP. O PRP foi dividido em três amostras de 2 ml, sendo uma considerada a amostra fresca e as outras duas destinadas à criopreservação. A amostra fresca foi enviada ao laboratório para contagem plaquetária, determinação do VPM e avaliação morfológica. A avaliação morfológica consistiu na contagem de 200 plaquetas, sob microscopia óptica e na classificação quanto à sua forma: em inativas (discóides), ativadas (com emissão de pseudópodes) ou em estado incerto (que perderam a forma discóide, mas não apresentavam pseudópodes). As amostras destinadas à criopreservação foram armazenadas em freezer, a -80°C, durante 14 dias, contendo 6% de dimetil sulfóxido (DMSO) como crioprotetor ou sem adição de crioprotetor. Após este período, as amostras foram descongeladas e submetidas às mesmas análises laboratoriais da amostra fresca. As amostras frescas e congeladas com DMSO não apresentaram diferença quanto ao número total de plaquetas, VPM e plaquetas ativadas (617,9 ± 65,5 x103/μL; 5,3±0,06fL; 9,6%) (p>0,05). Entretanto, as amostras sem DMSO apresentaram um número menor de plaquetas (519,6 ± 66 x103/μL), maior VPM (5,71±0,08fL) e maior percentagem de plaquetas ativadas (13,87%) (p<0,05). O DMSO 6% se mostrou um crioprotetor eficaz no armazenamento do PRP eqüino a -80°C por 14 dias.

A solução de preservação da Universidade de Wisconsin (UW) é considerada a solução padrão para preservação de fígados, rins e pâncreas. A frutose-1,6-bisfosfato (FBP) é uma substância que apresenta efeito protetor do fígado contra injúrias provocadas por agentes químicos e ocorridas durante o período de isquemia-reperfusão. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da FBP na composição de soluções para preservação de fígados para transplante. Neste estudo experimental, a perfusão e a preservação dos fígados foram realizadas em cada grupo com as soluções de UW, UW contendo 10 mmol/L de FBP (UWM) e FBP 10 mmol/L (FBPS), respectivamente. Os fígados foram armazenados em um recipiente plástico contendo solução de preservação a 4oC por 24 horas. As mensurações bioquímicas de AST, ALT, LDH e TBARS foram realizadas em amostras das soluções de preservação nos tempos de 0, 12, 18 e 24 horas. A análise histológica foi realizada em fígados preservados por 24 horas. O grau de preservação observado com as soluções de UW e FBPS foi similar até 18 horas de armazenamento. A adição de 10 mmol/L de FBP à solução de UW provocou um aumento das injúrias ocorridas e uma pior preservação quando comparado ao grupo armazenado em UW. A FBP protegeu os fígados contra danos causados pelos radicais livres por tempos de preservação inferiores a 18 horas. Não houve diferença significativa entre os grupos na análise histológica dos fígados preservados no tempo de 24 horas. A FBP utilizada em solução foi eficaz na preservação de fígados, podendo ser um importante constituinte para outras formulações. / University of Wisconsin (UW) solution is considered the standard preservation solution for livers, kidneys and pancreas. Fructose-1,6-bisphosphate (FBP) has been reported to have a protective effect in liver injury caused by chemical agents and ischemic-reperfusion damages. The aim of this study was to evaluate the effects of FBP in storage solution for cold liver preservation. In this experimental study, we divided the rats in three experimental groups. The perfusion and preservation of the liver were performed on each group with UW, UW containing 10 mmol/L of FBP (UWM) and FBP 10mmol/L (FBPS) solutions, respectively. The livers were stored in a plastic bag containing storage solution at 4oC for 24 hours. Biochemical measurements of AST, ALT, LDH e TBARS were realized in cold storage solution samples at 0, 12, 18 and 24 hours of preservation. Histological evaluation was performed in tissue samples obtained after 24 hors of cold storage. The preservation grade was similar in FBPS and UW solutions during 18 hours. Addition of 10 mmol/L of FBP in UW solution induced liver injury and a poor preservation when compared to group of livers preserved in UW solution. FBP protects the liver from injury caused by free radicals for preservation times bellow 18 hours. There were no significant histological differences between groups after 24 hours of preservation. FBP could be an important component of cold storage solutions for liver preservation.

Resumo: O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento (blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia - 5,2-hpf; fechamento do blastóporo - 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf) foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2- hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3- hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas, estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e 10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C. / Abstract: The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu, Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization (haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a cooling curve (-1oC/min) until -8oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf (49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored up to 10 hours at -8 ° C. / Orientadora: Elizabeth Romagosa / Coorientador: DaniloPedro Streit Junior / Banca: Luis David Solis Murgas / Banca: Sérgio Ricardo Batlouni / Mestre

As células-tronco mesenquimais derivados do tecido adiposo (ASC) apresentam potencial para uso em terapêuticas para reparação cardíaca e o modelo de suínos recapitula aspectos relevantes dos seres humanos. Nesta dissertação quisemos caracterizar ASC de porcos (pASC), após criopreservação e avaliar a responsividade destas células ao shear stress. Após descongelamento as pASC exibiram 90-95% de viabilidade, não apresentaram alterações morfológicas e nem na expressão de marcadores de superfície (CD29+ 99,74%±0,10; CD90+ 97,84%±1,32; CD44+ 99,39%±0,19, CD31- 1,75%±0,21; média±EPM, n=3). O tempo de dobramento médio foi de 63,51±16,46 horas (média±DP) e o dobramento populacional cumulativo aumentou constantemente até a passagem 10, com pequeno e gradual aumento na senescência (P5 3,25%±0,26 e P10 9,6%±0,29 SA-?-Gal). Além disso, as pASC responderam, in vitro, ao tratamento para diferenciação em adipócitos e osteócitos. Já a exposição ao SS (15 dyn/cm² por 48 hs) não induziu a expressão de marcadores endoteliais (CD31, VE-caderina e FLK-1), mas resultou no acúmulo de VEGF induzido por NO (15 dyn/cm² por 96 hs). Interessantemente, o SS induziu a fosforilação de ERK e AKT e a liberação de NO independente da magnitude do SS (1-30 dyn/cm², por 30 min). No entanto, longos períodos de estímulo (24-48 hs) e diferentes intensidades de shear stress induziram desigualmente a liberação de NO e VEGF (5 dyn/cm² maior do que 10 ou 15 dyn/cm²). Tomados em conjunto, nossos dados promovem evidências de que a viabilidade, morfologia, cinética de crescimento e resposta a estímulos químicos ou físicos de pASC não foram influenciados pela criopreservação. Além disso, a magnitude de SS aplicada a essas células afetou a liberação de NO e VEGF somente após longos períodos de exposição a esse estímulo / Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASC) offer potential regenerative therapeutic application for cardiac repair and the porcine model recapitulates key aspects relevant to humans. In this dissertation we wanted to establish the culture characteristics of pig ASC (pASC), especially after long-term cryopreservation and the effect of shear-stress (SS)-induced phenotypes. Upon thawing, pASC displayed 90-95% viability and no changes in morphological characteristics or in the expression of surface markers (CD29+ 99.74%±0.10; CD90+ 97.84%±1.32; CD44+ 99.39%±0.19, CD31- 1.75%±0.21; mean±SEM, n=3). Mean population doubling time was 63.51±16.46 hours (mean±SD) and cumulative population doubling increased constantly until passage 10 with a small and gradual increase in senescence (P5 3.25%±0.26 and P10 9.6%±0.29 SA--Gal staining). In addition, pASC in vitro responded to adipogenic and osteogenic chemical cues, whereas SS exposure (15 dyn/cm² up to 48 hours) failed to induce endothelial cell (EC) markers (CD31, VE-cadherin and FLK-1), but resulted in nitric oxide (NO)-induced VEGF accumulation (15 dyn/cm² up to 96 hours). Interestingly, SS-induced phosphorylation of ERK and AKT and the release of NO were independent of the magnitude of the stimulus (1-30 dyn/cm², up to 30minutes). In contrast, long term (24-48 hours) SS-induced NO and VEGF release under 5 dyn/cm² were higher than 10 or 15 dyn/cm2. Altogether, we provided evidence that pASC cell viability, morphology, growth characteristics and capacity to respond to chemical or physical cues were not influenced by cryopreservation. Moreover, the magnitude of the SS affected the NO and VEGF release in pASC only during long-term exposure to SS

Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-05T13:14:46Z No. of bitstreams: 1 DissNBD.pdf: 2471615 bytes, checksum: a8204662dfb8062a11f60b9f5723d468 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-13T20:17:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNBD.pdf: 2471615 bytes, checksum: a8204662dfb8062a11f60b9f5723d468 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-13T20:18:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissNBD.pdf: 2471615 bytes, checksum: a8204662dfb8062a11f60b9f5723d468 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T20:18:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissNBD.pdf: 2471615 bytes, checksum: a8204662dfb8062a11f60b9f5723d468 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Paspalum is the most important genus of Poaceae family in the Americas, with about 330 species and occurs throughout Brazil, Bolivia, Paraguay, Argentina and Uruguay. In Brazil, except for the Pampa Biome, the use of species of this genus as a cultivated forage is still very small. Species of the informal group Plicatula are among the most promising Paspalum genotypes for forage quality. The majority of Paspalum accessions is tetraploid and apomitic. The sexual cytotypes are rare in the Plicatula group. To add features located in different accessions, it is necessary to cross sexual species in tetraploid level with apomictic genotypes that are interesting to breeding programs and select those that have better agronomic characteristics. For the occurence of hybridization, the flowering synchronization betwemn parents is essencial. An interesting tool for this is the cryopreservation of pollen. P. notatum, popularly known as bahiagrass, is a species from Notata group and is widely used in the United States as forage. Diploid and tetraploid accessions are observed in this species and, it is easy to obtain large amounts of pollen. The purpose of this study was to evaluate the cryopreservation of pollen of P. notatum, as a model for future conservation and synchronization of flowering of other species that are interesting for breeding program. The P. notatum pollen grains were collected in the field at Embrapa Southeast Livestock. Four dehydrating agents were tested (LiCl, MgCl2, NaOH and Silica gel) with three distinct periods of exposion (30, 60 and 120 minutes). After slow thawing, pollen grains were evaluated for viability by staining with tetrazolium solution 0.25% and in vivo germination by fluorescence. The viability of fresh pollen grains was also evaluated as a control. For comparison, pollen grains were stored in freezer and refrigerator conditions for a period of 10, 60, 120 and 180 days. The data showed that the dehydration of Paspalum notatum pollen with lithium chloride during 30 minutes and silica gel during 120 minutes was adequated for the conservation in liquid nitrogen and freezer as the viability of pollen after this treatment remained equal to the control. The pollen preservation in the refrigerator without dehydration since 10 days may be an alternative for short-term storage situations. Dehydration results with dehydrated magnesium chloride for 30 and 60 minutes and dehydrated sodium hydroxide for 60 and 120 9 minutes were also statistically similar to the control. The use of the tetrazolium sollution and in vivo germination were an effective technique to evaluate the viability of pollen grains after liquid nitrogen conservation. The use of tetrazolium was also efficient for the evaluation of pollen grains after storage in freezer and refrigerator. / Paspalum é o mais importante gênero da família Poaceae nas Américas, com cerca de 330 espécies e ocorre em todo Brasil, Bolívia, Paraguai, Argentina e Uruguai. No Brasil, a exceção do Bioma Pampa, o uso deste gênero como forrageira plantada ainda é muito pequeno. As espécies pertencentes ao grupo informal Plicatula são consideradas entre as mais promissoras pela qualidade forrageira. A grande maioria dos acessos de Paspalum é tetraplóide e apomítico. São raros os citotipos de espécies do grupo Plicatula sexuais. Para agregar características localizadas em acessos distintos, é necessário cruzar espécies sexuais já em nível tetraplóide com genótipos apomíticos promissores e selecionar os que tem melhores características agronômicas. Para isso, há a necessidade de sincronização de florescimento entre os genitores. Uma ferramenta interessante para isso é a criopreservação de pólen. A espécie P. notatum, conhecida popularmente como grama-batatais, do grupo informal Notata, é muito usada nos Estados Unidos para produção de forragem. Já foram observados acessos diplóides e tetraplóides dessa espécie, sendo fácil a obtenção de grande quantidade de pólen. A proposta desse trabalho foi estudar a criopreservação de pólen de P. notatum, como um modelo, para futuramente conservar e sincronizar o florescimento de outras espécies com características de interesse para o melhoramento. Os grãos de pólen de P. notatum foram coletados em campo na Embrapa Pecuária Sudeste. Foram testados quatro agentes de desidratação (LiCl, MgCl2, NaOH e sílica gel) e um tratamento sem desidratação, todos por três tempos distintos (30, 60 e 120 minutos). Após descongelamento lento, os grãos de pólen foram avaliados quanto à viabilidade por coloração com solução de tetrazólio 0,25% e por germinação in vivo via fluorescência. A viabilidade de grãos de pólen recém-colhidos também foi avaliada como controle. Para efeitos de comparação, foram armazenados grãos de pólen em condições de freezer e geladeira, por um período de 10, 60, 120 e 180 dias. Os dados demonstraram que a desidratação de pólen de Paspalum notatum com cloreto de lítio por 30 minutos e sílica gel por 120 minutos foi adequado no armazenamento em nitrogênio liquido e em freezer, pois a viabilidade permaneceu igual aos grãos de pólen recém-colhidos 7 (testemunha). A conservação de pólen em geladeira sem desidratação por até 10 dias pode ser uma alternativa em situações de armazenamento a curto prazo. A conservação de pólen em freezer por até 60 dias também pode ser uma alternativa, já que além dos tratamentos citados acima, resultados de desidratação com cloreto de magnésio desidratado por 30 e 60 minutos e hidróxido de sódio desidratado por 60 e 120 minutos também foram estatisticamente iguais a testemunha. O uso do corante de tetrazólio e da técnica de germinação in vivo foram eficientes para a avaliação da viabilidade de grãos de pólen após o armazenamento de nitrogênio líquido. O uso do corante de tetrazólio também foi eficiente para a avaliação dos grãos de pólen após o armazenamento em freezer e em geladeira.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 794139 bytes, checksum: d16377a072ea68de9d1fee4cb6556d5d (MD5) Previous issue date: 2009-03-03 / This study presented three experiments realized in six adult captive ocelots. The first experiment had as a main objective, the comparative study of a two protocols for semen collection by eletroejaculation. Were compared the conventional technique applied in felids recommended by the scientific literature (80 electric stimuli in 3 series from 2 to 6v), and an adaptation of the conventional technique that praise de emptying and washing of the bladder to avoid semen contamination by urine, and uses a minor number of identical electric stimulus, however with a higher voltage. (35 electric stimuli in 7 series of 5 stimuli of 16v). A total of six animals were used, and in four of them were tested the two protocols. Three semen collections were made in each technique for each animal. The weight, corporal and testicular measurements were realized, and the semen characteristics evaluated were the aspect, sperm volume, sperm motility, sperm progressive status, sperm concentration, total sperm of ejaculate, and sperm motility index. Both protocols showed efficiency, but the modified protocol, got values on average 6 times bigger for sperm volume (1,2 mL), about 3,6 times bigger of sperm concentration for milliliter of semen (456,6x106), and 18 times bigger of total number of sperm per ejaculate (667,3x106). The modified protocol showed fast free and of contamination for urine. The qualitative data of the spermatozoa as sperm progressive status, sperm motility and sperm motility index had demonstrated excellent sperm quality and had been compatible with the data supplied for literature. The second experiment presented a study of the characterization of the ejaculate of six adult ocelots of captivity and a comparative assay between two cryoprotectors in the freezeability of the semen in two of these animals. The collections of the semen was made by eletroejaculation (80 electric stimuli in 3 series of 2 to 6v) carried through with the previous emptying and washing of the bladder, to prevent the contamination of the semen for urine. Three collections of each animal had been carried through. The characterization of the ejaculate one was based evaluation of the semen s color, consistency, gradual sperm motility, to the sperm progressive status, the sperm concentration, the total of sperm for ejaculate, the sperm index and of the morphologic analysis of the semen. The surveyed parameters had been all fellow creatures to the data of literature, being distinguished total the average values of ejaculate spermatozoon for (37,1 million), sperm index (83%), total number of pathology (35.9%) and primary (8.9%) and secondary pathology (27.7%). The third experiment evaluated two extensor cryoprotectors with the base of glycerol and ethylene glycol, both to a 6% concentration, in the viability of the semen after unfreeze of two animals. For this, tests of Thermoresistance (TTR), Hiposmotic (HO) and Supravital Coloration (CS). had been carried through In the present study, the media with the base of glycerol presented best results in the TTR test (45 to 60min glycerol and 35 to 40min ethylene glycol), and tests HO and SC had had a percentage of 34% to 43% of cells with integrity of membrane and between 20% and 68% of viable cells in the after-unfreeze in both of the tested protocols. / Este trabalho apresentou três experimentos realizados em jaguatiricas adultas de cativeiro. O primeiro experimento teve por objetivo principal o estudo comparativo entre dois protocolos para coleta de sêmen por eleteoejaculação. Foram comparadas a técnica convencionalmente utilizada na literatura para felídeos (80 estímulos elétricos em 3 séries de 2 a 6V) e uma adaptação na qual se preconiza o esvaziamento e lavagem da bexiga, para se evitar a contaminação do sêmen pela urina, e utiliza um menor número de estímulos elétricos idênticos, porém com uma voltagem mais alta (35 estímulos elétricos em sete séries de cinco estímulos de 16V). Foi utilizado um total de seis animais sendo que em quatro foram realizadas ambos os protocolos. Foram realizadas três coletas de sêmen para cada técnica em cada animal. Foram aferidos o peso, a biometria corporal e testicular e as características do sêmen avaliadas foram: aspecto, volume espermático, motilidade espermática, vigor, concentração espermática, total de espermatozóides por ejaculado e índice espermático. Ambos os protocolos mostraram eficiência para a coleta de amostras de sêmen, porém, com o protocolo modificado, obteve-se em média valor 6 vezes maior para volume espermático (1,2 mL), cerca de 3,6 vezes maior de concentração espermática por mililitro de sêmen (456,6x106), e dezoito vezes maior de número total de espermatozóides por ejaculado (667,3x106). O protocolo modificado se mostrou ainda mais rápido e livre de contaminação por urina. Os dados qualitativos dos espermatozóides como vigor, motilidade e índice espermático demonstraram ótima qualidade espermártica e foram compatíveis com os dados fornecidos pela literatura. O segundo experimento apresentou um estudo da caracterização do ejaculado de seis jaguatiricas. A coleta do sêmen foi feita por eletroejaculação (80 estímulos elétricos em 3 séries de 2 a 6V) realizada com o esvaziamento e lavagem prévios da bexiga, para se evitar a contaminação do sêmen pela urina. Foram realizadas três coletas de cada animal. Os resultados da caracterização do ejaculado revelaram parâmetros semelhantes aos dados da literatura, destacando-se os valores médios de espermatozóide totais por ejaculado (37,1 milhões), índice espermático (83%), número total de patologias (35,9%) e patologias primárias e secundárias (8,9%) e (27,7%), respectivamente. O terceiro experimento, realizado em duas jaguatiricas, avaliou os meios criprotetores à base de glicerol e etileno glicol, ambos a uma concentração de 6%, na viabilidade do sêmen pós descongelamento de dois animais. Para isso, foram realizados testes de Termorresistência (TTR), Hiposmótico (HO) e Coloração Supravital (CS). No presente estudo, o meio a base de glicerol se apresentou melhor no teste TTR (45 a 60min glicerol e 35 a 40min etileno glicol), e os testes HO e SC tiveram uma percentagem de 34% a 43% de células com integridade de membrana e entre 20% e 68% de células viáveis no pós-descongelamento em ambos os protocolos testados.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2387024 bytes, checksum: 01d23ccd7bff613e81deb218403993c6 (MD5) Previous issue date: 2009-03-02 / The wild felines is one of the most endangered species of the world and its population is affected by some factors that vary geographically because of the alduteration of their habitat, food available, strong hunt pressure or even the low population density. Assisted reproduction techniques such as gamete s cryopreservation and in vitro fertilization are fundamental for the conservation as they contributes to restoring genetic vigor and makes possible to transfer genetics sources without moving the animals itself. The aim of this study is collect semen from cougar (Puma concolor), describe its physics and morphologics characteristics and also evaluate its frozen capacity using two extenders with TRIS- citrate and egg yolk were evaluated, one with 5% of glycerol and the other with 7.5%. Five captive adult cougars from Mato Grosso do Sul s Rehabilitation Center Brazil (CRAS-MS) were used. The anesthetic protocol was an association of ketamine (10 mg/kg) and xilazine (1.2 mg/kg). Semen collection was done through electroejaculation method with a maximum of four series of 10 stimuli with 16 Volts. Before with collection the urine was collected and the bladder was washed with sterile physiologic solution. The semen samples were evaluated using the following parameters: physics aspects (color and smell), volume, concentration, morphology, sperm progressive status, sperm motility. The last two parameters were used to calculate the sperm motility index. The semen samples were packed in 0.25 ml straws, cooled at a rate 0.55ºC/min during two hours (one for de cooling and one in equilibrium) and finely frozen at a rate 5.8ºC/min. The thawing was carried through immersion in water at 37ºC during 30 seconds. The post thawed samples were evaluated using the sperm progressive status, sperm motility, sperm longevity (thermorresistance test) and hiposmotic swelling tests. The protocol used in this study for captive cougar s semen collection were efficient, with the acquisition of samples free from urine and a medium of total spermatozoids per ejaculate higher than those describe in literature for this species. The sperm motility index was also higher than those describe in literature. The medium of structurally abnormal spermatozoa were 53.88% and besides the high pleiomorphic rate only one animal between those evaluated at this study was considered teratospermic. The most frequent pathologies were tightly coiled or bent tail, coiled or bent tail and tail coiled on the head. The cryopreservation and thawing protocol were good for the cryopreservation of cougar s semen. The sperm motility index reduced only after 40 minutes of incubation at 38ºC for both extenders tested (16.25% in the extender with 5% of glycerol and 11.25% in the extender with 7.5%) and a medium of 25 to 29% of the spermatozoids showed plasmatic membrane integrity. There was no difference (p>0.05) between the two concentrations of glycerol used, according to the parameters evaluated. / Os felinos silvestres estão entre as espécies mais ameaçadas do mundo, e sua população é afetada por fatores que variam geograficamente, seja a descaracterização de habitats, disponibilidade de alimentos, forte pressão de caça ou baixa densidade populacional. Tecnologias de reprodução assistida, como a criopreservação de gametas e a fertilização in vitro, são ferramentas fundamentais para a conservação das espécies, uma vez que auxiliam na manutenção de uma população geneticamente viável e permitem translocação de material genético sem a necessidade do transporte dos animais. O presente estudo objetivou coletar sêmen de pumas (Puma concolor) assim como descrever as características físicas e morfológicas do sêmen e também avaliar a congelabilidade do sêmen desta espécie empregando dois meios de congelamento a base de TRIS-citrato e gema de ovo, sendo um com 5% de glicerol e outro com 7,5%. Foram utilizados cinco pumas adultos mantidos em condições de cativeiro no Centro de Reabilitação de Animais Silvestres do estado do Mato Grosso do Sul Brasil (CRAS-MS). Os animais foram anestesiados com associação de cloridrato de quetamina e cloridrato de xilazina nas doses de 10 mg/kg e 1,2 mg/kg, respectivamente. |Posteriormente foi realizada a coleta, por meio da eletroejaculação, que consistiu na aplicação de um máximo de 4 séries de 10 estímulos elétricos de 16V. Após a sedação, procedeu-se a coleta de urina e lavagem da bexiga com solução fisiológica estéril. O sêmen coletado foi analisado quanto ao aspecto físico (cor e odor), volume, concentração e morfologia espermática, além do vigor e da motilidade, que foram utilizados para o cálculo do índice espermático. O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL, resfriado sob uma taxa de 0,55ºC/min por duas horas (uma hora de resfriamento e mais uma hora de equilíbrio) e por fim congelado a uma taxa de 5,8ºC/min. As amostras de sêmen foram descongeladas em banho maria a 37ºC por 30 segundos e avaliadas quanto ao vigor e à motilidade espermática, além dos teste de termorresistência e hiposmótico. O protocolo proposto para coleta de sêmen de puma mantidos em cativeiro mostrou-se eficiente, com a obtenção de amostras livres de contaminação com urina e com uma média total de espermatozóides por ejaculado superior à descrita na literatura para esta espécie. O índice espermático observado nas amostras frescas também foi superior ao descrito na literatura. A média de patologias totais observada foi de 53,88% e apesar da elevada taxa de espermatozóides patológicos, apenas um indivíduo dentre os pumas avaliados mostrou-se teratospérmico. As patologias mais frequentemente observadas foram cauda fortemente dobrada ou enrolada, cauda dobrada ou enrolada e cauda enrolada na cabeça. O protocolo de congelamento e descongelamento empregado mostrou-se satisfatório na criopreservação de sêmen de puma. O índice espermático declinou somente após 40 minutos de incubação a 38ºC em ambos os meios testados (16,25% no meio com 5% de glicerol e 11,25% no meio com 7,5%) e em média de 25 a 29% dos espermatozóides apresentaram integridade na membrana plasmática. Não foram observadas diferenças (p>0,05) entre os parâmetros avaliados após a criopreservação, utilizando as diferentes concentrações de glicerol no meio TRIS- gema de ovo.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1144474 bytes, checksum: 90be17c3551f2f4eb67e6564c42f0527 (MD5) Previous issue date: 2012-03-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to elucidate aspects of asinine behavior from the description of various collections using an artificial vagina and relate this behavior with the seminal parameters. We evaluated also the availability of the formulation of the diluent T2-94 plus dimethylformamide in the protection of sperm cells during cryopreservation of semen from the Pêga breed donkeys; examined the effect of the reintroduction of seminal plasma (SP) after thawing in protection against osmotic stress of that semen, and also the effect of dilution with Botu-Semen ® (BTU), evaluating the effects on parameters of sperm viability assessments by "in vitro", described in Chapter 2. Used in this study were three Pêga donkeys. At first, the samples were taken only for sexual behavior of animals: Number of Flehmen Reflexes (FR), numbers of mounts without erection (MWE) and reaction time (RT), besides the evaluation of fresh semen is not diluted. The results showed that the animals were, on average, FR 3.9, MWE 1.4 and finishing the service about 24.8 min. The mean ejaculate volume was 53 mL. The motility was 77%, and the force of 3.7 ± 0.3. The sperm concentration ranged from 683 to 710 million sperm per mL of semen ejaculated. In morphology, the average was 12% of viable cells in the ejaculate. It was found that the greater the reaction time and the number of mounts without erection, the greater number of ejaculations in the presence of gel. The best adequacy of management to be employed under the conditions of the study, the proportion depends on knowledge about the sexual behavior of animals used. In a second step, semen was collected from those animals intended for freezing, using the diluent T2-94, plus the cryoprotectant dimethyl formamide. On thawing, the samples were diluted SP or BTU and observed for two hours, during the heat resistance test (HRT). Samples were removed for evaluation of frozen-thawed semen, the morphology and hypoosmotic stress test in three treatments (control, SP and BTU). The results showed that the motility was greater in SP treatment (55.9%) compared with the control group (50.6%). The mean of the spermatic was 3.4 with addition of SP and BTU after freezing. The number of cells reactive to supravital test, and the percentage of total defects observed in sperm morphology did not differ between treatments. In hypoosmotic test, the number of reactive cells was higher in treatment with the addition of PS (43.5%). During the HRT, motility was kept higher within 2 hours after thawing with addition of PS or with addition of BTU (25.2 ± 10.6 and 23.4 ± 13.1, respectively). The same occurred with the spermatic in T4 showed that 2.8 ± 0.4 in the treatment with the addition of SP, and 2.4 ± 0.6 with the addition of BTU. The evaluation means 94 + T2-dimethylformamide to asses semen were positive, showing be able to preserve sperm motility after cryopreservation. The reintroduction of SP showed improvement in semen parameters and remained seminal acceptable standard tests "in vitro". / O objetivo do presente estudo foi observar aspectos do comportamento asinino a partir da descrição de várias coletas realizadas com vagina artificial e relacionar esse comportamento com os parâmetros seminais. Avaliou-se, ainda, a eficácia da formulação do diluente T2-94 acrescido de dimetilformamida na proteção das células espermáticas durante a criopreservação do sêmen de jumentos da raça Pêga; analisou-se o efeito da reintrodução do plasma seminal (PS) após o descongelamento na proteção contra o estresse osmótico desse mesmo sêmen; e também o efeito da diluição com Botu-Sêmen® (BTU), avaliando-se os efeitos nos parâmetros de viabilidade espermática mediante as avaliações in vitro , descritas no capítulo 2. Foram utilizados neste estudo três jumentos da raça Pêga. Em um primeiro momento, as coletas foram realizadas somente para observação do comportamento sexual dos animais: Número de Reflexos de Flehmen (RF), Números de montas sem ereção (MSE) e Tempo de reação (TR), além da avaliação do sêmen fresco não diluído. Como resultados, observou-se que os animais faziam, em média, 3,9 RF, 1,4 MSE e finalizavam o serviço em torno de 24,8 min. A média do volume ejaculado foi 53 mL. A motilidade média foi de 77%, e o vigor de 3,7±0,3. A concentração espermática variou de 683 a 710 milhões de espermatozoides por mL de sêmen ejaculado. Na morfologia, a média foi de 12% de células inviáveis no ejaculado. Concluiu-se que, quanto maior o tempo de reação e o número de montas sem ereção, maior a quantidade de ejaculados com a presença de gel. A melhor adequação do manejo a ser empregado, nas condições do estudo, depende proporcionalmente do conhecimento sobre o comportamento sexual dos animais utilizados. Em um segundo momento, sêmen coletado dos referidos animais foi destinado ao congelamento, utilizando-se o diluente T2-94, acrescido do crioprotetor dimetilformamida. No descongelamento, as amostras foram diluídas em PS ou BTU e observadas por duas horas, durante o teste de termorresistência (TTR). Foram retiradas amostras para avaliação, desse sêmen descongelado, da morfologia e para teste de estresse hiposmótico em três tratamentos (controle, com PS e com BTU). Os resultados mostraram que a motilidade foi superior no tratamento com PS (55,9%), quando comparada com o grupo controle (50,6%). Já a média do vigor espermático foi de 3,4 nos tratamentos com adição de PS e de BTU pós-congelamento. O número de células reativas ao teste supravital, e a porcentagem de defeitos totais observados na morfologia espermática, não diferiram entre os tratamentos. No Teste Hiposmótico, o número de células reativas foi superior no tratamento com adição de PS (43,5%). Durante o TTR, a motilidade manteve-se maior até duas horas após o descongelamento nos tratamentos com adição de PS ou com adição de BTU (25,2±10,6 e 23,4±13,1, respectivamente). O mesmo ocorreu com o vigor espermático que no tempo 90 min apresentava 2,8±0,4 no tratamento com adição de PS, e 2,4±0,6 com adição de BTU. A avaliação do meio T2-94 acrescido de dimetilformamida para sêmen de jumentos foi positiva, demonstrando ser capaz de preservar motilidade dos espermatozoides após a criopreservação. A reintrodução do PS mostrou melhora nos parâmetros seminais e manteve um padrão seminal aceitável nos testes in vitro .

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1494903 bytes, checksum: 868284081df988ac35cef0a3dbbd85c9 (MD5) Previous issue date: 2012-07-25 / The present study aimed to evaluate the cooling effects and association of penetrant, non-penetrant cryoprotectors and ascorbic acid on the quality of vitrified bovine preantral follicles (FOPAs). Two experiments were conducted. In experiment I, the morphology of FOPAs after cooling followed by vitrification was studied. Ovaries were collected (n=10) from five crossbred heifers aged of 14 to 16 months. At the laboratory 22 ovarian fragments were taken from the cortical region and distributed as followed: two fragments for fresh control (zero hour) submitted to histological analysis and 20 fragments cooled at 4 ºC for four and 24 hours in TCM-199+HEPES+Antibiotics medium. From the 20 fragments cooled, four were fixed as control 4 and 24 hours (two piece each) and the remaining 16 fragments were distributed in four vitrification treatments for each cooling time, respectively: Treatments V4a and V24a: TCM-199 + dimethyl sulfoxide (DMSO) 1.5M + Ethylene glycol (EG) 1.5M; Treatments V4b and V24b: TCM-199 + DMSO 1.5M + EG 1.5M + sucrose (SUC) 0.5M; Treatments V4c and V24c: TCM-199 + DMSO 1.5M + EG 1.5M + Ascorbic Acid (AA) 0.1 mM/L and treatments V4d and V24d: TCM-199 + DMSO 1.5M + EG 1.5M + SUC 0.5M + AA 0.1mM/L. After being vitrified, fragments were stored in liquid nitrogen for three days. Fragments were then heated in solution of decreasing SUC and fixed for histology. In experiment II, the viability of FOPAs after cooling followed by vitrification by Trypan Blue staining (AT) was studied. Bovine ovaries (n = 10) were collected, fragmented and distributed as described in the first experiment, subsequently submitted to mechanical follicular isolation for analysis of viability. The morphology variable was evaluated by SNK test and viability was analyzed by Chi-square Test at 5% probability or the Fisher Exact Test when the number of repetitions was less than 30 follicles. There was no difference in percentage of morphologically normal follicles between fresh control group and control group cooled for 4 h (99.3% and 96.0% respectively; P>0.05), nevertheless, there was reduction of FOPAs morphological integrity of control cooled for 24 h (86%; P<0.05). After vitrification, there was reduction (P<0.05) of normal morphology in all treatments when compared with cooled control groups. On the other hand, the viability analysis showed that V4c treatment were not significantly different when compared with control 24h treatment and, together V24c treatment, showed higher capacity of morphological preservation of FOPAs than other treatments (P<0.05), indicating that AA can reduce the toxic and osmotic damages caused by cryopreservation procedure. In conclusion, FOPAs included in the ovarian bovine tissue conserve the morphology efficiently when cooled to 4 °C for 4 hours in TCM-199 + HEPES + Antibiotics and, the association of permeable cryoprotectants DMSO and EG with the antioxidant AA improves survival rates and maintain the morphologic integrity during the vitrification. / O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do resfriamento e da associação de crioprotetores penetrantes e não penetrante acrescido de ácido ascórbico na qualidade de folículos pré-antrais (FOPAs) bovinos vitrificados. Para isso, foram realizados dois experimentos. No experimento I, foi estudada a morfologia dos FOPAs após resfriamento seguido de vitrificação. Ovários (n=10) foram coletados de cinco novilhas mestiças de 14 a 16 meses de idade. No laboratório, 22 fragmentos ovarianos foram retirados da região cortical, os quais foram distribuídos: dois para controle fresco (zero hora), sendo imediatamente fixados para análise histológica, e 20 fragmentos resfriados à 4 ºC por quatro e 24 horas em meio TCM-199+HEPES e antibióticos. Dos 20 fragmentos resfriados, quatro foram fixados como controle 4 e 24 horas (dois fragmentos cada) e os 16 restantes foram distribuídos em quatro tratamentos de vitrificação para cada tempo de resfriamento, respectivamente: Tratamentos V4a e V24a: TCM-199 + Etilenoglicol (EG) 1,5M + Dimetilsulfoxido (DMSO) 1,5M; Tratamentos V4b e V24b: TCM-199 + DMSO 1,5M + EG 1,5M + sacarose (SAC) 0,5M; Tratamentos V4c e V24c: TCM-199 + DMSO 1,5M + EG 1,5M + Ácido Ascórbico (AA) 0,1 mM/L e tratamentos V4d e V24d: TCM-199 + DMSO 1,5M + EG 1,5M + SAC 0,5M + AA 0,1mM/L. Após a vitrificação, os fragmentos permaneceram armazenados em Nitrogênio Líquido por três dias, e posteriormente aquecidos em soluções decrescentes de SAC e fixados para histologia clássica. No experimento II, foi estudada a viabilidade dos FOPAs após resfriamento seguido de vitrificação pela coloração Azul de Trypan (AT). Ovários bovinos (n=10) foram coletados, fragmentados e distribuídos nos quatros tratamentos conforme descrito no experimento I, os quais foram posteriormente submetidos ao isolamento folicular mecânico para análise da viabilidade. A variável morfologia foi avaliada pelo Teste SNK e a viabilidade foi analisada pelo teste Qui-quadrado com nível de significância de 5%, ou pelo Teste Exato de Fisher quando o número de repetições foi menor que 30 folículos. Não houve diferença na percentagem de folículos morfologicamente normais entre o grupo controle fresco e o grupo controle 4 h (99,3% e 96,0% respectivamente; P>0,05). Entretanto, houve redução da integridade morfológica dos FOPAs após 24 h de resfriamento (controle 24 h: 86%; P<0,05). Após a vitrificação, houve uma redução da integridade morfológica e viabilidade folicular em todos os tratamentos em relação aos controles resfriados (P<0,05). No entanto, o tratamento V4c manteve a viabilidade folicular semelhante ao controle 24 h (P > 0.05). Este mesmo tratamento (V4c) mostrou maior capacidade de preservação em relação aos demais tratamentos de vitrificação (P<0,05). Em conclusão, FOPAs inclusos no tecido ovariano bovino conservam a morfologia eficientemente quando são resfriados a 4 ºC por até quatro horas em meio TCM-199+HEPES+Antibióticos. Além disso, a associação dos agentes crioprotetores penetrantes DMSO / EG, com o agente antioxidante AA melhora as taxas de sobrevivência e mantêm a integridade morfológica durante a vitrificação.