Les bactéries utilisent un mode de communication appelé quorum sensing pour régulerl’expression des gènes en fonction de la densité de population et contrôler ainsi de façonmulticellulaire des processus tels que la sporulation, la compétence ou la virulence. Chez les bactériesà Gram-positif, le quorum sensing repose principalement sur la production, la sécrétion et la détectionde petits peptides de signalisation.Le projet porte sur l’étude du système quorum sensing: NprR/NprX chez Bacillus cereus, oùNprR est l’effecteur qui reconnait spécifiquement le peptide de signalisation NprX. NprR est uneprotéine bi-fonctionnelle. Seule, elle agit en tant qu’inhibiteur de la sporulation, en complexe avecNprX, elle perd sa fonction initiale au profit d’une activité facteur de transcription impliquée dans lavirulence. NprR appartient à une famille d’effecteurs de quorum sensing appelée RNPP (Rap, NprR,PlcR et PrgX) encore mal caractérisée au niveau structural. Mon projet de thèse a consisté en l’analysestructure-fonction du système NprR/NprX.Pour comprendre la régulation fonctionnelle de NprR par NprX, des études en solution (SECMALSet DLS) ont permis de mettre en évidence un switch moléculaire qui repose sur un changementd’oligomérisation. Ainsi NprX fait basculer NprR d’une conformation Apo dimérique à uneconformation compléxée tétramérique.L’étude structurale par cristallographie a aboutit à la résolution de la structure du complexeNprR/NprX. L’analyse de ce tétramère suggère la reconnaissance de 2 sites distincts sur l’ADN.L’étude structurale par SAXS, a quant à elle, permis de proposer une conformation dimérique de laforme Apo NprR, modèle conforté grâce à une étude par mutagénèse dirigée des résidus d’interface. Ils’agit d’un mode de dimérisation semblable à celui des protéines Rap (membres de la famille RNPP).La caractérisation par ITC de l’interaction NprR/NprX avec différentes formes du peptide,ainsi que l’analyse de la poche de fixation du complexe, ont permis de mieux comprendre la spécificitéd’interaction et de mettre en évidence deux résidus clés de l’effecteur : l’Asn275 essentielle à lafixation du peptide et l’Arg 126 essentielle à l’activation de la fonction facteur de transcription.Ces travaux ont contribué à une meilleure compréhension du système quorum sensingNprR/NprX grâce à l’élucidation du switch moléculaire contrôlé par NprX mais aussi à une meilleureconnaissance de la famille d’effecteurs RNPP. / Bacteria use a communication mode named quorum sensing to regulate gene expression depending on the population density and thus to control processes such as sporulation, competence or virulence in a multicellular manner. In Gram-positive bacteria, the quorum sensing relies mostly on the production, the secretion and the detection of small signaling peptides. The project focuses on the study of the quorum sensing system NprR/NprX in Bacillus cereus, where NprR is the effector, which recognizes specifically the signaling peptide NprX. NprR is a bi-functional protein. In the absence of peptide, it acts as a sporulation inhibitor while in complex with NprX, it acts as transcription factor implicated in virulence. NprR belongs to a family of quorum sensing effectors named RNPP (for the first identified members: Rap, NprR, PlcR and PrgX) still not well characterized at a structural level. My PhD project consisted to perform the structure/function analysis of the NprR/NprX system. To understand the functional regulation of NprR by NprX, I carried out different studies in solution (SEC-MALS and DLS). These results allowed me to highlight a molecular switch based on a changing of the oligomerisation state of the protein. NprX binding switches NprR from an Apo dimeric conformation to a tetrameric complex. The structural study by crystallography led to the resolution of the tetrameric NprR/NprX complex structure. The analysis of this tetramer suggests the recognition of 2 DNA binding sites. The structural study of the dimeric conformation of Apo NprR by SAXS, allowed me to propose a model similar to that of the Rap dimers (members of RNPP family). This model is supported by a directed mutagenesis study of interface residues. The characterization by ITC of the NprR/NprX interaction with different forms of the peptide, as well as the analysis of the binding pocket in the complex, led to a better understanding of the specificity of the interaction. Two key residues of the effector were highlighted: Asn275, essential to peptide binding and Arg126, essential to the activation of the transcription factor function. These results have contributed to a better understanding of the NprR/NprX quorum sensing system thanks to the elucidation of the molecular switch controlled by NprX but also in a better knowledge of the RNPP effectors family.

Les polykétides sont des molécules complexes possédant des rôles thérapeutiques divers (antibiotiques, anticancéreux, immunosuppresseurs, etc..). Ces composés sont synthétisés par les polykétides synthases (PKS) qui présentent donc un intérêt certain. Une stratégie prometteuse et en développement, appelée biologie synthétique, consiste en l’ingénierie protéique des PKS pour produire de nouveaux polykétides. Cependant, un prérequis au succès de cette méthode est la compréhension du fonctionnement des PKS. En effet, les PKS sont des systèmes complexes composés de plusieurs sous-unités. Celles-ci comportent chacune un ou plusieurs modules responsable d’un cycle d’extension du polykétide. Les modules sont composés également de plusieurs domaines assurant chacun un rôle biosynthétique. Il est ainsi nécessaire de comprendre comment s’opère la communication entre domaines au sein d’un module. Pour cela, nous avons étudié le module 5 de la PKS synthétisant la virginiamycine M par une approche combinant la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la modélisation par homologie. Ainsi nous sommes parvenus à caractériser la structure en solution du module 5, mais également à positionner les structures à haute résolution des domaines à l’intérieur de l’enveloppe SAXS. De plus, notre étude de la dynamique du module 5 a montré que les deux domaines acyl carrier protein (ACP) composant le module semblent non-équivalents, et que l’ACP5b doit être doté d’une certaine mobilité afin d’être fonctionnel, ceci dû à la flexibilité du linker reliant les deux ACP. L’interaction entre les sous-unités consécutives est également primordiale pour assurer la fidélité de la synthèse des polykétides. Ces interactions sont assurées, au moins en partie, par des domaines de petite taille appelés « domaine de docking (DD) ». Jusqu’alors, les DD avaient été caractérisés uniquement chez les PKS de type cis-AT. Nous avons caractérisé une nouvelle classe de DD, la première chez les PKS trans-AT. Grâce à une approche pluridisciplinaire, nous avons montré que l’un des DD constitue probablement une protéine intrinsèquement désordonnée (IDP) : son interaction avec le DD partenaire induirait son repliement. Nous avons résolu la structure RMN d’une protéine de fusion entre les deux DD, affichant une nouvelle topologie pour une interaction protéine-protéine. Cette interface de docking a ensuite été replacée dans son contexte modulaire par SAXS. Contrairement aux autres DD qui ne forment qu’une seule interface de docking, ces DD forment deux complexes de docking à l’intersection des deux sous-unités. Nos données SAXS nous avons également permis de proposer un modèle de l’interface créée entre deux sous-unités PKS dans laquelle une chambre réactionnelle est formée, qui pourrait servir à protéger des intermédiaires réactifs de polykétide. Des enzymes post-PKS interviennent suite à la synthèse du polykétide pour maturer ce dernier. Cette étape est d’une importance considérable puisqu’elle confère la structure et l’activité finale du polykétide. Dans ce contexte, nous avons mené une étude structure/fonction de l’enzyme post-PKS catalysant la macrocyclisation de l’antibiotique lankacidine C. Après un phasage par SAD sur la protéine séléniée, nous avons résolu la structure de l’enzyme en complexe avec des analogues de substrats, puis procéder à la conception de mutants pour résoudre la structure de l’enzyme avec son substrat naturel / Polyketides are structurally complex molecules which exhibit diverse therapeutic activities (antibiotic, antitumor, immunosuppressant…). These compounds and the enzymes responsible for their synthesis, the polyketide synthases (PKSs), are thus of significant biomedical interest. An emerging though promising strategy for the generation of novel polyketides is the engineering of the PKS proteins, an approach called synthetic biology. Nevertheless, a fundamental understanding of the mode of operation of the PKS enzymes is directly correlated with the success of this methodology. Indeed, PKSs are molecular-scale assembly lines which are composed of several subunit, each of which includes one or several modules catalyzing a polyketide elongation cycle. The module themselves are composed of several domains each with a specific role in the biosynthesis. It is therefore necessary to understand how the domains within a module communicate with each other. To address this question, we studied module 5 of the PKS responsible for virginiamycin M using an approach combining small angle X-ray scattering (SAXS), nuclear magnetic resonance (NMR) and homology modeling. This strategy allowed us to characterize the solution structure of module 5, but additionally to position high-resolution domain structures inside the SAXS envelopes. We also studied the dynamics of module 5, demonstrating that the two component acyl carrier proteins (ACPs) appear to be non-equivalent, and that the function of ACP5b is likely dependent on the mobility conferred on it by the flexible linker between the two domains. The interaction between the consecutive subunits is also critical to ensuring the fidelity of polyketide synthesis. This communication is assured, at least in part, by small domains called docking domains (DD), which have to date only been characterized from cis-AT PKS. Here, we have identified a new class of DD, the first shown to be present in trans-AT PKSs. Using a multidisciplinary approach, we have demonstrated that the N-terminal DD (VirFG NDD) is likely to be an intrinsically disordered protein (IDP), whose interaction with its partner DD (VirA CDD) induces its folding. We have solved the NMR structure of a fusion protein between the two DD, revealing a new topology for a protein-protein interaction. This docking interface was then placed into its modular context by SAXS. In contrast to the other classes of DD which form a single docking complex, this new type of DD gives rise to two docking interfaces at the intersubunit junction. Finally, our SAXS data have allowed us to propose a model for the complete interface between two PKS subunits in which a reaction chamber is formed, which may allow reactive polyketide intermediates to be protected. Post-PKS enzymes catalyze maturation of the polyketide after its release from the last module of the PKS. This processing is critical as it yields the final structure and activity of the polyketide. In this context, we conducted a structure/function study of the post-PKS enzyme catalyzing the macrocyclisation of the antibiotic lankacidine C. After phasing by SAD using a seleniated protein, we solved the structure of the enzyme in complex with substrate analogues. We then proceeded to site-directed mutagenesis of specific residues, in order to solve the structure of the enzyme in complex with its natural substrate

La plupart de ARN de transfert (tRNA) subissent des modifications post-transcriptionnelle nécessaires à leur fonction. La modification t6A (N6-threonylcarbamoyladenosine) présente en position 37 des ARNt spécifiques des codons ANN, joue un rôle primordial dans la fidélité de la traduction (appariement correct avec le codon AUG initiateur ; prévention des décalages de phase de lecture etc.). La modification t6A est catalysée en deux étapes par les protéines de la famille Sua5 /YrdC (aboutissant à la synthèse d’un intermédiaire TCA : threonylcarbamoyladenylate) puis transfert de l’entité Carbamoylthreonine du TCA sur l’ARNt via les protéines du complexe KEOPS chez les eucaryotes et archae ou des protéines YgjD, YeaZ et YjeE chez les bactéries ou encore de la protéine Qri7 dans les mitochondries de levures. Le complexe KEOPS comprend les 4 sous-unités suivantes : Kae1, Bud32, Cgi121 et Pcc1 auxquelles s’ajoutent une 5ème sous-unité (Gon7) retrouvée uniquement chez la levure. Alors que YgjD est l’homologue bactérien de la protéine Kae1, YeaZ et YjeE n’ont pas d’homologue chez les eucaryotes ni les archées. Jusqu’à présent, les mécanismes catalytiques responsables de la modification t6A restent peu connus.Nous présentons dans cette thèse une série d’études structure-fonction de plusieurs protéines impliquées dans la biosynthèse de la modification t6A : Sua5 de P. Abyssi ; les sous-complexes Bud32-Cgi121 et Gon7-Pcc1 de S. cerevisiae ainsi que le sous-complexe YgjD-YeaZ de E. coli. Les principaux résultats confirment que Sua5/YrdC est l’acteur majeur de la synthèse de l’intermédiaire TCA via son activité pyrophosphatase. Dans la levure, la protéine Gon7, empêche l’homodimérisation de Pcc1 qui ne peut plus induire de dimérisation du complexe entier (alors que c’est le cas chez les archées pour lesquelles Gon7 est absente). La structure du sous-complexe Bud32-Cgi121 de levure fournit des informations essentielles quant à son rôle de Kinase et d’ATPase au sein du complexe KEOPS. Ensemble, ces deux structures Bud32-Cgi121 et Gon7-Pcc1 nous permettent de proposer un modèle pentamérique du complexe KEOPS. Enfin, concernant les protéines bactériennes, nous montrons que l’activité ATPase de YjeE est stimulée par son association au complexe YgjD-YeaZ et que la formation du complexe ternaire YgjD-YeaZ-YjeE a lieu en présence d’ATP. Nous proposons un modèle structural de ce complexe ternaire pouvant expliquer les rôles des protéines YeaZ et YjeE dans la modification t6A.L’ensemble des études structurales abordées dans cette thèse permet donc de mieux comprendre le mécanisme catalytique de la modification t6A essentielle et ubiquitaire dans les 3 royaumes de la vie. / Most tRNAs undergo chemical modifications during their maturation after the transcription. N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) is universally present at position 37 of tRNAs that recognize ANN-codons. tRNA t6A plays an essential role in translational fidelity through enhancing the codon-anticodon interaction. Recently, the tRNA t6A-modifying enzymes have been identified and characterized in bacteria, archaea and yeast. The biosynthesis of tRNA t6A proceeds in two main steps: first, the biosynthesis of an unstable intermediate threonylcarbamoyladenylate (TCA) by Sua5/YrdC family protein, using ATP, L-threonine, bicarbonate as substrates; second, the transfer of threonylcarbamoyl-moiety from TCA onto A37 of cognate tRNAs by a set of other proteins that use Kae1/Qri7/YgjD family proteins as a catalytic component. Though the biosynthesis of tRNA t6A could be accomplished by Sua5 and Qri7 in yeast mitochondria, the t6A biosynthesis in archaea and yeast cytoplasm requires Sua5 and KEOPS protein complex, which consists of Kae1, Bud32, Cgi121, Pcc1 in archaea, and a fifth Gon7 in yeast. In bacteria, it requires YrdC, YgjD, YeaZ and YjeE, of which YeaZ and YjeE are not related to any KEOPS subunits. Presently, the molecular mechanism of Sua5/YrdC in catalyzing the TCA biosynthesis is not well understood; How the KEOPS subunits assembly and cooperatively transfer threonylcarbamoyl-moiety from TCA to tRNA is not known; The contribution of YeaZ and YjeE in t6A biosynthesis in bacteria still remains to be probed.In this study, we report crystal structures of P. abyssi Sua5, S. cerevisiae Gon7/Pcc1 and Bud32/Cgi121 binary complexes, and E. coli YgjD-YeaZ heterodimer. Based on the information revealed by the crystal structures, advanced biochemical characterizations were carried out to validate the hypotheses. We confirm first that Sua5/YrdC is capable of catalyzing the TCA biosynthesis using substrates of ATP, L-threonine, and bicarbonate. The structure of P. abyssi Sua5 in complex with pyrophosphate provides a basis for its ATP-pyrophosphatase activity. Second, the structure of Gon7 reveals that it functions as a structural mimic of Pcc1 and therefore prevents the formation of Pcc1 homodimer, which mediates the formation of a dimer of tetrameric KEOPS from archaea. The structure of Bud32-Cgi121 in complex with ADP provides a basis in support of the dual kinase and ATPase activities of Bud32. We present a structural model of yeast KEOPS that exists as a heteropentamer. Third, we discovered that the weak intrinsic ATPase activity of YjeE is activated by YgjD-YeaZ heterodimer. YgjD, YeaZ and YjeE associate and form a ternary complex that is regulated by both the formation of YgjD-YeaZ heterodimer and the binding of ATP to YjeE. The model of YgjD-YeaZ-YjeE ternary complex provides structural insight into the essential role of YeaZ and YjeE in t6A biosynthesis in bacteria. This work provides structural insights into understanding the biosynthesis of tRNA t6A that is essential and ubiquitous in all three domains of life.

HU est une protéine bactérienne de type histone impliquée dans de nombreuses fonctions biologiques telles que la compaction, la transcription, la réplication et la réparation de l'ADN. Chez E. coli, il existe trois espèces dimériques de HU (HUα2, HUβ2 et HUαβ) ayant des rôles biologiques distincts. La formation de l'hétérodimère repose sur un échange de chaines peptidiques entre les homodimères. Un mécanisme modèle a été proposé par Ramstein et collaborateurs (J.M.B. 331, 101-121 2003) et a servi de point de départ a ce travail. Dans ce modèle, les homodimères transitent d'une conformation native (N2) vers une conformation intermédiaire (I2). Les homodimères sous forme I2 s'associent ensuite dans un hétérotetramère transitoire qui se redissocie en formant des hétérodimères. L'objectif principal de ce travail de thèse a été de caractériser chaque étape du mécanisme d'échange du point de vue structural et cinétique. Parmi les principaux résultats de ce travail, deux structures originales, HUβ2 de E. coli et HU de L. lactis, ont été obtenues par diffraction des rayons X et complètent la caractérisation structurale des protéines HU sous leur forme N2. Un modèle de la conformation I2, partiellement désordonnée, a été élaboré à partir des résultats obtenus en RMN et en simulation de dynamique moléculaire. De plus, l'existence de la conformation tétramérique a été mise en évidence en faible concentration par spectrométrie de masse en conditions natives. Des protocoles de production/purification/oxydation ont été mis au point pour l'introduction de ponts disulfure afin de stabiliser la conformation tétramérique en vue de sa caractérisation structurale. L'ensemble des données acquises par ces différentes méthodes biophysiques affine la compréhension du mécanisme d'échange de chaines d'un point de vue structural et cinétique et met en lumière le rôle clef de la conformation I2 dans le contrôle de la composition des dimères de HU. / HU is a histone like protein of bacteria involved in numerous biological functions such as DNA compaction, transcription, replication and repair. In E. coli, three HU dimers types are present (HUα2, HUβ2 et HUαβ) and show distinct biological roles. The heterodimer is formed from homodimers through a peptidic chain exchange. A model of this mechanism has been proposed by Ramstein and coworkers (J.M.B. 331, 101-121 2003) and was used as a starting point for this study. In this model, homodimers undergo a conformationnal change from a native state (N2) toward an intermediate state (I2). Then, I2 homodimers associate to form a transient heterotetramer which then dissociate into heterodimers. The main aim of this work was to characterize the structure and kinetic of each step of this mechanism. Major results of this work include the elucidation of two original crystal structures : HUβ2 from E. coli and HU from L. lactis in N2 states. A model of the partially disordered I2 state has also been proposed for HUβ2 and HUα2, and is consistent with results obtained from both NMR and molecular dynamics experiments. In addition, the existence of a low concentration tetrameric conformation has been evidenced by native mass spectrometry experiments. A protocol of production/purification/oxydation as been developped for the introduction of disulfide bridges in order to stabilize this conformation and characterize its structure. Together, results obtained from these different biophysical means refine our understanding of the chain exchange mechanism at the molecular level and highlight the role of the I2 conformation in controlling HU dimers composition.

Au cours du cycle réplicatif des rétrovirus, l’ADN viral rétro-transcrit est intégré dans l’ADN de la cellule hôte par l’intégrase virale (IN). L’IN possède un rôle clé dans le cycle rétroviral et représente une cible thérapeutique majeure pour le traitement des infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). L’IN est constituée de trois domaines (N-terminal, central et C-terminal) connectés par des boucles flexibles, qui la rendent difficilement cristallisable. Le Dr. C. Ronfort (Equipe Rétrovirus et Intégration Rétrovirale) et le Pr. P. Gouet (Laboratoire de BioCristallographie) collaborent depuis 2002 sur l’IN du Rous Associated Virus type 1 (RAV-1). Mes travaux de thèse s’inscrivent dans le cadre de cette collaboration. Il s’agissait de mener une étude cristallographique et moléculaire du domaine central de l’IN du RAV-1 pour pouvoir, ensuite, modéliser des mutants d’intérêt identifiés par l’équipe du Dr. C. Ronfort. Pour ce faire, le fragment protéique a été surproduit et purifié. Sa structure cristallographique a été résolue à une résolution de 1,8 Å. L’examen de cette structure révèle que le dimère de l’IN du RAV-1 peut s’assembler suivant une nouvelle interface moléculaire stabilisée par trois paires d’hélices α. Cet assemblage se caractérise également par la présence d’un étroit sillon basique à sa surface. Par des expériences in vitro de biochimie et in silico de docking, nous avons montré que ce sillon était susceptible de fixer un brin d’ARN. D’autre part, nos données expérimentales permettent d’expliquer comment les conditions de cristallisation, ainsi que la substitution d’un acide aminé de surface, favorisent la formation soit de ce nouvel arrangement dimérique, soit de l’arrangement dimérique classique. Ainsi, l’ensemble des données obtenues au cours de cette thèse suggère que l’intégrase possède des propriétés structurales modulables, lui permettant d’intervenir dans plusieurs étapes du cycle rétroviral en présence d’ADNdb (intégration) ou d’ARNsb (rétro-transcription et/ou encapsidation du génome ARN viral) / During the replicative cycle of retroviruses, the retrotranscribed viral DNA is integrated into the host chromosome by the viral integrase protein (IN). The integration reaction is essential for the viral life cycle. Therefore, IN is a key target for antiretroviral drug design to treat HIV infection. IN consists of three domains (N-terminal, central and Cterminal) connected by flexible loops, making the enzyme difficult to crystallize. Dr C. Ronfort (Team Retrovirus and Retroviral Integration) and Pr P. Gouet (BioCrystallography Laboratory) collaborate since 2002 in Lyon to study IN from the Rous Associated Virus type 1 (RAV-1). My thesis work lies within this collaboration. Its objective was to perform crystallographic and molecular studies of the central domain of RAV-1 IN and of mutants of interest identified by the team of Dr C. Ronfort. In this aim, the IN fragment has been overexpressed and purified. Its crystal structure has been solved to a resolution of 1.8 Å. The observation of this structure reveals that the RAV-1 IN can exhibit a novel dimeric arrangement with a molecular interface stabilized by three pairs of facing α-helices. This arrangement is also characterized by the presence of a basic narrow groove at its surface. Thanks to biochemical in vitro experiments and in silico docking studies, we have shown that this median groove could allow the binding of a linear singlestranded RNA. Moreover, our experimental data can explain how the crystallization conditions as well as the mutation of a specific residue located at the surface of the enzyme favor either this novel dimeric arrangement or the classical dimeric interface. Therefore, the data obtained during this thesis suggest that IN exhibits modular structural properties, allowing it to operate in several distinct steps of the retroviral cycle in presence of dsDNA (integration) or ssRNA (reverse transcription and/or encapsidation of the retroviral RNA genome)

Le mode d’action des traitements médicaux fait généralement intervenir des interactions entre une (des) molécule(s) et une (des) cible(s) protéique(s) de l’organisme. Au sein de notre équipe, le choix s’est porté vers l’APN, protéine connue depuis les années 2000, pour être impliquée dans les processus d’angiogenèse i.e. la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, et de migration cellulaire. Compte tenu de la pertinence thérapeutique des fonctions de l’APN et de leur validation lors d’études in vivo, la conception de voies de synthèse simples et efficaces menant à l’inhibiteur le plus puissant et sélectif de l’APN est devenu un des objectifs premier du laboratoire : 3 voies de synthèses sont décrites. Par ailleurs, notre laboratoire s’est intéressé à une nouvelle classe de composés comportant un groupement ferrocényle. En effet, les composés organométalliques suscitent un intérêt grandissant dans le développement de thérapies anticancéreuse ou encore les maladies tropicales. Ses possibilités réactionnelles étendues combinées à ses remarquables propriétés électrochimiques donnent lieu à des molécules nouvelles aux propriétés biologiques étonnantes. Ayant développé la molécule la plus puissante vis-à-vis de l’APN, ses impressionnantes propriétés inhibitrices peuvent être exaltées en créant des molécules à activité duale : inhibitrice de l’APN et cytotoxique vis-à-vis des cellules tumorales. La synthèse de ces composés hybrides ainsi que l’évaluation de leurs effets envers deux cibles, l’APN (porcine et d’Escherichia coli) et les cellules HT1080 (cellules de type fibrosarcome exprimant fortement l’APN), sont décrites dans cette thèse. / APN/CD13, a zinc dependent metallo-peptidase ectoenzyme widespread in human tissues is emerging as a new target in cancer therapy. Indeed several studies indicate that APN/CD13 plays an active role in angiogenesis and tumor metastasis. We already prepared a series of (±)-1,4-disubstituted-7-amino-benzocyclohepten-6-ones and discovered the extraordinary inhibitory power of the 1-bromo-4-phenyl derivative (Ki = 60 pM) on mammalian APN/CD13. As recent crystallographic works in collaboration with the Paul Scherrer Institut have revealed that only the (S) enantiomer was efficiently binded to the enzyme active site, we recently developed a new synthetic pathway to prepare this optically pure molecule in benzo-oxepine series. In parallel we prepare analogs equipped with at least one ferrocenyl moiety of potential intrinsic additional cytotoxicity.

Les protéines fluorescentes photocommutables (RSFPs) ont la propriété de passer d’un état fluorescent à un état non-fluorescent en réponse à la lumière. Cette propriété en fait des outils de marquage pour la microscopie de super-résolution (ou nanoscopie). Le mécanisme de photocommutation implique l’isomérisation du chromophore ainsi qu’un changement d’état de protonation de ce dernier. Le mécanisme a été très étudié par différentes approches de spectroscopie et de simulation mais reste encore mal compris, l’ordre séquentiel des évènements est notamment encore débattu. Certains de ces évènements de la photocommutation se déroulent à des échelles de temps très courtes, ce qui rend difficile l’étude structurale par cristallographie des rayons X à l’aide des sources synchrotron actuelles dont la résolution temporelle est encore limitée. Les lasers à électrons libres (XFELs) sont une nouvelle source de rayons X produisant des impulsions suffisamment courtes pour permettre l’étude structurale des intermédiaires précoces ou à courte durée de vie qui se forment ou cours de la photocommutation, et suffisamment brillantes pour permettre la collecte de données cristallographiques sur des cristaux de tailles nano- et micrométrique. L’utilisation de ce nouveau genre d’instrument a permis l’émergence de la cristallographie sérielle, une nouvelle approche de la cristallographie des rayons X. Cette approche a depuis été adaptée aux lignes synchrotrons.Le travail présenté ici se focalise sur l’étude de rsEGFP2, une protéine fluorescente photocommutable de la famille de la GFP. Il y est décrit la mise au point d’un protocole de microcristallisation permettant l’obtention d’échantillons en vue d’une expérience de cristallographie résolue en temps au XFEL. Un mécanisme de photocommutation y est proposé à travers le résultat de deux expériences sur les deux XFELs actuellement opérationnels, à des échelles de temps différentes, dévoilant un chromophore « twisté » à l’état excité ainsi qu’un état cis protoné de ce dernier. La caractérisation structurale des variants de rsEGFP2 par cristallographie d’oscillation « classique » combinée à la découverte fortuite d’une conformation alternée du chromophore dans l’état non-fluorescent, issue d’expérience de cristallographie sérielle, apporte un complément d’explication des propriétés photophysiques de la protéine. / Reversibly switchable fluorescent proteins (RSFPs) are able to reversibly toggle between a fluorescent on-state and a non-fluorescent off-state under visible light irradiation. This property makes them a suitable marker used in super-resolution microscopy (or nanoscopy). The photo-switching mechanism involves isomerisation of the chromophore and a change of its protonation state. This mechanism has been well studied but remains poorly understood. The structural nature and the sequential order of atomistic events are still under debate. Some of them take place on the ultra-fast time scale and make structural investigation by X-ray crystallography impossible using current synchrotron radiation sources whose temporal resolution they offer is limited. X-ray free electron lasers (XFELs) are a new kind of X-ray source producing femtosecond pulses that allow structural investigation of ultra-fast intermediates during photoswitching. They are also so bright that crystallographic data collection from micro- and nanometer-sized crystals became possible. The bright and short XFEL pulses required a new methodology to be developed, the so-called serial crystallography methodology. This method is now being adapted to synchrotron radiation facilities.Here is presented a time-resolved crystallography study of the reversibly switchable green fluorescent protein 2 (rsEGFP2). A microcrystallization protocol is described allowing the preparation of suitable samples in large amounts for time-resolved serial crystallography experiments. A photoswitching mechanism of rsEGFP2 is proposed based on crystallographic results obtained from data collected at the two XFEL facilities currently fully operational, i.e. the LCLS in the USA and SACLA in Japan. In particular, the structure of two photoswitching intermediates have been determined, one featuring a twisted chromophore in the excited state and the other displaying a protonated cis isomer of the chromophore in the ground state. The structural characterization of rsEGFP2 variants by traditional oscillation crystallography combined with the serendipitous discovery of an alternate chromophore conformation in the off-state during an XFEL experiment provided unique insight into the photophysical behavior of the protein.

Les phosphoinositides sont des molécules régulatrices présentes à l'interface membrane-cytosol, impliquées dans la transduction du signal, le trafic membranaire ainsi que l'organisation du cytosquelette. Ces lipides recrutent non seulement diverses protéines vers des compartiments spécifiques, mais régulent aussi leur activité enzymatique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ils interagissent directement avec le domaine RhoGAP de la protéine Rgd1, identifiée comme un activateur commun aux GTPases Rho3 et Rho4. Ces 2 protéines, respectivement impliquées dans la croissance polarisée et la cytocinèse, voient leur activité GTPasique exacerbée en présence de Rgd1pet des PIPs. L'objectif de cette thèse était comprendre à l'échelle moléculaire le processus unique d'activation de RhoGAP par les PIPs. Pour ce faire, nous avons réalisé l'étude structurale de RhoGAP par cristallographie couplée à la RMN en solution. Nos résultats montrent que le domaine possède les éléments essentiels à l'activation des protéines Rho. L'interaction avec les PIPs a été suivie par RMN en présence de PI(4)P et de PI(4,5)P2, respectivement localisés dans les vésicules de sécrétion et à la membrane plasmique. Nos résultats révèlent un site de liaison commun aux PIPs dans une région non conservée chez les domaines RhoGAP. L'affinité des complexes, de l'ordre de la centaine de micromolaires suggèrent qu'in vivo l'interaction soit transitoire et réversible avec les PIPs. La sélectivité de l'interaction se ferait donc de façon spatio-temporelle, au niveau des vésicules de sécrétion pour la croissance polarisée et de la membrane plasmique pour la cytocinèse. / Phosphoinositides act as regulatory and signalling molecules at the membrane-cytosol interface in signal transduction, membrane traffic and cytoskeleton organization. These lipids recruit several proteins to specific compartments, but also regulate their activity. In the yeast Saccharomycescerevisiae, they directly bind the Rgd1-RhoGAP domain, that stimulates the GTPase activity of bothRho3p and Rho4p. The GTPase activity of these two Rho proteins, respectively involved in the polarized growth and cytokinesis of the yeast, is enhanced with the presence of Rgd1p and PIPs. The main objective of this thesis is to understand the PIP-RhoGAP interaction at the molecular level. In order to do that, we coupled X-ray structure determination to solution NMR spectroscopy on the isolated RhoGAP domain. Our results show that the domain contains the conserved elements that would usually confer the catalytic GTPase activation. We us e liquid-state NMR spectroscopy to follow the interaction with PI(4)P and PI(4,5)P2, respectively found in secretion vesicles and the plasma membrane. Our study reveals a common binding site for both PIPs in a non-conserved region in the RhoGAP domain family. We measured sub-millimolar binding affinity for PIPs. Such moderate binding affinities are consistent with the biological requirement for reversible complex formation. The selectivity of the interaction could be made in a spatio temporal way, on the secretion vesicles during polarized growth and at the plasma membrane during cytokinesis.

Environ 40 pour cent du protéome humain est composé d'importantes régions dépliées. Ces protéines intrinsèquement désordonnées (PID) n'adoptent pas de structures secondaires et tertiaires stables mais échantillonnent un vaste paysage conformationnel. Malgré cela, elles sont aujourd'hui connues pour intervenir dans de nombreux processus biologiques ou pathologiques. À l'instar des eucaryotes, les virus -- surtout les virus à ARN -- ont eux aussi recours aux propriétés particulières des PID pour effectuer les interactions nécessaires à leur réplication. Les paramyxovirus, comme le virus de la rougeole, sont des virus à ARN simple brin de polarité négative et environ 10 pour cent de leur génome de 15 à 18 kilobases code pour des régions dépliées. Cette thèse détaille l'étude de deux protéines virales directement impliquées dans la réplication, la nucléoprotéine et la phosphoprotéine. Elles interagissent l'une avec l'autre et sont composées à la fois de régions dépliées et repliées. Des données à résolution atomique ont été obtenues en spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) en ce qui concerne les parties désordonnées, et en cristallographie pour ce qui est des parties repliées. Les résultats apportent un nouvel aperçu du rôle du désordre conformationnel dans la transcription et la réplication des paramyxovirus. / About 40 percent of the human proteome contains large disordered regions. These intrinsically disordered proteins (IDPs) do not adopt stable secondary and tertiary structures, but sample a large conformational space. In spite of that, they are now known to be involved in many physiological as well as pathological processes. Following the example of eukaryotes, viruses -- especially RNA viruses -- benefit from the particular features of IDPs in their replication machinery. Paramyxoviruses, that includes Measles virus, are single stranded, negative sense RNA viruses and about 10 percent of their 15 to 18 kilobase RNA genome is known to encode for disordered regions. This thesis focuses on the study of two different proteins of paramyxoviruses, namely the nucleoprotein and the phosphoprotein that are directly involved in the replication of the viral genome. They interact with each other and are composed of folded and disordered domains. Atomic resolution information is obtained about the structure and dynamics of these proteins using a combination of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy measurements for the disordered parts and X-ray crystallography for the folded domains. The results provide novel insight into the role of conformational disorder in transcription and replication of paramyxoviruses.

Le travail retranscrit dans cette thèse regroupe l'étude de différents processus biologiques impliquant les ARN de transfert. Premièrement, dans le cadre de l'étude du rôle de la protéine de nucléocapside (NC) dans la formation du complexe d'initiation de la transcription inverse du VIH-1, un site de fixation fort et spécifique de la NC a été identifié sur le bras D de l'ARNtLys3 — l'ARNt servant d'amorce à la transcriptase inverse lors de la synthèse du brin d'ADNc(-). Cette fixation permet d'une part la fusion des interactions tertiaires entre les bras T et D de l'ARNtLys3 et pourrait d'autre part être l'un des facteurs déplaçant l'équilibre vers la formation de l'hybride ARNtLys3/ARN viral. L'étude structurale par RMN du complexe NC/bras D s'est heurtée à des problèmes d'échange chimique dans la gamme intermédiaire–rapide de l'échelle de temps spectrale. L'utilisation de séquences de type CPMG–HSQC a permis d'améliorer le rapport signal/bruit des expériences RMN, et particulièrement celui des signaux des résidus de l'interface. Ceci nous a permis d'identifier les résidus de la NC impliqués dans la reconnaissance du bras D. Deuxièmement, la structure de la m1A58 méthyltransférase de T. thermophilus (TrmI) — une enzyme de modification des ARNt — a été résolue par cristallographie et affinée à 1.7 Å. Ceci a permis d'identifier trois résidus potentiellement impliqués dans la catalyse et/ou la reconnaissance du substrat ARNt (D170, Y78 et Y194). La production de variants de TrmI au niveau de ces résidus ainsi que des études d'amarrage moléculaire d'une adénine au site actif ont permis de confirmer cette hypothèse et de proposer un rôle catalytique pour chacun d'eux. Parallèlement, des études par gel natif et par spectrométrie de masse en conditions non dénaturantes ont montré une stoechiométrie 1/2 pour le complexe entre l'enzyme TrmI tétramérique et le substrat ARNt. Troisièmement, la résolution de la structure cristallographique de l'ARNtfMet initiateur d'E. coli a révélé une conformation unique de la région de l'anticodon. Cette conformation unique est associée au paires GC de la tige anticodon, caractéristiques des ARNt initiateurs. Cette conformation particulière — dans laquelle la base A37 ne vient pas s'empiler entre les bases 36 et 38, comme dans tous les ARNt élongateurs — permet de mettre en lumière de nombreux résultats biochimiques de la littérature et suggère un mécanisme par lequel la machinerie de l'initiation de la traduction pourrait discriminer l'ARNt initiateur de tous les ARNt cellulaires.