Le ribosome est une machinerie cellulaire importante impliquée dans la synthèse protéique de toute cellule vivante. Par conséquent, le ribosome est l'une des principales cibles des antibiotiques naturels, qui sont capables de tuer les cellules bactériennes en bloquant la synthèse protéique. Toutefois, certaines bactéries sont résistantes à ces antibiotiques en raison de petites modifications au niveau de leurs ribosomes. Entre autres, Staphylococcus aureus (S. aureus) est un agent pathogène responsable de nombreuses infections graves chez l’Homme. Les structures cristallines d'antibiotiques en complexe avec des ribosomes de bactéries non-résistantes, non-pathogènes, Gram négatives ont fourni un aperçu sans précédent des mécanismes d'action de ces antibiotiques. Cependant, aucune structure de ribosome de bactéries pathogènes, hautement résistantes, Gram positives telles que S. aureus n’a encore été identifiée.Dans cette étude, nous présentons la première structure de ribosome de S. aureus à haute résolution (3.9 Å) résolue par cryo-microscopie électronique (cryo-ME). Nous mettons en évidence plusieurs caractéristiques de l'organisation des ribosomes spécifiques des bactéries Gram-positives. Nous décrivons également le protocole de purification et de cristallisation du ribosome de S. aureus pour de futures études de cryo-ME et de cristallographie aux rayons X.Tous les résultats obtenus dans ces travaux, faciliteront la description à l’échelle atomique du ribosome de S. aureus et ses complexes fonctionnels’ ’dans un futur proche. La combinaison des méthodes de cristallographie aux rayons X et de cryo-ME aidera à atteindre cet objectif. Les résultats obtenus serviront de base pour le développement de nouveaux composés contre la bactérie pathogène et extrêmement résistante qu’est S. aureus. / The ribosome is a large cellular machinery that performs the protein synthesis in every living cell. Therefore, the ribosome is one of the major targets of naturally produced antibiotics, which can kill bacterial cells by blocking protein synthesis. However, some bacteria are resistant to these antibiotics due to small modifications of their ribosomes. Among them, Staphylococcus aureus (S. aureus) is a severe pathogen that causes numerous infections in humans. The crystal structures of complexes of antibiotics with ribosomes from Gram-negative non-pathogenic non-resistant bacteria have provided unparalleled insight into mechanisms of antibiotics action. However, the structure of the ribosome from Gram-positive pathogenic and highly resistant bacteria such as S. aureus was still unidentified.In this study we present the first high resolution structure of the ribosome from S. aureus solved at 3.9 Å by cryo-electron microscopy (cryo-EM). We demonstrate several features of the ribosome organization which are unique for Gram-positive bacteria. We also describe the protocol of purification and crystallization of S. aureus ribosome for future cryo-EM and X-ray crystallography studies.All the results obtained in this work will help to describe S. aureus ribosome and its functional complexes at the atomic level in the nearest future. The combination of X-ray crystallography and cryo-EM methods will help to achieve this aim. The obtained results will provide a foundation for the development of new compounds against the pathogenic and extremely resistant bacteria S. aureus.

Le recyclage des ARN débute par un étape de déadenylation ou la queue poly (A) est enzymatiquement clivée. La deadenylation est l’étape limitante dans le processus de dégradation des ARN. In vivo la deadenylation s’effectue successivement par les complexes multi-protéiques Pan2-Pan3 et Ccr4-Not. Le complexe Ccr4-not est conservé chez les eucaryotes et considéré comme le complexe prédominant responsable de l’activité de déadenylation dans la cellule. Le complexe est compose de neuf protéines organisées autour de la protéine d’échafaudage Not1. Le complexe comprend quatre modules distincts ; le module de déadenylation, la module Caf40, le module N-terminal et le module C-terminal. Mon mémoire de thèse regroupe les études structurales qui ont contribuées à caractériser les structures des différents modules à la fois chez la levure et chez l’humain / MRNA turnover begins with deadenylation where in the poly(A) tail at the 3’ end of the mRNA is removed. Deadenylation is the rate-limiting step of the decay pathway. In vivo, deadenylation is carried out by two major macromolecular complexes, the Pan2-Pan3 complex and the Ccr4-Not complex. The Ccr4-Not complex is a multi-protein complex that is evolutionarily conserved in all eukaryotes and is considered to be the major deadenylase complex in the cell. In S. cerevisiae, the Ccr4-Not complex is composed of nine subunits and is built around the scaffolding protein Not1. Structurally, the Ccr4-Not complex assembles into four separate modules with distinct domains of Not1 acting as a scaffold for individual modules. The four modules include the N-terminal module, the deadenylase module, the Caf40 module and the C-terminal module. With the exception of the C-terminal module, the architecture and biochemical role of all other modules of the yeast Ccr4-Not complex has been characterized. My doctoral thesis is focused on the elucidation of the architecture of the human of the yeast Ccr4-Not complex

Durant la réplication du chromosome bactérien, le désappariement du double brin d'ADN est réalisé par l'hélicase hexamérique DnaB. Chez Escherichia coli, le positionnement de l'hexamère de DnaB sur l'ADN simple brin dans le sens 5'-3'est permis par le facteur de chargement. La primase DnaG interagit ensuite avec l'hélicase pour former le primosome. Chez Helicobacter pylori, aucun facteur de chargement n'a été identifié, ce qui est également le cas pour la majorité des espèces bactériennes. De plus, DnaB d'H. pylori (HpDnaB) peut complémenter des souches mutantes d'E.coli DnaBts et DnaCts suggérant que HpDnaB peut jouer le rôle des deux protéines. Pour mieux comprendre le mode d'action de HpDnaB, nous avons résolu sa structure cristallographique à une résolution de 6.7 Å. Celle-ci révèle que la protéine s'assemble en dodécamère, formé par deux hexamères interagissant par leurs domaines N-terminaux (NTD). Nos expériences en diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) montrent que le dodécamère de HpDnaB adopte une conformation modifiée et dynamique en solution. Nous avons ensuite étudié la structure de HpDnaB après interaction avec HpDnaGHBD et/ou l'ADN simple brin par chromatographie d'exclusion stérique couplée à la diffusion de la lumière multi-angles (SEC-MALS) et par SAXS. Ces expériences suggèrent qu'après interaction avec HpDnaGHBD, le double hexamère est dissocié en simples hexamères formant un complexe avec HpDnaGHBD. De plus, HpDnaB forme des hexamères avec l'ADN simple brin en présence d'AMP-PNP. L'ensemble de nos résultats suggère que la formation du primosome d'H. pylori conduit à la dissociation du dodécamère en deux complexes HpDnaB6•HpDnaG3 / During bacterial chromosomal replication, unwinding of double stranded DNA is performed by the hexameric helicase DnaB. In Escherichia coli, the positioning of DnaB hexamers onto replication forks in the 5’to 3’ direction is dedicated by helicase loader. DnaB then interacts with the DnaG primase helicase binding domain (DnaGHBD) to form the primosome. Helicobacter pylori does not encode for a DnaC homologue, which is also the case of most bacterial species. Moreover, H. pylori DnaB (HpDnaB) could complement two temperature–sensitive mutants of E. coli dnaBts and dnaCts, suggesting that the HpDnaB was able to bypass DnaC in these cells. To gain insights into HpDnaB mode of activation, we have solved the crystal structure of HpDnaB at 6.7Å resolution. The structure reveals a novel dodecameric organisation where HpDnaB assembles as planar stack-twisted double hexamers via N-terminal domain (NTD)-rings interactions. Small angle X-ray scattering analysis (SAXS) demonstrates that HpDnaB adopts a modified and dynamic structure in solution but maintains dodecameric architecture. We have then investigated the structure of HpDnaB upon interaction with HpDnaGHBD and/or ssDNA using size exclusion chromatography coupled to multiangle light scattering and SAXS. These experiments show that upon interaction with HpDnaGHBD, HpDnaB double hexamer dissociates into single hexamers to form a complex with HpDnaGHBD. Moreover, we found that HpDnaB also forms hexamers in complex with ssDNA in the presence of AMP-PNP. Collectively, these data suggest that primosome assembly in H. pylori results in the dissociation of the double hexamer into two HpDnaB6•HpDnaG3 sister primosomes

Dans ce travail, nous nous sommes principalement intéressé à la description et à la rationalisation de certaines propriétés des complexes de coordination, par des approches mixtes expérience/théorie. La première de ces études, purement théorique, revisite les propriétés de coordination des ligands par des méthodes de type DFT conceptuelle. Dans un premier temps, les ligands seuls sont étudiés, puis les résultats de cette première approche sont utilisés pour caractériser et rationaliser les effets trans dans les complexes octaédriques. La deuxième étude ci-présentée concerne la synthèse et la caractérisation de complexes polynucléaires de Cu(II) et de ligands de type base de Schiff dérivés d'acides aminés. Dans un premier temps, la réactivité de ces complexes en solution est rationalisée par des mesures spectroscopiques et des calculs de type DFT. Puis, les propriétés magnétiques de deux complexes trinucléaires sont présentées et analysées grâce au support de calculs ab initio de haut niveau. Enfin, dans la troisième étude nous nous intéressons à des complexes mononucléaires d'ion lanthanides présentant une dynamique lente de l'aimantation à basse température. Des mesures magnétiques, mais aussi de luminescence et de diffraction de neutrons polarisés, combinées à des calculs de type SA-CASSCF/RASSI-SO permettent de rationaliser les propriétés magnétiques ainsi observées / In this work, we focused on the description and rationalisation of certain properties of coordination complexes through the use of joint experiment/theory approaches. The first study is purely theoretical, and revisits the coordination properties of ligands using conceptual DFT methods. In a first time, ligands alone are studied, and the results of this study are then employed to characterise and rationaliser the trans effects in octahedral complexes. The second study deals with the syntheses and characterisation of polynuclear Cu(II) complexes deriving from amino-acid based Schiff base-like ligands. In a first time, the reactivity of these complexes in solution is rationalised through the use of spectroscopies and DFT calculations. Then, the magnetic properties of two trinuclear complexes are presented and analysed thanks to high level ab initio calculations. Finally, in the third study we focus on mononuclear lanthanide-based complexes presenting a slow dynamics of magnetisation at low temperature. Magnetic measurements, as well as luminescence and polarised neutron diffraction experiments, combined to SA-CASSCF/RASSI-SO calculation allow the rationalisation of the observed magnetic properties

La cristallographie aux rayons X permet la détermination des structures tridimensionnelles de macromolécules biologiques ainsi que de leurs complexes à haute résolution. Cependant, la cristallisation des protéines est un phénomène totalement aléatoire et peu de cristaux sont généralement produits, de plus leur qualité et résistance sont souvent insuffisantes. Ces travaux visent à présenter les différentes étapes pour résoudre des structures de protéines ainsi que deux développements innovants pour formuler des solutions de criblage pour la cristallisation (appelés Pi et MORPHEUS). / X-ray crystallography enables the structure determination of biological macromolecules, their complexes and assemblies to high-resolution. Nevertheless, protein crystallisation is a stochastic process and the yield of crystals is typically very poor. In addition, crystal properties are often deceiving. Herein, we introduce the basic principles of protein structure determination process and we will discuss two innovative developments of screen formulation (called Pi and MORPHEUS).

Les mécanismes de reconnaissance moléculaire sont à la base de nombreuses fonction biologiques essentielles (transduction du signal, régulation de l’expression génique, stimulation du système immunitaire,...). La compréhension des phénomènes physiques et chimiques à la base de ces phénomènes est fondamentale pour de nombreuses applications telles que la conception de médicaments, le développement d’outils diagnostiques ou tout autre procédé biotechnologique. Dans cette étude, nous avons étudié de manière extensive l’interaction entre la métalloélastase du macrophage (MMP-12) et le RXP470.1, un inhibiteur puissant et sélectif. En combinant des approches de cristallographie, de microcalorimétrie (ITC) et des tests enzymatiques, nous avons pu quantifier l’importance énergétique du transfert d’un seul proton suite à la liaison du RXP470.1, et mettre en lumière l’importance des contributions entropiques. Ainsi, la protonation du Glu219, un résidu catalytique, permet de compenser une enthalpie de liaison intrinsèque défavorable. Cette protonation est rendue possible par le large shift de pKa que subit le Glu219 en réponse à la liaison du RXP470.1 (pKalibre = 5.7 ± 0.1 / pKalié = 10 ± 0.04). Enfin, cette étude est la première, à notre connaissance, ayant combiné données d’affinité, thermodynamiques et structurales pour aborder le rôle du groupe chélatant. Nous avons ainsi étudié deux analogues du RXP470.1 variant seulement par la nature de leur pince à zinc. Ces modifications se traduisent par un effet marqué sur les profils d’affinité et de sélectivité ainsi que sur la signature énergétique des composés étudiés. L’étude des facteurs B, associés à l’analyse des structures cristallographiques, de ces inhibiteurs en complexe avec la MMP-12, suggère que des différences mineures de structures peuvent engendrer des variations de mobilité importantes au niveau des résidus impliqués dans l’interaction inhibiteur - enzyme. Ces différences trouvent leur origine dans un positionnement très légèrement différent du groupe chélatant par rapport au zinc.Pris dans leur ensemble, ces résultats pointent la nécessité de combiner un ensemble d’approches expérimentales pour décrire la complexité des interactions protéine/ligand. Ces associations doivent permettre d’évaluer le potentiel de méthodes théoriques capables de décrire des systèmes complexes. / Protein-ligand recognition mechanisms are essential to many fundamental biological functions such as signal transduction, gene regulation or stimulation of the immune system. Understanding the physical and chemical phenomenon upon protein-ligand binding is essential for many practical applications such as drug design, ligand based diagnostic tools and any other study based on biotechnology. In this study, we extensively explored the interaction between human macrophage metallo elastase MMP-12 and RXP470.1, a potent and selective inhibitor. By combining high resolution X-ray crystallography, FRET based enzyme assays and Isothermal Titration Calorimetry, we were able to highlight the importance of entropic contributions and to quantify the importance of a single proton transfer upon RXP470.1 binding. We show, here, how the protonation of Glu219 upon RXP470.1 binding rescues an otherwise unfavourable binding enthalpy. This protonation is made possible by the large pKa shift Glu219 undergoes as RXP470 enters MMP12h To our knowledge, this study is also the first to address the zinc binding group effect from affinity, thermodynamlc and structural data. We tested two RXP470 analogues, which only differ by their zinc-binding group. We show that this, apparently minor, change has great consequences regarding their affinity profiles and thermodynamic signatures. In addition, the analysis of the b factors, associated to the X-ray structures of these compounds in complex with MMP-12, suggests that small modifications of the zinc binding group might imply important mobility variations of the residues involved in the protein-ligand interaction. These modifications are initiated by a small shift of the zinc binding groups positioning in the active site.Taken together, these results point toward the necessity to combine several experimental approaches to describe the complexity of protein-ligand interactions. These associations should allow the evaluation of new theoretical methods able to describe complex systems.

Les bactéries utilisent la communication intercellulaire pour se coordonner afin de réguler des processus bactériens majeurs comme la virulence, la sporulation, la compétence ou la formation de biofilms en fonction de la densité cellulaire. Ce processus repose sur la sécrétion de petites molécules signal appelées phéromones. Chez les bactéries à gram positif, ces phéromones sont de petits peptides qui peuvent être, soit reconnus au niveau de la membrane externe par des systèmes à deux composants dits systèmes indirects, soit être re-internalisés afin de se fixer directement sur un régulateur transcriptionnel cytoplasmique. Dans la recherche de nouveaux agents antimicrobiens, le potentiel thérapeutique d’inhibiteurs ciblant les systèmes de communication intercellulaire est bien étudié chez les bactéries à gram négatif qui utilisent des homosérine lactones comme phéromones. Quelques études s’intéressent aux systèmes indirects de bactéries pathogènes à gram positif mais le potentiel des systèmes directs, plus récemment identifiés, n’a pas encore été explorés.Les récepteurs cytoplasmiques directement régulés par des peptides signal re-internalisés forment la famille des RNPP. Ces récepteurs sont caractérisés par un domaine de fixation du peptide composé d’une répétition de motifs en hélice  appelés TetratricoPeptide Repeats (TPR). La plupart de ces récepteurs sont des régulateurs transcriptionnels contenant un domaine N-terminal de fixation de l’ADN de type Hélice-Tour-Hélice (HTH). Les études précédentes ont montré que, malgré une structure conservée, les modes de régulation des différents membres de la famille RNPP suivent des mécanismes moléculaires distincts. L’un de ces systèmes directs le mieux caractérisé est le système ComRS qui régule la compétence chez les streptocoques. La compétence permet aux bactéries d’internaliser des fragments d’ADN exogènes pour l’acquisition de nouveaux phénotypes tels que la résistance aux antibiotiques ou la virulence. Dans le groupe salivarius, il a été montré que les récepteurs ComR de deux espèces très proches, S. thermophilus et S. vestibularis, ne sont pas capables de coordonner leur état de compétence par échange de leurs peptides ComS respectifs.L'objectif de ma thèse a été d'étudier les déterminants structuraux de la spécificité du système ComRS. J’ai produit, purifié et cristallisé le récepteur ComR de S. vestibularis afin d’en déterminer la structure cristalline, seul et en présence de son peptide signal ComS. La comparaison de ces structures avec celles précédemment résolues chez S. thermophilus, conjointement à une étude fonctionnelle par mutagénèse dirigée réalisée chez nos collaborateurs (P. Hols, UCLouvain, Belgique), a permis d’aller plus loin dans la compréhension du mécanisme de régulation de ComR mais aussi d’identifier les résidus responsables de la spécificité du système ComRS. En parallèle, j’ai également initié la caractérisation structurale de deux paralogues de ComR chez S. salivarius, ScuR et SarF, qui ne sont pas activés par ComS et ne reconnaissent pas les mêmes cibles ADN que ComR malgré des séquences très conservées. Une analyse par SEC-MALS et SAXS m’a permis de montrer que ScuR semble suivre un mécanisme similaire à celui de ComR alors que SarF se comporte différemment en solution. J’ai proposé un modèle par homologie pour ScuR et cristallisé SarF. La résolution de sa structure est en cours. Cette étude permet donc de mieux comprendre la régulation de la compétence chez les streptocoques et ouvre la voie à d’éventuelles applications biotechnologiques ou biomédicales. / Bacteria use intercellular communication to coordinate and regulate major bacterial processes such as virulence, sporulation, competence or biofilm formation, as a function of cell density. This process relies on the secretion of small signal molecules called pheromones. In gram-positive bacteria, these pheromones are small peptides that can be either recognized at the outer membrane by two-component systems called indirect systems, or can be re-internalized to directly interact with a cytoplasmic transcriptional regulator. In the search for new antimicrobial agents, the therapeutic potential of inhibitors targeting intercellular communication systems is well studied in gram-negative bacteria that use homoserine lactones as pheromones. Some studies focus on the indirect systems of gram-positive pathogenic bacteria, but the potential of the more recently identified direct systems has not yet been explored.The cytoplasmic receptors directly regulated by re-internalized signal peptides form the RNPP family. These receptors are characterized by a peptide binding domain consisting of repeats of  helical motifs called TetratricoPeptide Repeats (TPR). Most of these receptors are transcriptional regulators containing an N-terminal DNA binding domain of the helix-turn-helix (HTH) type. Previous studies have shown that, despite a conserved structure, the modes of regulation of the different members of the RNPP family follow distinct molecular mechanisms. One of the best characterized direct systems is the ComRS system that regulates competence in streptococci. Competence allows bacteria to internalize exogenous DNA fragments for the acquisition of new phenotypes such as antibiotic resistance or virulence. In the salivarius group, it has been shown that the ComR receptors of two closely related species, S. thermophilus and S. vestibularis, are not able to coordinate their state of competence by exchange of their respective ComS peptides.The aim of my thesis was to study the structural determinants of the specificity of the ComRS system. I produced, purified and crystallized the ComR receptor from S. vestibularis in order to determine its crystal structure, alone and in the presence of its ComS signal peptide. The comparison of these structures with those previously solved with ComR from S. thermophilus, together with a functional study by directed mutagenesis performed by our collaborators (P. Hols, UCLouvain, Belgium), allowed us to go further in the understanding of the regulatory mechanism of ComR but also to identify residues responsible for the specificity of the ComRS system. In parallel, I also initiated the structural characterization of two ComR paralogs from S. salivarius, ScuR and SarF, which are not activated by ComS and do not recognize the same DNA targets as ComR despite highly conserved sequences. SEC-MALS and SAXS analyses allowed me to show that ScuR seems to follow a mechanism similar to that of ComR whereas SarF behaves differently in solution. I proposed a homology model for ScuR and crystallized SarF. The resolution of its structure is in progress. This study therefore provides a better understanding of the regulation of competence in streptococci and opens the way to potential biotechnological or biomedical applications.

La chromatine chez les eucaryotes, porte des informations génétiques et épigénétiques. Les mécanismes garantissant le maintien de ces informations lors de la division cellulaire ou la réparation de l’ADN sont encore mal connus et ils constituent l’enjeu principal du projet de thèse. Plus particulièrement, l’objectif du projet de thèse est de chercher à comprendre comment les chaperons d’histones coordonnent leur action avec des partenaires associés à la fourche de réplication pour conserver les marques épigénétiques portées par les histones parentales et les reporter sur les histones nouvellement synthétisées. Cette thèse décrit précisément comment ASF1 (Anti Silencing Function 1) coopère avec le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et la sous-unité de l’hélicase réplicative MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), pour la prise en charge des H3-H4 dans la réplication et la réparation de l’ADN.La thèse s’intéresse également à la régulation de l’activité de ces chaperons d’histones par des kinases activées suite à des stress réplicatifs ou des dommages de l’ADN. En particulier nous avons cherché à mieux comprendre comment l’ajout de groupements phosphate sur ASF1 par une enzyme appelée TLK (Tousled Like Kinase) module son activité au cours du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l’ADN. La caractérisation de l'importance des sites phosphorylés sur les propriétés de liaison du chaperon, permet de mieux comprendre le rôle joué par différent forme d’ASF1 dans l’assemblage des histones sur l’ADN et le maintien des informations épigénétiques. Le travail de thèse contient d’analyses biochimiques et structurales par une combinaison de techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, RMN, cristallographie des rayons X) et d’analyses fonctionnelles sur des modèles cellulaires. / In eukaryotes, chromatin carries both, the genetic and epigenetic information. Mechanisms implicated in maintenance of these information during cell division or DNA repair remain poorly understood and they constitute the main issue of this thesis project. More specifically, the goal of the project is to understand how histone chaperones coordinate their action with partners associated with the replication fork to recognize and preserve the epigenetic marks carried by parental histones and to copy on the newly synthesized histones. The work unravels how ASF1 (Anti-Silencing Function 1) cooperates with the CAF-1 complex (Chromatin Assembly Factor 1) and with the replicative helicase subunit MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), for the management of H3-H4 histones in DNA replication and repair.Moreover, this thesis investigates the regulation of histone chaperones activities by kinases activated after a replicative stress or DNA damage. In particular, we analyzed the consequences of ASF1 phosphorylation by the enzyme called TLK (Tousled like kinase). The activity of TLK is modulated during the cell cycle and after DNA damage. Characterization of the importance of phosphorylated sites on the chaperone binding properties, allows a better understanding of the role played by different forms of ASF1 in the assembly of histones on DNA and maintenance of epigenetic information. The thesis work included biochemical and structural analysis with a combination of different techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, NMR, X-ray crystallography) and functional analysis in cellular models.

Le noyau est un organite caractéristique des cellules eucaryotes et les propriétés mécaniques de ce dernier jouent un rôle essentiel dans le comportement de la cellule, notamment sa motilité, sa polarité et sa survie. Le noyau est entouré par une enveloppe comprenant une membrane interne et une membrane externe, ainsi que de nombreuses protéines. Mes objectifs de thèse étaient de comprendre des mécanismes moléculaires déficients dans deux types de maladies génétiques causées par des mutations dans les lamines: la dystrophie musculaire d’Emery-Dreifuss et les syndromes de type progéroïde.Dans un premier temps, nous avons montré que l’émerine s’auto-associe in vitro et en cellules (Herrada et al. ACS Chem. Biol. 2015). J’ai ensuite étudié la structure des oligomères d’émerine, déterminé le fragment protéique minimal nécessaire à la formation de ces oligomères et décrit l’impact de mutations de l’émerine, causant une dystrophie musculaire d’Emery-Dreifuss, sur son auto-assemblage (Samson et al. Biomol NMR Assign. 2016 ; Samson et al. FEBS J. 2016). Puis, j’ai montré que seule cette forme auto-assemblée de l’émerine est capable d’interagir avec la lamine A et que la phosphorylation de l’émerine par la kinase Src, observée suite à un stress mécanique, régule cette interaction entre l’enveloppe nucléaire et le nucléosquelette.Pour finir, j’ai montré que la forme monomérique de l’émerine est capable de former un complexe ternaire avec BAF et la lamine A. Après avoir mesuré les affinités protéine-protéine au sein de ce complexe, identifié les fragments minimaux des différentes protéines permettant de former ce complexe et mis au point un protocole robuste de purification de ce complexe, j’ai pu obtenir des cristaux de ce complexe dans plusieurs conditions. Par la suite, nous avons pu résoudre la structure de ce complexe par remplacement moléculaire avec une résolution de 2 Å. Enfin, j'ai montré que les mutations dans les lamines de type A provoquant des syndromes de type progéroïde pouvaient altérer l'interaction avec BAF in vitro, et nos collaborateurs, l'équipe du Dr B. Buendia (Paris Diderot), ont montré que ces mêmes mutations induisaient une diminution significative de la proximité entre la lamine A et BAF dans les cellules HeLa. Un article, où je suis premier auteur, vient d’être soumis au journal NSMB. / The nucleus is an organelle characteristic of eukaryotic cells and its mechanical properties play an essential role in the behavior of the cell, in particular its motility, polarity and survival. It is surrounded by an envelope comprising an inner membrane and an outer membrane, as well as a large number of proteins. These proteins are either anchored at the nuclear membrane, as emerin, or form a filament meshwork lining the inner nuclear membrane, as lamins. My thesis objectives were to understand molecular mechanisms deficient in two types of genetic diseases caused by mutations in inner nuclear envelope proteins: Emery-Dreifuss muscular dystrophy, associated to mutations in emerin and A-type lamins, and progeroid syndromes caused by mutations in A-type lamins.First, we showed that the emerin protein self-assembles in vitro and in cells (Herrada, Samson et al., ACS Chem. Biol., 2015). I then studied the structure of emerin oligomers, determined the minimal protein fragment necessary for the formation of these oligomers, identify residues forming the structural core of these oligomers by solid-state NMR in collaboration with the group of Prof A. Lange (FMP Berlin), and described the impact of emerin mutations causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy on emerin self-assembly (Samson et al., Biomol. NMR Assign. 2016, Samson et al., FEBS J. 2017). Then, I observed, mainly using solution-state NMR, that only the self-assembled form of emerin is able to interact with A-type lamin tail, and that mutants causing Emery-Dreifuss muscular dystrophy and unable to self-assemble are also defective in A-type lamin binding. I also obtained preliminary data showing that phosphorylation of emerin by the Src kinase, observed after a mechanical stress in purified nuclei, regulates the interaction between self-assembled emerin and A-type lamins.Finally, I showed that the monomeric form of emerin is able to form a ternary complex with A-type lamin tail through the chromatin-associated protein Barrier-to-Autointegration Factor (BAF). After having measured the protein-protein affinities within this complex, identified the minimal protein fragments involved in the complex and developed a robust protocol for purification of this complex, I was able to obtain crystals under several conditions. Subsequently, I solved the 3D structure of this complex by molecular replacement at a resolution of 2 Å. Finally, I showed that mutations in A-type lamins causing autosomal recessive progeroid syndromes impair interaction with BAF in vitro, and our collaborators at Univ. Paris Diderot, the team of Dr B. Buendia, showed that these same mutations induce a significant decrease in the proximity between lamin A and BAF in HeLa cells. An article with me as a first author is in preparation that reports all these new data.

La lectine de Helix pomatia (HPA), extraite de la glande à albumine de l'escargot de Bourgogne et spécifique du résidu GalNAc, appartient à une nouvelle famille de lectine dite de type H. Elle est utilisée depuis plus de vingt ans comme marqueur d'adénocarcinomes (notamment du sein, du colon, du poumon) à fort pouvoir métastatique et donc faible pronostic vital. Son utilisation comme outil de routine en oncologie est, cependant, fortement limitée par son impossibilité à la produire sous forme recombinante. Afin de contourner ces difficultés, des protéines homologues ont été recherchées chez d'autres invertébrés. Deux lectines de type H ont été identifiées chez l'amibe Dictyostelium discoideum (discoidines) et une chez le corail Sinularia lochmodes (SLL-2). Les discoidines sont composées de deux domaines distincts, un domaine C-terminal, spécifique des résidus galactosylés et homologue à HPA et un domaine N-terminal, dit domaine discoidine, de fonction inconnue. Ces travaux de thèse portent, dans un premier temps, sur la poursuite de la caractérisation structurale de la discoidine 1 puis sur la production du domaine N-terminal de la discoidine 2 afin de confirmer la fonction lectine supposée. Dans un second temps, des expériences de microscopie confocale ont montrés que les discoidines ne possédaient pas la capacité d'HPA dans la discrimination des cellules métastatiques par rapport aux non métastatiques. La construction, par mutagenèse, d'une protéine chimérique entre la discoidine 2, très facilement produite dans E. coli, et HPA a alors été entreprise, le but étant de lui apporter la même spécificité qu'HPA. Enfin, la protéine SSL-2 a été clonée et de nombreux essais d'expression sous forme soluble et de purification ont été réalisés en vue de sa caractérisation biochimique et structurale pour sa possibilité d'utilisation comme marqueurs en histopathologie