La détoxication est un processus biochimique présent chez tous les organismes biologiques et qui leur permet d’assurer leur survie face aux xénobiotiques provenant de leur environnement. Les glutathion transférases (GST) représentent une large famille d’enzymes participant à la phase II de détoxication en conjuguant le glutathion au composé à éliminer. Par ailleurs, certaines GST ont un rôle non catalytique et assurent la séquestration ou le transport de molécules d’un compartiment cellulaire à un autre. Alors que l’activité catalytique des GST est étudiée depuis plusieurs décades, l’identification précise des molécules physiologiques ciblées par les GST reste un défi. Chez les organismes fongiques dégradeurs de bois, certaines classes de GST se sont multipliées au niveau génomique. Cette redondance serait le reflet de la diversité des molécules chimiques libérées lors de la dégradation du bois. Dans cette thèse, des approches biochimiques et structurales ont été employées pour caractériser onze isoformes de GST du basidiomycète Trametes versicolor. De plus, une approche utilisant des librairies de molécules a permis d’identifier une famille de ligands reconnus par ces GST : les polyphénols. Les modes d’interaction de ces ligands ont été décrits précisément à partir de la résolution de nombreuses structures cristallographiques. L’identification d’un flavonoïde à partir d’un extrait de bois de merisier (Prunus avium), arbre sur lequel croît T. versicolor, a été permise par une approche de cristallographie d’affinité. Ces données suggèrent que les GST d’organismes fongiques saprotrophes pourraient prendre en charge les polyphénols libérés lors de la décomposition du bois / The ubiquitous biochemical process that enables each organism to cope with xenobiotics from its environment and thus ensures its survival is called detoxification. Glutathione transferases (GSTs) form a large family of enzymes divided into several classes. These enzymes participate in the detoxification phase II by conjugating the tripeptide glutathione to the molecule to be eliminated. Moreover, some GSTs are involved in non-catalytic processes such as sequestration or transport of molecules from one cellular compartment to another. Studies dedicated to the catalytic activity of GSTs have been ongoing for decades, yet precise identification of molecules targeted by GSTs remains challenging. In wood-decaying organisms, some of the GST classes have expanded with an increase of the number of isoforms encoded at the genomic level. This redundancy would reflect the diversity of the small molecules released upon wood enzymatic degradation. Through this thesis work, biochemical and structural approaches were used in order to characterize eleven GST isoforms from the saprotrophic fungus Trametes versicolor. In addition, the use of libraries of molecules helped in identifying polyphenols as a family of ligands that bind these GSTs. The molecular interaction modes were described precisely based on the resolution of numerous crystal structures. The identification of a flavonoid from an extract of the wild-cherry tree (Prunus avium) on which T. versicolor grows, was enabled by using an affinity crystallography approach. These data suggest that fungal GSTs could interact with plant polyphenols released during wood degradation

Le fer est un élément essentiel à la vie car il possède un rôle clé dans de nombreux processus biologiques.Malgré son abondance au niveau de la croûte terrestre, le fer est très faiblement biodisponible. Pour contourner ce problème, la majorité des micro-organismes a développé différents systèmes particulièrement efficaces pour l’acquisition de cet élément. Le mécanisme le plus répandu implique la production et la sécrétion de petites molécules chélatrices ayant une forte affinité pour le fer. Après sécrétion dans le milieu extracellulaire, ces composés chélatent le Fe3+ et le transportent ensuite au travers de la membrane externe via des transporteurs TonB-dépendants (TBDT). Durant cette thèse, nous avons mis en place un protocoleefficace permettant d’aller rapidement du clonage à la cristallisation de ces cibles afin d’étudier la structure tridimensionnelle de cette famille de protéines. Ainsi, nous avons pu résoudre et étudier la structure de plusieurs TBDT, de bactéries Gram-négatives. Ainsi nous avons mis en évidence un mouvement du domaine de signalisation en présence du ligand, proposé un mécanisme de transporteur de la molécule d’hème par le système shu chez Shigella dysenteriae. Chez les bactéries du genre Pseudomonas, nous avons élucidé et caractérisé au niveau structural les mystères de l’énantiosélectivité des pyochélines. En parallèle, nous nous sommes intéressé au devenir du ferri-sidérophore au niveau du périplasme, chez P. aeruginosa, ainsi qu’au transport du fer au travers de la membrane interne grâce à un transporteur ABC FpvCDEF ayant laparticularité de posséder deux protéines périplasmiques associées capables d’interagir avec le sidérophore. / Iron is essential for life because it has a key role in many biological processes. Despite its abundance in the earth's crust, iron is poorly bioavailable. To circumvent this problem, most micro-organisms have developed different systems particularly effective for the acquisition of this element. The most common mechanism involves the production and secretion of small chelating molecules having high affinity for iron. After secretion into the extracellular medium, these compounds chelate and transport ferric iron through the outer membrane via TonB-dependent transporters (TBDTs). In this thesis, we have developed an efficient protocol to easily go from cloning to crystallization of these targets and then studied the three-dimensional structure of this protein family. Thus, we were able to solve and study the structure of several TBDT of Gram-negative bacteria. We have identified a movement of the signaling domain in the presence of ligand. We proposed a mechanism for heme translocation through the shu system, in Shigella dysenteriae. In Pseudomonas species, we elucidated and characterized at the structural level the mysteries of the pyochelin enantioselectivity. In Pseudomonas aeruginosa, we studied the ferri-siderophore become in the periplasmic space, as well as iron transport across the inner membrane by an ABC transporter, named FpvCDEF, with the particularity of having two periplasmic proteins associated able to interact with the siderophore.

Les ARNnc sont impliqués dans la régulation de l’expression des gènes via divers mécanismes. Ils adoptent des structures 3D composées à 70% de pb WC formant des hélices de types A liées entre elles par des jonctions modulaires ayant des caractéristiques géométriques spécifiques. Nous avons identifié un nouveau motif 3D d’ARN apparenté au kturn, le pk-turn. Le pk-turn, situé dans la RNase P bactérienne permet, comme le k-turn, la formation d’un angle de 60° entre les hélices P16 & P17 avec cependant des exigences de séquences et de structure différentes. Le 2nd ribozyme qui a focalisé mon attention est le LCrz observé dans l’intron siamois (GIR2/LCrz) identifié dans le pré-ARNr 18S de la petite sous unité du ribosome eucaryote du myxomycète D. iridis. LCrz catalyse une réaction de branchement, équivalente à la première étape de l’épissage par les introns de groupe II, dans un contexte structural proche des introns du groupe I. Nous avons résolu la structure cristallographique du LCrz à une résolution de 2.5Å révélant un repliement inattendu. Cette structure a été confirmée par des expériences de SAXS. Ce travail nous permet de souligner la relation entre structure et fonction dans l'évolution des ribozymes. / NcRNA represent most of primary transcripts RNA in higher eukaryotes and tune gene expression via diverse mechanisms. They adopt 3D structures composed at 70% by WC bp forming A-form helices linked by RNA motifs. We identified the pk-turn, a new RNA motif related to k-turns that allow for the formation of a bend of 60° between stems P16 and P17 from the bacterial RNaseP. Yet it features different sequence and structural requirements than k-turns. The 2nd ribozyme which got my attention is the LCrz inserted in GIR2, a group I intron. This twintron is observed in the pre-rRNA 18S of the small subunit of the eukaryoteD. iris. LCrz catalyzes a reaction equivalent to the first step of splicing by group II introns, but in a structural context related to group I introns. We solved the 2.5 Å crystal structure of the LCrz and confirmed the unexpected shape by means of SAXS experiments. This work emphasizes the relationship between structure and function in the evolution of ribozymes.

Les hélicases à ARN de la famille DEAH/RHA sont impliquées dans la plupart des processus essentiels à la vie tels que l'épissage, la biogenèse des ribosomes, la réplication, la transcription ou encore la détection d’ARN viraux. Ces enzymes sont capables de catalyser la dissociation de duplexes d'ARN, la réorganisation de structures secondaires ou de remodeler des complexes ARN-protéines. L'hélicase DEAH/RHA Prp43 présente la particularité d'être bifonctionnelle. Prp43 est impliquée dans l'épissage des Pré-ARNm, où elle assure le recyclage du spliceosome et du lasso, mais aussi dans la biogenèse des ribosomes où elle est impliquée dans la maturation des deux sous-unités. Prp43 est activée et régulée par cinq partenaires protéiques : Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 et GPATCH2. Ces partenaires protéiques présentent tous un domaine G-patch et sont capables de stimuler les activités hélicase et ATPase de Prp43. La structure cristallographique de Prp43 en complexe avec l'ADP a été résolue au laboratoire. Cette structure a mis en évidence un mode de fixation du nucléotide inédit chez les autres hélicases, notamment au niveau de la base qui s'empile entre la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 et l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1. Les déterminants de l'activation de Prp43 par les protéines à domaine G-patch demeurent méconnus. Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer quel était le rôle de l’empilement de la base dans l’activation de Prp43. Nous présentons ici plusieurs structures cristallographiques de Prp43 en complexe avec tous les nucléotides diphosphates(NDP) et les désoxynucléotides triphosphates (dNDP). Ces structures ont permis de conclure qu'il y avait des différences dans l’empilement de la base selon le (d)NDP considéré. Des dosages d'activité NTPase de Prp43 avec et sans son partenaire protéique Pfa1 montrent que lorsque la base ne s'empile pas avec la F357 et la R159, l'activité de l'enzyme n'est pas correctement régulée par son partenaire protéique. Les dosages d’activité enzymatique sur les mutants ponctuels F357A et R159A révèlent que le résidu F357 permet de moduler l’activité de Prp43. Tous ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un modèle de la régulation de Prp43 par les protéines à domaines G-patch et d'expliquer l'importance du mode de fixation de la base à l'enzyme dans cette régulation. / RNA helicases from the DEAH/RHA family are involved in most of essential processes of life such as pre-mRNA splicing, ribosome biogenesis, replication, transcription or viral RNA sensing. These enzymes are able to catalyze RNA unwinding, secondary structures reorganization or RNA-protein complexes remodeling. The DEAH/RHA helicase Prp43 is remarkable because it is bifunctional, as it is involved both in pre-mRNA splicing, where it is responsible of spliceosome and lariat recycling and in the biogenesis of the two ribosomal subunits. Prp43 is activated by five protein partners: Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 and GPATCH2. These protein partners all possess a G-patch domain and are able to stimulate helicase and ATPase activity of Prp43. The structure of Prp43 in complex with ADP has been solved by X-ray crystallography. The structure reveals that the nucleotide is bound to the enzyme in a novel mode that has never been observed in other known helicase structures. The specific feature of this binding mode is the base, stacked between phenylalanine (F357) from RecA2 domain and an arginine (R159) from RecA1 domain. Features of the activation of Prp43 by G-patch proteins are unclear. In this work, we investigated the role of base stacking in the activation of Prp43. We present several structures of Prp43 bound to all the nucleotide diphosphates (NDP) and deoxynucleotide diphosphates (dNTP). These results indicate that there are differences in stacking according to the (d)NDP bound to the enzyme. NTPase activity assays revealed that when stacking is weakened, Prp43 activity cannot be properly regulated by its protein partner Pfa1. Moreover, point mutations F357A and R159A show that stacking of F357 permits to modulate Prp43 activity. All these results allow us to propose a model of NTPase activity activation of Prp43 by G-patch proteins and to highlight the importance of base stacking in this regulation.

Plasmodium falciparum est responsable de la forme la plus grave de paludisme avec plus de 600 000 décès par an. L'absence de vaccin efficace, combinée à l'émergence de résistances aux traitements récurrents, exige le développement de nouvelles molécules. Afin de limiter ces résistances, il est nécessaire de cibler de nouvelles voies métaboliques indispensables à la survie du parasite. Ce travail de thèse repose sur l'étude de deux voies métaboliques essentielles au parasite que sont la voie de recyclage des bases puriques et la voie de biosynthèse des ancres glycosylphosphatidylinositol (GPI).En ce qui concerne la voie de recyclage des bases puriques, la détermination des structures cristallines de l' « IMP specific 5‘-nucleotidase » (PfISN1) associée aux études biochimiques et biophysiques (SAXS, EM, MALS…), a permis de préciser le mécanisme d'action fournissant ainsi une base solide pour la mise au point d'inhibiteurs. Une banque de plus 3000 composés a été criblée par Fluorimétrie à Balayage Différentiel et les effets des molécules sélectionnées seront évalués sur l'enzyme et sur la croissance du parasite en culture.Quatre cibles thérapeutiques potentielles appartenant à la voie de biosynthèse des ancres GPI ont été sélectionnées. L'utilisation de plusieurs systèmes d'expression disponibles au laboratoire (bactérie, levure, acellulaire en germe de blé) ou via des plateformes européennes pour l‘expression en cellules de mammifères HEK293T (Oxford), de cellules BHK21 transfectées avec le virus de la vaccine modifié, T7-MVA, (Strasbourg) ou la plateforme ESPRIT (Grenoble) ont permis de passer outre les difficultés rencontrées pour exprimer les protéines d'intérêt. L'une des quatre cibles, la mannose-1-phosphate guanylyltransférase (PfMPG), a pu être exprimée de manière suffisante quantitativement et qualitativement pour une caractérisation biochimique et structurale. Une analyse par SAXS et cristallographie aux rayons X a été réalisée / Plasmodium falciparum is responsible for the most severe form of malaria with more than 600,000 deaths per year. The lack of an effective vaccine, combined with the emergence of drug resistant parasites, necessitates the development of new drugs. In order to limit these resistances, it is necessary to target new metabolic pathways essential for parasite survival. This thesis work is based on the study of two metabolic pathways essential to the parasite, the purine salvage pathways and the glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor biosynthesis pathway.Concerning the purine salvage pathway, the determination of the crystal structures of the IMP -specific 5'-nucleotidase (PfISN1) associated with biochemical and biophysical studies (SAXS, EM, MALS, etc.) have allowed to propose a reaction mechanism, thereby providing a solid basis for the conception and development of inhibitors. A library of more than 3000 compounds was screened by Differential Scanning Fluorimetry and the selected molecules will be evaluated for their inhibitory effect on the enzyme and on the growth of parasites in culture.Four potential therapeutic targets belonging to the GPI anchor biosynthesis pathway were selected. The use of several in-house available expression systems (bacteria, yeast, and acellular wheat germ) as well as European platforms for the expression in HEK293T mammalian cells (Oxford), in BHK21 cells transfected with the modified vaccinia virus, T7-MVA, (Strasbourg) or the ESPRIT platform (Grenoble) has allowed us to overcome the difficulties encountered on obtaining the selected protein targets. One of the four targets has been expressed in sufficient amount and quality for biochemical- and structural characterization, namely the mannose-1-phosphate guanylyltransferase (PfMPG). SAXS and X-ray crystallography analyses have been carried out

Le développement d’une économie basée sur l’hydrogène implique l’utilisation de catalyseurs efficaces et peu chers. Pour cela on peut s’inspirer de la nature qui a produit des métalloenzymes, les hydrogénases. On considère que la maturation est réalisée en deux étapes. Dans un premier temps, les clusters [4Fe–4S] sont assemblés par les systèmes ISC/SUF. Puis trois maturases, HydE/F/G réalisent la biosynthèse du 2Fe sous-cluster pour synthétiser le cluster-H. Seules quelques hydrogénases à [FeFe] ont été caractérisées montrant une grande diversité alors qu’elles possèdent le même centre catalytique, le cluster-H. Ainsi, une partie de cette thèse a porté sur l’utilisation de la «maturation chimique» pour activer de nouvelles enzymes apo-HydA. L’hydrogénase provenant de Megasphaera elsdenii, et sa version tronquée, MeH-HydA, contenant seulement le domaine du cluster-H ont été étudiées grâce à cette technique. La stratégie mise en œuvre a été la reconstitution des cofacteurs métalliques par l’assemblage des clusters [4Fe–4S] et la maturation des enzymes par le complexe biomimétique [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–. Les hybrides HydF synthétisés en incubant la protéine contenant le cluster [4Fe–4S] avec les complexes biomimétiques [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– possèdent un centre à 6 fers similaire au cluster-H. Cette grande similarité amène au dernier point traité dans cette thèse: la possible activité catalytique d’HydF en tant que «hydrogénase artificielle». Les hybrides de HydF ont été caractérisés et leur activité d’hydrogénase a été évaluée. De plus, une structure RX de la protéine contenant son cluster [4Fe-4S] a été obtenue. / There is a general agreement that the building of a sustainable H2 economy relies on the availability of cheap, abundant and efficient catalysts. Nature has provided attractive solutions, hydrogenases. However, these enzymes are difficult to produce and so far only few HydAs have been completely characterized showing diversity despite the same active site. This core, H-cluster, is composed of a [4Fe–4S] cluster bound via a Cys to a diiron complex which has 3 CO, 2 CN and an azadithiolate ligands. Recently, it has been showed that hydrogenases can be easily produced through the insertion of a biomimetic [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2– complex inside the heterologously produced apo-enzyme, resulting in a full activation. Part of the PhD has been focused on the chemical maturation of new HydA from Megasphaera elsdenii and its truncated version, MeH-HydA, containing only the H-cluster. The assembly of all metal cofactors via the chemical reconstitution of the [Fe–S] clusters and the maturation through the [Fe2(adt)(CO)4(CN)2]2–complex has been carried out. Interestingly, HydF hybrids synthesized incorporating biomimetic [Fe2(xdt)(CO)4(CN)2]2– complexes onto the [4Fe–4S] cluster HydF protein, have a 6Fe core reminiscent of the H-cluster. HydFs from different organisms were purified and subsequently the [4Fe–4S] cluster has been reconstituted. For the first time, an X-ray structure of HydF with its [4Fe-4S] cluster has been obtained. The 6Fe cluster of HydF has been also prepared chemically with diiron complexes mimicking the active site of HydA. The metallo-cofactors have been spectroscopically characterized (EPR, FTIR, HYSCORE), hydrogenase activities evaluated.

Les rétrovirus sont un enjeu de santé publique, aussi bien humaine qu'animale. La compréhension des déterminants structuraux sous-jacents à la fonction de leurs protéines constitue une étape essentielle dans le développement de stratégies antirétrovirales efficaces.Ce manuscrit porte sur l'étude des bases structurales des mécanismes moléculaires impliqués dans les fonctions clés des rétrovirus que sont i) la régulation de l'expression des protéines de rétrovirus complexes et ii) l'assemblage des particules virales, à travers l'étude de deux protéines rétrovirales d'intérêt thérapeutique : la protéine Tax du virus T-lymphotrope humain (HTLV) et la protéine de capside du virus de l'immunodéficience féline (FIV). L'étude structurale de ces deux protéines d'intérêt et la compréhension des mécanismes moléculaires nécessaires à leurs fonctions permettraient d'ouvrir la voie à la conception de nouvelles stratégies antirétrovirales.Malgré de nombreux tests d'expression et de purification, l'étude structurale de la protéine Tax du HTLV n'a pu être réalisée, en raison de son insolubité. Cependant, ce travail doctoral a permis de résoudre, pour la première fois, la structure cristallographique de la protéine de capside entière du FIV. Bien que cette dernière adopte un repliement similaire aux autres capsides rétrovirales dont la structure est connue, elle présente également des spécificités structurales dont les conséquences fonctionnelles seront discutées / Retroviruses are a major concern of public health in humans but also in animals. A better understanding of the structural determinants underlying the functions of retroviral proteins is a crucial step for the development of efficient antiretroviral therapies.This manuscript studies the structural basis of the molecular mechanisms implicated in key functions of retroviruses such as, i) the regulation of complex retroviruses protein expression and ii) the assembly of viral particles, through the study of two retroviral proteins of therapeutic interest: the human T-lymphotropic virus (HTLV) Tax protein and the feline immunodeficiency virus (FIV) capsid protein. The functional and structural studies of these two proteins and the understanding of the molecular mechanisms required for their functions will pave the way to the conception of new antiretroviral therapeutic strategies.Despite several expression and purification assays, no structural studies could be performed for the HLTV Tax protein. However, this study allowed the resolution of the first structure for the full-length FIV capsid protein by X-ray crystallography. Although the FIV capsid protein displays a standard a-helical topology like other retroviral CAs, it also harbors original features whose functional consequences will be discussed

Le latex de Carica papaya est un milieu riche en cystéine protéinases. Celles-ci ont été régulièrement utilisées en cosmétique ou pour l’attendrissement de la viande. Mais ces protéines ont aussi un intérêt pharmaceutique. En effet, le latex est bien connu pour posséder une activité antifongique mais aussi une activité anthelminthique. Ces effets sont régulièrement attribués aux cystéine protéinases qui se trouvent en concentration importante dans le latex. Malgré ces concentrations importantes en protéinases, d’autres protéines restent actives dans ce milieu. C’est le cas de la glutamine cyclase, qui a été extraite intacte de ce milieu et cristallisée. Sa structure nous a révélé une architecture particulière en ‘’&61538;-propeller‘’ à cinq pales avec double fermeture. Cette structure lui confère sa très grande stabilité. <p>Les industries pharmaceutiques sont aussi à la recherche de protéines très stables et résistantes aux protéinases endogènes. Nous avons donc entrepris l’étude du protéome de Carica papaya afin de mettre en évidence d’autres protéines minoritaires relativement stables pouvant conférer au latex son activité anthelminthique. Cette analyse a permis la mise en évidence de différentes protéines appartenant à diverses familles des « pathogenesis related protéins » (PR-proteins): une &61538;-1,3 glucosidase, une analogue à la barwin, une thaumatine et deux chitinases.<p>Nous nous sommes particulièrement intéressés à ces deux dernières au cours de cette thèse. Une caractérisation de ces deux protéines a permis de montrer que celles-ci étaient bien deux protéines distinctes, identifiées comme chitinases majeure et mineure selon leur abondance dans le latex. Elles sont relativement stables et résistantes à la protéolyse. Une analyse de la séquence de la chitinase majeure a montré que celle-ci était homologue à la chitinase issue de l’orge et une analyse de sa structure révèle la présence d’une grande concentration en prolines localisées principalement dans les neuf boucles de sa structure. Cela pourrait expliquer sa grande résistance vis à vis des cystéine protéinases.<p>La cristallisation de cette même chitinase en présence de N-acétyl-glucosamine comme additif, a conduit à une structure contenant trois molécules de GlcNac, deux dans le centre actif de notre protéine et une participant au réseau cristallin. Aucune structure de chitinase n’avait encore pu être obtenue en co-cristallisation avec un substrat. A partir des deux GlcNac observés dans le centre actif, nous avons reconstruit un complexe chitinase/(GlcNac)4. L’analyse de ce complexe a permis de mettre en évidence de nouvelles interactions entre (GlcNac)4 et les acides aminés du centre actif ainsi que de confirmer le mécanisme de la famille GH 19.<p> Des tests préliminaires sur nématodes ont finalement confirmé l’activité anthelminthique du latex et montré que la chitinase pouvait aussi être un bon nématocide<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La protéine Vif (Viral infectivity factor) joue un rôle essentiel dans la réplication virale et dans le pouvoir infectieux du VIH-1. Elle est aussi qualifiée de « protéine de contre-défense » car elle neutralise un facteur cellulaire à action antivirale, APOBEC3 en recrutant le complexe de la E3 ubiquitine ligase formé de CBFβ/EloB/EloC/Cul5/Rbx2, qui va entrainer sa polyubiquitinilation et sa dégradation. APOBEC3 comprend une famille de protéines présentes dans les mammifères et capable d'induire des mutations dans l'ADN viral.La structure tridimensionnelle des molécules et complexes macromoléculaires étant intimement liée à la fonction, il est primordial de connaître la place d’A3G/F dans le complexe Vif-CBFβ-EloB-EloC ainsi que les détails des interactions entre Vif et A3G/F, ceci dans une perspective thérapeutique.La co-expression des différentes protéines de ce complexe a été réalisée dans deux systèmes d’expression : bactérien (E. coli) et eucaryote (BHK21) dû au manque de solubilité d’APOBEC et de la difficulté de sa cristallisation. Une fois les protéines exprimées et le complexe Vif-CBFβ-EloB-EloC-A3G/F formé dans les deux systèmes, des tests de cristallisation et des études structurales seront réalisés pour caractériser la structure et la fonction des protéines.Dans E. coli, j’ai réussi à obtenir le complexe Vif/CBFβ/EloB/EloC/Cul5 in vivo et in vitro de manière soluble, pure, monodisperse ainsi qu’en quantité adéquate avec les études biophysiques envisagées. Par contre, je n’ai pas réussi à surexprimer A3G. En passant dans les cellules de hamster BHK21 et en appliquant la technique du virus de la vaccine, nous avons réussi à obtenir le complexe Vif-CBFβ-EloB-EloC-A3G/F mais en quantité insuffisante pour la cristallisation.Les perspectives de ce projet seront d’améliorer : (1) les rendements du complexe pour des tests de cristallisation et (2) la pureté du complexe pour réaliser la cryo-microscopie électronique. / APOBEC3 are human antiviral cytidine deaminase and RNA/DNA-editing enzymes that belong to the innate immune defense system, targeting retroviruses or retrotransposons. Among all APOBEC3 proteins, hA3B, hA3C, hA3DE, hA3F and hA3G are able to interfere negatively with HIV-1 infectivity: they induce a deamination of dC to dU in the minus strand DNA, resulting in G to A hypermutation in the plus strand DNA. This hypermutation results either into a degradation of U-rich DNA strands by the uracyl-DNA glycosylase or into the production of aberrant viral protein. In addition, a deaminase-independent mechanism is able to inhibit the HIV-1 reverse transcription through a yet unknown mechanism.To evade the host defense system, HIV expresses the virion infectivity factor, Vif, which causes the degradation of APOBEC3G by the proteasome by recruiting the E3 ubiquitin ligase complex composed of the CBFβ, EloB, EloC, Cullin5, Rbx2 proteins. The goal of this study will be the determination of the X-ray structure of the Vif/APOBEC-3 complex. Understanding this molecular recognition might be useful to direct structure-based design of anti-HIV drugs that act by inhibiting the action of Vif and lead to new anti-HIV drugs.To overcome the solubility problems of Vif and APOBEC3G/F, a co-expression strategy had been applied with the different E3 ubiquitin ligase proteins both in prokaryotic (E. coli) and eukaryotic (BHK21) systems. Once the complex obtained, we will perform several structural and biophysical studies as well as crystallization trials.In E. coli, I managed to obtain the Vif/CBFβ/EloB/EloC/Cul5 complex in vivo and in vitro, soluble, monodisperse and in good quantities for structural studies. The protein A3G was not obtained in E. coli even by co-expression with the complex.On the other side, I succeeded in obtaining the polyprotein Vif-CBFβ-EloB-EloC-A3G/F complex in the hamster cells (BHK21) by applying the vaccinia virus strategy. Optimizing the yield and the purity is necessary for crystallization and more structural studies.

Secretion is the passage of macromolecules across cellular membranes. In bacteria, secretion is essential for virulence and survival. Gram-negative bacteria use specialized envelope-spanning multiprotein complexes to secrete macromolecules called type IV secretion system (T4SS). T4SSs mediate the secretion of monomeric proteins, multisubunit protein toxins and nucleoprotein complexes. Also, they contribute to the horizontal spread of plasmid-encoded antibiotic resistance genes. Consequently, they are potential targets for antivirulence drugs. Gram- negative bacteria have two membranes that the secretion complex spans. As a result, the T4SS consists of proteins inserted in the membranes and of soluble proteins that face into or out of the bacterial cell. The details of channel assembly and structure are not known, although recent advances have revealed the structure of the core secretion channel. VirB8 is an inner membrane protein of the complex that interacts with many other T4SS subunits and works as nucleation factor for T4SS channel assembly. Biophysical studies and NMR experiments in particular were conducted to characterize the structural aspects of VirB8 interactions. Dynamic regions of VirB8 during monomer-to-dimer transition were identified by NMR spectroscopy. X-ray crystal and NMR analyses revealed structural differences at the helical regions (α-1 and α-4) of wild-type VirB8 and its monomeric variant VirB8M102R. Fragment screening identified small molecules binding to the wild-type and monomeric variant. In silico docking analyses suggested that the surface groove in the VirB8 structure is important for effective binding of the small molecules. NMR experiments and biochemical assays demonstrated that the β-sheet domain (β1 in particular) is the binding interface of VirB8 for the interaction with VirB10. The identified interface has functional importance for T4SS-mediated conjugation. In addition, I used NMR spectroscopy to identify changes in the structure of VirB8 upon interaction with VirB5. Altogether, structural and biochemical studies on periplasmic and full length VirB8 enabled us to characterize the sequence of interactions between VirB8 and other VirB proteins during T4SS complex assembly and function. The results of this research may lead to an innovative strategy for the development of novel antimicrobial drugs. / La sécrétion est le passage de macromolécules à travers les membranes cellulaires. Chez les bactéries, la sécrétion est essentielle pour la virulence et la survie. Les bactéries à Gramnégatif utilisent le système de sécrétion de type IV (SST4) pour la sécrétion de toxines et de nucléoprotéines. Les SST4 contribuent notamment à la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques. Pour cette raison, les composants du SST4 sont des cibles potentielles pour le développement de médicaments antivirulence. Le SST4 est un complexe protéique qui s’étend entre la double membrane de la bactérie à Gram-négatif. Les protéines qui le composent sont insérées dans les membranes cellulaires ou solubles. Bien que la structure du pore central du SST4 ait été résolue récemment, les détails de l'assemblage et la structure de ce complexe ne sont pas connus. VirB8 est une protéine de la membrane interne qui interagit avec de nombreuses autres sous-unités du SST4. Il s’agit d’un acteur central de l'assemblage du SST4. Des études biophysiques, et notamment des expériences de RMN ont ainsi été réalisées pour caractériser les aspects structuraux des interactions avec VirB8. Des regions dynamiques dans la structure de VirB8 ont été identifiées par spectroscopie RMN lors de la transition entre la forme monomérique et dimérique. Les analyses de cristallographie et de RMN ont révélé des différences structurales dans les régions hélicoïdales (α1 et α4) de VirB8 wild-type et du variant monomérique VirB8M102R. Le criblage de fragments a permis d’identifier de petites molécules capables de se lier à VirB8 ainsi qu’au variant monomérique. Les analyses d’arrimage moléculaire in silico suggèrent que la rainure de surface dans la structure VirB8 est importante pour laliaison de ces petites molécules. Les expériences de RMN et les essais biochimiques révèlent que le feuillet β (β1 en particulier) constitue l'interface d’interaction entre VirB8 et VirB10. Cette interface d’interaction est d’ailleurs importante pour la conjugaison du SST4. De plus, j'ai identifié des changements dans la structure de VirB8 lors de l'interaction avec VirB5. Les études sur la protéine VirB8 nous ont permis de caractériser la séquence d'événements entre VirB8 et d'autres protéines VirB, régulant l'assemblage et la fonction du SST4.