In this thesis, the behavior of pearlitic steel was characterized under controlled wear conditions in the laboratory and service conditions in two ore mining stages, comminution and transportation. The thesis consists in three experimental chapters, divided according to the tribosystems analyzed. On all the chapters Electro Microscopy techniques for the microstructural analysis were employed. Scanning Electron Microscopy (SEM), Focused Ion Beam (FIB-SEM), Electron Backscatter Diffraction (EBSD) and Transmission Electron Microscopy (TEM) were used. The first experimental chapter shows the analysis of the pearlite under abrasive wear with loose abrasive particles in multi-events conditions. The sample was taken from Semi-Autogenous Grinding mills (SAG) and experimental simulation was carried out in laboratory using the Dry Sand Rubber Wheel Abrasion Test (DSRW). The results show a polycrystalline layer formation in both cases, characterized by ultra-fine grains of ferrite in the layer closer to the surface. It was also concluded that the DSRW can simulate the wear produced on field (superficial and microstructural features) in conditions of higher normal load than recommended by the ASTM Standard G65. The second experimental chapter explores the characterization of the microstructure after the indenter pass in scratch test using two conditions of normal load applied and five sequences of scratch. The microstructural analysis shows the formation of two subsuperficial layers identified by the level of the microstructural alterations. In the subsuperficial layer (close to the surface), the formation of new ultra-fine grains of ferrite was observed. A second layer was observed deeper in the sample and denominated as layer of the microstructure transition, characterized by the combination of deformed (reduction of the interlamellar spacing) and pearlite colonies not affected plastically by the mechanical loading. On this layer, the crystallographic texture in RD // in samples tested at 4 N (normal load) and one-pass scratch was determined. Later, on this chapter, the microstructure in a ground rail (industrial procedure characterized as a multi-event scratch test) was analyzed. Two grinding conditions were used for the analysis with variation of the grinding linear speed and load on the grinding stones (discs). The combination of low grinding speed and high load promotes a higher deformed layer formation beneath the patch zone and low randomized orientation of the pearlite colonies. Finally, in the third experimental chapter, the pearlitic characterization was concluded with the study of samples of railway wheel and rail under wear in service and Rolling Contact Fatigue (RCF) in laboratory. The laboratorial simulation was carried out using the twin-disc rolling contact tribometer with a variation of number of cycles. The characterization of railway wheel shows that the WEL is characterized by levels of breaking and aligned cementite and zones with dissolution of the carbon atom in the ferrite to form the supersaturated carbon ferrite. The polycrystalline ferrite formation (ultra-fine grains) in the sub-superficial layer and it was identified a preferential orientation of RD // in the layer of microstructural transition. The results of the laboratory test show surface crack nucleation and propagation at low angle in the more severe deformed layer. The microstructure of the layer consists in polycrystalline ferrite and the cementite dissolution. / Nesta tese foi caracterizado o comportamento do aço perlítico em condições controladas de desgaste em laboratório e em serviço em dois estágios do processo de mineração de minério, cominução e transporte ferroviário. A tese consiste em três capítulos experimentais divididos segundo o tribosistema analisado. Em todos os capítulos do trabalho foi utilizada a técnica de microscopia eletrônica para análise microestrutural. Foi utilizado Microscopia eletrônica de varredura (MEV), Focused Ion Beam (FIB-SEM), Electron Backscatter Diffraction (EBSD) e Microscopia eletrônica de transmissão (MET). O primeiro capítulo experimental mostra a análise da perlita in condições de desgaste abrasivo com partículas soltas em eventos múltiplos. As amostras foram tiradas de um moinho semi-autógeno (SAG) e realizada uma simulação experimental do desgaste em condições controladas usando o tribômetro de roda de borracha (RWAT). Os resultados mostraram a formação de camada branca em ambas as condições de análise, consistindo em uma camada poli cristalina caracterizada pela formação de grãos ultrafinos na camada mais próxima da superfície de desgaste. Também foi concluído que a roda de borracha pode simular o desgaste produzido nos moinhos SAG tanto nas características superficiais quanto microestruturais em condições de maior severidade as comumente utilizadas na norma ASTM G65 (procedimento B). O Segundo capítulo experimental explora a caracterização da microestrutura depois da passagem do endentador no ensaio de riscamento (scratch test) utilizando duas condições de carga normal aplicada e 5 sequências de riscamento. A análise microestrutural mostrou a formação de duas camadas subsuperficiais identificadas pelo nível de alteração microestrutural. Na camada mais próxima da superfície de desgaste foi observada a formação de grãos ultrafinos de ferrita. A segunda camada identificada mais profundamente na amostra, denominada como camada de transição, é caracterizada pela combinação de colônias deformadas (redução do espaçamento interlamelar) e camadas não afetadas pelos esforços produzidos no contato. Nesta camada foi determinada a texturização em direção RD // nas amostras testadas a 4 N (carga normal aplicada) e uma passada. Posteriormente à análise de riscamento foi caracterizada a microestrutura de uma amostra tirada de um trilho esmerilhado (processo industrial que pode ser considerado como aplicação do ensaio de riscamento). Foram consideradas duas condições de esmerilhamento com variação de velocidade de esmerilhamento (deslocamento linear do veículo esmerilhador) e potência dos motores dos rebolos usada no procedimento. A combinação de baixa velocidade de esmerilhamento e alta potência nos motores controladores dos rebolos promoveu uma grande deformação nas camadas subsuperficiais na região de contato e uma baixa aleatoriedade das orientações cristalográficas das colônias de perlita. Finalmente, no capítulo três, a caracterização da microestrutura perlitica foi finalizada com o estudo de amostras de roda e trilho em condições de desgaste em campo e de Rolling Contact Fatigue (RCF) em ensaios de laboratório. A simulação experimental foi realizada utilizando o tribômetro twin-disc rolling (configuração disco-disco) com variação do número de ciclos. A caracterização da roda ferroviária mostrou a formação da camada branca caracterizada por níveis de cementita fraturada e alinhada em direção do movimento de rolamento/deslizamento com áreas de dissolução do átomo de carbono na ferrita formando uma ferrita supersaturada. Foi identificado a formação de policristais de ferrita (grãos ultrafinos) na camada mais superficial e uma orientação preferencial RD // na camada de transição. Os resultados dos ensaios de laboratório mostraram a nucleação de trincas superficiais se propagando a baixo ângulo na camada branca. A transformação microestrutural dessa camada após ensaios de laboratório consiste em policristais de ferrita e dissolução da cementita.

A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-09-21T17:25:16Z No. of bitstreams: 1 NayaraCruz.pdf: 2821867 bytes, checksum: 4cc762016119d71d331457a53080cac3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-21T17:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NayaraCruz.pdf: 2821867 bytes, checksum: 4cc762016119d71d331457a53080cac3 (MD5) Previous issue date: 2017-07-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The crystals based in Amino acid have been studied recently, mainly due to their useful properties for electronic, non-linear optical and magnetic applications. One of most used amino acids are β-alanine, whose complexes with nickel were studied in the 1990s. However, there are no studies on the thermal and structural stability of this material. In order to better investigate β-alanine complexes with metal ions, this work presents the structural and thermal study of nickel (II) β-alaninate crystal. The crystals were grown by slow evaporation of the solvent. The crystals grew after a period of 30 days. The techniques used for the characterization of the sample were: X-Ray Diffraction (XRD) along with the refinement by the Rietveld method, Raman spectroscopy at room temperature and with temperature variation, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and Thermal Analysis By Differential Exploratory Calorimetry (DSC). The XRD data showed that the crystals grown were the desired ones, presenting the same triclinic structure and spatial group P1. The DSC results showed events corresponding to water loss followed by phase transformation and subsequent melting at approximately 138 ° C. The results obtained by Raman Spectroscopy at room temperature and with temperature variation showed 32 spectral bands for the crystal, of which 5 are referring to the network modes or external modes. Raman spectroscopy confirmed the observed phase transformation on the DSC curve due to the loss of the water molecule. As the temperature increases, the bands shift to the number of smaller waves. For the results obtained at temperatures above 137 ° C the appearance of spectral bands was not observed, indicating that the crystal was melted as observed in the DSC curve. The results of X-ray diffraction as a function of temperature showed that, as the temperature increases, the peaks shift to smaller angles and that the process is non-reversible, characteristic of a phase transformation. For the FITR data we have that most bands have a high spectral absorption showing a total of 26 bands. The present result shows that the crystal is thermally stable up to 110 ° C and can be used for application below this temperature. / Cristais à base de aminoácidos têm sido estudados recentemente, principalmente devido à suas propriedades úteis para aplicações eletrônicas, óptica não linear e magnéticas. Dentre os aminoácidos mais utilizados há a β-alanina, cujos complexos com níquel foram estudados na década de noventa. Contudo, não há estudos da estabilidade térmica e estrutural desse material. No intuito de investigar melhor complexos de β-alanina com íons metálicos, este trabalho apresenta o estudo estrutural e térmico do cristal de β- alaninato de níquel (II). Os cristais foram crescidos por meio do método de evaporação lenta do solvente. Os cristais cresceram após um período de 30 dias. As técnicas utilizadas para a caracterização da amostra foram: Difração de Raios X (DRX) juntamente com o refinamento pelo método de Rietveld, Espectroscopia Raman em temperatura ambiente e com variação de temperatura, Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e Análise Térmica pela técnica de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC). Os dados de DRX comprovaram que os cristais crescidos eram os desejados, apresentando a mesma estrutura triclínica e grupo espacial P1. Os resultados de DSC mostraram eventos que correspondem à perda de água seguida da transformação de fase e posterior fusão em aproximadamente 138°C. Os resultados obtidos por Espectroscopia Raman à temperatura ambiente e com variação de temperatura apresentaram 32 bandas espectrais para o cristal, das quais cinco são referentes aos modos de rede ou modos externos. A espectroscopia Raman confirmou a transformação de fase observada na curva de DSC, devido à perda da molécula de agua. À medida que a temperatura aumenta, ocorreu o deslocamento das bandas para número de ondas menores. Para os resultados obtidos em temperaturas superiores a 137°C não se observou o aparecimento de bandas espectrais, indicando que o cristal sofreu fusão conforme observado na curva de DSC. Os resultados de Difração de Raios X em função da temperatura mostraram que, à medida que ocorre o aumento da temperatura ocorre o deslocamento dos picos para ângulos menores e que o processo é não reversível, característica de uma transformação de fase. Para os dados de FITR, a maioria das bandas apresentam uma alta absorção espectral mostrando um total de 26 bandas. O presente resultado mostra que o cristal é termicamente estável até 110°C podendo ser utilizado para aplicação abaixo dessa temperatura.

O presente trabalho apresenta a determinacao da estrutura tridimensional da L-aminoacido oxidase do veneno de Bothrops atrox (BatroxLAAO) e sua avaliacao como potencial agente biotecnologico. Quanto a caracterizacao estrutural, a enzima BatroxLAAO (6 mg/mL) foi submetida a varios screenings e, por meio destas variacoes, obtivemos um resultado ideal para o crescimento dos monocristais sob a condicao de 0,05 M de sulfato heptahidratado de zinco, 15% (v/v) de Polietilenoglicol monometil eter 550, controle de pH 5 com 0,1M de cacodilato de sodio. A utilizacao de parafina e silicone resultou na melhora dos cristais, revelando cristais unicos e de coloracao amarela, o que permitiu o melhor crescimento e difracao desses cristais, a 2,3 .. Estes dados permitiram a determinacao de estrutura terciaria de BatroxLAAO e, portanto, melhor entendimento dos mecanismos de atuacao da mesma. A proteina foi obtida, atraves de passos cromatograficos, com rendimento medio de 1,54% do veneno bruto. Esta apresentou acentuada inibicao da proliferacao celular de celulas tumorais HL-60, JURKAT, PC12 e B16F10, principalmente nas maiores concentracoes (50 e 100 Êg/mL). Ainda, o tratamento de celulas PBMC com BatroxLAAO, demonstrou baixa citotoxicidade em relacao ao tratamento das celulas tumorais. A viabilidade celular da Leishmania sp. foi analisada apos o tratamento com BatroxLAAO. A adicao de BatroxLAAO diretamente as formas promastigotas de diferentes especies de Leishmania resultou em morte dos parasitas de forma dose-dependente. As especies L. major e L. donovani foram as mais susceptiveis ao efeito toxico de BatroxLAAO. O efeito toxico apresentado pela BatroxLAAO foi quase completamente abolido pela adicao de catalase, sugerindo que a liberacao de H2O2 esta diretamente envolvida com o efeito da enzima. A atividade bactericida foi avaliada pela inibicao do crescimento das cepas de E. coli e S. aureus apos tratamento com a BatroxLAAO. A proteina (37,5 Êg/mL) apresentou alta atividade fungicida contra Candida albicans, com 100% da inibicao do crescimento das cepas. Foi avaliada a atividade tripanomicida, onde BatroxLAAO mostrou-se potencialmente ativa sobre T. cruzi. Foram realizados experimentos para a producao de anticorpo monoclonal (anti-BatroxLAAO). O anticorpo produzido apresentou reatividade ate diluicao 1:60000. No entanto, apos a realizacao do teste de ELISA com o anticorpo produzido e outras L-aminoacidos oxidases de diferentes venenos de serpentes, averiguamos que o anti-BatroxLAAO nao tem especificidade unica, ocorrendo reatividade para todos os venenos e proteinas testadas. Foram realizados ensaios in vivo para a deteccao da expressao dos genes FAS, BAX e BCL2. Os dados obtidos sugerem que BatroxLAAO apresenta potencial biotecnologico bastante evidente nas acoes leishmanicida e fungicida, bem como na atividade antitumoral, in vitro, mostrando-se um composto com potencial agente terapeutico. / This work presents the determination of three-dimensional structure of L-amino acid oxidase from Bothrops atrox (BatroxLAAO) and its evaluation as a potential biotechnology agent. Regarding the structural characterization, BatroxLAAO (6 mg / mL) underwent multiple screenings, and through these variations, we got an ideal result for the single crystals growth under condition of 0.05 M zinc sulfate heptahydrate, 15 % (v / v) polyethylene glycol monomethyl ether 550, pH control: 5.0 with 0.1 M sodium cacodylate. The use of paraffin and silicone resulted in the improvement of the crystals, revealing single and yellow crystals, which allowed better growth and diffraction of these crystals, to 2.3 . These data allowed the determination of tertiary structure BatroxLAAO and therefore better understanding of action mechanisms of this protein. The protein was obtained using three chromatographic steps, with an average yield of 1.54% from crude venom. This showed marked inhibition of cell proliferation on tumor cells as HL-60, Jurkat, PC12 and B16F10, especially at higher concentrations (50 and 100 g / mL). Also, treatment of PBMC cells with BatroxLAAO showed low cytotoxicity in comparison to the treatment on tumor cells. Cell viability of Leishmania sp. was analyzed after treatment with BatroxLAAO. The addition of BatroxLAAO directly to promastigotes forms of different species of Leishmania resulted in a dose-dependent death. The species L. major and L. donovani were more susceptible to the toxic effect of BatroxLAAO. The toxic effect presented by BatroxLAAO was almost completely abolished by the addition of catalase, suggesting that the release of H2O2 is directly involved with the effect of this enzyme. The bactericidal activity was evaluated by inhibiting the strains growth of E. coli and S.aureus after treatment with BatroxLAAO. The protein (37.5 g / mL) showed high fungicidal activity against Candida albicans with 100% growth inhibition of strains. We evaluated the trypanocidal activity, where BatroxLAAO proved to be potentially active against the T. cruzi parasite. Experiments were carried out for production of monoclonal antibody (anti-BatroxLAAO). The antibody showed reactivity produced by dilution until 1:60000. However, after performing the ELISA assay with the antibody produced and other L-amino acidoxidases from different snake venoms, we found that anti-BatroxLAAO did not present unique specificity, BatroxLAAO reacted with all poisons and proteins tested. Experiments, in vivo, were performed to detect the gene expression of FAS, BAX and BCL2. These data suggest that BatroxLAAO presented quite evident biotechnologic potential as leishmanicidal, fungicidal and antitumoral, in vitro, agent. Further studies are needed to confirm the potential therapeutic use of this protein.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: Os acidentes ofídicos constituem um problema de saúde pública, afetando regiões de clima tropical e subtropical e áreas rurais e pobres de países da América Latina, África, Ásia e Oceania. No Brasil, o gênero Bothrops é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos notificados, cujo envenenamento é caracterizado por intensa mionecrose local ineficientemente neutralizada pela soroterapia. O veneno botrópico possui uma classe de proteínas miotóxicas estruturalmente semelhantes às fosfolipases A2 (PLA2), responsáveis por induzir lesões musculares por um mecanismo não-catalítico parcialmente explicado por diferentes hipóteses. Contudo, há evidências que os efeitos miotóxico e paralisante in vitro são decorrentes de sua atividade desestabilizadora de membranas e que atuam em sinergia com as PLA2 catalíticas no envenenamento. Neste estudo, foi desenvolvido um novo protocolo de purificação da miotoxina não-catalítica (PLA2 homólogas ou proteínas PLA2-like) botrópica BthTX-I, a qual foi avaliada em testes cristalográficos, calorimétricos, miográficos e morfológicos. Potenciais inibidores vegetais da classe dos cinamatos foram co-cristalizados com a BthTX-I e testados em inibir as lesões e paralisia musculares in vitro promovida pela toxina a fim de evoluir no conhecimento da relação estrutura/atividade das PLA2 homólogas miotóxicas. Dentre todos os compostos testados, os ácidos chicórico e caftárico apresentaram-se como excelentes inibidores da BthTX-I. Contudo, foi possível ap... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Snakebites are a public health problem, concerning tropical and subtropical regions, rural and poor areas of Latin America, Africa, Asia and Oceania countries. In Brazil, Bothrops genus accounts for about 90% of reported snakebites, whose envenomation is characterized by intense local myonecrosis inefficiently neutralized by antivenom. A class of myotoxic proteins found in Bothrops venoms which is structurally similar to phospholipases A2 (PLA2), is responsible for inducing muscle injuries by a non-catalytic mechanism, partially explained by different hypotheses. However, there are evidences that myotoxic and in vitro paralyzing effects are due to their destabilizing-membrane activity and they act in synergy with the catalytic PLA2 myotoxins in envenomation. In this study, it was developed a new protocol for purification of a non-catalytic botropic myotoxin (PLA2 homologues or PLA2-like proteins) BthTX-I, which was evaluated by crystallographic, calorimetric, myographic and morphologic assays. Potential plant inhibitors of cinnamates class were co-crystallized with BthTX-I and tested to inhibit in vitro paralysis and muscle injuries promoted by the toxin. Among all the compounds tested, the chicoric and caftaric acids presented excellent BthTX-I inhibition characteristiscs. However, only chicoric acid (CA) we were able to perform crystallographic experiments, which presented different structural characteristics compared to other ligands and bothropic toxins. According to the ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Neste trabalho são apresentados os resultados das determinações cristalinas, estruturais e supramoleculares, por difração de raio X, bem como os estudos de \"docking\" , de oito compostos derivados da 1,4-quinona. As estruturas resolvidas e refinadas mostraram a existência de ligações de hidrogênio, não convencionais intra e intermoleculares. Estas últimas permitiram entender o empacotamento cristalino em cada composto. Os resultados cristalográficos foram comparados com aqueles encontrados na literatura. Mas as estruturas correspondentes aos compostos AC1 (6,7-bis-fenilsulfanil-1,4-dihidro-1,4-metano-naftaleno-5,8-diona) e AC6 (6,7-bis-metilsulfanil-1,4-dihidro-1,4-metano-naftaleno-5,8-diol) possuem esqueletos químicos ainda não descritos na cristalografia. Os estudos de \"docking\" foram realizados utilizando as conformações cristalográficas dos oito compostos e da estrutura cristalográfica da tripanotiona redutase, uma proteína, dimérica, envolvida no sistema anti-stress oxidativo no Tripanosoma cruzi, parasita responsável pela enfermidade de Chagas. Foram, então, gerados complexos proteína-ligante no sítio da interface entre monômeros. Os complexos resultantes foram agrupados de acordo com orientações preferenciais e em cada grupo, a estrutura com menor energia total foi selecionada como representante do conjunto e analisado em tela gráfica. Para cada uma das moléculas foram realizados estudos detalhados das suas interações com todos os aminoácidos que as rodeavam. Finalmente, levando em conta as energias envolvidas e as interações foi possível escolher aquela que mostra o melhor encaixe. Dentre todas as moléculas, a AC8 [4a,8a-Dicloro-6-etilsulfanil-7-(metiletil-fenil-amino)-1,4,4a,8a-tetrahidro-1,4-metano-naftaleno-5,8,-diona] foi considerada como a mais promissora, a qual apresentou melhores resultados, um maior número de interações favoráveis com menor energia. / In this work the results of the crystal structure and supramolecular determination by X-ray diffraction together with docking studies, of eight compounds derived from 1,4-quinone, are presented. The solved and refined structures showed the existence of non-conventional hydrogen bonds, intra and inter-molecular. These last ones gave an insight about the crystal packing in each compound. The crystallographic results have been compared with those found in the literature. It should pointed out that structures of compounds AC1 (6,7-bis-phenylsulfanyl-1,4-dihydro-1,4-methano-naphthalene-5,8-dione) and AC6 (6,7-bis-methylsulfanyl-1,4-dihydro-1,4-methane-naphthalene-5,8-diol) have chemical skeletons which were not described before in crystallography. The docking studies have been carried out using the crystallographic conformations of the eight compounds and the crystallographic structure of trypanothione reductase, a dimmeric protein, involved in the anti-stress oxidative system of the Trypanosoma cruzi, the parasite responsible for the Chagas disease. The compounds were docked in the dimmer interface, which is the most likely binding site. The resulting complexes have been clustered together according with their orientation and of each group the one with the lowest total energy was chosen as representative of the cluster and analyzed in graphical screen. Thus, for that complex a detailed study of its interactions with all the neighbor amino acids was done. Finally, taking in account the energies and the interactions it was possible to choose the one that showed the best docking result. Amongst all molecules, the AC8 [4a,8a-dicloro-6-etilsulfanil-7-(metiletil-fenil-amino)-1,4,4a,8a-tetrahidro-1,4-methane-naftaleno-5,8,-diona] was considered as the most promising, which presented better results, a bigger number of favorable interactions with lesser energy.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-08-18Bitstream added on 2014-06-13T20:29:19Z : No. of bitstreams: 1 silva_don_me_sjrp.pdf: 1054782 bytes, checksum: 832047dd271670cc0bc6debdbd5dc8d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) catalisa a fosforólise de nucleosídeos de purina para suas respectivas bases e açucares (ribose ou desoxirribose) 1-fosfato. A PNP desempenha uma função central no metabolismo das purinas, normalmente operando na via de recuperação do DNA das células. Mais ainda, a PNP cliva ligações glicosídicas com inversão da configuração para produzir a-ribose 1-fosfato. Acredita-se que no organismo do Mycobacterium tuberculosis a PNP desempenha tarefas similares, o que levanta o interesse em desenvolver ciência que dê suporte para o desenvolvimento de drogas baseadas na estrutura desta proteína. A proteína é um homotrímero simétrico com um arranjo triangular das subunidades, similar às PNPs triméricas de mamíferos. Cada monômero consiste de um enovelamento a/ß formado por onze fitas ß circundadas por oito hélices a. O estudo desta PNP visa proporcionar comparações com outras estruturas, na intenção de identificar as bases estruturais de possíveis diferenças ou similaridades funcionais entre esta e outras PNPs, num esforço para desenvolver pesquisa que dê suporte para o desenho de novas drogas mais seletivas e poderosas contra a tuberculose. / The Purine nucleoside phosphorylase (PNP) catalyses the phosphorolysis of purine nucleosides to corresponding bases and ribose 1-phosphate. PNP plays a central role in purine metabolism, normally operating in the purine salvage pathway of cells. Moreover, PNP cleaves glycosidic bond with inversion of configuration to produce á-ribose 1-phosphate. It is believed that in the MtPNP is responsible for the same labor in the Mycobacterium tuberculosis organism, which arouses the interest in developing science for giving support to the development of structure based drugs. The protein is a symmetrical homotrimer with triangular arrangement of the subunits, similar to the trimeric mammalian PNPs. Each monomer consist of a á/â folding formed by eleven â sheet surrounded by eight á helices. The study of this PNP aims the possibility of caring out comparisons with other structures, in order to identify the structural basis of possible differences or functional similarities between this and other PNPs, in an effort to develop research which gives support to the design of more selective and powerful new drugs against tuberculosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:10:04Z : No. of bitstreams: 1 souza_mm_me_sjrp.pdf: 836354 bytes, checksum: 11c4cceceb0b5cfc0fbfbee0acea3de5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / De acordo com a OMS, a tuberculose mata 5000 pessoas por dia, e se não controlada, são estimados 35 milhões de novos casos nos próximos vinte anos. A alta susceptibilidade dos infectados por HIV para a tuberculose, bem como a proliferação da tuberculose multidroga-resistente (MDR), tem criado um grande interesse mundial de expansão nos programas atuais de pesquisas sobre a tuberculose. A Purina Nucleosídeo Fosforilase do Mycobacterium tuberculosis (MtPNP) é um potencial alvo para novas drogas anti-tuberculose visto que é responsável pela síntese de novo de ribonucleotídeos de purina. A Inibição específica da PNP poderia potencialmente levar o M. tuberculosis ao estado latente. O objetivo desde trabalho é resolver a estrutura da MtPNP complexada com adenina, e analisar as interações com os ligantes. A MtPNP foi cristalizada utilizando condições experimentais descritas posteriormente, e o ligante (adenina) foi adicionado por soaking. Os dados de difração de raios X foram coletados no detector CCD utilizando fonte de radiação síncotron (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). O programa MOSFLM foi utilizado para o processamento, e os dados foram escalonados através do programa SCALA, apresentando o grupo espacial ortorrômico P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). O cristal foi determinado utilizando o método de substituição... / In according to the WHO, the tuberculosis kills 5000 people every day, if does not controlled, are esteemed 35 millions of new cases in next 20 years. The high susceptibility of human immunodeficiency virus infected persons to the disease and the proliferation of multidrug-resistant (MDR) strains have created a worldwide interest in expanding current programs in tuberculosis research. The Purine Nucleoside Phosphorylase from Mycobacterum tuberculosis (MtPNP) is a potential target for new drug anti-tuberculosis, whereas is responsible for de novo synthesis of purine ribonucleotides. The specific inhibition of M. tuberculosis PNP could potentially lead to the latent state of M. tuberculosis. The objective of this work is to solve the structure from MtPNP complexed with adenine, and to analyze their interactions with the ligand. MtPNP was crystallized using the experimental conditions described elsewhere, and the ligand (adenine) was added by soaking. The X-ray diffraction data were collected on a CCD detector using synchrotron radiation source (Laboratório Nacional de Luz Síncrotron, LNLS, Campinas, Brazil). It was used the MOSFLM program to processing, and the data were scaled through the program SCALA, presenting orthorhombic spatial group P21212 (a=118,96Å, b=134,65 Å, c=44,42 Å). The crystal was determined by molecular replacement methods using the program AMoRe. The final model has Rfree and Rfactor of 23.87% and 17.51% respectively, and maximum resolution of 1.86Å. It was observed a large...(Complete abstract click electronic access below)

A bothropasina é uma proteína hemorrágica de 48 kDa, pertencente à classe P-III das metaloproteases, isolada a partir do veneno bruto da serpente brasileira Bothrops jararaca, e que possui os domínios adesivos desintegrina (D) e rico em cisteína (C). Neste trabalho, nós apresentamos a estrutura cristalográfica da bothropasina complexada ao inibidor POL647. O domínio catalítico , metaloprotease (M), pode ser dividido em dois subdomínios, dispostos de maneira muito similar aos descritos para essa família de metaloproteases de venenos de serpentes (em inglês \"SVMPs\"), que inclui os sítios de ligação ao zinco e ao cálcio. A cisteína livre, resíduo Cys189, está localizado em um núcleo hidrofóbico e, sendo assim, impossibilitado de fazer pontes dissulfeto ou qualquer outra interação. O domínio D não apresenta estruturas secundárias bem definidas, sendo constituído, majoritariamente, por estruturas desordenadas como \"loops\", porém estabilizados por 7 pontes dissulfeto e por dois íons cálcio. A região do motivo ECD está localizada em um \"loop\" e é estruturalmente relacionado à região RGD das desintegrinas-RGD, derivadas de SVMPs da classe P-II. O motivo ECD é estabilizado pela ponte dissulfeto Cys277-Cys310 (entre os domínios D e C), além de um íon cálcio. A cadeia lateral do Glu276 do motivo ECD está exposta ao solvente. Na bothropasina, a região hiper variada (em inglês HVR), descrita para outras P-III de SVMPs, presente no domínio C, de fato, é bastante conservada quando comparada a outros membros da classe P-III de diversas espécies. Nós propomos que esse subgrupo deva ser referido como PIII-HCR (região altamente conservada) SVMPs. Ainda é proposto que as diferenças estruturais dos domínios D, C ou DC possam estar envolvidas em uma melhor adaptação da estrutura na interação com diferentes alvos, além do reconhecimento e especificidade a um substrato para o domínio M. / Bothropasin is a 48kDa hemorrhagic P-III metalloprotease isolated from the venom of the Brazilian snake Bothrops jararaca, which has the disintegrin (D) and cysteine-rich (C) adhesive domains. We present the crystal structure of the bothropasin complexed with the inhibitor POL647. The catalytic domain, metalloprotease (M), consists of two subdomains in a very similar scaffold to the ones described for other snake venom metalloproteases (SVMPs) including the zinc and calcium binding sites. The free cysteine, residue Cys189, is in a hydrophobic core and it is not available for disulfide bonding or other interactions. The D domain does not have a defined secondary structure, but instead is composed by mostly loops stabilized by seven disulfide bonds and by two calcium ions. The ECD region is in a loop and it is structurally related to the RGD region of RGD-disintegrins, which are derived from P-II SVMPs. The ECD motif is stabilized by the Cys277-Cys310 disulfide bond (between D and C domains) and by one calcium ion. The side chain of the Glu276 of the ECD motif is solvent exposed. In bothropasi, the HVR (hyper-variable region) described for other P-III SVMPs in the C domain in fact presents a well conserved sequence with respect to several other P-III members from different species. We propose that this subset be referred to as PIII-HCR (highly-conserved region) SVMPs. We further propose that the structural differences in the D, C or DC domains may be involved in selecting target binding which in turn could generate substrate diversity or specificity for the M domain.

As glicosidases são enzimas que apresentam uma grande variedade de enovelamentos, assim como uma alta especificidade frente a diferentes substratos. Estas enzimas têm em comum a presença de dois resíduos catalíticos, responsáveis pela clivagem das ligações glicosídicas. O uso de glicosidases nas indústrias têxtil e alimentícia, no processamento de polpa de papel e na síntese de oligossacarídeos tem incentivado a engenharia destas proteínas no sentido de melhorar suas propriedades catalíticas e estabilidade. Estudos estruturais das glicosidases têm aumentado nosso entendimento de seus mecanismos de ação catalitica, assim como dos processos de interação proteína-carboidrato. Neste trabalho apresentamos os estudos cristalográficos de duas glicosidases de fungos, sendo elas a beta-galactosidase de Penicillium sp. e a Exo-inulinase de Aspergillis awamori, assim como estudos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) da beta-xylosidase de Trichoderma reesei. As estruturas cristalográficas da beta-galactosidase e de seu complexo com galactose foram determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.9 A angstron de resolução para a estrutura sem substrato e 2.0 angstron de resolução para o complexo. A estrutura do complexo com galactose foi usada para identificar os resíduos catalíticos, sendo o resíduo Glu 200 identificado como doador de próton e o resíduo Glu 299 como o nucleófílo. As estruturas cristalográficas da Exo-inulinase de Aspergillus awamori e de seu complexo com frutose foram também determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.55 angstron e 1.8 angstron de resolução, respectivamente. A partir da estrutura do complexo foi possível identificar os resíduos Asp41 e Glu241 como o nucleófilo e o doador de próton, respectivamente. Além disto, foi possível verificar que o Asp189, o qual faz parte do motivo conservado Arg-Asp-Pro (RDP), é importante no reconhecimento do substrato através de duas pontes de hidrogênio. Com o intuito de obter informações estruturais sobre a P-xylosidase seu envelope foi determinado a partir dos dados do espalhamento de raios-X a baixos ângulos. O envelope da p-xylosidase em solução foi calculado a 20 A de resolução, sendo o raio de giro e a dimensão máxima 36.9 angstron e 90 angstron, respectivamente. Usando algoritmos de reconhecimento de possíveis domínios foi determinado que esta proteína apresenta, além dos dois domínios característicos da família GHF3, um barril TIM e um domínio alfa/beta, um terceiro domínio. A predição da estrutura secundária e os dados de dicroísmo circular indicam que este terceiro domínio apresentaria um enovelamento tipo beta. / Glycosidases belong to a group of enzymes displaying a great variety of protein folds and substrate specificities. Two critically located acidic residues make up the catalytic machinery of these enzymes, responsible for the cleavage of glycosidic bonds. The applications of glycosidases in textile, food, and pulp processing, as well as in catalysts and oligosaccharide synthesis have encouraged the engineering of these proteins in order to obtain improved catalytic properties and stability. Furthermore, structural studies extend our understanding of the catalytic mechanism and the role of glycosidases in the recognition processes of their different substrates. In this work, we describe crystallographic studies of two fungi glycosidases, beta-galactosidase from Penicillium sp and Exo-inulinase from Aspergillis awamori, and the small-angle x-ray scattering (SAXS) studies of another glycosidase, beta-xylosidase (from Trichoderma reesei). The crystallographic structures of j3-galactosidase its complex with galactose were solved by single isomorphous replacement with anomalous scattering (SIRAS) using the quick cryo-soaking technique, at 1.90 angstron and 2.10 angstron resolution, respectively . The X-ray structure of the enzyme-galactose complex was useful in identifying the residue Glu 200 as the proton donor and residue Glu 299 as the nucleophile involved in catalysis. The x-ray structure of exo-inulinase and its complex with fructose were also solved by SIRAS using the quick cryo-soaking technique at 1.55 angstron and 1.8 angstron resolutions, respectively. The solved structure of the enzyme-fructose complex revealed two catalytically important residues, Asp41 and Glu241, as nucleophile and proton donor, respectively. It was also possible to see that residue Asp189, which belongs to the Arg-Asp-Pro motif, provides hydrogen bonds important for substrate recognition. In order to gain structurai insights about the beta-Xylosidase from Trichoderma reesei, we calculated their SAXS envelope. The low resolution shape of this enzyme in solution was obtained fiom synchrotron x-ray scattering data at 20 angstron resolution. The radii of gyration and the maximum dimension of the beta-Xylosidase were calculated to be 36.9 angstron and 90 angstron, respectively. In contrast to the fold of the only structurally characterized member of GHF-3, the beta-D-glucan exohydrolase, which has two distinct domains, the shape of the beta-xylosidase indicates the presence of three domains located in the same plane. Domain recognition algorithms were used to show that the C-terminal part of the mino acid sequence of the protein forms the third domain. Circular dichroism spectroscopy and secondary structure prediction programs show that this additional domain adopts predominantly the B-conformation.