O acúmulo de poluentes orgânicos persistentes é um dos principais problemas de contaminação do meio ambiente em todo o mundo. As atividades industriais e os avanços tecnológicos na maioria dos setores de produção contribuem com a crescente liberação de compostos poluentes, altamente tóxicos, biocumulativos e resistentes à degradação física, química, fotolítica e biológica. Esses poluentes são o resultado do uso indevido de pesticidas de um modo geral, da subprodução não planejada de sintéticos tóxicos como dioxinas policloradas e de uma lista enorme de atividades que promovem a combustão incompleta da matéria orgânica e despejam no ambiente uma vasta quantidade de hidrocarbonetos aromáticos persistentes. A biorremediação é uma estratégia biotecnológica que vem lançar luz sobre as técnicas de revitalização de sítios contaminados. É baseada na utilização de microorganismos, ou suas enzimas, para reduzir ou eliminar perigos ambientais contaminantes em substâncias inertes, CO2 e água. As oxigenases são uma classe de enzimas amplamente estudadas por suas propriedades catalíticas únicas, sendo a clorocatecol 1,2- dioxigenase de Pseudomonas putida um interessante alvo biotecnológico para a biorremediação devido a sua ampla especificidade a substratos aromáticos, aromáticos halogenados e dialogenados altamente poluentes, biocumulativos e carcinogênicos. Nesse trabalho, o protocolo de expressão heteróloga em E. coli foi implementado em nosso laboratório e a purificação realizada em coluna de afinidade através do uso de resina de quitina. Os cristais de cor marrom avermelhado da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase Pseudomonas putida foram obtidos na presença de polietilenogligol e acetato de magnésio durante o período de 10 dias, utilizando-se a técnica de difusão de vapor em gota sentada. A estrutura cristalográfica da enzima Pp 1,2-CCD foi determinada através da utilização da técnica MR-SAD, utilizando átomos de ferro, cofator da proteína, como agentes espalhadores e as coordenadas da enzima 3-clorocatecol 1,2-dioxigenase de Rhodococcus opacus como modelo de busca. O modelo final, contendo 3 moléculas na unidade assimétrica foi refinado a 3.4 Å de resolução. A enzima se enovela na forma dimérica (Fe3+)2, e apresenta de um modo geral, dois domínios catalíticos compostos de fitas-beta e uma região de loops e um domínio de ligação composto por hélices formando um túnel hidrofóbico. Como a primeira clorocatecol de bactérias gram-negativa a ser descrita para essa classe de enzimas, será possível investigar as diferenças conformacionais que levam aos mecanismos de catálise, amplo a diversos substratos, e avaliar características de seu funcionamento e ativação, como uma importante ferramenta para validação do papel desta proteína dentro do processo de biorremediação. / Accumulation of persistent organic pollutants is one of the most important environmental problems worldwide. Industrial activities and technological advances contribute to the spread of pollutants, highly toxic, bioaccumulative, and resistant to physical, chemical, photolytic and biological degradation. The persistent organic pollutants are consequence of the inappropriate use of pesticides, the production of toxic synthetic compounds such as polychlorinated biphenyls and a large list of activities promote incomplete combustion of which organic matter and release a large amount of persistent aromatic hydrocarbons to the environment. Bioremediation is a biotechnogical strategy that has shed light on revitalization techniques of contaminated sites. It is based on the application of microorganisms, or their enzymes, to eliminate or reduce environmental contaminants into inert substances, CO2 and water. The oxygenases are a class of largely studied enzymes due to their catalytic properties, being chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida an interesting biotechnological target for bioremediation due to its specificity to a broad spectrum of highly polluted aromatic substrates. In the present work, heterologous expression protocol has been implemented in our laboratory and purification was performed by using affinity column in chitin resin. Brown-reddish crystals of chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida were obtained in presence of polyethylene glycol (PEG) and magnesium acetate after 10 days, by utilizing vapor diffusion techniques in sitting drops. The crystallographic structure of Pp 1,2-CCD has been solved by MR-SAD technique, using iron atoms, the enzyme cofactor, as scattering centers and the coordinates of 3- chlorocatechol 1,2-dioxygenase of Rhodococcus opacus as the search model. The final model, containing three molecules in the asymmetric unit, has been refined up to 3.4 Å resolution. The enzyme folds in the dimeric form (Fe3+)2, and shows two catalytic domains composed of -strands and a loop region, and a helical domain that pack together forming a hydrophobic channel. As being the first member of the chlorocatechol dioxygenase family of enzymes from a gram-negative bacteria to be solved, it will be possible to explore the crystallographic structure of chlorocatechol 1,2- dioxygenase from Pseudomonas putida in order to investigate the conformational differences that explain its mechanism of action, on a broad spectrum of substrates, and evaluate the functional features, as an important tool to validate the role of this enzyme in the bioremediation process.

A galectina-1 (Gal-1) é uma lectina homodimérica multifuncional capaz de reconhecer e se ligar a beta-galactosídeos por meio de um domínio denominado carbohydrate recognition domain (CRD). A Gal-1 humana (Gal-1h) e a Gal-1 de camundongo (Gal-1c) mantêm 88,15% de homologia e, apesar de não existirem mutações em aminoácidos-chave do CRD, há substituições próximas a esses resíduos. Considerando as implicações dessas diferenças em estrutura e função, e que é comum a utilização de modelos murinos para estudar a função Gal-1, o presente trabalho objetiva analisar comparativamente a Gal-1c e a Gal-1h por meio de ensaios de cristalização e determinação estrutural da Gal-1c, além da avaliação comparativa da atividade lectínica da Gal-1h e da Gal-1c por glycan array e hemaglutinação. Também foi avaliada a capacidade de ambas as Gal-1 em induzir a exposição de fosfatidilserina (FS) em neutrófilos ativados provenientes de medula de camundongos normais ou deficientes de ?-2 integrina (Mac-1), de modo a investigar se a interação Gal-1/Mac-1 estaria envolvida nesse processo. Preparações homogêneas e ativas de Gal-1c e Gal-1h foram utilizadas nos ensaios. Os cristais de Gal-1c foram obtidos em 20% de polietilenoglicol 3350 e 0,2 M de fluoreto de amônio. Os dados de difração de raios X foram coletados e processados, obtendo-se uma estrutura com resolução de 2,4 Å. Observou-se que substituições de aminoácidos entre a Gal-1c e a Gal-1h estão localizadas em regiões expostas ao solvente, próximas do CRD e distantes da interface de dimerização. A análise comparativa entre Gal-1c e Gal-1h mostrou que estas substituições conferem a Gal-1c um caráter mais polar, com consequente aumento da distribuição de volume molecular. Nos ensaios de hemaglutinação, pode-se observar que é necessária uma concentração 2 vezes maior de Gal-1c para aglutinar eritrócitos humanos, de carneiro e de coelho na mesma proporção que a Gal-1h. Por meio do glycan array, pode-se determinar o perfil de ligação a glicanas de ambas as Gal-1. As duas Gal-1 apresentam afinidade por glicanas ramificadas contendo galactose terminal, e a Gal-1h apresentou maior intensidade de ligação às glicanas quando comparada à Gal-1c. Preparações de Gal-1c e Gal-1h induzem níveis semelhantes de exposição de FS na superfície de neutrófilos deficientes ou não de Mac-1, sugerindo que a interação Gal-1/Mac-1 não esteja envolvida no processo de exposição de FS na superfície de neutrófilos ativados. Assim, a diferença sequencial entre a Gal-1c e a Gal-1h é capaz de gerar diferenças estruturais consideráveis que implicam no reconhecimento diferencial de glicanas, o que, entretanto, não se reflete na capacidade de indução de FS na superfície de neutrófilos ativados. Além disso, a interação Gal-1/Mac-1 parece não participar desse processo, o que pode indicar que o papel da Gal-1 no turnover de neutrófilos, via reconhecimento fagocítico, seja um processo complexo e independente dessa interação. / Galectin-1 (Gal-1) is a homodimeric and multifunctional lectin that recognizes and binds to beta-galactoside by a carbohydrate recognition domain (CRD). Human Gal-1 (hGal-1) and mouse Gal-1 (mGal-1) are 88.15% identical, and although there are no mutations in key amino acids within the CRD, there are differences in the amino acids sequence near the CRD. Given the potential of these differences to alter overall structure and function, and the common utilization of murine models to study Gal-1 function, we sought to directly compare key biochemical features of hGal and mGal-1. Thus, we performed crystallization and structure determination assays of mGal-1, and determined the carbohydrate binding specificy of mGal-1 and hGal-1 using a glycan array and using hemagglutination assay. We also evaluated the ability of both Gal-1 to induce exposure of phosphatidylserine (PS) in activated neutrophils from the bone marrow of normal or ?-2 integrin (Mac-1) deficient mice, in order to investigate the involvement of Gal-1/Mac-1 interaction in this process. To accomplish this, homogeneous and active preparations of hGal-1 and mGal-1 were used in the study. mGal-1 crystals were obtained in 20% polyethylene glycol 3350 and 0.2 M ammonium fluoride. Data from X-ray diffraction were collected and processed, yielding a structure with a final resolution of 2.4 Å. The amino acid substitutions found between mGal-1 and hGaI-1 are detected on the solvent-exposed surfaces where the CRDs are located and not on the proteins dimerization surfaces. A comparative structural analysis between mGal-1 and hGal-1 shows that these amino acid substitutions confer to mGal-1 a greater number of ionizable residues, polar character, appearance of the acid regions clustered, and a slight increase of volume distribution. In hemagglutination assays, twice the concentration of mGal-1 was required to cause equivalent agglutination of human, sheep or rabbit erythrocytes as hGal-1. Glycan array analysis demonstrated that both galectins have affinity for branched glycans containing terminal galactose residues. However, hGal-1 appeared to display higher levels of binding that mGal-1. Preparations of mGal-1 and hGal-1 induced similar levels of PS exposure on normal or Mac-1 deficient neutrophils, suggesting that the interaction Gal-1/Mac-1 is not involved in this process. Thus, hGal-1 and mGal-1 appear to possess considerable differences in glycan recognition that likely reflects subtle difference in amino acid sequence. Furthermore, the interaction Gal-1/Mac-1 do not appear to participate in this PS exposure process, which suggest that other Gal-1 receptors are likely important in this process.

Neste trabalho são apresentados os resultados das determinações cristalinas, estruturais e supramoleculares, por difração de raio X, bem como os estudos de \"docking\" , de oito compostos derivados da 1,4-quinona. As estruturas resolvidas e refinadas mostraram a existência de ligações de hidrogênio, não convencionais intra e intermoleculares. Estas últimas permitiram entender o empacotamento cristalino em cada composto. Os resultados cristalográficos foram comparados com aqueles encontrados na literatura. Mas as estruturas correspondentes aos compostos AC1 (6,7-bis-fenilsulfanil-1,4-dihidro-1,4-metano-naftaleno-5,8-diona) e AC6 (6,7-bis-metilsulfanil-1,4-dihidro-1,4-metano-naftaleno-5,8-diol) possuem esqueletos químicos ainda não descritos na cristalografia. Os estudos de \"docking\" foram realizados utilizando as conformações cristalográficas dos oito compostos e da estrutura cristalográfica da tripanotiona redutase, uma proteína, dimérica, envolvida no sistema anti-stress oxidativo no Tripanosoma cruzi, parasita responsável pela enfermidade de Chagas. Foram, então, gerados complexos proteína-ligante no sítio da interface entre monômeros. Os complexos resultantes foram agrupados de acordo com orientações preferenciais e em cada grupo, a estrutura com menor energia total foi selecionada como representante do conjunto e analisado em tela gráfica. Para cada uma das moléculas foram realizados estudos detalhados das suas interações com todos os aminoácidos que as rodeavam. Finalmente, levando em conta as energias envolvidas e as interações foi possível escolher aquela que mostra o melhor encaixe. Dentre todas as moléculas, a AC8 [4a,8a-Dicloro-6-etilsulfanil-7-(metiletil-fenil-amino)-1,4,4a,8a-tetrahidro-1,4-metano-naftaleno-5,8,-diona] foi considerada como a mais promissora, a qual apresentou melhores resultados, um maior número de interações favoráveis com menor energia. / In this work the results of the crystal structure and supramolecular determination by X-ray diffraction together with docking studies, of eight compounds derived from 1,4-quinone, are presented. The solved and refined structures showed the existence of non-conventional hydrogen bonds, intra and inter-molecular. These last ones gave an insight about the crystal packing in each compound. The crystallographic results have been compared with those found in the literature. It should pointed out that structures of compounds AC1 (6,7-bis-phenylsulfanyl-1,4-dihydro-1,4-methano-naphthalene-5,8-dione) and AC6 (6,7-bis-methylsulfanyl-1,4-dihydro-1,4-methane-naphthalene-5,8-diol) have chemical skeletons which were not described before in crystallography. The docking studies have been carried out using the crystallographic conformations of the eight compounds and the crystallographic structure of trypanothione reductase, a dimmeric protein, involved in the anti-stress oxidative system of the Trypanosoma cruzi, the parasite responsible for the Chagas disease. The compounds were docked in the dimmer interface, which is the most likely binding site. The resulting complexes have been clustered together according with their orientation and of each group the one with the lowest total energy was chosen as representative of the cluster and analyzed in graphical screen. Thus, for that complex a detailed study of its interactions with all the neighbor amino acids was done. Finally, taking in account the energies and the interactions it was possible to choose the one that showed the best docking result. Amongst all molecules, the AC8 [4a,8a-dicloro-6-etilsulfanil-7-(metiletil-fenil-amino)-1,4,4a,8a-tetrahidro-1,4-methane-naftaleno-5,8,-diona] was considered as the most promising, which presented better results, a bigger number of favorable interactions with lesser energy.

Os hormônios tireoidianos estão envolvidos em vários efeitos regulatórios, em órgãos diversos. Suas variações no organismo estão relacionadas a quadros clínicos de grande relevância. A presente dissertação trata do estudo de duas proteínas diretamente relacionadas ao complexo sistema regulatório associado a tais hormônios. A primeira delas é a globulina de ligação à tiroxina (TBG), responsável pelo transporte da grande maioria dos hormônios tireoidianos circulantes, e cujas alterações estão relacionadas a falhas na interpretação de testes de avaliação da função tireoidiana, podendo levar a tratamentos desnecessários. A segunda proteína é o receptor tireoidiano (TR), responsável pela mediação dos efeitos regulatórios do hormônio tireoidiano, tendo sua estimulação de atividade transcricional relacionada à ligação do hormônio em um de seus domínios. A TBG foi estudada através da técnica computacional conhecida como modelagem molecular por homologia, aplicada à proteína em sua forma selvagem e a mutantes observados no Brasil, com o intuito de relacionar a inviabilidade de tais mutantes a aspectos estruturais. Foi proposto que, para dois dos mutantes estudados, a formação das estruturas secundárias como na forma nativa da proteína seria inviável, enquanto que para o terceiro mutante a inviabilidade poderia ser causada por enovelamento incorreto causado por uma possível interação entre um resíduo de cisteína adveniente da mutação e outros resíduos do mesmo aminoácido em posição fisicamente próxima. O estudo do TR teve como base as estruturas cristalográficas das duas isoformas humanas do receptor (hTR α e hTR β) quando ligadas ao tiromimético GC-1. Esse composto tem a propriedade de ligar-se preferencialmente à isoforma β, o que pode ter interessantes aplicações farmacológicas. A análise comparativa da ligação do GC-1 às duas isoformas mostrou que, para tal composto, a seletividade se deve a mudanças consideráveis no modo de ligação ao hTR α e hTR β. Para a isoforma , há dois modos de ligação, envolvendo conformações alternativas de ligante e proteína, onde em uma delas a ligação é mais favorável e semelhante à ligação do composto à isoforma , enquanto no outro modo de ligação há a perda de uma interação direta entre composto e proteína, explicando a mais baixa afinidade do GC-1 à isoforma quando comparado à isoforma . O mecanismo de -seletividade para esse composto está relacionado a um átomo de oxigênio específico que não existe no ligante natural do receptor, o que fornece úteis informações para a criação de novos compostos. / The thyroid hormones are involved in various regulatory effects, on diverse organs. Their fluctuations on the body are related to clinical scenarios of great relevance. This work deals with the study of two proteins which are directly related to the regulatory system associated to these hormones. The first one is the thyroxine-binding globulin (TBG), responsible for the transport of a large part of the thyroid hormones in serum, and whose variations are related to misinterpretation of thyroid function tests. The second protein is the thyroid receptor (TR), responsible for the mediation of the thyroid hormone regulatory effects . the transcriptional activity being related to ligand binding to one of the protein domains. The wild-type TBG and three mutants discovered in Brazil were studied by the computational technique known as homology modeling. The purpose of this investigation was to relate protein unviability to structural aspects. It was proposed that, for two mutants, the unviability was related to the impossibility of secondary structure formation as needed to form the native folding, while the third mutant the cause could be the formation of an incorrect folding due to possible interactions involving a cysteine residue created by the mutation and other nearby cysteine residues. The thyroid receptor was studied in the light of the x-ray structures of the two isoforms of the protein (hTR α and hTRβ) bound to GC-1, a synthesized compound which resembles the thyroid hormones. This ligand binds preferably the isoform, a feature that may have interesting pharmacological applications. The comparative analysis of GC-1 binding to the two isoforms allowed the construction of a structural basis of its -selectivity property, which is due to considerable differences in the binding modes for the two isoforms. This involves two different configurations of ligand and protein conformations for the isoform - on one of them, the ligand docks to the molecule the same way it docks to hTRβ, while on the second configuration it loses one direct interaction to the protein, explaining its lower affinity to hTR α when compared to hTRβ. The -selectivity mechanism for this compound is related to a specific oxygen atom which doesn?t exist on the receptor endogenous ligand, providing useful information for the development of new compounds.

Foram analisados, por difração de raios X, dois materiais policristalinos: uma liga de Heusler (C02ScSn), onde amostras originárias da mesma preparação foram submetidas a vários tratamentos térmicos distintos, e um material biocerâmico. Para o refinamento utilizou-se o Método de Rietveld. Na análise feita com a liga de Heusler (C02ScSn) tornou-se evidente uma segunda fase: C02Sn, e que não foi refinada por não haver um modelo de estrutura para a mesma. Assim, o refinamento foi efetuado, apenas para a estrutura conhecida, escolhendo algumas alternativas de função perfil, tais como as funções Gaussiana, pseudo-Voigt e Thompson¬-Cox-Hastings pseudo-Voigt modificada. A radiação de fundo também foi refinada utilizando o polinômio de quinta ordem. Os resultados obtidos foram equivalentes. Dos resultados obtidos nos refinamentos, conclui-se que as condições de preparação das amostras Fl17 (proveniente da amostra original, tratada a 600°C por 60 horas, em seguida moída, tratada a 200°C por 80 horas e submetida a resfriamento lento) e Al17 (proveniente da amostra original, tratada a 800°C por 48 horas e submetida a resfriamento lento), foram as mais satisfatórias. As amostras Fl17 e Al17 foram mais satisfatórias, respectivamente, segundo os índices de discordância do refinamento: qualidade do refinamento, de perfil e de perfil ponderado, e segundo os índices de discordância do refinamento: de Bragg e de fator de estrutura. Pela análise feita com o material biocerâmico tornou-se evidente a presença de duas fases cristalinas: hidroxiapatita [Ca10 (PO4) 6 (OH)2] e whitlockite [βCa3(PO4)2], e com o refinamento foi possível calcular a composição da mistura nas amostras. Pode-se concluir que o processo utilizado na obtenção da amostra HAIII103 ([Jarcho, M., Bolen, H. C., Thomas, M. B., Bobick, J., Kay, J. F. and Doremus, R. H., 1976. J. Matter. Sci., 11, 2027-2035], e homogeneizada com a mistura de colágeno: polímeros hidrofílicos) mostrou-se mais adequado, já que a mesma apresentou-se mais rica em hidroxiapatita. / Two polycrystalline materials were analysed by X-ray diffraction: a Heusler alloy (Co2ScSn), where samples originating from the same preparation were submitted to several different thermal treatments, and a bioceramic material. The Rietveld method was employed for the refinement. The analysis of the Heusler alloy clearly revealed the presence of a second phase: CO2Sn, which was not refined due to the absence of a structural model. Thus, the refinement was performed, only for the component with known structural model, choosing several alternative profile functions such as Gaussian, pseudo-Voigt and Thompson-Cox-Hastings modified pseudo-Voigt. The background radiation also was refined using a fifth order polynomial. The results obtained were equivalent. From the results obtained by the refinement it can be concluded that the preparation conditions of sample Fl17 (arising from the original sample treated at 600OC for 60 hours, ground, treated at 200OC for 80 hours and annealed) and Al17 (arising from the original sample treated at 800OC for 48 hours and annealed) were more satisfactory. The samples F117 and Al17 were more satisfactory, respectivelly, according to the disagreement factors goodness of fit, pattern and weighted pattern, and according to the disagreement factors Bragg and structure factor. The analysis of the bioceramic material clearly revealed the presence of two crystalline phases: hydroxyapatite [Ca10(PO4)6(OH)2] and whitlockite [β-Ca3(PO4)2] and via the refinement it was possible to calculate its composition. The procedure used to obtain sample HAIII103 ([Jarcho, M., Bolen, H. C., Thomas, M. B., Bobick, J., Kay, J. F. and Doremus, R. H., 1976. J. Matter. Sci., 11, 2027-2035], and homogeneized with a mixture of collagenous: hidrophylic polymers) proved to be the most adequate since this sample was richer in hydroxyapatite.

Os explosivos compósitos desenvolvidos no CTA utilizam HMX, que pode existir em 4 formas polimórficas denominadas a, b, g e d. O HMX produzido no IAE cristaliza-se na forma a, que é mais sensível ao atrito e choque durante o manuseio, sendo necessário a recristalização para a forma b-HMX, que é a forma mais estável para utilização. Neste trabalho foi feita a caracterização do b-HMX, quanto a pureza, forma cristalina e formato em várias granulometrias, com a utilização das técnicas Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), Microscopia ótica, Calorimetria exploratória diferencial (DSC), Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e Difração de raios-X. Foi observado que o tamanho da partícula e sua distribuição afetam a temperatura da transição bd-HMX medida por DSC, sendo que quanto mais fina a granulometria mais alta a temperatura da transição. A microscopia ótica e MEV mostraram que as frações não são uniformes quanto ao tamanho e o formato das partículas, com a existência de partículas mal formadas, "clusters". A análise DSC mostrou que o comportamento do "cluster" é diferente dos cristais pequenos, obtendo a transição em temperatura mais baixa do que cristais maiores. MEV mostrou que após a conversão para forma d, as partículas maiores apresentam trincas , o que pode explicar picos múltiplos observados no DSC. O efeito da granulometria sobre a decomposição acompanhou o efeito sobre a transição cristalina, embora de forma pouco significativa.

Filmes epitaxiais de telureto de chumbo e estanho com a concentração de estanho variando em todo o intervalo de composição de liga foram crescidos pela primeira vez poe epitaxia de feixe molecular (MBE) sobre o plano natural de clivagem do substrato de BaF2(111), utilizando-se fontes sólidas distintas de PbTe e SnTe. A largura a meia altura da varredura w/2q refletida pelos planos (222) das amostras, medida com um difratômetro de raios X de alta resolução, foi aproximadamente 400 segundos de grau para as ligas ternárias, e 150 segundos de grau para os compostos binários. A mobilidade Hall a baixa temperatura foi de 5x105cm2V-1s-1 para o PbTe, e 2x103cm2V-1s-1 para o SnTe, embora a qualidade cristalográfica das amostras fossem semelhantes. Este decréscimo na mobilidade é uma conseqüência do aumento de densidade de buracos, que variou de 2x1017cm-3 para 2x1020cm-3 quando a concentração de estanho mudou de 0 para 100%. Este valor elevado de densidade de portadores, nas amostras com alta concentração de estanho, mostrou uma grande mudança no espectro de transmissão no infravermelho medido entre 77 a 300K, devido ao efeito de Burstein-Moss.

O genoma de Xanthomonas citri (Xac) possui mais de 20 tipos de transportadores do tipo ABC incluindo o operon ssuABC associado ao transporte de alcano sulfonatos. Deste operon, escolhemos a proteína periplasmática ligadora de alcano sulfonatos SsuA2, para caracterização e análises espectroscópicas e estruturais. A rSsuA2 foi expressa no citoplasma de células de Escherichia coli e utilizada para a preparação de anticorpos em camundongos, que foram capazes de reconhecer a proteína recombinante, mas não a nativa no extrato de células de Xac. A rSssuA2 apresenta estrutura característica de proteínas alfa-beta, maior estabilidade em pH neutro (7.0), como também foi evidenciado pela obtenção de cristais somente nesta faixa, e pouca flexibilidade ao desenovelamento térmico. Os cristais difratam com resolução de 1.8 Å e pertencem ao grupo espacial de simetria P21. Além do o operon ssu (ssu2) altamente conservado, Xac apresenta o operon tau (ssu1) para captação de taurina. O papel do operon para Xac é discutido. / Xanthomonas citri (Xac) genome has more than 20 different ABC transporters, including the ssuABC operon. In this work, the alkanosulphonate-periplasmic binding protein SsuA2 was chosen for spectroscopic and structural analysis. The rSsuA2 protein was expressed as a soluble form and purified by immobilized metal affinity chromatography. Antibodies produced from the recombinant protein were able to recognize the rSsuA2, but not the native protein in the Xac extract samples. The protein presents secondary structure defined by alfa helices and beta-sheets, high stability in neutral pH and low flexibility to the thermal denaturation. The determination of the optimal pH range was important to produce crystals of high quality diffracting at 1.8 Å with symmetry of the P21 spatial group. Besides the highly conserved operon ssu (ssu2), Xac has the tau operon (ssu1) for taurine uptake.

As glicosidases são enzimas que apresentam uma grande variedade de enovelamentos, assim como uma alta especificidade frente a diferentes substratos. Estas enzimas têm em comum a presença de dois resíduos catalíticos, responsáveis pela clivagem das ligações glicosídicas. O uso de glicosidases nas indústrias têxtil e alimentícia, no processamento de polpa de papel e na síntese de oligossacarídeos tem incentivado a engenharia destas proteínas no sentido de melhorar suas propriedades catalíticas e estabilidade. Estudos estruturais das glicosidases têm aumentado nosso entendimento de seus mecanismos de ação catalitica, assim como dos processos de interação proteína-carboidrato. Neste trabalho apresentamos os estudos cristalográficos de duas glicosidases de fungos, sendo elas a beta-galactosidase de Penicillium sp. e a Exo-inulinase de Aspergillis awamori, assim como estudos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) da beta-xylosidase de Trichoderma reesei. As estruturas cristalográficas da beta-galactosidase e de seu complexo com galactose foram determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.9 A angstron de resolução para a estrutura sem substrato e 2.0 angstron de resolução para o complexo. A estrutura do complexo com galactose foi usada para identificar os resíduos catalíticos, sendo o resíduo Glu 200 identificado como doador de próton e o resíduo Glu 299 como o nucleófílo. As estruturas cristalográficas da Exo-inulinase de Aspergillus awamori e de seu complexo com frutose foram também determinadas pela técnica de substituição isomórfa simples com espalhamento anômalo (SIRAS) até 1.55 angstron e 1.8 angstron de resolução, respectivamente. A partir da estrutura do complexo foi possível identificar os resíduos Asp41 e Glu241 como o nucleófilo e o doador de próton, respectivamente. Além disto, foi possível verificar que o Asp189, o qual faz parte do motivo conservado Arg-Asp-Pro (RDP), é importante no reconhecimento do substrato através de duas pontes de hidrogênio. Com o intuito de obter informações estruturais sobre a P-xylosidase seu envelope foi determinado a partir dos dados do espalhamento de raios-X a baixos ângulos. O envelope da p-xylosidase em solução foi calculado a 20 A de resolução, sendo o raio de giro e a dimensão máxima 36.9 angstron e 90 angstron, respectivamente. Usando algoritmos de reconhecimento de possíveis domínios foi determinado que esta proteína apresenta, além dos dois domínios característicos da família GHF3, um barril TIM e um domínio alfa/beta, um terceiro domínio. A predição da estrutura secundária e os dados de dicroísmo circular indicam que este terceiro domínio apresentaria um enovelamento tipo beta. / Glycosidases belong to a group of enzymes displaying a great variety of protein folds and substrate specificities. Two critically located acidic residues make up the catalytic machinery of these enzymes, responsible for the cleavage of glycosidic bonds. The applications of glycosidases in textile, food, and pulp processing, as well as in catalysts and oligosaccharide synthesis have encouraged the engineering of these proteins in order to obtain improved catalytic properties and stability. Furthermore, structural studies extend our understanding of the catalytic mechanism and the role of glycosidases in the recognition processes of their different substrates. In this work, we describe crystallographic studies of two fungi glycosidases, beta-galactosidase from Penicillium sp and Exo-inulinase from Aspergillis awamori, and the small-angle x-ray scattering (SAXS) studies of another glycosidase, beta-xylosidase (from Trichoderma reesei). The crystallographic structures of j3-galactosidase its complex with galactose were solved by single isomorphous replacement with anomalous scattering (SIRAS) using the quick cryo-soaking technique, at 1.90 angstron and 2.10 angstron resolution, respectively . The X-ray structure of the enzyme-galactose complex was useful in identifying the residue Glu 200 as the proton donor and residue Glu 299 as the nucleophile involved in catalysis. The x-ray structure of exo-inulinase and its complex with fructose were also solved by SIRAS using the quick cryo-soaking technique at 1.55 angstron and 1.8 angstron resolutions, respectively. The solved structure of the enzyme-fructose complex revealed two catalytically important residues, Asp41 and Glu241, as nucleophile and proton donor, respectively. It was also possible to see that residue Asp189, which belongs to the Arg-Asp-Pro motif, provides hydrogen bonds important for substrate recognition. In order to gain structurai insights about the beta-Xylosidase from Trichoderma reesei, we calculated their SAXS envelope. The low resolution shape of this enzyme in solution was obtained fiom synchrotron x-ray scattering data at 20 angstron resolution. The radii of gyration and the maximum dimension of the beta-Xylosidase were calculated to be 36.9 angstron and 90 angstron, respectively. In contrast to the fold of the only structurally characterized member of GHF-3, the beta-D-glucan exohydrolase, which has two distinct domains, the shape of the beta-xylosidase indicates the presence of three domains located in the same plane. Domain recognition algorithms were used to show that the C-terminal part of the mino acid sequence of the protein forms the third domain. Circular dichroism spectroscopy and secondary structure prediction programs show that this additional domain adopts predominantly the B-conformation.

A Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, atinge cerca de um quarto da população da América Latina. Os fármacos disponíveis para o tratamento desta doença são inapropriados, apresentam baixa eficácia e sérios efeitos colaterais que limitam o seu uso. Esse grave panorama torna urgente a descoberta de novos agentes quimioterápicos para o tratamento seguro e eficaz da doença. A via glicolítica é principal forma de obtenção de energia de tripanosomatídeos. Um alvo molecular atrativo desta via bioquímica que desempenha papel essencial no controle do fluxo glicolítico do Trypanosoma cruzi, a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), foi selecionada neste trabalho de Tese para estudos em biologia estrutural e química medicinal visando à identificação e planejamento de novos inibidores enzimáticos. Neste contexto, triagens biológicas resultaram na identificação de compostos de origem natural e sintética com atividade inibitória in vitro frente à GAPDH de T. cruzi, ampliando a diversidade química de moduladores seletivos deste alvo. Estudos cinéticos e estruturais demonstraram o comportamento não cooperativo entre os sítios ativos da enzima GAPDH de T. cruzi em relação à interação com o cofator NAD+, fornecendo importantes evidências mecanísticas e estruturais para uma melhor compreensão das bases moleculares envolvidas no processo de reconhecimento molecular. Os estudos das relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR 2D e QSAR 3D) resultaram na geração de modelos com elevada consistência estatística interna e externa, além de alto poder preditivo da propriedade-alvo. Além disso, estudos de modelagem molecular e de QSAR 3D revelaram aspectos estruturais relevantes para o planejamento de inibidores seletivos da enzima GAPDH de tripanosomatídeos. Por fim, uma estratégia de triagem virtual baseado na estrutura do receptor foi empregada para a identificação de novos inibidores da GAPDH de T. cruzi, consistindo, entre outros, na aplicação de filtros hierárquicos sucessivos envolvendo restrições farmacofóricas e estudos de docagem molecular que resultaram na seleção de 35 candidatos a inibidores da enzima-alvo. Os trabalhos integrando estudos em química medicinal e biologia estrutural apresentados nessa Tese de Doutorado significam importantes contribuições no desenvolvimento de bases científicas sólidas para o planejamento de novos inibidores potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi, um alvo molecular de alta prioridade em nosso grupo de pesquisa. / Parasitic diseases are the foremost threat to human health and welfare around the world. Chagas\' disease (also called American trypanosomiasis) is a tropical parasitic disease which occurs in Latin America, particularly in South America. The currently available drugs for this parasitic disease have severe limitations, including poor efficacy and high toxicity. The crucial dependence of trypanosomatids on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic enzymes promising targets for drug design. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) from Trypanosoma cruzi, a key enzyme in the glycolytic cascade, has been selected as an attractive drug target in this PhD Thesis work for studies in structural biology and medicinal chemistry for the identification and design of new enzyme inhibitors. In this context, compounds from both natural and synthetic sources with in vitro inhibitory activity against T. cruzi GAPDH were identified by screening assays, improving the chemical diversity of selective modulators of the target. Kinetic and structural studies have demonstrated the non-cooperative behavior between the T. cruzi active sites in the interaction with the NAD+ cofactor, shedding some light on the mechanistic and structural determinants underlying the biochemical recognition phenomenon. Quantitative structure-activity relationships (2D QSAR 2D and 3D QSAR) were successfully created, resulting in statistically significant models with good predictive ability for untested compounds. In addition, molecular modeling and 3D QSAR studies highlighted important structural aspects to assist the design of novel trypanosomatid GAPDH inhibitors. Finally, a structure-based virtual screening approach was employed for the identification of novel inhibitors of T. cruzi GAPDH, consisting of several consecutive hierarchical, fast pharmacophore matching and molecular docking, which afforded 35 inhibitor candidates for the target enzyme. The integration of structural biology and medicinal chemistry studies presented in this PhD Thesis are important contributions in the development of strong scientific basis for the design of new selective and potent inhibitors of GAPDH from T. cruzi, a molecular target of highest priority in our research group.