Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T00:17:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Falco_JoseRicardoPenteado_D.pdf: 2833002 bytes, checksum: 94d95638b51ee423178bbf3ea81afed6 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Valores de concentração crítica de eletrólitos (CEC) da cromatina de células (espermatozóides e eritrócitos de frango) conhecidas ou suspeitas de apresentarem variantes da histona HI foram comparados entre si com o objetivo de estabelecer semelhanças ou diferenças nos complexos DNA-proteína em nível citoquímico. A afinidade por moléculas de azul de toluidina em condições de competição com íons Mg2+ foi investigada nos espermatozóides do sapo boi, de ouriços do mar, de abelhas melíferas, de abelhas sem ferrão, de mamangavas e em eritrócitos de frango. Uma íntima relação entre os valores de CEC de Rana catesbeiana e de duas espécies de ouriço do mar com os da cromatina de eritrócitos de frango, que contém a histona H5, foi vista estar de acordo com certas semelhanças bioquímicas e estruturais entre seus complexos DNA-proteína. Quanto aos dados para abelhas, não se pôde associar a variabilidade em valores de CEC com a posição das espécies na respectiva árvore filogenética. Conclui-se, portanto, que a CEC de cromatina de espennatozóides que contêm histona H1 é um indicador útil da influência de variantes de H1 na organização de complexos DNA-proteína, mas é de pouco valor em estudos filogenéticos. Suspeitas cito químicas da presença de histonas H1 na cromatina de espermatozóides de Apis mellifera foram confirmadas através da extração, com PCA 5%, das proteínas básicas nucleares dos espennatozóides de Apis mellifera e eletroforese em gel de poliacrilamida 15% contendo 6,25M de uréia. As bandas detectadas, de pequena mobilidade eletroforética quando comparadas às H1 de timo de bezerro comercial (Sigma) e figado de rato, não foram encontradas em outros órgãos do mesmo animal aqui analisados, sugerindo a presença de histonas H1 com menor basicidade e/ou maior massa molecular relativa e exclusivas de espermatozóides em Apis mellifera / Abstract: The critical electrolyte concentrations (CEC) of spenn chromatin iTom animal species known or suspected to contain histone H1 variants were compared by examining the affinity of their DNA-protein complexes for toluidine blue in the presence of Mg2+. BulliTog, sea urchin, honeybees, stingless bees and bumblebee spennatozoa and chicken erythrocytes were studied. The CEC for Rana catesbeiana and two sea urchin species were similar to that of histone H5-containing chromatin iTom chicken erythrocytes, thus confinning the biochemical and structural similarities of these DNA-protein complexes. The CEC for bees and the bumblebee, Bombus atratus, showed no particular phylogenetic relationship. We conc1uded that the CEC ofhistone Hl-containing spenn cell chromatin is a useful indicator ofvariability _in DNA-protein complexes but is oflittle phylogenetic value. Suspicion that a lysine-rich somatic-like histone (H1) occurs in chromatin spennatozoa of the honey bee were confinned by 5% PCA extraction and electrophoresis in 15% polyacrylamide gels containing 6.25M urea. Five bands with slower migration as compared with the standards were detected. Our data suggest that a lysine-rich histone (H1), spenn specific with lower basic charge density or large molecular mass occurs in the spenn cells of the honey bee / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória. / Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-07-13T16:07:40Z No. of bitstreams: 1 2017_KaianAmorimTeles.pdf: 9165310 bytes, checksum: 0f2627fbc50890dca9c01374109f19e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-28T20:52:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_KaianAmorimTeles.pdf: 9165310 bytes, checksum: 0f2627fbc50890dca9c01374109f19e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T20:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_KaianAmorimTeles.pdf: 9165310 bytes, checksum: 0f2627fbc50890dca9c01374109f19e7 (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / A cromatina é uma estrutura fundamental para a fisiologia celular e pode ser regulada através de uma variedade de pequenas moléculas e proteínas que, em sua maioria, atuam em nível nucleossomal. A competição entre diferentes Proteínas Ligantes de Nucleossomo (NBPs) ajudam a definir o estado final da cromatina. Embora toda a superfície do nucleossomo seja alvo de diferentes NBPs, uma região conhecida como patch acídico é o alvo preferêncial dessas moléculas. A fim de compreender como o impacto que NBPs tem sob o nucleossomo o ensaio de thermal shift foi feito para desvendar como diferentes NBPs afetam a estabilidade desse complexo. Foram utilizadas peptídeos baseados nas NBPs identificadas que se ligam aos nucleossomos conhecidos como Nucleosome Biding Molecules (NBMs). Foi observado que diferentes sítios de ligação que NBMs fazem com o patch acídico induzem diferentes desfechos na desnaturação do nucleossomo. Assim, foi possível criar um mapa das regiões vitais da superfície do nucleossomo responsável pela estabilidade do complexo utilizando os dados estruturais (PDB) do nucleossomo:NBPs, que futuramente pode será utilizado para o desenho racional de fármacos. / The chromatin is a fundamental structure for the cell physiology. It can be regulated trough a variety of small molecules and proteins, most of which acting at a nucleosomal level. The competition among Nucleosome Binding Proteins (NBPs) binding help to define the final chromatin architecture. Although the entire nucleosome surface has been explored by several NBPs, a region known as the acidic patch is at the preferable target. In order to understand how the NBPs impact the nucleosome, thermal shift assay was conducted to understand how different NBPs influence over the stability fo the complex. We used peptides based on the structure of NBPs known as Nucleosome Biding Molecules (NBMs). We were able to identify biding sites that NBMs interact with the acidic patch and induce several denaturation outcomes of the nucleosome. Herein it was possible to create a map of the vital regions of the surface of the nucleosome responsable for the stability of the complex, using structural data (PDB) of the nucleosome:NBPs, that in the future can be used in rational drug design.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-10T17:38:54Z No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) Previous issue date: 2018-04-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O DNA de organismos eucarióticos é organizado sob a forma de cromatina, sendo responsável pela regulação da transcrição, replicação e reparo do DNA. O nucleossomo, unidade fundamental da cromatina, compreende estrutura formada por uma sequência de DNA enrolada no octâmero de histonas, chegando a altos níveis de compactação que dão origem ao cromossomo. Para o estudo da estrutura do nucleossomo, é imprescindível a sua reconstituição in vitro, na qual faz-se necessário um método eficiente para a obtenção de histonas recombinantes. Existem diversos protocolos para expressão e purificação de histonas recombinantes publicados na literatura. Portanto, o objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo para obtenção de histonas canônicas recombinantes. Para estabelecimento do protocolo de expressão, duas cepas competentes de E. coli (Rosetta gami e Rosetta pLysS) foram testadas quanto a capacidade de produzir grande quantidade de histona recombinante por duas diferentes metodologias: expressão clássica com uso de IPTG e expressão espontânea. As histonas foram purificadas por extração de corpos de inclusão seguido por cromatografia de troca iônica. Surpreendentemente, os melhores resultados de expressão, para todas as histonas, foram obtidos pela metodologia de auto-expressão com uso de Rosetta pLysS. No entanto, com exceção da H3, bons resultados também foram adquiridos por expressão clássica com IPTG. Ajustes no protocolo de purificação foram realizados de forma a reduzir a degradação por proteases, grande desafio encontrado nesta etapa. A utilização de associação de inibidores favoreceu a modulação desta degradação. Assim, foi possível estabelecer um método para expressão e purificação de histonas de forma a obter grande quantidade de histona recombinante livres de degradação. / Eukaryotic DNA is organized into chromatin that regulates gene transcription, DNA replication and repair. Nucleosomes, the basic unit of chromatin, are formed by a sequence of DNA wrapped around a histone octamer, achieving high levels of compaction that goes to chromosome. In order to reconstitute nucleosomes in vitro to perform structural studies on chromatin, it is necessary to have an efficient method for recombinant histone production. Although there is several established protocols for expression and purification of recombinant histones, our challenge is to adapt a protocol that will be compatible with laboratory. For establishment of histone expression protocol, two competent E. coli strains (Rosetta gami and Rosetta pLysS) were tested about the ability to produce large amounts of recombinant histone by two different methodologies: classical expression using IPTG and spontaneous expression. The human histones H2A, H2B, H3 e H4 were purified from inclusion body followed by ion exchange chromatography. Surprisingly, the best expression results for all histones were obtained by spontaneous expression methodology using Rosetta pLysS. However, with the exception of H3, good results were also acquired by classical expression with IPTG. Adjustments in purification protocol were performed in order to reduce degradation by proteases, a challenge encountered in this step. The use of association of inhibitors helped the modulation of degradation. Thus, it was possible to establish a method for expression and purification of histones in order to obtain large amounts of recombinant histone free of degradation

A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória. / Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-16T11:25:06Z No. of bitstreams: 1 2013_ManuelaSwertsBatistaLeite.pdf: 2017082 bytes, checksum: 291d02a0409cb1eb39172518522f9905 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-16T12:53:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_ManuelaSwertsBatistaLeite.pdf: 2017082 bytes, checksum: 291d02a0409cb1eb39172518522f9905 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T12:53:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_ManuelaSwertsBatistaLeite.pdf: 2017082 bytes, checksum: 291d02a0409cb1eb39172518522f9905 (MD5) / Em eucariotos, o DNA é organizado na forma de cromatina, cuja estrutura é formada por complexos nucleoproteicos chamados nucleossomos. Na porção proteica dos nucleossomos, há uma região superficial denominada patch acídico, que é alvo de interação de diversas proteínas, tanto oriundas de agentes infecciosos quanto endógenas. O patch acídico participa do mecanismo de compactação da cromatina, processo que dita desfechos de importantes eventos celulares por restringir o acesso de fatores de transcrição e outras proteínas reguladoras ao DNA. Desequilíbrios em modificações estruturais da cromatina são cada vez mais relacionados a doenças. Os objetivos deste trabalho foram: (i) buscar condições de maior estabilidade das longas fibras de cromatina visando futuros estudos estruturais, usando agentes desidratantes (detergentes); (ii) busca por um peptídeo ideal, ligante do patch acídico. Utilizando longas fibras de cromatina reconstituídas in vitro, verificamos distintas ações de detergentes sobre as fibras. A presença de Triton X-100 possibilitou uma melhor reconstituição e formação de diferentes arranjos de nucleossomo in vitro. Além disto, o Triton X-100 mostrou-se como um desestabilizador térmico das longas fibras de cromatina. O CHAPS, por sua vez, não afetou a estabilidade das fibras reconstituídas in vitro. Concluímos que o CHAPS pode ser um bom candidato para uso em futuros estudos estruturais. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In eukaryotic cells, DNA is organized in the form of chromatin, which is formed by nucleoprotein complexes called nucleosomes. In the surface of the protein portion of the nucleosomes, there is a region known as acidic patch, which is the site of interaction of several proteins, both derived from infectious agents as endogenous. The acidic patch also participates in the mechanism of chromatin compaction, a process that dictates important outcomes of cellular events by restricting access of transcription factors and other regulatory proteins to DNA. Unbalances in chromatin structural modifications have been increasingly linked to diseases. The objectives of this study were: (i) find conditions under which long chromatin fibers gain stability, aiming future structural studies, using dehydrating agents (detergents); (ii) search for an ideal peptide, ligand of the acidic patch. Using long chromatin fibers reconstituted in vitro, we found distinct actions of detergents on the fibers. Triton X-100 led to an improved reconstitution and formation of different nucleosome arrays in vitro. Furthermore, Triton X-100 was a thermal destabilizing agent of the long chromatin fibers. CHAPS, in turn, did not affect the stability of the reconstituted fibers in vitro. We concluded that CHAPS might be a good candidate to be used in future structural studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-10-15T13:31:51Z No. of bitstreams: 1 2013_IsabelTorresGomesSilva.pdf: 3349378 bytes, checksum: e037fab7e2667f2730822d4822ab69d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-16T13:36:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_IsabelTorresGomesSilva.pdf: 3349378 bytes, checksum: e037fab7e2667f2730822d4822ab69d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T13:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_IsabelTorresGomesSilva.pdf: 3349378 bytes, checksum: e037fab7e2667f2730822d4822ab69d5 (MD5) / O DNA em seres eucarióticos é organizado na forma de cromatina, sendo esta a principal responsável por regular diversas atividades vitais para célula, como o processo transcricional e a manutenção do genoma. A cromatina é um complexo formado por unidades repetitivas de nucleossomos e pode se apresentar na forma aberta (10nm-permissiva) ou fechada (30nm-repressiva). Está evidente que a dinâmica de modulação da estrutura da cromatina determina a resposta transcricional e consequentemente clínica. Neste trabalho, os objetivos foram: i) estudar a ação do colesterol, um agente desidratante e importante molécula sinalizadora, sobre a arquitetura da fibra de cromatina e ii) estabelecer uma metodologia para obtenção do complexo de Receptor nuclear:mononucleossomo. Observamos, por ensaios bioquímicos e imagens de microscopia eletrônica de transmissão, que o colesterol auxilia a formação de fibras de cromatina de 10 e 30nm reconstituídas in vitro, por direcionar as histonas para interação com o DNA. Entretanto, o colesterol afetou a estabilidade de longas fibras de cromatina. Acreditamos que a alteração da estequiometria das moléculas de água com o nucleossomo, causada pela presença do colesterol, possa ter grande impacto na arquitetura da cromatina e que estes resultados obtidos in vitro sirvam de ponto de partida para novas investigações dentro do contexto celular. Na segunda parte, realizamos uma revisão bibliográfica sobre a ação dos RNs no contexto da cromatina, iniciando a construção de clones, contendo elementos responsivos à RNs com o DNA 601, de forte posicionamento de nucleossomos. Também, preparamos um fragmento de DNA 601 para início das reconstituições de mononucleossomo. Estes resultados irão ajudar a implementação de metodologias para estudos in vitro das interações de RNs a nucleossomos e cromatina. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The genome in eukaryotes is organized into chromatin, which is the main responsible for regulating many vital cell activities, such as the transcriptional process and the maintenance of genome. It is clear that the local chromatin state open (10nm fiber- permissive) or close (30nm fiber - repressive), regulates the access of transcription factors, co-regulators and basic transcription machinery to specific enhancers in target genes. Thus, it seems obvious that the dynamic modulation of the chromatin structure determines transcriptional and clinical outcome. Herein, we aimed: i) to study the action of cholesterol, a dehydrating agent and an important signalling molecule, on the architecture of the chromatin fiber and ii) to establish a methodology for obtaining the complex Nuclear Receptor: nucleosome. We aimed to dissect the role of the water and electrostatic forces on the three dimensional structure of the first level of folding of nucleosome arrays and the higher order structure of chromatin. By comparing long chromatin fibers reconstituted in vitro, in presence and in absence of cholesterol, we observed that cholesterol improves the 10 and 30nm fibers formation by freeing the highly basic histone octamers to interact with the highly negative DNA. However, by thermo-denaturation assays, cholesterol showed to severely affect chromatin fibers stability. These observations suggest that disturbing the water stoichiometry of a chromatin fiber may have a great impact on chromatin architecture. Moreover, these results can be seen as a start point to investigate the effect of cholesterol in vivo as a potential chromatin remodeler. In the second part, I conducted a literature review on the action of RNs in a chromatin context. We also initiated the construction of clones containing responsive elements to RNs with DNA 601that has strong positioning of nucleosomes. Besides that, we prepared a DNA array for nucleosomes reconstitutions in vitro. These results will help to establish a new methodology for in vitro studies of RNs interaction to nucleosomes and chromatin.

A acetilação de histonas está envolvida na plasticidade sináptica e na memória, sendo uma reação reversível catalisada por acetiltransferases de histonas (HATs) e revertida por histonas desacetilases (HDACs). A administração intraperitoneal de butirato sódico (NaB) - inibidor de histonas desacetilases (HDACi), na dose de 1,2 g/kg imediatamente após o treino na tarefa de reconhecimento de objeto novo (NOR), abrandou o prejuízo associado ao envelhecimento em ratos de 24 meses no teste 24 horas após o treino, memória de longa duração (LTM). A mesma dose de NaB administrada i.p. 6 horas após o treino de NOR não tem efeito na LTM em ratos de 18 meses, indicando que a melhora observada pelo HDACi seja temporalmente restrita à fase inicial da consolidação. A injeção de NaB imediatamente após o treino não teve efeito na LTM de NOR em ratos de 3 meses. Em camundongos treinados pelo protocolo de NOR que não induz per se a memória de curta ou longa duração, observou-se memória 24 horas e 7 dias após o treino quando receberam NaB i.p. após o aprendizado. Os animais treinados pelo protocolo de NOR de indução de memória 24 horas - mas não 7 dias - após aprendizado, não apresentam melhora no teste de 7 dias quando receberam NaB i.p. 1 hora antes do referido teste, sugerindo que a inibição de HDACs não tenha efeito na evocação. A administração i.p. de NaB após aquisição reverteu o déficit na memória dos camundongos com a proteína de ligação à CREB com mutação no sítio de ligação à CREB 7 dias após o treino de NOR, indicando que esse sítio não é necessário na melhora da memória de NOR por NaB. A infusão de tricostatina A - um HDACi - imediatamente após o treino na amígdala de camundongos melhorou a LTM de condicionamento aversivo ao contexto, mas não de condicionamento aversivo ao indício sonoro, indicando que o efeito gerado pela inibição de HDACs pode depender do tipo de memória analisada. Este estudo sugere que NaB abranda o prejuízo associado ao envelhecimento na memória de NOR e aumenta a persistência da memória. / Histone acetylation is involved in synaptic plasticity and memory. This reversible reaction is catalysed by histone acetyltransferases (HATs) and reversed by histone deacetylases (HDACs). Systemic administration of sodium butyrate (NaB), an inhibitor of histone deacetylases (HDACi), at 1.2 g/kg (i.p.) immediately after training on a novel object recognition task (NOR), ameliorated aging-related memory impairments in 24 month old rats. The same dose of NaB administred i.p. 6 hours after NOR training had no effect on long-term memory (LTM) in 18 month old rats, indicating that the HDACi memory enhancement is temporaly restricted to the initial phase of consolidation. NaB injection immediately after training had no effect on NOR memory in 3 month old rats. Mice trained in a NOR protocol that does not elicit neither short-term nor long-term memory by itself, when received NaB i.p. after learning, showed memory 24 hours and 7 days after acquisition. Mice trained in a NOR protocol in which memory is observed 24 hours - but not 7 days - after learning, did not show memory enhancement on the 7-day test when received i.p. NaB 1 hour before, suggesting that the HDACs inhibition had no effect on retrieval. Administration of NaB after training reversed the memory deficit at the 7-day test in mice with CREB binding protein mutated on its binding site to CREB, indicating that this site is not necessary for NaB enhancement of NOR memory. Intra-amygdala infusions of the HDACi trichostatin A immediately after training enhanced contextual, but not cued, fear conditioning LTM, indicating that the effect of HDAC inhibition may depend on the memory analysed. This study indicates that NaB ameliorated aging-related NOR memory impairments and produced an enhancement in memory persistence.

Orientador : Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:03:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amaral_MauricioJoseLopesVazdo_M.pdf: 2837363 bytes, checksum: ae54931d05b9272f0e556d6db1a4ba45 (MD5) Previous issue date: 1988 / Resumo: A concentração eletrolítica crítica (CEC) da cromatina corresponde à concentração salina na qual se constata total abolição do fenômeno de metacromasia, quando se usam azul de toluidina como corante catlônico e íons Mg2+ como microcátions. Neste trabalho a CEC foi "determinada em hetero e eucromatina de hepatócitos de camundongo e de células epiteliais de túbulos de Malp1gh1 de Triatoma infestans submetidos a jejum. O objetivo foi determinar variações de CEC que pudessem ser correlacionadas a alterações estruturais e/ou de composição desses tipos cromatínicos, induzidas pelo "stress" do jejum. Constataram-se alterações de CEC na hetero- e na eucromatina de hepatócitos de camundongos e na heterocromatina de células de Triatoma infestans, nas condições de jejum. O padrão de resposta ao jejum, no entanto, variou conforme o materiaI, sugerindo diferenças estruturais entre os tipos cromatínicos considerados. O sensível decréscimo no valor da CEC na hetero cromatina de Triatoma infestans após o jejum certamente se relaciona à sua nítida descompactação nesta situação fisiológica. Já nos hepatócitos; com o jejum, há de início uma compactação de hetero- e eucromatina, evidenciada através do aumento dos valores de CEC e mesmo visualmente, e só então, após tempo mais elevado, decréscimo no valor de CEC e também em compactação cromatínica. A realimentação propiciou a que os valores de CEC se aproximassem aos do controle, sugerindo retomada da compactação cromatínica normal e possivelmente de suas funções / Abstract: The critical electrolyte concentration (CEC) of chromatins corresponds to the salt concentration at which the phenomenon of metachromasy is completely abolished when toluidine blue is used as the cationic dye and Mg2+ ions as microcations. In this work the CEC values were determined in the hetero- and euchromatin of mouse hepatocytes, and in the epithelial cells of the Malpighian tubules of Triantoma infestans all after being submitted to atartion. The objective was to determine variations in CEC which could be correlated to structural alterations and/or to the composition of these types of chromatins induced the by stress of starvation. Under starvation conditions, alterations of the CEC were shown the hetero- and euchromatin of the hepatocytes and in the heterochromatin of the Triatoma infestans cells. The pattern response to starvition, however, varied according to the material, suggesting structural differences between the types of chromatin considered. The noticeable decrease in the CEC value of the heterochromatin Triatoma infestans after starvation is clearly defined unraveling wich occurs under this physiological situation. In the case of starved hepatocytes, there is initially a condensation of hetero- and euchromatin as measured both by an increase in the CEC values and visually, which is followed after a certain time by a decrease in the CEC value and also unpackage of the chromatin. With the resumption of feeding the CEC values approximate those of the control, suggesting a return to normal packing state of the chromatin and possibly a normalization of its functions / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Acompanha memorial / Tese (livre-docencia) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-15T05:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_MariaLuizaSilveira_LD.pdf: 15356664 bytes, checksum: 83c561548b32afe2230e0657048ed338 (MD5) Previous issue date: 1976 / Resumo: Com objetivo de efetuar um estudo comparativo entre as heteocromatinas (cromocentros) e eucromatinas de células epiteliais dos tubos de Malpighi do hemíptero Triatoma insfestans klug, estas forma investigados ao nivel citoquímico e citofísico quantitativo. Foram verificadas diferenças entre tais cromatinas, explicadas com base na variação em proteínas, principalmente não histônicas (tipos, conformação em proteínas, principalmente não histonicas (tipos, conformação molecular e/ou grau de complixação com DNA) e algumas vezes foram deduzidas em função: das partes à reação de Felgen, em termos de curvas de hidrólise (principalmente as diferentes velocidades de solubilização de ácido apurínico em condições especiais de fixação). As eucromatinas nesse caso são menos resistentes á hidrolise ácida do que as heterocromatinas. Da variação em velocidade de remoção ( e em resistência) à hidrólise àcida, pertinete à reação de Feulgen, das proteínas reativas ao fast green a pH 2,7 (proteínas não histônicas removidas com diferentes velocidades e intensidades exporiam o DNA diferentemente à ação solubilizadora do HCl). Dos padrões de basofilia, que são um reflexo da disponibilidade e sequência de de grupos fosfatos do DNA. Das propriedades anisotrópicas das cromatinas coradas com soluções de azul de toluidina. Supõe-se que essas proteínas não histônicas estejam envolvidas, nas eucromatinas, com os processos de depressão e regulação gênica, enquanto nas heterocromatinas, relacionadas com um papel estrutural e talvez mesmo com algum efeito em regulação gênica ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Com objetivo de efetuar um estudo comparativo entre as heteocromatinas (cromocentros) e eucromatinas de células epiteliais dos tubos de Malpighi do hemíptero Triatoma insfestans klug, estas forma investigados ao nivel citoquímico e citofísico quantitativo. Foram verificadas diferenças entre tais cromatinas, explicadas com base na variação em proteínas, principalmente não histônicas (tipos, conformação em proteínas, principalmente não histonicas (tipos, conformação molecular e/ou grau de complixação com DNA) e algumas vezes foram deduzidas em função: das partes à reação de Felgen, em termos de curvas de hidrólise (principalmente as diferentes velocidades de solubilização de ácido apurínico em condições especiais de fixação). As eucromatinas nesse caso são menos resistentes á hidrolise ácida do que as heterocromatinas. Da variação em velocidade de remoção ( e em resistência) à hidrólise àcida, pertinete à reação de Feulgen, das proteínas reativas ao fast green a pH 2,7 (proteínas não histônicas removidas com diferentes velocidades e intensidades exporiam o DNA diferentemente à ação solubilizadora do HCl). Dos padrões de basofilia, que são um reflexo da disponibilidade e sequência de de grupos fosfatos do DNA. Das propriedades anisotrópicas das cromatinas coradas com soluções de azul de toluidina. Supõe-se que essas proteínas não histônicas estejam envolvidas, nas eucromatinas, com os processos de depressão e regulação gênica, enquanto nas heterocromatinas, relacionadas com um papel estrutural e talvez mesmo com algum efeito em regulação gênica ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Tese (livre-docencia) - Univer / Biologia Celular / Livre-Docente