Les microtubules (MTs) sont des constituants hautement dynamiques du cytosquelette, impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la division cellulaire ou le transport d'organites. Leur comportement dynamique est régulé par différents facteurs tels que les +TIPs, qui présentent la particularité de cibler les extrémités en croissance des MTs. Une de ces protéines, EB1, cible de façon autonome ces extrémités et y recrute un grand nombre d'autres +TIPs. Néanmoins, les mécanismes moléculaires impliqués dans cette reconnaissance restent imprécis. Afin de mettre en évidence une caractéristique structurale présente à l'extrémité des MTs en croissance et préférentiellement reconnue par EB1, nous avons utilisé deux approches de cryo-microscopie électronique. Nous avons tout d'abord utilisé une approche d'analyse par particules isolées, dans le but de comparer les reconstructions 3D de MTs assemblés en présence de GTP ou de GMPCPP, analogue lentement hydrolysable du GTP. Par la suite, nous avons utilisé la cryo-tomographie électronique couplée au marquage d'EB1 avec des nanoparticules d'or fonctionnalisées. Nos résultats nous permettent de proposer un modèle de ciblage impliquant une relocalisation de l'extrémité C-terminale d'EB1 lors de la fermeture des feuillets en tube. Cette relocalisation permettrait de recruter les autres +TIPs, et entraînerait une perte d'affinité d'EB1 pour la paroi des microtubules. La comparaison de ces résultats avec des études récentes effectuées par d'autres équipes, et concernant le rôle de l'hydrolyse du GTP dans la liaison d'EB1 avec les MTs, nous permet de proposer un modèle global incluant l'ensemble de ces données. / Microtubules (MTs) are highly dynamic cytoskeleton polymers, involved in many cellular processes, including cell division and intracellular transport. Their dynamic behavior is regulated by numerous factors, such as +TIPs that preferentially target MT growing ends.

Nous avons analysé par cryomicroscopie électronique la morphologie et la structure de longues chaines d’ADN condensées par un polycation tétravalent, la spermine (polyamine). Les expériences ont été réalisées i) avec des solutions de chaînes diluées et ii) avec des chaines isolées confinées dans la capside d’un virus.Les expériences ont été réalisées avec de l’ADN Lambda (48kbp) en solution diluée (0.03 mM Ph) et à faible concentration ionique (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6). Nous avons exploré une large gamme de concentrations en spermine, allant du seuil de précipitation (0.05 mM sp) jusqu’à la limite de re-solubilization et au-delà (400 mM sp). Seize minutes après mélange de l’ADN et de la spermine, les échantillons sont piégés en film mince et vitrifiés à basse température pour garder intactes les conditions ioniques, puis imagés à basse température sous faibles doses d’électrons (cryoMET). La plupart des chaînes d’ADN forment des agrégats de tores de structure hexagonale avec des interdistances entre hélices de 2.93, 2.88, et 2.95 nm pour des concentrations en spermine respectivement égales à 0.05, 1 et 100 mM spermine, ce qui est en bon accord avec les données collectées précédemment par diffraction des rayons X. A concentration plus élevée en spermine (200mM), les tores hexagonaux sont remplacés par des faisceaux cholestériques de structure plus lâche (3.32 nm entre hélices). Nous en déduisons que la forme comme la structure des condensats cristallins liquides ADN-sp sont liées aux interdistances entre hélices et déterminés par les conditions ioniques i.e. par l’énergie cohésive entre chaînes d’ADN. En dehors du domaine de précipitation (400mM sp), les molécules d’ADN forment un réseau soluble de fines fibres (4-6nm de diamètre) qui nous amènent à reconsidérer l’état de ces chaiînes en présence de spermine. Nous avons également conçu des expériences pour visualiser les agrégats formés 6 à 60 sec après addition de la spermine dans les mêmes conditions de tampon. Parmi les nombreuses formes originales que nous avons observées (absentes après 16 min), la présence de fibres étirées ou en hélice, visibles seulement après 9sec, nous conduit à proposer que les chaines d’ADN soient immédiatement étirées après addition de spermine puis relaxent sous forme de fibres hélicoïdales qui donnent naissance à de petits toroids (comprenant quelquefois moins d’une chaine) qui grandissent et fusionnent. Nous avons également analysé les dimensions de l’ensemble des tores observés et montré l’existence de contraintes géométriques qui restent à élucider. Puisqu’il était généralement impossible de prévenir l’agrégation des chaines d’ADN, nous avons choisi une autre approche pour analyser le collapse de chaines d’ADN individuelles. Nous avons utilisé une population de virus T5 contenant une fraction de leur génome initial (12-54 kbp). La molécule d’ADN, initialement confinée dans le petit volume de la capside (de de 80nm diamètre) est collapsée par addition de spermine. Par comparaison avec le premier jeu de données, nous avons travaillé à concentration plus élevée en ADN (0.45 mM Phosphates dans l’ensemble de l’échantillon) et la concentration en spermine a été ajustée entre 0.05 et 0.5 mM (ce qui correspond à des rapports de charges +/- bien inférieurs). Ces expériences ont donc été réalisées au voisinage de la ligne de précipitation, dans la « région de coexistence », entre le domaine où les chaines sont en condition de pelote et le domaine ou les chaines sont toutes collapsées sous forme de tores. Nous avons montré l’existence de formes intermédiaires entre ces deux états que nous appelons « tores chevelus » dans lesquels une partie de la molécule est condensées dans le tore alors que l’autre partie reste non condensée. Les distances entre hélices ont également été mesurées. Elles sont plus grandes dans ces structures intermédiaires que dans les tores formés à plus forte concentration en spermine. Ces deux séries d’expériences montrent l’intérêt des méthodes de cryo-microscopie pour étudier la structure locale des phases condensées de l’ADN. Nous avons montré comment le confinement modifie le comportement de l’ADN en solution et l’intérêt d’étudier ces effets compte tenu de son importance dans le contexte biologique. / By using cryo-electron microscopy, we analyzed the morphology and structure of long double-stranded DNA chains condensed upon addition of varying amounts of the tetravalent polycation spermine (polyamine). Experiments have been performed i) with chains diluted in the bulk and ii) with individual chains confined in a virus capsid.Bulk experiments have been done with lambda DNA (48.5 kbp) at low concentration (0.03 mM Ph) and in low salt conditions (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6). We explored a wide range of spermine concentration, from the onset of precipitation (0.05 mM sp) up to above the resolubilization limit (400 mM sp). Sixteen min after mixing spermine and DNA, samples have been trapped in thin films and vitrified in liquid ethane to keep ionic conditions unchanged, and imaged at low temperature with low doses of electrons (cryoTEM). DNA chains mostly form large aggregates of toroids in which DNA chains are hexagonally packed with interhelical spacings of 2.93, 2.88, and 2.95 nm at 0.05, 1 and 100 mM spermine, respectively, in agreement with previous X-ray data. At higher spermine concentration (200 mM), hexagonal toroids are replaced by cholesteric bundles with a larger interhelical spacing (3.32 nm). We conclude that the shape and the structure of the liquid crystalline sp-DNA condensates are linked to the DNA interhelix spacing and determined by the ionic conditions i.e. by the cohesive energy between DNA strands. Outside of the precipitation domain (400 mM spermine), DNA chains form a soluble network of thin fibers (4-6 nm in diameter) that let us reconsider the state of these DNA chains in excess of spermine. We also designed experiments to visualize condensates formed 6-60 sec after mixing Lambda DNA with 0.05 mM spermine, under identical buffer conditions. Among multiple original shapes (not found after 16 min), the presence of stretched and helical elongated fibers seen only 9sec after addition of spermine let us propose that DNA chains are immediately stretched upon addition of spermine, relax into helical structures and finally form small toroids (containing in some cases less than one Lambda chain) that further grow and aggregate. We also analyzed the dimensions and structural details of the complete collection of toroids, and reveal the existence of geometric constraints that remain to be clarified. Since it was only exceptionally possible to prevent the aggregation of DNA in dilute solution, we used another approach to observe the collapse of single DNA chains. We handled a population of T5 viruses containing a fraction of their initial genome (12-54 kbp long). The Na-DNA chain, initially confined in the small volume of the capsid (80nm in diameter) is collapsed by the addition of spermine. Compared to the first set of experiments, we explored a higher DNA concentration range (0.45 mM Phosphates in the whole sample) and the spermine concentration was varied from 0.05 to 0.5 mM (which corresponds to much lower +/- charge ratios). Experiments are thus performed close to the precipitation line, in the coexistence region, between the region where all chains are in a coil conformation, and the region where all chains are collapsed into toroids. We describe the existence of intermediate states between the coil and the toroidal globule that were not reported yet. In these “hairy toroids”, part of the DNA chain is condensed in the toroid and the other part stays uncondensed outside of it. The interhelical spacing was also measured; it is larger in these partly-condensed toroids than in the fully organized toroids formed at higher spermine concentration.These two series of experiments show the interest of cryoEM to analyze the structural polymorphism and local structure of spermine-DNA aggregates. We also demonstrated how the confinement interferes with DNA condensation and the interest to investigate such effects that are important in the biological context.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La cryo-microscopie électronique a connu une révolution majeure ces dernières années, liée à des évolutions technologiques importantes, tant au niveau des microscopes, que des caméras ou des logiciels de traitement d’images. Ainsi, avec l’arrivée de microscopes électroniques plus stables mécaniquement et électroniquement, il est possible d’enregistrer plusieurs milliers d’images de façon automatique en quelques jours, et par conséquent d’obtenir un jeu initial d’images conséquent des particules des complexes protéiques étudiés. Sauf que maintenant, il ne s’agit plus d’image au sens strict, mais de film. En effet, les nouvelles caméras, dites à détection directe d’électrons, permettent de décomposer l’image en plusieurs fractions d’images au cours de l’exposition, et ce, avec une sensibilité dix fois supérieure par rapport à celle des anciennes caméras. L’analyse de ces fractions d’images a permis de montrer que les particules protéiques, bien que piégées dans une mince pellicule de glace, bougeaient sous l’effet du faisceau d’électrons. L’alignement des fractions et leur sommation permettent ainsi de corriger ces mouvements, améliorant la qualité du signal contenu dans chaque image. Ainsi, alors que pendant des dizaines d’années, les informations structurales extraites des images des microscopes électroniques étaient limitées à la moyenne résolution, c’est à dire entre 5 et 15 Å de résolution, nous voyons apparaître depuis ces deux-trois dernières années, de très nombreuses cartes de densités électroniques de complexes protéiques issues de la microscopie électronique, à des résolutions inférieures à 4 Å, permettant de construire des modèles atomiques à l’aide d’outils jusqu’alors réservés à la cristallographie aux rayons X. C’est dans ce contexte, que j’ai étudié par cryo-microscopie électronique et traitement d’images, l’organisation structurale de trois virus de plante :- Le virus de la mosaïque de l’arabette (ArMV), un Nepovirus uniquement transmis par le nématode Xiphinema diversicaudatum, qui est responsable de la maladie du court-noué de la vigne. -Le virus de la tâche de la fève (BBSV), un Comovirus transmis par les coléoptères, responsable de la dégénération chez les légumineuses.- Le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV), un Caulimovirus servant de virus modèle pour l’étude de la transmission des virus non circulants.Les virus sont des parasites endocellulaires obligatoires, dont l’efficacité dépend de leur capacité de réplication au sein de la cellule infectée et de leur transmission vers de nouveaux hôtes. En raison de l’immobilité des plantes, les phytovirus font souvent appel à des vecteurs pour la transmission plante à plante, qui sont principalement des insectes, des nématodes, des champignons ou des acariens. Les phytovirus sont généralement responsables d’une baisse importante de croissance de la plante et des fruits, voire de la mort de l’hôte infecté. Les dégâts ainsi causés engendrent des pertes de rendement dans les cultures partout dans le monde, se traduisant par d’énormes pertes économiques pour les cultivateurs. Ce travail de thèse présente les structures atomiques de l’ArMV et du BBSV obtenues par cryo-microscopie électronique, ainsi que les premiers résultats obtenus sur la structure de la capside du CaMV, et sa protéine de transmission P2. / A revolution has taken over the world of cryo-electron microscopy for the last years, by dint of a major breakthrough both in technology, with the rise of new microscopes and cameras, and in image processing. With the advent of high-end microscopes, mechanically and electronically more stable, one can expect to record an initial data set of thousand images in few days, thanks to automated acquisition. Besides, the new direct electron detectors can not only record images, but also movies with a better sensitivity than the one we used to have. The movie processing revealed the existence of a beam-induced motion occurring during acquisition. The correction of the motion through frame alignment improves significantly the quality of data. Thus, cryo-electron microscopy was only limited to a middle resolution range (5 to 15 Å) until two or three years ago, when several density maps above 4 Å started to appear, allowing the building of atomic model using tools that were only restricted to X-ray crystallography.In this context, I have studied the structural organization of three plant viruses, using cryo-electron microscopy and image processing:- Arabis Mosaic Virus (ArMV), it’s a Nepovirus only transmitted by the nematode Xiphinema diversicaudatum, responsible for disease of vineyards.- Broad Bean Stain Virus (BBSV), it’s a Comovirus transmitted by beetles, responsible for the degeneration of leguminous plants.- Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), it’s a Caulimovirus used as model to characterize the transmission of non circulative viruses.Viruses are obligate intracellular parasites, which efficiency is directly related to its replicative capacity inside the infected cell, and its transmission to new hosts. Due to the immobility of plants, plant viruses often use vectors for the transmission plant to plant, which are mainly insects, nematodes, fungi or mites. Plant viruses are generally responsible for a significant decrease in plant and fruit growth, and even the death of the plant. The plant viruses are devasting fields worldwide, causing huge loss in crop yield each year. This study highlights the atomic structures of ArMV and BBSV, as well as the first data about the CaMV capsid and its transmission protein.

Ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre du projet ISS/FSL/FASES dont l’objectif est de comprendre les mécanismes de vieillissement des émulsions en microgravité. Ce manuscrit est dédié à l’étude au sol des émulsions de ce projet et notamment de celles stabilisées par des mélanges tensioactifs/nanoparticules. Ces émulsions sont diluées et constituées d’une phase continue d’huile de paraffine et d’une phase dispersée aqueuse contenant un tensioactif et des nanoparticules. Leur étude et leur caractérisation est réalisée par microscopie tomographique optique et cryo-microscopie électronique à balayage. Une étude préalable de la phase dispersée permet de démontrer que les proportions respectives en tensioactif et nanoparticules modifient les propriétés rhéologiques et microscopiques de ces mélanges. Ces modifications permettent de caractériser le couplage entre les molécules tensioactives et les nanoparticules. Lorsque cette phase dispersée est émulsifiée dans l’huile de paraffine, une transition dans la morphologie des gouttes peut être mise en évidence. Les gouttes de phase dispersée présentent une topologie dépendante du ratio des concentrations en tensioactif et nanoparticules : de sphérique (pour les grandes valeurs de ce ratio) elles deviennent polymorphes (pour les petites valeurs). L’observation de ces émulsions en cryo-microscopie électronique à balayage permet de visualiser des microstructures de nanoparticules et d’expliquer l’origine de la déformation des gouttes. / This thesis is part of the ISS/FSL/FASES project which aims at understanding emulsion ageing mechanisms in microgravity. This manuscript is dedicated to the ground study of these emulsions, and particularly to those stabilized by surfactant/nanoparticles mixtures. These emulsions are diluted and composed of a paraffin oil continuous phase and an aqueous dispersed phase composed of the surfactant/particle mixtures. Emulsion characterization is performed with optical tomographic microscopy and cryo-scanning electron microscopy. A preliminary investigation of the dispersed phase shows that the proportion of surfactant and nanoparticles changes the rheological and microscopic properties of these mixtures. These changes allow the characterization of the coupling between surfactant molecules and nanoparticles. When these mixtures are emulsified in paraffin oil, a transition in the droplets morphology is evidenced. Indeed, dispersed phase droplets exhibit different shapes depending on the ratio of surfactant and nanoparticle concentrations: from spherical (for high ratios) they become polymorphous (for small ratios). Observations of these emulsions with cryo-scanning electron microscopy show the existence of nanoparticles microstructures that helps the understanding of the origin of droplets deformation.

Les récepteurs nucléaires (RNs) sont des facteurs de transcriptions se liant à des séquences spécifiques d'ADN et activant la transcription de gènes en réponse à la fixation de ligands spécifiques. Parmi tous les RNs impliquées dans l'étiologie des cancers, les récepteurs liés aux œstrogènes ERR jouent un rôle important dans les cancers du sein, de l'ovaire, du colon, de l’endomètre et la prostate. Ce RN est dit orphelin car il ne possède pas de ligand naturel connu à ce jour. Par une approche de biologie structurale intégrative combinant cryo-microscopie électronique, bioinformatique et évolution, mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude structurale de ERR et sur l'origine et l'évolution des RNs. Dans ce contexte, 3 outils informatiques ont été développés. Les résultats obtenus ont permis d'une part la révision des connaissances fondamentales sur l'origine des récepteurs nucléaires et leur évolution. D'autre part, l'étude structurale de ERR a permis d'acquérir de nouvelles données sur la topologie des récepteurs nucléaires stéroidiens fixés sur un élément de réponse ERRE/ERE ainsi que sur le mécanisme allostérique de la liaison du coactivateur PGC-1α sur le dimère de ERR. La résolution du complexe à l'échelle atomique par cryo-microscopie électronique permettra d'ouvrir la voie vers la conception de nouvelles molécules thérapeutiques. / Nuclear receptors (NRs) are transcription factors which bind to specific DNA sequences and activate gene transcription in response to the binding of specific ligands. Among all of the RNs involved in the etiology of cancers, ERR estrogen receptors play an important role in breast, ovarian, colon, endometrial and prostate cancers. This NR is said to be orphan because it does not have a natural ligand known to date. Using an integrative structural biology approach combining cryo-electron microscopy, bioinformatics and evolution, my PhD work focused on the structural study of ERR and the origin and evolution of RNs. In this context, three informatic tools have been developed. The results obtained allowed, on the one hand, the revision of fundamental knowledge on the origin of nuclear receptors and their evolution. On the other hand, structural study of ERR allow us to acquire new data on topology of steroid nuclear receptors fixed on an element of ERRE / ERE response as well as on the allosteric mechanism of the binding of the coactivator PGC-1α on the dimer of ERR. The resolution of the complex at the atomic scale by cryo-electron microscopy will open the way towards the design of new therapeutic molecules.

Les ADN topoisomérases régulent la topologie de l’ADN lors des processus cellulaires tels que la réplication, la transcription ou la ségrégation des chromosomes au cours de la division cellulaire. Leur rôle crucial dans le maintien de l’intégrité du génome et dans la transmission des gènes en fait des cibles privilégiées pour le développement de molécules thérapeutiques. Cependant, les inhibiteurs utilisés actuellement comme agents anti-tumoraux contre les topoisomérases humaines sont peu spécifiques et entrainent de nombreux effets secondaires. De même, l’utilisation massive d’antibiotiques à large spectre contre les topoisomérases bactériennes entraine l’apparition de mutations et le développement de souches résistantes. L'amélioration des traitements dépend de notre compréhension du mécanisme catalytique, des fonctions cellulaires précises, des architectures tridimensionnelles et des processus d'inhibition de ces ADN topoisomérases. Nous nous sommes tout d’abord consacrés à l’étude structurale de l’interaction entre la Coumermycine-A1, un antibiotique de la famille des aminocoumarines, avec le domaine ATPase de l’ADN Gyrase, une topoisomérase 2A bactérienne. Les résultats obtenus ont révélé un mode d’inhibition inédit et ouvrent la voie à la conception de nouveaux dérivés de cet antibiotique, ciblant plus spécifiquement les ADN Gyrases de pathogènes. La seconde partie de la thèse a consisté en l’étude de l’architecture complète de l’ADN Gyrase et de l’isoforme alpha de la Topo II humaine par Cryo-microscopie électronique. Les données structurales obtenues révèlent pour la première fois l’architecture complète de ces topoisomérases à haute résolution. L’ensemble des résultats apporte de nouveaux éléments pour la compréhension des mouvements allostériques des topoisomérases 2A lors du cycle catalytique. Ces données, jusque-là inaccessibles par les méthodes structurales conventionnelles, sont essentielles pour le développement de nouvelles molécules inhibitrices pouvant cibler spécifiquement différents états catalytiques. / DNA topoisomerases regulate DNA topology during cellular processes such as replication, transcription or chromosome segregation. Their crucial role in maintaining the integrity of the genome and in genetic transmission makes them prime targets for the development of therapeutic molecules. However, the inhibitors currently used as anti-tumor agents against human topoisomerases are not very specific and cause many side effects. Similarly, the massive use of broad-spectrum antibiotics against bacterial topoisomerases leads to the appearance of mutations and the development of resistant strains. The optimization of current therapeutics depends on our understanding of the catalytic mechanism, the precise cellular functions, the complete three-dimensional architectures and the inhibition processes of these topoisomerases. This study first focused on the structural characterization of the interaction between Coumermycin-A1, an aminocoumarin antibiotic, with the ATPase domain of DNA Gyrase, a bacterial Type 2A topoisomerase. The results obtained revealed an unprecedented mode of inhibition and pave the way to the design of new variants of this antibiotic, specifically targeting pathogenic DNA Gyrases. The second part of the thesis consisted in the study of the complete architecture of the DNA Gyrase and the human Topo II alpha isoform by Cryo-electron microscopy. The structural data obtained reveal for the first time the complete architecture of these topoisomerases at high-resolution. The results shed light on the finely-tuned allosteric movements of topoisomerases 2A during the catalytic cycle. These information, until now out of reach using the conventional structural methods, are essential for the development of new inhibitory molecules that can specifically target different catalytic states.

La biogenèse des ribosomes eucaryotes est un processus complexe qui implique la production et l'assemblage de 4 ARNr et 80 protéines. La production des deux sous-unités du ribosome, 40S et 60S, débute dans le nucléole par la synthèse d'un long précurseur commun contenant les séquences des ARNr matures et se termine dans le cytoplasme où ont lieu les dernières étapes d'assemblage des protéines ribosomiques et de clivage des ARNr. La production de ribosomes nécessite la participation de plus de 200 co-facteurs, qui catalysent les clivages et modifications des ARNr, coordonnent leur repliement et leur association aux protéines ribosomiques, et assurent des étapes de contrôle-qualité. Ces protéines sont associées aux particules en cours de maturation et absentes des sous-unités matures. Cette voie de synthèse, globalement conservée chez les eucaryotes, a été principalement étudiée chez la levure. Cependant, des études récentes ont montré des différences importantes de ce processus entre levure et mammifères. Un des verrous importants pour comprendre la fonction des co-facteurs, est l'absence de données sur la structure des précurseurs des sous-unités ribosomiques. J'ai donc entrepris une étude structurale de l'assemblage cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomique chez l'homme par cryo-microscopie électronique à transmission. Le but de ma thèse était de déterminer la structure 3D des précurseurs de la petite sous-unité ribosomique purifiés à différentes étape de leur maturation. Ce travail a été conduit en collaboration avec l'équipe du Pr. Ulrike Kutay (ETH Zurich) pour la purification des particules pré-40S à partir de cellules humaines. La première structure 3D de particule pré-40S intermédiaire purifiée en étiquetant le co-facteur LTV1 a été déterminée à 19Å de résolution. Dans un deuxième temps, la structure 3D de la particule pré-40S tardive purifiée à via RIO1(KD) a aussi été déterminée à 15Å de résolution. Ces données nous ont permis de proposer un modèle de localisation des co-facteurs sur les précurseurs de la petite sous-unité ribosomique et de montrer une nouvelle différence dans la formation de la petite sous-unité chez l'Homme comparé à la levure, du fait de la présence de la protéine RACK1 sur les particules pré-40S humaines. La comparaison des structures des précurseurs de la petite sous-unité obtenues a permis de mettre en lumière l'existence de remodelages structuraux de la particule pré-40S au cours de sa maturation. Ce travail met en lumière les premières structures 3D de particules pré-40S humaines et pose les fondements méthodologiques d'explorations futures de la dynamique structurale des particules pré-ribosomiques. / Ribosome biogenesis is a complex process that requires the production and the correct assembly of the 4 rRNAs with 80 ribosomal proteins. In Human, the production of the two subunits, 40S and 60S, is initiated by the transcription of a pre-ribosomal rRNA precursor to the mature 18S, 5.8S, and 28S rRNAs by the RNA polymerase I, which is chemically modified and trimmed by endo- and exoribonuclease, in order to form the mature rRNAs. The nascent pre rRNA associated with ribosomal proteins, small ribonucleoprotein particles (snoRNP) and so called co-factors leading to the assembly of an initial 90S particle. This particle is then split into pre-40S and pre-60S pre-ribosomal particles that fallow independent maturation to form the mature subunit into the cytoplasm. Production of eukaryotic ribosomes implies the transient intervention of more than 200 associated proteins and ribonucleoprotein particles, that are absent from the mature subunits. Synthesis of ribosome, globally conserved in eukaryotes, has been principally studied in yeast. However, recent studies reveal that this process is more complex in human compared in yeast. An important bottleneck in this domain is the lack of structural data concerning the formation of intermediate ribosomal subunits to understand the function of assembly factors. Determination of the structural remodeling of pre-ribosomal particles is crucial to understand the molecular mechanism of this complex process. So I have undertaken a structural study on the assembly of the small ribosomal subunit using cryo-electron microscopy and image analysis. The goal of my thesis is to determine the 3D structures of human pre-40S particles at different maturation stages to see the structural remodeling that occurs during the biogenesis of the small ribosomal subunit. We are collaborating with the group of Pr Ulrike Kutay at ETH Zurich, who purify human pre-40S particles. The 3D structures of human pre-40S particles purified at an intermediate and late maturation stages, has been determined with a resolution of 19 and 15Å respectively. Supplementary densities, compared to the mature subunit, indicate the presence of assembly factors and show the unexpected presence of the RACK1 protein in the precursor of the human small ribosomal subunit in the cytoplasm. The comparison of the 3D structures of human pre-40S particle allows showing the structural remodeling that occur during the maturation of the small ribosomal subunit. This work provides the first 3D structure of human pre-40S particles and laid the methodological foundations for future exploration of the structural dynamics of pre-ribosomal particles.

L'organisation de la chromatine eucaryote ainsi que les mécanismes qui régulent sa compaction restent discutés. Nous proposons de comprendre le rôle de variations locales de charges et de concentrations ioniques dans l'organisation supramoléculaire de la chromatine. Nous utilisons un système modèle, la particule cœur de nucléosome (NCP) constituée de 146pb d'ADN qui s'enroulent autour d'un octamère d'histones sur un 1.75 tours. Les extensions terminales des histones, les queues, sont mobiles et positivement chargées. A l'aide de NCPs reconstituées à partir d'ADN et d'histones intactes ou globulaires recombinants, nous montrons que les queues des histones H3 et H4 sont essentielles pour l'établissement d'interactions attractives entre NCPs, en solution diluée. Le rôle d'ions multivalents dans les interactions entre NCPs et la formation de précipités ont été étudiés. Le rôle des queues d'histones est également abordé pour la formation de phases denses obtenues sous stress osmotique.

Nous avons utilisé la méthode de CEMOVIS (Cryo-Electron Microscopy Of Vitreous Sections) pour étudier l'ultrastructure des cellules HT29 (lignée cancéreuse colique humaine) et plus particulièrement l'organisation de la chromatine au sein du noyau. Pour améliorer la méthode, nous avons développé un micromanipulateur qui facilite la collecte des coupes et leur transfert sur la grille. Nous avons également cherché à préparer de nouveaux films métalliques (en remplacement du carbone) permettant une meilleure adhésion des coupes sur le support Au vu des premiers tests réalisés, les films de TiO2 que nous avons fabriqués au laboratoire et caractérisés par microscopie électronique (HR, spectroscopie et cartographie EELS) semblent offrir des perspectives intéressantes que nous attribuons à leur propriétés de conducteur électrique à basse température (ce qui reste à démontrer). Les organites cellulaires (noyaux, réseaux de filaments du cytosquelette, systèmes multilamellaires) ont été identifiés in situ. Les conditions d'imagerie choisies nous ont permis d'obtenir une résolution permettant d'identifier les deux feuillets des bicouches membranaires. Dans le noyau, nous avons observé des motifs striés, distants de 2.7 à 3.5 nm que nous attribuons à la molécule d'ADN enroulée autour du cœur d'histones. Comparées aux images de phases denses de nucléosomes, ces images suggèrent que les nucléosomes (jamais identifiés in situ jusqu'à présent) présentent un ordre très local au sein de la chromatine, que nous discutons à la lumières des modèles polymériques actuels.