En les últimes dues dècades, la teràpia gènica ha permès plantejar noves aproximacions en l'àmbit de la medicina personalitzada. Es troba orientada a guarir malalties actualment incurables i/o a millorar ostensiblement la qualitat de vida dels pacients, gràcies a la introducció de material genètic al nucli de la cèl·lula diana per permetre, augmentar o suprimir l'expressió d'un gen específic amb finalitat terapèutica. El vector és l'agent que juga el paper cabdal en aquest mecanisme. D'entre els possibles tipus (virals i no virals), destaca el vector adenoviral per la seva preeminència en els actuals assajos preclínics amb humans i per la necessitat de proveir demandes de mercat importants. El present treball aborda el desenvolupament complet d'un bioprocés per a l'obtenció de vectors adenovirals per a teràpia gènica: estudia els diferents aspectes que conformen el bioprocés, i analitza la implementació a escala industrial de la millor alternativa possible. Com a punt de partida, es realitzen estudis previs per conèixer la interacció dels vectors adenovirals amb les línies cel·lulars productores existents. S'aprofundeix en les tècniques de cultiu de dos candidats cel·lulars concrets: HEK293 (adherent) i HEK293S (no adherent). A partir de la infecció d'ambdós amb el vector adenoviral, es caracteritzen els principals paràmetres del cicle infectiu, els quals permeten concloure que la línia cel·lular HEK293S resulta més apropiada en base a una major productivitat. Aquestes dades proporcionen la base per desenvolupar l'etapa de producció del bioprocés. Aquesta s'estructura entorn als tres factors fonamentals que descriuen la bioreacció (el monitoratge, l'estratègia i el sistema de producció), els quals s'analitzen en profunditat. Es demostra la validesa del mètode de la velocitat de consum d'oxigen (OUR) per realitzar el monitoratge en línia de l'activitat cel·lular durant les fases de creixement i d'infecció. Posteriorment, es decideix avaluar dues estratègies de producció: l'estratègia en discontinu (estratègia de referència) i l'estratègia en continu amb perfusió (estratègia que proporciona les condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo). Finalment, s'apliquen els anteriors factors en l'anàlisi del sistema de producció, en concret, amb la utilització de dues alternatives: l'anomenat sistema convencional (bioreactor de tanc agitat Biostat Bplus) i el sistema no convencional (bioreactor basat en tecnologia d'un sol ús Wave Bioreactor). A partir dels resultats obtinguts, es pot constatar que l'estratègia de producció en continu amb perfusió proporciona elevades concentracions cel·lulars, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració vírica final. D'altra banda, també es posen de manifest els avantatges operacionals del sistema de cultiu no convencional, encara que sacrificant la possibilitat d'utilitzar la mesura de la velocitat de consum d'oxigen (OUR). Per tal de completar el treball, es desenvolupa l'etapa de purificació del bioprocés. En aquesta s'analitzen les propietats del producte i del brou de cultiu, i s'avaluen dues estratègies de purificació. Aquestes es diferencien fonamentalment per la seva possibilitat de facilitar el canvi d'escala, de manera que es designen com a estratègia de purificació no escalable (basada en la ultracentrifugació) i escalable (basada en la cromatografia). La primera és comunament emprada a escala de laboratori; donat que es recull específicament la banda de densitat que conté el vector adenoviral, s'implementa per obtenir material amb una elevada puresa que serveixi com a referència a l'hora de comparar els resultats obtinguts amb l'estratègia escalable. Per portar a terme aquesta última, es dissenyen les operacions que la integren, i es determinen els paràmetres de purificació, entre ells el rendiment global de recuperació del producte final. Posteriorment, es realitza la caracterització del producte per determinar el seu grau de puresa. Els resultats obtinguts deixen palès que l'estratègia escalable presenta un rendiment global superior al de la no escalable, tot i que el grau de puresa aconseguit és inferior. Les dades experimentals, tant de la producció com de la purificació, permeten disposar de quatre alternatives amb l'objectiu d'analitzar la potencial implantació del bioprocés a escala industrial. El disseny i la comparació de les mateixes es realitza d'acord amb el seu dimensionament seguint unes bases de disseny comunes, i la seva valoració final es projecta en termes econòmics. A partir dels resultats obtinguts, l'alternativa més aconsellable d'ésser portada a la pràctica és la basada en el bioprocés integrat pel sistema de producció no convencional operant en continu amb perfusió. Aquesta memòria s'estructura, doncs, de manera que inicialment es fa una introducció (capítol 2), on es revisen les característiques de la teràpia gènica, dels vectors adenovirals i de les línies cel·lulars productores, així com del bioprocés i de l'estricta normativa de producció GMP que el regeix. Seguidament (capítol 3), es plantegen els principals objectius del treball. A continuació (capítol 4), es concentren els estudis previs que caracteritzen tant la línia cel·lular productora com la infecció amb el vector adenoviral. Al capítol 5, es presenta el desenvolupament de l'etapa de producció del bioprocés. Anàlogament, en el capítol 6, es desenvolupa l'etapa de purificació del mateix. En el capítol 7, es realitza l'anàlisi de procés de les alternatives sorgides. En el capítol 8, s'exposen les principals conclusions extretes del treball. Finalment, es presenten els materials i mètodes emprats (capítol 9), i s'afegeix l'apèndix (capítol 10), on es complementen alguns aspectes concrets d'aquest treball. / For the last two decades, gene therapy has allowed to bring up new approaches in personal medicine. Its goal is to cure illnesses through the introduction of genetic material to the nucleus of a target cell in order to allow, increase or suppress the expression of a specific gene with therapeutic purpose. The vector is the agent that plays the principal role in this mechanism. Among the possible types (viral and non viral), the adenoviral vector is one of the most important due to its pre-eminence in the current preclinical human assays. The present work achieves the complete development of a bioprocess for the obtention of adenoviral vectors for gene therapy: it studies the different aspects that conform the bioprocess, and analyzes the industrial implementation of the best alternative. As a starting point, previous studies are carried out for knowing the interaction of the adenoviral vectors with the existing producing cellular lines. Techniques are studied for culturing two cellular candidates: HEK293 (adherent) and HEK293S (non adherent). From the infection of both with the adenoviral vector, main parameters of the infective cycle are characterized, which allow to conclude that the cellular line HEK293S is more appropriate due to its higher productivity. These data provide the basis to develop the production of the bioprocess. This stage is based on the study of three fundamental factors that describe bioreaction (monitoring, culture strategy and production system), which are deeply analyzed. The oxygen uptake rate (OUR) method is developed to monitor the cellular activity during the phases of growth and infection. Later on, two culture strategies are evaluated: batch (reference stretegy) and perfusion (strategy that provides most similar conditions to those in vivo). Finally, the former factors apply to the analysis of the production system, in particular, with the utilization of two alternatives: the so called conventional system (stirred tank bioreactor Biostat Bplus) and the non conventional system (single use technology based Wave Bioreactor). From the results, it can be concluded that the perfusion strategy provides high cellular densities, increasing the productivity as well as the final viral concentration. On the other hand, some operational advantages of the non conventional system are outlined, in spite of losing the OUR measure. In order to complete the work, the purification stage of the bioprocess is developed. The properties of the product and the culture broth are analyzed, and two strategies of purification are evaluated. These differ in the possibility of increasing scale, so they are designated as non scalable strategy (based on ultracentrifugation) and scalable strategy (based on filtration and chromatography). The first one is commonly used at laboratory scale; given that the final product contains specifically the adenoviral vector, it is implemented to obtain referencie material with high purity when comparing the obtained results with the scalable strategy. The last one is developed based on the design of several operations. The characterization of the final product is carried out to determined its purity. The obtained results conclude that the scalable strategy shows higher global yield than the non scalable one, even though the degree of purity achieved is lower. The production and purification data allow to have four alternatives in order to analyze the potential implantation of the industrial bioprocess. The design and the comparison of these are carried out according to the same bases of design, and the final discussion is based on economical terms. From the results, the most advisable alternative of being brought to practice is the one based on the bioprocess operating in perfusion using the non conventional system. This memory is structured so it initially contains an introduction (chapter 2), where the characteristics of gene therapy, adenoviral vectors and the producing cellular lines, as well as the bioprocess are outlined. Next (chapter 3), the main objectives of the work are described. Next (chapter 4), the previous studies that characterize the producing cellular line as well as the infection with the adenoviral vector are concentrated. In chapter 5, the development of the production stage is presented. Analogously, in chapter 6, the purification stage is developed. In chapter 7, the process analysis of the alternatives is carried out. In chapter 8, main conclusions extracted from the work are set forth. Finally, the materials and methods used (chapter 9) are shown, and the appendix (chapter 10) is added, where some aspects of this work are complemented.

Four cellular models have been developed to implement and standardise in vitro methodology to monitor the effect of food compounds or extracts on anti-inflammatory system, on endothelial function and on anti-thrombotic response: 1. Induction of inflammation: Monocytes THP-1 cells challenged with Lipopolysaccharides and tumour necrosis factor-alpha (TNF-) protein release and mRNA expression were assessed. 2. Induction of endothelial dysfunction: HAEC challenged with TNF-α and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) protein release and mRNA expression were determined. 3. Assessment of endothelial function: HAEC were incubated with TNF- and Insulin and mRNA expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was determined. 4. Study of thrombotic effects: HAEC were pre-incubated with resveratrol and then, challenged with TNF-α to assess the tissue factor (TF) protein and mRNA expression. Thus, these in vitro cellular models are valid systems for the study of compounds or food extracts on mechanisms involved in the pathogenesis of atherosclerosis. / S'han desenvolupat 4 models per estandarditzar metodologia in vitro per supervisar l'efecte de compostos o extractes d'aliments en un sistema antiinflamatori, en funció endotelial i resposta antitrombòtica. 1. Inducció de la inflamació: Es van estimular monòcits THP-1 amb Lipopolisacàrids i avaluar l'expressió proteica i del mRNA del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-). Inducció de disfunció endotelial: Van estimular-se HAEC amb TNF- i determinar l'expressió proteica i del mRNA de la mol·lècula d'adhesió vascular cel·lular (VCAM-1). Avaluació de la funció endotelial: Es van incubar HAEC amb TNF- o Insulina i determinar l'expressió del mRNA de la endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Estudi dels efectes trombòtics: Les HAEC van ser pre-incubades amb resveratrol i estimulades amb TNF-α per avaluar l'expressió proteica i del mRNA del factor tissular. Aquests models cel·lulars in vitro són vàlids per estudiar compostos o extractes d'aliments sobre mecanismes implicats en la patogènesi de l'aterosclerosi.

Aquest treball s'inicià l'any 1993 al laboratori de cultiu in vitro de la Unitat de Fisiologia Vegetal de la Facultat de Biologia de la Universitat de Barcelona, i suposà la integració de dues línies ja existents en aquesta Unitat: el cultiu in vitro de material vegetal i l'ecofisiologia fotosintètica. L'objectiu general d'aquest treball ha estat analitzar, pel cas de gardènia, la incidència de diferents paràmetres ambientals sobre el creixement, fisiologia i anatomia de les plantetes in vitro. A més, veure si les condicions que normalment s'utilitzen en el cultiu in vitro són les adequades per al creixement de les plantetes, fent èmfasi en els punts següents: 1. Avaluar l'efecte de la quantitat de sacarosa del medi de cultiu, de la llum i de la concentració de C02 dins el pot de cultiu en l'afavoriment de la fotoautotròfia de les plantetes cultivades in vitro, sobretot en les primeres fases del cultiu (estadi II i estadi III b) i en la seva aclimatació posterior (estadi IV). 2. Desenvolupar una metodologia originalment emprada en condicions naturals i basada en la composició en isòtops estables de carboni per una avaluació ràpida i senzilla de l'efecte de diferents condicions ambientals sobre el grau de fotoautotròfia de les gardènies durant la micropropagació. 3. Estudiar l'efecte de les condicions de cultiu i estadi de micropropagació en les pautes de fotoinhibició duranmt la micropropagació i posterior aclimatació ex vitro. 4. Comprovar si una tècnica d'avaluació ràpida com ara fluorescència de la clorofil·la, molt utilitzada en estudis de planta i ambient ex vitro, pot utilitzar-se per indicar l'estat fisiològic de l'aparell fotosintètic de les plantes micropropagades durant els diversos estadis del cultiu i l'aclimatació posterior. 5. Estudiar els canvis de l'anatomia i de la ultraestructura fol·liar i del contingut en pigments fotosintètics associats a les variacions de les condicions del cultiu i als estadis de desenvolupament, i comparar com es relacionen amb determinades característiques fisiològiques, com ara les taxes de fotosíntesi i de la respiració a les fosques. Aquesta tesi es va dur a terme bàsicament en dues etapes, que a partir d'ara es descriuran com a experiment I i experiment II. S'ha estructurat en cinc apartats de resultats (els dos primers corresponen a l'experiment I i els altres tres, a l'experiment D). Són apartats independents, però relacionats entre si, i que consten d'una introducció, dels resultats i de la discussió. L'apartat corresponent al material i a la metodologia és comú a tots els resultats. Els apartats de resultats que conformen aquesta tesi estan basats en els diferents articles publicats (3), en premsa (1) i acceptat (1), enviats per la doctoranda i coautors. Això pot fer que, de vegades, certs conceptes que es desenvolupen a l'introducció general es repeteixin en alguna de les introduccions específiques de cada apartat.

L’endometri és el revestiment interior de la mucosa de l’úter. Histològicament, en l’endometri podem diferenciar dos tipus cel·lulars epitelials: l’epiteli luminal i l’epiteli glandular. Els teixits epitelials es caracteritzen per ser teixits polaritzats que presenten unes característiques morfològiques distingibles com són: polarització apico-basal, contactes cèl·lula - cèl·lula específics i adhesió a la membrana Basal. El primer objectiu d’aquest treball va ser la creació d’un cultiu en tres dimensions (3D) de cèl·lules epitelials d’endometri de ratolí, que permetés la possibilitat d’estudiar els diferents processos relacionats amb la morfogènesi i carcinogènesi endometrial. Un cop desenvolupat el sistema de cultiu, vam estudiar els factors extracel·lulars que influïen en la correcta formació del lumen glandular, així com l’establiment de la polaritat de les cèl·lules epitelials que formen les glàndules. D’aquesta manera hem pogut determinar un nou paper de les citocines TNF-α i IL-1α en la formació i manteniment del lumen. A més a més, també hem pogut demostrar que els glucocorticoides són els encarregats de reprimir l’expressió d’aquestes citocines a través de l’acció del receptor d’estrògens. En segon lloc, hem utilitzat el model de cultiu desenvolupat per estudiar aspectes relacionats amb la polaritat cel·lular i la carcinogènesi. Recentment s’ha suggerit que l’establiment de la polarització cel·lular podria actuar com a supressor tumoral mentre que la pèrdua de la mateixa, és un reconegut marcador de la progressió tumoral. Per aquest motiu, i utilitzant el nostre sistema de cultiu, vam voler caracteritzar l’acció del TGF-β tant en cèl·lules polaritzades com en no polaritzades. En aquest treball demostrem que la pèrdua de la polaritat canvia la resposta pro-apoptòtica del TGF-β en cèl·lules polaritzades a una resposta associada a la progressió del fenotip tumoral (EMT) en cèl·lules no polaritzades. Finalment vam voler estudiar els efectes de l’hiperestrogenisme en relació a pèrdues del gen supressor de tumors PTEN en la carcinogènesi endometrial. Per una banda, les pèrdues del supressor tumoral PTEN constitueixen una de les principals alteracions en el carcinoma d’endometri. Per altra banda, l’hiperestrogenisme és un conegut factor de risc en el desenvolupament de neoplasies endometrials. Tanmateix, no està clara si l’acció de l’estradiol sobre les cèl·lules epitelials, és directa o és dóna a través d’un efecte paracrí de les cèl·lules del estroma; i si la pèrdua d’expressió de PTEN té repercussió en els efectes produïts pels estrògens sobre l’endometri. Per aquest motiu, vam voler investigar els efectes de l’estradiol en cèl·lules polaritzades que creixen en un medi definit, sense la interferència de factors paracrins provinents de les cèl·lules de l’estroma. Els nostres estudis indiquen que l’estradiol i la Insulina cooperen en la regulació de la proliferació de cèl·lules endometrials a través del receptor d’estrògens α. A més a més, pèrdues al·lèliques en PTEN donen lloc a una proliferació desmesurada en resposta a Insulina i estradiol, similar a la que es troba en les hiperplàsies endometrials. Fa més d’una dècada que es va suggerir, per primera vegada, la rellevància de la polarització cel·lular a l’hora d’entendre els mecanismes involucrats en la morfogènesi cel·lular així com en la progressió tumoral. Tot i això, avui en dia encara es desconeixen molts dels mecanismes involucrats en aquest processos. En aquest context, el nostre treball és important perquè: per primer cop, hem generat un cultiu en 3D de cèl·lules no immortalitzades i no transformades; hem determinat quins són els factors extracel·lulars involucrats en el manteniment i formació de la cavitat luminal; hem aportat evidencies què la polaritat epitelial actua com a supressor tumoral no canònic i; hem demostrat que pèrdues en PTEN causen una hiperplàsia de les cèl·lules endometrials en resposta a l’exposició a l’estradiol i la Insulina. / El endometrio es el revestimiento interior de la mucosa del útero. Histológicamente en el endometrio podemos diferenciar dos tipos celulares epiteliales: el epitelio luminal y el glandular. Los tejidos epiteliales se caracterizan por ser tejidos polarizados que presentan unas características morfológicas distinguibles como son: polarización apico-Basal, contactos célula - célula específicos y adhesión a la membrana Basal. El primer objetivo de este trabajo fue la creación de un cultivo en tres dimensiones (3D) de células epiteliales de endometrio de ratón, que presentara algunas ventajas a los cultivos ya existentes, a la vez que permitiera la posibilidad de estudiar los diferentes procesos relacionados con la morfogénesis y la carcinogénesis endometrial. Una vez obtenido el sistema de cultivo, quisimos estudiar los factores extracelulares que influían en la correcta formación del lumen de las glándulas, así como el establecimiento de la polaridad de las células epiteliales que forman las glándulas. De esta manera hemos podido determinar un nuevo papel de las citoquinas TNF-α y IL-1α en la formación y mantenimiento del lumen. Además, también hemos podido concluir que los glucocorticoides son los encargados de reprimir la expresión de estas citoquinas a través de la acción del receptor de estrógenos. En segundo lugar, utilizamos el modelo de cultivo desarrollado, para estudiar aspectos relacionados con la polaridad celular y la carcinogénesis. Recientemente se ha sugerido que el establecimiento de la polarización celular podría actuar por si misma como un supresor tumoral, mientras que la pérdida de dicha polarización es un reconocido marcador de la progresión tumoral. Por este motivo, y utilizando nuestro sistema de cultivo, quisimos caracterizar la acción del TGF-β tanto en células polarizadas como en no polarizadas. En este trabajo demostramos que la pérdida de la polaridad, cambia la respuesta pro-apoptótica del TGF-β en células polarizadas a una respuesta asociada a la progresión del fenotipo tumoral (EMT) en células no polarizadas. Finalmente quisimos estudiar los efectos del hiperestrogenismo en la tumorogénesi endometrial. El hiperestrogenismo es un factor de riesgo muy importante en el desarrollo de neoplasias endometriales. Sin embargo, no está claro si la acción del estradiol es directa o se da mediante un efecto paracrino de las células del estroma. Por este motivo, quisimos investigar los efectos del estradiol en células polarizadas que crecían en un medio definido, sin la interferencia de factores paracrinos procedentes de las células del estroma. Gracias a nuestro estudio, hemos podido determinar que la acción del estradiol mediante el receptor de estrógenos alpha, actúa por debajo de la acción de PTEN en la tumorogénesis endometrial. Hace más de una década se sugirió, por primera vez, la relevancia de la polarización celular a la hora de entender los mecanismos involucrados en la morfogénesis celular así como la progresión tumoral. Sin embargo, hoy en día todavía se desconocen muchos de los mecanismos involucrados en estos procesos. En este contexto, nuestro trabajo es importante porque: por primera vez hemos generado un cultivo en 3D de células no transformadas, hemos determinado cuáles son los factores extracelulares involucrados en el mantenimiento y formación de la cavidad luminar, hemos aportado evidencias de que la polaridad epitelial actúa como supresor tumoral no canónico y que el hiperestrogenismo ligado a una deficiencia en la expresión de PTEN da lugar a un fenotipo de hiperplasia. / The endometrium is innermost glandular layer of the uterus. It functions as a lining for the uterus. Histologically, we can distinguish two types of epithelial cells: luminal and glandular epithelium. The epithelial tissues have some distinct morphological features such as: apico-Basal polarity, cell-cell specific contacts and adhesion to the basement membrane. The first objective of this work was to establish a three dimensional culture (3D) of mouse endometrial epithelial cells suitable for the study of endometrial morphogenesis and carcinogenesis. Once the 3D culture protocol was established, our next step was to analyze the influence of the extracellular factors in the formation and maintenance of the glandular lumen. To this regard, we have identified a new role of cytokines TNF-α and IL-1α in the formation and maintenance of the lumen. In addition, we demonstrate that glucocorticoids are the responsible of cytokine down-expression, in an estrogen receptor alpha dependent manner. Our next step was to use our culture model to study the issues related with the cellular polarity and malignance development. Recently it has been suggested that the establishment of cell polarization is a potent tumor suppressor mechanism. Loss of this polarization is a wellknown marker of tumor progression. Taking advantage of our 3D culture system, we sought to characterize the action of TGF-β in both polarized cells and in non-polarized. In this study, we show that loss of polarity changes the pro-apoptotic response of TGF-β (in polarized cells) to a response associated with tumor progression phenotype (EMT) in non-polarized cells. Finally we wanted to study the effects of hyperestrogenism. Hyperestrogenism represent a major risk for development of endometrial neoplasia. However, it is unclear whether estradiol action occurs direct or trough a paracrine effect of stromal cells. For this reason, we wanted to investigate the effects of estradiol on polarized cells growing in a defined medium without interference of paracrine stromal factors. With our study, we could conclude that estradiol trough its receptor, acts as downstream mediator on PTEN mediated tumorogenesis. More than one decade ago, cell polarization was as an important mechanisms involved in cellular morphogenesis and tumor progression. However, most of the mechanisms involved in these processes are still unknown. Our study provides new insights about mechanisms involved in those processes. In this context, we have generated, for the first time, a 3D culture from untransformed cells, we have determined the extracellular factors involved in maintaining and formation of the luminal cavity, we have provided evidence that epithelial polarity acts as a non-canonical tumor suppressor and PTEN deficient expression leads an exacerbated response to estrogen, which leads to loss of cell polarity and glands structure, two alterations observed in cancer.

En aquest treball s'ha abordat el problema de l'optimització dels cultius de cèl·lules animals, més específicament dels hibridomes, des de l'estudi de l'aplicació de diferents estratègies de cultiu, com les operacions en discontinu, discontinu alimentat, i continu amb perfusió. Aquestes estratègies de cultiu s'han realitzat en un bioreactor de tanc agitat amb l'ajut d'eines de monitoratge i control que genèricament s'han utilitzat per obtenir informació i poder actuar, en els casos que ha estat necessari, sobre l'entorn cel·lular. En l'estratègia en discontinu s'han validat les mesures de concentració cel·lular i d'activitat cel·lular, utilitzades per obtenir informació en línia de l'estat del cultiu, i s'ha optimitzat l'operació mitjançant la fortificació del medi de cultiu. Tot i que aquest és el sistema d'operació més estès des del punt de vista industrial, bàsicament per la seva simplicitat, es demostra que és clarament subòptim, ja que les cèl·lules es troben sotmeses sempre a un ambient canviant en què les condicions de cultiu són poc favorables. Mitjançant l'operació en discontinu alimentat s'ha intentat donar solució als problemes de l'operació en discontinu, tot canviant el metabolisme cel·lular fixant els substrats majoritaris a baixos nivells de concentració, i així poder reduir la producció de subproductes inhibitoris i, per tant, augmentar la concentració cel·lular i perllongar la vida del cultiu. Per a tal propòsit, s'ha fet necessari l'ús de diferents esquemes de control de nutrients amb l'ajut de les mesures implementades en línia i del disseny d'una solució concentrada d'addició. En concret, les estratègies desenvolupades graviten sobre dues mesures en línia, la de la concentració cel·lular i la del consum d'oxigen, indicativa de l'activitat cel·lular. De totes formes, encara que els subproductes es redueixen i la concentració cel·lular augmenta, no ho fa en prou quantia respecte al cultiu amb medi fortificat i, per tant, la productivitat augmenta molt lleument. Per eliminar els problemes tant de l'operació en discontinu com de l'operació en discontinu alimentat, les cèl·lules són retingudes a l'interior del reactor mitjançant un mòdul de microfiltració extern i són cultivades amb una aportació constant de medi, de manera que es garanteix una presència dels diferents nutrients essencials a unes concentracions adequades per a les cèl·lules i s'aconsegueix eliminar els diferents subproductes cel·lulars que podrien esdevenir tòxics, aconseguint així unes condicions el més semblants possibles a les que tindria la cèl·lula in vivo. A partir dels resultats obtinguts s'ha pogut constatar que aquesta estratègia de cultiu permet obtenir elevades concentracions cel·lulars durant períodes de temps superiors als de les altres dues estratègies estudiades, incrementant-se també tant la productivitat com la concentració final d'anticòs monoclonal. / In this thesis the problem of the mammalian cells culture optimisation, more specifically of hybridomas, has been undertaken from the study of application of different cultivation strategies, as the operations in batch, fed-batch, and continuous perfusion. These cultivation strategies have been carried out in a well agitated bioreactor with the aid of monitoring and control tools that they have been utilised to obtain information and to be able to act upon the cellular environment, in the cases that has been necessary. In batch strategy it has been validated the measurements of cellular concentration and cellular activity, utilised to obtain on-line information of the culture state, and the operation has been optimised fortifying the growth medium. Although this is the most extended operation system from industrial point of view, basically by their simplicity, is shown that is clearly sub-optimised, since the cells have been always submitted to a changing environment where culture conditions are unfavourable. Fed-bath strategy has tried to give solution to batch operation problems, changing the cellular metabolism setting the major substrates to low concentration levels, and thus to be able to reduce the production of inhibitors by-products and, therefore, to increase cellular concentration and to extend cell culture life. For this purpose, it is done necessary the use of different nutrients scheme control with the aid of the implemented on-line measurements and the design of concentrated addition solutions. In concrete, the strategies developed gravitate upon two on-line measurements: cellular concentration and oxygen consumption rate, indicative of cellular activity. Nevertheless, although by-products production are reduced and cellular concentration is increased, does not do it in sufficient amount regarding the cell culture made with fortified growth medium and, therefore, the productivity is increased very lightly. To eliminate the problems of batch and fed-batch strategies, the mammalian cells are retained inside of bioreactor by means of an external microfiltration module (hollow fiber) and they are cultivated with a constant medium contribution. By means this strategy the presence of different essential nutrients is guaranteed to adequate concentrations for the cells and is obtained to eliminate the different cellular by-products that would be able toxic, being reached thus similar conditions that would have the cells in vivo. The obtained results has been able to confirm that this cultivation strategy permits to obtain high cell concentrations during long time periods over the other two strategies studied, being increased also so much the productivity as the final monoclonal antibody concentration.

El meló (Cucumis melo L.) és una espècie vegetal de gran importància econòmica, amb la que s'han establert nombrosos programes de millora. Dins d'ells, és de gran importància la utilització de línies pures, la seva obtenció ha avançat en gran mesura per la utilització de tècniques de biotecnologia, entre les que es troben, l'obtenció de poblacions de línies diphaploids i els marcadors moleculars.La producció de línies haploids diploiditzades, disminueix el temps de generació necessari per a obtenir individus completament homozigots a una mateixa generació. Així mateix, la naturalesa homozigòtica d'aquestes línies i el seu potencial per a ser perpetuades il·limitadament per llavor, fan de les poblacions de línies dihaploids, siguin molt útils per a estudis genètics com la generació de mapes genètics, on els marcadors dominants i codominants poden ser mapats amb idèntica precisió. Així mateix, la disponibilitat de material vegetal, genèticament idèntic de manera il·limitada, fa possible que es puguin afegir nous marcadors a mesura que es vagin generant i que aquestes poblacions siguin molt útils per a la localització de gens majors i QTLs (Quantitative Trait Loci), podent-se estudiar, al mateix temps, genotips en diferents localitzacions i estudiar-se la interacció genotip per ambient (GxE).En aquest treball es va estudiar la resposta partenogènica de varis genotips de meló, donat que s'havia descrit la importància del genotip en l'obtenció de LDHs. Després d'aquest estudi es va poder descriure 3 passos limítrofs en el procés d'obtenció de LDHs: Eficàcia en l'obtenció d'embrions a partir de llavors de fruits partenocàrpics, supervivència dels embrions en el procés de cultiu in vitro i obtenció de línies diploiditzades, perpetuades per llavor a partir d'aquests embrions. Es va observar diferent comportament en els genotips estudiats en cadascun dels passos limítrofs definits per a el procés. Posteriorment es va generar, per partenogènesis induïda in situ per polinització amb pol·len irradiat, una població de 95 línies dihaploids (LDHs) a partir del creuament de dos línies de meló, PI161375 x T111. Aquestes dos línies es van escollir per presentar característiques agronòmiques importants. La línia T111 pertany a la varietat botànica inodorus, del tipus "Piel de Sapo" és una de les línies més consumides a Espanya, mentres que PI161375 "Sogwhan Charmi", pertany a la varietat botànica chinensis, presenta nombroses resistències a malalties. Les línies de la població van ser analitzades per marcadors moleculars del tipus codominant (RFLPs i SSRs) per a determinar la seva homozigòsis i es va determinar el seu nivell de ploidia per citometria de flux. A partir de la població de LDHs es va realitzar un mapa genètic, transferint marcadors moleculars codominants d'alta qualitat del tipus RFLPs i SSRs que ja havien estat posicionats en el mapa F2 obtingut a partir del mateix creuament i es van incloure 54 nous marcadors del tipus SSR. Es va obtindre un mapa amb 169 marcadors moleculars codominants de grups de lligament, cobrint una distància de 1289.6cM. La densitat de mapa va ser de 7.6cM/marcadors. L'ordre dels marcadors es va mantenir al comparar-lo amb altres mapes de meló existents i amb el mapa realitzat a partir d'una població F 2, el que demostra la consistència del mapa genètic obtingut, permet utilitzarlo com a mapa de referència per a posteriors estudis amb aquesta espècie i la integració dels dos mapes obtinguts a partir del creuament PI161375 x T111. Integrant es va obtenir un mapa altament saturat amb 331 marcadors codominants que es van distribuir en dotze grups de lligament, cobrint tot el genoma de meló, amb una densitat de 3.02cM/marcador i que van cobrir una distància de 1061cM.Es va estudiar, també, la segregació de les freqüències aléliques dels marcadors utilitzats en la generació del mapa de la població de LDHs per a identificar zones distorsionades que poguessin estar implicades en el procés d'obtenció d'haploids. Es van observar 6 zones que van presentar distorsió de les freqüències aléliques. Aquestes zones serien candidates a incloure gens que són seleccionats en el procés de generació de LDHs. En 2 d'aquestes zones la segregació va ser favorable a l'al.lel del parental PI161375 i en altres 4 la distorsió va ser favorable a l'al.lelde T111, el que indicaria que els dos parentals influeixen en el procés de generació de les línies dihaploids.Finalment, es van estudiar diferents caràcters quantitatius implicats en la morfologia floral, morfologia del fruit i la germinació, localitzant 71 QTLs, per a tots els caràcters analitzats. L'alta correlació observada entre la forma de l'ovari i el fruit i la co-localització dels QTLs implicats en aquest caràcters, suggereix que la forma del fruit ve determinada per la forma de l'ovari, és a dir, que els mateixos gens controlen ambdós caràcters, i la forma del fruit ve determinada en les primeres etapes de desenvolupament. També va permetre dividir el caràcter d'herència poligènica, el que explicaria l'aparició de genotips intermitjos en les classificacions taxonòmiques realitzades. Es van trobar, així mateix, QTLs relacionats amb la germinació de les LDHs que ens indiquen que els gens que intervenen en els processos relacionats amb la germinació s'expressen en les primeres etapes del procés, que existeixen al.lels de PI161375 amb efectes favorables a la germinació i que existeix un important efecte ambiental relacionat amb la llum, observant que amb presència de llum un major porcentatge de germinació. / El melón (Cucumis melo L.) es una especie vegetal de gran importancia económica, en la que se han establecido numerosos programas de mejora. En ellos es de gran importancia la utilización de líneas puras, cuya obtención ha avanzado en gran medida por la utilización de técnicas de biotecnología entre las que se encuentran la obtención de poblaciones de líneas dihaploides y los marcadores moleculares.La producción de líneas haploides diploidizadas disminuye el tiempo de generación necesario para obtener individuos completamente homocigotos a una generación. Así mismo, la naturaleza homocigótica de estas líneas y su potencial para ser perpetuadas ilimitadamente por semilla, hacen a las poblaciones de líneas dihaploides muy útiles para estudios genéticos como la generación de mapas genéticos, donde los marcadores dominantes y codominantes pueden ser mapados con igual precisión. Así mismo, la disponibilidad de material vegetal genéticamente idéntico de forma ilimitada hace posible que se puedan añadir nuevos marcadores a medida que se vayan generando y que estas poblaciones sean muy útiles para la localización de genes mayores y QTLs (Quantitative Trait Loci), pudiendo estudiarse el mismo genotipo en diferentes localizaciones y estudiarse la interacción genotipo por ambiente (GxE).En este trabajo se estudió la respuesta partenogénica de varios genotipos de melón, ya que se había descrito la importancia del genotipo en la obtención de LDHs. Tras este estudio se pudieron describir 3 pasos limitantes en elproceso de obtención de LDHs: Eficacia en la obtención de embriones a partir de semilla de frutos partenocárpicos, supervivencia de los embriones en el proceso de cultivo in vitro y obtención de líneas diploidizadas, perpetuadas porsemilla a partir de estos embriones. Se observó diferente comportamiento de los genotipos estudiados en cada uno de los pasos limitantes definidos para el proceso. Posteriormente se generó, por partenogénesis inducida in situ porpolinización con polen irradiado, una población de 95 líneas dihaploides (LDHs) a partir del cruzamiento de dos líneas de melón, PI161375 x T111. Estas dos líneas se eligieron por presentar características agronómicas importantes. La línea T111 perteneciente a la variedad botánica inodorus, de tipo 'Piel de Sapo' es una de las líneas más consumidas en España mientras que PI 161375 'Sogwhan Charmi', perteneciente a la variedad botánica chinensis, presenta numerosas resistencias a enfermedades. Las líneas de la población fueron analizadas por marcadores moleculares de tipo codominante (RFLPs y SSRs) para determinar su homocigosis y se determinó sunivel de ploidía por citometría de flujo.A partir de la población de LDHs se realizó el mapa genético, transfiriendo marcadores moleculares codominates de alta calidad de tipo RFLPs y SSRs que ya habían sido posicionados en el mapa F 2 obtenido a partir del mismo cruce y se incluyeron 54 nuevos marcadores de tipo SSR. Se obtuvo un mapa con 169 marcadores que sedistribuyeron en 12 grupos de ligamiento, cubriendo una distancia de 1289.6cM. La densidad de mapa fue de 7.6cM/marcador. El orden de los marcadores se mantuvo al compararlo con otros mapas de melón existentes y con el mapa realizado a partir de una población F2, lo que demuestra la consistencia del mapa genético obtenido, permitiendo emplearlo como mapa de referencia para posteriores estudios en esta especie y la integración de los dos mapas obtenidos a partir del cruce PI161375 x T111. Integrando se obtuvo un mapa altamente saturado con 331 marcadores codominantes que se distribuyeron en doce grupos de ligamiento cubriendo todo el genoma de melón, con una densidad de 3.02cM/ marcador y que cubrieron una distancia de 1061cM.Se estudió también la segregación de las frecuencias alélicas de los marcadores utilizados en la generación del mapa de la población de LDHs para identificar zonas distorsionadas que pudieran estar implicadas en el proceso de obtención de haploides. Se observaron 6 zonas que presentaron distorsión de las frecuencias alélicas. Estas zonas serían candidatas de incluir genes que son seleccionados en el proceso de generación de LDHs. En 2 de estas zonas la segregación fue favorable al alelo del parental PI161375 y en las otras 4 la distorsión fue favorable al alelo de T111, lo que indicaría que los dos parentales influyen en el proceso de generación de las líneas dihaploides.Finalmente, se estudiaron diferentes caracteres cuantitativos implicados en la morfología floral, morfología de fruto y la germinación, localizando 71 QTLs, para todos los caracteres analizados. La alta correlación observadaentre la forma de ovario y fruto y la co-localización de los QTLs implicados en estos caracteres sugiere que la forma del fruto esta determinada por la forma del ovario, es decir, que los mismos genes controlan ambos caracteres, y laforma de fruto se determina en etapas tempranas del desarrollo. También permitió dividir el carácter de la pubescencia del ovario en dos componentes, longitud y densidad, confirmando que se trata de un carácter de herencia poligénica lo que explicaría la aparición de fenotipos intermedios en las clasificaciones taxonómicasrealizadas. Se encontraron, así mismo, QTLs relacionados con la germinación de las LDHs que nos indican que los genes que intervienen en los procesos relacionados con la germinación se expresan en las primeras etapas del proceso, que existen alelos de PI161375 con efectos favorables a la germinación y que existe un importante efecto ambiental relacionado con la luz, observándose en presenc ia de luz un mayor porcentaje de germinación. / Melon (Cucumis melo L.) is an important vegetal crop; with large number of breeding programs already established. In these programs, the use of inbred lines is very important; the process to obtain these lines can be enhanced with the use of biotechnology techniques as the generation of dihaploid lines population and molecular markers.DHLs production decreased the generation time needed to obtain complete homocigous plants to one generation.The homocigosity potential to be perpetuated by seed, make DHLs populations an useful tool for genetics studies, as genetic map construction, where the dominants and codominants markers can be mapped with the same precision.Also, the possibility to dispose unlim ited material genetically identical make possible to add news markers as soon as they are generated, the localization of major genes and QTLs (Quantitative trait loci) and study the genotype by environment (GxE) interaction by evaluating the same genotype in different locations.The parthenogenetic response of several melon genotypes was studied. As reported by other authors the genotype had an important effect on the production of DHLs. Three limiting steps were found in the DHLs production process: (1) the parthenogenic embryo production efficiency from parthenocarpic fruits; (2) the in vitro rescueefficiency of parthenogenic embryos; and (3) the production of diploid lines, perpetuated by seed, out of the rescued embryos. For each of these limiting steps, different behaviours were observed on the studied genotypes. Moreover, apopulation of 95 DHLs was generated from the PI161375 x T111 hybrid, utilizing the in situ induction of parthenogenic embryos through pollination by gamma-irradiated pollen. The two parents were chosen for their important agronomic traits. The T111 line, pertaining to inodorus botanic variety, of fruit type 'Piel de Sapo', is one of the most consumed in Spain. Whereas, PI 161375 or 'Sogwhan Charmi', pertaining to the chinensis botanical variety, has a large number of disease resistances. Presumed parthenogenic lines were analyzed by codominants molecular markers (RFLPs and SSRs) to confirm their homocigosity, and by flow citometry to determine their ploidy level.A molecular markers map, involving RFLP and SSRs mapped previously in a F2 population from the same cross, was constructed using the DHL population. 54 new SSRs markers were added to the DHL map. A map with 169 markers distributed in twelve linkage groups was obtained with a distance coverage of 1286 cM. The map density was 7.6cM/marker. The order of markers was maintained when compared with other melon maps and with the F2 map. This fact proved the consistence of obtained genetic map, allowing their use as a reference map for later studies in this specie and permitting the integration of the two maps obtained from the cross PI161375 X T111. After integration, a highly saturated map with 331 codominats markers, covering the whole genome was obtained. Markerswere distributed in twelve linkage groups with a density of 3.02cM/marker covering a distance of 1061cM.Allelic frequency segregation of markers in DHLs population map was studied to identify genomic regions with segregation distortion. Six regions were observed which could include genes selected during DHLs generation process. Two of the regions showed favourable segregation towards PI 161375 alleles and in the other four the segregation was favourable towards T111 alleles. This confirms the influence of both parentals in the DHLs generation process.Finally, a study of several quantitative traits involved in floral and fruit morphology and germination of melon was realized. Seventy-one QTLs were localized for all analysed traits. The high correlation observed between ovary andfruit shape and the co-localization of QTLs involved in these traits suggests that the fruit shape was determined by ovary shape, i.e., the same genes control both traits and the fruit shape is determinated in the early period of development. Also, this analysis allowed to divide ovary pubescence trait in two components, hair length and density, and also confirming that this trait is under polygenic control. This could explain the apparition of intermediate phenotypes in the taxonomic classifications by others authors. In addition, QTLs related with germination were found, indicating that the genes involved in germination are expressed in the first steps of the process. PI161375 alleles withfavourable effect in germination were uncovered. Light intensity during germination has a major effect on the percentage of seed germination, being higher light intensity associated with higher percentage of germination.

L‟olivicultura de la comarca del Priorat es basa en la varietat „Arbequina‟ i està inclosa dins la DOP “Siurana” (Tarragona) on ocupa unes 2.900 ha que produeixen 4.700 t d‟olives i 900 t d‟oli, que ha de competir amb unes 100.000 t d‟oli d‟aquesta varietat produïdes a tot el mon, més de la meitat fora de Catalunya i amb tecnologies de producció modernes que permeten reduir costos i millorar la rendibilitat. Per aquest motiu els productors de la zona van fundar l‟Associació d‟Oleïcultors del Priorat (AOP) amb la finalitat de crear una estructura comercial que permetés accedir a mercats d‟alt preu, semblants als que utilitzen els vins de qualitat de la comarca. La AOP signà el 2002 un conveni amb l‟IRTA i el DAAM per a desenvolupar un programa científico-tècnic que permetés la caracterització i tipificació dels olis de la comarca, establint criteris objectius de selecció d‟aquells olis de qualitat superior i diferenciable de la resta d‟olis de „Arbequina‟ de Catalunya, per a facilitar la seva comercialització. Aquesta tesis doctoral inclou tots els aspectes científics sobre els que està fonamentada l‟aplicació comercial d‟aquest programa. Els objectius fixats són: (1) caracteritzar els olis produïts a la comarca, a nivell fisicoquímic i sensorial; (2) constatar si aquests olis són objectivament diferents dels d‟altres zones, produïts amb la mateixa varietat „Arbequina‟; (3) identificar en què consisteix la seva tipicitat, relacionant-la amb factors propis del clima i sòls de la comarca; i (4) caracteritzar l‟olivicultura i elaiotècnia de la comarca. Els treballs s‟han desenvolupat durant sis campanyes successives (2002-03 a 2008-09) i es basen en l‟anàlisi sistemàtica de pràcticament el 100% dels olis produïts a la comarca durant aquests anys (6.308.124 litres), la descripció de l‟olivicultura de la zona (mitjançant enquesta) i dels processos d‟extracció (descripció de les instal·lacions i anotació de les condicions de procés en campanya) i l‟estudi de la relació existent entre l‟oli i els factors de producció, edàfics i climàtics. Als olis s‟han analitzat les característiques sensorials, paràmetres fisicoquímics de qualitat, àcids grassos, esterols, polifenols totals, índex d‟amargor, estabilitat i, en alguns casos, ceres i compostos volàtils. La metodologia utilitzada és similar a la dels nombrosos treballs de tipificació i caracterització d‟olis d‟oliva verge, normalment associats a DOP espanyoles i d‟Itàlia, la qual fiabilitat està relacionada amb la representativitat de les mostres d‟oli analitzades i que apliquen tècniques estadístiques univariants i multivariants diverses. Els resultats demostren que fins un 54% dels olis de la zona Priorat, elaborats majoritàriament amb „Arbequina‟, es poden diferenciar objectivament dels d‟altres zones productores del mon que utilitzen la mateixa varietat, inclús de les veïnes Garrigues i Siurana-Camp. Aquestes diferències ho són tant a nivell sensorial (principalment els atributs picant, aromes secundàries, fruitat, astringència i dols), como a nivell d‟àcids grassos (principalment palmitoleic, oleic, palmític i esteàric). Existeix una variabilitat intrazonal (inferior al 20% en tots els paràmetres, excepte els esterols) que sembla aleatòria en el cas d‟atributs sensorials i, en el cas de la composició química, està relacionada amb factors geogràfics, de tècniques de cultiu i de clima de cada municipi. Les diferències respecte d‟altres zones veïnes on es cultiva la mateixa varietat estan relacionades amb l‟orografia i geologia particular de la comarca (més del 50% de plantacions estan a més de 400 m d‟altitud i sobre sòls del Paleozoic de baixa fertilitat i amb zones de transició cap a sòls sedimentaris del quaternari cap al Camp de Tarragona i del terciari cap a Les Garrigues) i amb el clima particular i bastant homogeni a tota la zona (règim termo-pluviomètric de tipus “mediterrani prelitoral sud”, amb transició cap a “mediterrani continental sec” a Les Garrigues i “mediterrani litoral sud” al Camp de Tarragona). S‟ha definit un model matemàtic per a predir si una partida d‟olives té possibilitats de produir olis de qualitat suficient per a la seva diferenciació, així com funcions discriminants de Fischer per a determinar si el perfil sensorial o la composició en àcids grassos d‟un oli són típics de la comarca del Priorat i, per tant, diferenciables de les zones veïnes. Actualment, els resultats d‟aquests treballs serveixen de base per a establir les estratègies comercials de venda dels olis del Priorat. Els moliners i envasadores trien aquells olis considerats com típics de la zona per a ser envasats (s‟ha passat del 20% al inici del programa fins al 65% actual), dedicant la resta de la producció a l‟autoconsum i al mercat a doll / El olivar de la comarca del Priorat se basa en el cultivo de la variedad „Arbequina‟ y está incluido en la DOP “Siurana” (Tarragona), ocupando unas 2.900 ha que producen 4.700 t de aceitunas y 900 t de aceite, que debe competir con unas 100.000 t de aceite de esta variedad producidas en todo el mundo, más de la mitad fuera de Cataluña y con tecnologías de producción modernas que permiten reducir los costes y mejorar la rentabilidad. Por este motivo, los productores de la zona fundaron la Asociación de Oleicultores del Priorat (AOP) con el fin de crear una estructura comercial que permitiera acceder a mercados de alto precio, parecidos a los que utilizan los vinos de calidad de la comarca. La AOP firmó, en 2002, un convenio con el IRTA y el DAAM para desarrollar un programa científico-técnico que permitiera la caracterización y tipificación de los aceites de la comarca, estableciendo criterios objetivos de selección de aquellos aceites de calidad superior y diferenciable del resto de aceites de „Arbequina‟ de Cataluña, para facilitar su comercialización. La presente tesis doctoral incluye todos los aspectos científicos sobre los que se fundamenta la aplicación comercial de este programa. Los objetivos que se plantean son: (1) caracterizar los aceites producidos en la comarca, a nivel físico-químico y sensorial; (2) constatar si estos aceites son objetivamente diferentes de los de otras zonas producidos con la misma variedad „Arbequina‟; (3) identificar en qué consiste su tipicidad, relacionándola con factores propios del clima y suelos de la comarca; y (4) caracterizar la olivicultura y elaiotecnia de la comarca. Los trabajos se han desarrollado durante seis campañas (2002-03 a 2008-09) y se basan en el análisis sistemático de prácticamente el 100% de los aceites producidos en la comarca durante esos años (6.308.124 litros), la descripción de la olivicultura de la zona (mediante encuesta) y de los procesos extractivos (descripción de las instalaciones y anotación de las condiciones de proceso en campaña) y el estudio de la relación existente entre el aceite y los factores tanto de producción como edáficos y climáticos. En los aceites se han analizado las características sensoriales, parámetros físico-químicos de calidad, ácidos grasos, esteroles, polifenoles totales, índice de amargor, estabilidad y, en algunos casos, ceras y compuestos volátiles. La metodología utilizada se basa en los numerosos trabajos de tipificación y caracterización de aceites de oliva virgen, normalmente asociados a DOP españolas e italianas, cuya fiabilidad está relacionada con la representatividad de las muestras de aceite analizadas y que aplican técnicas estadísticas univariantes y multivariantes diversas. Los resultados demuestran que hasta un 54% de los aceites de la zona Priorat, elaborados mayoritariamente con „Arbequina‟, pueden diferenciarse objetivamente de los de otras zonas productoras del mundo que utilizan la misma variedad, incluso de las vecinas Garrigues y Siurana-Camp. Dichas diferencias lo son tanto a nivel sensorial (principalmente los atributos picante, aromas secundarios, frutado, astringencia y dulzor), como a nivel de ácidos grasos (principalmente palmitoleico, oleico, palmítico y esteárico). Existe una variabilidad intrazonal (inferior al 20% en todos los parámetros, excepto los esteroles) que parece aleatoria en el caso de atributos sensoriales y que, en el caso de la composición química, está relacionada con factores geográficos, de técnicas de cultivo y de clima de cada municipio. Las diferencias respecto de otras zonas vecinas, donde se cultiva la misma variedad, están relacionadas con la orografía y geología particular de la comarca (más del 50% de plantaciones están a más de 400 m de altitud y sobre suelos del Paleozoico de baja fertilidad y con zonas de transición hacia suelos sedimentarios del cuaternario hacia el Camp de Tarragona y del terciario hacia Les Garrigues) y con el clima particular y bastante homogéneo en toda la zona (régimen termopluviométrico de tipo “mediterráneo prelitoral sur”, con transición hacia el “mediterráneo continental seco” de Les Garrigues y el “mediterráneo litoral sur” del Camp de Tarragona). Se ha definido un modelo matemático para predecir si una partida de aceitunas tiene posibilidades de producir aceites de calidad suficiente para su diferenciación, así como funciones discriminantes de Fischer para determinar si el perfil sensorial o la composición en ácidos grasos de un aceite son típicos de la comarca del Priorat y, por tanto, diferenciables de las zonas vecinas. Actualmente, estos resultados sirven de base para establecer las estrategias comerciales de venta de los aceites del Priorat. Los almazareros y envasadores escogen aquellos aceites considerados como típicos de la zona para su envasado (se ha pasado desde un 20% al inicio del programa hasta el 65% actual), dedicando el resto de la producción al autoconsumo y al mercado de graneles. / Olive production in the Priorat area raws on „Arbequina‟ cultivar and is included into PDO “Siurana” (Tarragona), with 2.900 ha and yielding 4.700 t fruits in average, equivalent to 900 t of virgin oil. This oil competes with 100.000 t of oil from the same cultivar produced worldwide (more than a half out of Catalonia and using new technologies to reduce costs and enhance profitability). This was the reason to promote the Priorat‟s Producer Association (PPA) in order to build a commercial structure to gain high value markets, similar to those used by high quality wines of this area. PPA proposed in 2002 an agreement with IRTA and the Agricultural Services from the Catalan Government with the aim to develop a scientific and technical program to characterize and differentiate virgin oils from Priorat and setting objective criteria to select high quality oils different from others „Arbequina‟. This ought to improve current commercialization. This thesis includes all scientific aspects supporting the commercial application of the program. Research goals were: (1) to characterize oils from Priorat using physic, chemical and sensorial parameters; (2) to assess if these oils can be differentiated from others produced with the same cultivar „Arbequina‟ in other regions; (3) to test their “typicality”, related to Priorats‟ climate and soil characteristics; and (4) to characterize olive production and mill technology in Priorat. The study was carried out during a six years period (2002-03 to 2008-09 harvests) with systematic analysis of almost 100% virgin oil produced in the area (6.308.124 liters). Olive crop production was studied using a questioner, while mill technology was assessed by registering processing conditions along harvest every year. The relationship between oil quality and climate, soils and cultural practices was studied. Chemical parameters analyzed were: sensory profile, physic and chemical quality parameters, fatty acids, sterols, total polyphenols, bitterness index, stability and, sometimes, waxes and volatiles. Methodology was similar to that applied in many scientific studies on virgin oil characterization in wide areas, usually linked to PDO in Spain and Italy. Results reliability depends on oil sampling representativeness. Both univariate and multivariate statistics were used. Results show that up to 54% of Priorat virgin oils made with „Arbequina‟ can be classified to be typical and different from other producing regions, even the neighboring areas of Garrigues and Siurana-Camp. Such differences are both sensorial (mainly pungency, secondary aromas, fruity, astringency and sweet) and chemical (fatty acids palmitoleic, oleic, pamitic, and stearic). Variability between Priorat areas, is lower than 20% (except for sterols) and seems to be random for sensory profile while is related to geography, cultural practices and climate, for chemical composition. Differences to other regions with the same cultivar are related to the Priorat‟s geography and geology (more than 50% orchards are placed higher than 400 m and over soils from Paleozoic with low fertility with transitions to quaternary sedimentary soils towards Camp of Tarragona and transitions to tertiary sedimentary soils towards Garrigues) and climate (Priorat‟s climate belongs to “south pre-littoral Mediterranean” with transitions to “dry continental Mediterranean” towards Garrigues and transitions to “south littoral Mediterranean” towards Camp of Tarragona). A mathematic model was fitted which makes possible to decide if an olive lot is able to produce virgin oil of enough quality to be classified as typical of Priorat. Fischers‟ discriminate functions were fitted that make possible to decide if a virgin oil sample has a fatty acid composition or a sensory profile characteristics from Priorat and different to other regions. Currently, these results are used to establish commercial strategies to sell Priorat virgin oils. The oil producers from this area select those more characteristics oils to be retailed (this increased from 20% at the beginning of the program to currently 65%) while the standard oils are used to self consumption or for bulk market.

La utilització de composts com substrats de cultiu i/o l'ús d'agents de control biològic són una alternativa als mitjans de control de fitopatògens mitjançant fitosanitaris químics. Aquesta tesi consta de 4 capítols. En el Capítol I es va estudiar la capacitat de 5 composts procedents de residus municipals i agrícoles de suprimir la malaltia produïda pel patogen foliar Botrytis cinerea en plantes de cogombre. Els cinc composts van ser capaços de reduir la incidència i severitat de la malaltia en comparació amb els substrats de cultiu estàndard (2 torbes comercials). La reducció de la malaltia es va associar al subministrament de Ca, Mo i Si per part dels composts, a cert grau d'estrès salí produït en la planta, així com a l'alta activitat microbiològica dels composts. En el Capítol II es descriu el desenvolupament d'un mètode basat en la cromatografia líquida acoblada a detecció per espectrometria de masses en tàndem per a la quantificació simultània de les hormones àcid salicílic i àcid jasmònic en extractes vegetals. El mètode es va aplicar per a estudiar l'efecte de la colonització de l'arrel de plantes de cogombre per part de l'agent de control biològic Trichoderma asperellum T34 o la infecció per part del patogen Rhizoctonia solani. No es va observar cap efecte de T34 aplicat a l'arrel a 105 ufc/ml sobre els nivells d'aquestes hormones. R. Solani, va produir l'increment de les dues hormones, tant en arrel com en cotilèdon. En el Capítol III es va estudiar l'efecte de T34 aplicat a l'arrel de la planta de cogombre a 105, 106 i 107 ufc/ml sobre l'activitat peroxidasa, els nivells d'àcid salicílic i jasmònic i el proteoma dels cotilèdons en les primeres hores de la interacció. T34 activa l'activitat peroxidasa i eleva els nivells de les hormones estudiades de forma depenent a la concentració. A 105 no s'observen efectes. T34 aplicat a l'arrel a 107 ufc/ml és capaç de produir canvis el proteoma dels cotilèdons afectant l'expressió de proteïnes relacionades amb la defensa contra patògens. Aquest mateix tractament és capaç d'induir en la planta resistència sistèmica contra el patogen foliar Pseudomonas syringae pv. lachrymans. En el Capítol IV es va comprovar la capacitat de T34 aplicat a 105 ufc/ml per a induir resistència sistémica en Arabidopsis enfront dels patògens foliars Pseudomonas syringae pv. tomato, Hyaloperonospora parasitica i Plectosphaerella cucumerina. Aquesta resistència sistèmica és semblant a la induced systemic resistance (ISR) produïda per rizobacteris no patogènics. L'ús d'Arabidopsis mutants va permetre establir que la ISR induïda per T34 és independent d'àcid salicílic i depenent de NPR1 i MYB72. A més, la ISR induïda per T34 es basa en el priming ja que precondiciona a les plantes a expressar el gen LOX2 i el bloqueig d'espores de patògens mitjançant cal·losa de forma mes ràpida i intensa quan posteriorment responen a un atac. / This thesis consists in 4 chapters. In Chapter I we checked the ability of 5 composts from municipal an agricultural wastes to suppress disease produced by the foliar pathogen Botrytis cinerea in cucumber plants. The 5 studied composts were able to reduce disease incidence and disease severity compared to standard growth media (2 commercial peats). The reduction in disease was related to the supply of Ca, Mo and Si to the plants, a certain degree of salt stress and the high microbial activity of the composts. In Chapter II we describe a method based in liquid chromatography coupled to mass spectrometry to simultaneously quantify salicylic and jasmonic acids in crude plant extracts. No effect on the hormones was found when the biological control agent Trichoderma asperellum T34 was applied to the roots at 105 cfu/ml. Rhizoctonia solani infection increased both hormones in both cotyledons and roots. In Chapter III we studied the effect of T34 applied to the roots at 105, 106 and 107 cfu/ml on peroxidase activity, salicylic and jasmonic acids levels and proteome of cucumber cotyledons during the early hours after the interaction. T34 affects peroxidase activity and hormone levels depending on the concentration. No effects at 105. T34 applied to the roots at 107 cfu/ml is able to produce changes to the proteome affecting the expression of defense related proteins. This treatment is also able to induce systemic resistance against the foliar pathogen Pseudomonas syringae pv. lachrymans. In Chapter IV we checked the ability of T34 applied at 105 cfu/ml to induce systemic resistance in Arabidopsis against the foliar pathogens Pseudomonas syringae pv. tomato, Hyaloperonospora parasitica and Plectosphaerella cucumerina. This systemic resistance is similar to induced systemic resistance (ISR) triggered by non pathogenic rhizobacteria. The use of Arabidopsis mutants allowed us to establish that ISR induced by T34 is salicylic acid independent but is dependent on NPR1 and MYB72. In addition ISR triggered by T34 is based on priming as it primes plants for enhanced LOX2 gene expression as well as callose deposition when plants face an stress.

En aquest treball s'han desenvolupat dos mètodes simples i ràpids pel cultiu de les cèl·lules epitelials de les tres regions de l'epidídim de Sus domesticus. Un es basa en el cultiu de fragments del túbul epididimari intactes durant 8 dies. L'altre mètode es basa en el cultiu de fragments del túbul epididimari digerits amb col·lagenasa que, després de 7 dies, donen lloc a la formació d'una monocapa de cèl·lules epitelials epididimàries que adquireixen el 90-100% de confluència després de 12-16 dies en cultiu. Aquestes cèl·lules es mantenen viables durant més de 60 dies en cultiu i no s'observa proliferació de cèl·lules no epitelials. Per determinar el nivell de conservació de les característiques epididimàries en els cultius s'ha analitzat l'estructura cel·lular, l'activitat de síntesi i secreció proteica, i el manteniment i maduració dels espermatozoides en cocultiu. / In this work, we have developed two simple and quick methods for the culture of boar epididymal epithelial cells. The first one involves the culture of intact epididymal tubule fragments during 8 days. The second one involves the culture of epididymal tubule fragments digested with collagenase that, after 7 days in culture, allows the formation of an epididymal epithelial cell monolayer that reached 90-100% confluence after 12-16 days. These epididymal epithelial cells monolayers were maintained in vitro for more than 60 days and overgrowth of non-epithelial cells was not observed. To estimate the level of preservation of epididymal characteristics in these cultures we have focused on cell morphology, protein secretion activity, and sperm preservation and maturation.

No description available.