Objetivo:Comparar a eficácia dos meios de cultivo HTF (Human Tubal Fluid) e TCM 199 (Tissue Culture Medium) na maturação in vitro. Métodos:Estudo experimental controlado e randomizado no qual foram avaliadas as taxas de maturação oocitária, fertilização, clivagem e produção de embriões de boa qualidade em 23 ciclos não estimulados de maturação oocitária, com 119 oócitos coletados, de 13 mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos. Os oócitos de cada paciente foram transferidos randomicamente para cada um dos meios de cultivo sendo que, 61 (51%) foram colocados no meio TCM 199 e 58 (49%) no meio HTF. Os dois meios de cultivo receberam suplementação hormonal. Resultados:Diferenças significativas foram encontradas entre os meios de cultivo TCM 199 e HTF em relação à taxa de maturação oocitária (82% vs. 56.9%, p = 0.005), taxa de fertilização (70% vs. 39.4%, p = 0.007) e taxade produção de embriões de boa qualidade (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusão:O meio de cultivo HTF embora seja utilizado para manutenção de embriões em técnicas de fertilização assistida e em procedimentos de maturação in vitrocom ciclos estimulados, não é o meio mais apropriado paramaturação de oócitos obtidos de mulheres com Síndrome dos Ovários policísticosem ciclos não estimulados. / Objective:Compare oocytes human culture in human tubal fluid (HTF) and Tissue Culture Medium (TCM 199) invitromaturation cycles. Methods:Randomized controlled trial which oocyte maturation, fertilization, cleavage rates and embryo quality in 23 in vitromaturation cycles no stimulation were evaluated, resulting in 119 oocytes retrieved from 13 patients withpolycystic ovarian syndrome. The oocytes from each patient were assigned randomly to the two culture media, 61 (51%) to the TCM 199 and 58 (49%) to the HTF using the same hormonal supplementation. Results:Significant differences were observed between TCM 199 and HTF regarding maturation rate (82% vs. 56.9%, p = 0.005), fertilization rate (70% vs. 39.4%, p = 0.007) rates and embryo quality (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusion:The HTF medium, although widely employed for oocyte fertilization and embryo maintenance in IVF techniques, is not an appropriated medium to maturation oocytes obtained from PCOS patients innon - stimulated cycles.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.

Neste trabalho foi avaliada a possibilidade do emprego de caldo de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) como matéria-prima para obtenção de 2,3-butanodiol por fermentação, utilizando a bactéria Klebsiella pneumoniae NRRL B199. A pesquisa compreendeu o teste de diferentes nutrientes para a composição de um meio de fermentação eficiente com o caldo de cana e experimentos em que a influência da concentração inicial de sacarose (S0) sobre o processo em regime descontínuo foi estudada. Ensaios realizados em frascos agitados, com S0 entre 140 e 150 g/L, mostraram que a fermentação de caldo de cana clarificado não suplementado com nutrientes não é viável. Por outro lado, a adição de 5,0 a 10,0 g/L de fosfato de amônio ao caldo levou a concentrações finais de 2,3-butanodiol de até 64 g/L e rendimentos, em relação ao máximo teórico, da ordem de 81% em cerca de 38 horas. Estes resultados se aproximam daqueles alcançados na fermentação do caldo enriquecido com vários nutrientes, usado como referência, na qual foram produzidos 66,7 g/L de diol com um rendimento de 85,6%. A utilização de concentrações de fosfato de amônio de até 4,0 g/L resultou em fermentações incompletas. A cinética da fermentação foi estudada com o caldo diluído a, aproximadamente, 180 g/L de sacarose e suplementado com 8,0 g/L de fosfato de amônio e, também, com o meio rico, em regime descontínuo em fermentador de bancada. Foram obtidos, nestes ensaios, concentrações de butanodiol de 71,7 e 71,1 g/L, rendimentos de 78,0 e 74,1 %, produtividades de 2,1 e 2,0 g/Lh e tempos de fermentação de 34,5 e 35,7 horas, respectivamente. A principal diferença foi observada na concentração de biomassa que atingiu 9,1 g/L, no meio com fosfato, e 11,8 g/L no meio rico. As máximas velocidades específicas de crescimento (µx, m), 0,61 e 0,45 h-1, observadas com oxigênio dissolvido acima de zero, indicam que o crescimento celular, no meio rico, foi inibido pela alta concentração de nutrientes. Na seqüência das fermentações, com concentrações nulas de oxigênio dissolvido, a produção de diol foi iniciada e as máximas velocidades específicas de formação de produto (µP,m), 0,53 h-1 com fosfato de amônio e 0,45 h-1 com o meio rico, foram atingidas, sugerindo que altas concentrações de nutrientes afetam, também, a formação de produto. Nos dois ensaios foi observada a ocorrência de uma fase estacionária de crescimento que, no caso do meio contendo fosfato de amônio, teve uma duração 12 horas mais longa devido a um insuficiente suprimento de oxigênio ou do esgotamento de algum nutriente. Neste ponto, foi verificada uma queda das velocidades específicas de formação de produto (µP). Com o caldo diluído a cerca de 20 g/L de sacarose e 8,0 g/L de fosfato de amônio, a fermentação transcorreu em um tempo muito longo (23,5 horas) para a baixa concentração de sacarose empregada. Com S0 semelhante e o meio rico, o tempo de processo foi de apenas 6,5 h, o que demonstra que, no primeiro caso, ocorreu uma diluição excessiva dos nutrientes naturalmente presentes no caldo. O estudo do efeito da concentração inicial de sacarose sobre a fermentação, conduzido em fermentador de bancada e com o meio rico em nutrientes, mostrou que este parâmetro influencia fortemente o crescimento celular e a produção de 2,3-butanodiol. O aumento de S0 levou a valores decrescentes dos fatores de conversão de substrato em células, enquanto os rendimentos em diol aumentaram com S0 até 152 g/L. Valores crescentes de S0 provocaram uma inibição do crescimento celular, evidenciada pela diminuição de µx,m de 0,91 a 0,45 h-1, com S0 entre 24 e 181 g/L. Valores aproximadamente constantes de µP,m (0,62 a 0,68 h-1) foram observados com S0 até 152 g/L, enquanto uma queda acentuada foi verificada com S0=181 g/L (µP,m=0,45 h-1). As máximas produtividades (3,2 g/Lh) foram obtidas com valores de S0 de 105 e 152 g/L. Os dados gerados neste trabalho permitem concluir que caldo de cana-de-açúcar é uma matéria-prima adequada para a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. / The use of sugar cane (Saccharum officinarum) juice, as raw material for the fermentative production of 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae NRRL B199, was evaluated in this work. The research was focused on testing different nutrients to formulate an efficient fermentation medium with the juice and some experiments to study the effect of the initial sucrose concentration (S0) on the batch process. Shaker flasks experiments with S0 between 140 and 150 g/L have shown that the fermentation of sugar cane juice without added nutrients is not viable. On the other hand, the addition of 5.0 to 10.0 g/L ammonium phosphate to the juice led, after 38 hours, to final 2,3-butanediol concentrations of 64 g/L, with yields of 81% of the theoretical maximum. These results are similar to those found in the fermentation of a reference medium composed of juice enriched with several nutrients in which 66.7 g/L butanediol and a yield of 85.6% were obtained. Ammonium phosphate concentrations up to 4.0 g/L resulted in incomplete fermentations. The fermentation kinetics was studied in a laboratory scale fermentor, with the sugar cane juice diluted to ca. 180 g/L sucrose. Both ammonium phosphate (8.0 g/L) and reference media were tested. In these experiments, after process times close to 35 hours, butanediol concentrations of 71.7 and 71.1 g/L, yields of 78.0 and 74.1 % , and productivities of 2.1 and 2.0 g/Lh, respectively, were obtained. The most important difference was the final biomass concentration that reached 9.1 g/L with the ammonium phosphate medium and 11.8 g/L with the rich medium. The maximum specific growth rates (µx,m=0.61 and 0.45 h-1), measured with dissolved oxygen concentrations above zero, have indicated that cell growth in the rich medium was inhibited by high nutrient concentration. In the sequence, when the oxygen concentration was zero, butanediol production started and maximum specific production rates (µP,m of 0.53 h-1 with the ammonium phosphate medium and 0.45 h-1 with the rich medium were reached. These values suggest that nutrient concentration in the rich medium also affects product formation. ln both runs, a stationary growth phase was noticed. In the experiment with the ammonium phosphate medium, the stationary phase was 12 hours longer due to the insufficient oxygen supply rate or the shortage of some nutrient. At that moment, decreasing specific product formation rates (7#181;P) were observed. With the sugar cane juice diluted to approximately 20 g/L and 8.0 g/L ammonium phosphate, fermentation time was 23.5 hours, too long to such sucrose concentration. With similar S0 and the rich medium, fermentation time was reduced to 6.5 hours. That shows that, in the first case, natural nutrients of the juice were excessively diluted. The study on the effect of the initial sucrose concentration on the process, performed in a laboratory fermentor with the rich medium, has shown that this parameter strongly affects both cell growth and 2,3-butanediol production. Increasing S0 led to decreasing cell yields and, for S0 up to 152 g/L, diol yields increased. Cell growth inhibition was stronger as higher sucrose concentrations were used. This is evidenced by the values of µx,m that decreased from 0.91 to 0.45 h-1 as S0 was augmented from 24 to 181 g/L. Approximately constant µP,m (0.62 to 0.68 h-1) were observed with S0 up to 152 g/L. With S0=181 g/L, µP,m is reduced to 0.45 h-1 . The maximum productivities (3.2 g/Lh) were obtained with S0 between 105 and 152 g/L. From the results of this work, one can conclude that sugar cane juice is a suitable raw material for the production of 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae.

O Eucalyptus cloeziana se destaca pelas propriedades tecnológicas da sua madeira, principalmente em razão da sua durabilidade, densidade e resistência. Entretanto, essa espécie apresenta limitações quanto ao enraizamento adventício de estacas, dificultando a obtenção de mudas clonais e o avanço nos programa de melhoramento da espécie. Nesta perspectiva, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a micropropagação de E. cloeziana a partir de materiais juvenis e adultos como uma técnica para a propagação da espécie. Para tanto, o trabalho foi dividido em quatro partes. No primeiro estudo, estabeleceu-se um protocolo de organogênese indireta de E. cloeziana a partir de hipocótilos e cotilédones. No segundo estudo avaliou-se o resgate de matrizes adultas de E. cloeziana através da indução de brotações epicórmicas em megaestacas. No terceiro estudo definiu-se um protocolo de micropropagação via proliferação de gemas axilares de matrizes adultas de E. cloeziana. Por último, no quarto estudo avaliou-se o rejuvenescimento in vitro de matrizes adultas de E. cloeziana por meio da micropropagação via proliferação de gemas axilares e a microestaquia, a partir das matrizes rejuvenescidas in vitro,para comprovar a viabilidade do cultivo in vitro como alternativa de propagação da espécie. A organogênese indireta de E. cloeziana mostrou-se possível e dependente do tipo de explante, dos reguladores de crescimento, suas concentrações e combinações utilizadas nas diferentes fases de morfogênese. As brotações adventícias foram micropropagadas e aclimatizadas com sucesso, obtendo-se mudas clonais de E. cloeziana. No resgate das matrizes adultas de E. cloeziana ocorreu maior indução de brotações epicórmicas para as megaestacas coletadas na época do ano com maior pluviosidade e temperatura. O diâmetro médio das megaestacas, compreendido entre 2,0 e 5,0 cm, correspondeu ao mais adequado para a obtenção de maior número de brotações epicórmicas no resgate das matrizes adultas de E. cloeziana. O protocolo de micropropagação das matrizes adultas de E. cloeziana foi estabelecido com sucesso, utilizando como explantes, brotações epicórmicas induzidas nas megaestacas. A multiplicação in vitro das microcepas foi realizada com êxito no meio de cultura WPM suplementado com BAP e ANA, cujas concentrações variaram entre os genótipos. Os tratamentos de \"pulse\" com GA3 não foi adequado para promover o alongamento in vitro das brotações, o qual foi obtido coma redução da concentração do BAP (0,1 mg L-1). A aclimatização e o enraizamento ex vitro das microestacas foi realizada com sucesso nos miniestufas, garantindo a obtenção de mudas clonais das matrizes adultas de E. cloeziana para a composição de um microjardim clonal. As microcepas das árvores matrizes de E. cloeziana apresentaram diferentes taxas de multiplicação in vitro, apresentando especificidades dos materiais genéticos à micropropagação. Os resultados da microestaquia das matrizes rejuvenescidas in vitro de E. cloeziana corroboraram as evidências de rejuvenescimento desses genótipos durante a micropropagação. Além disso, constatou-se que outros fatores, além da maturidade, podem estar atuando diretamente na recalcitrância do E. cloeziana ao enraizamento adventício. Dessa forma, comprovou-se a importância da micropropagação como uma ferramenta para a clonagem de E. cloeziana, abrindo perspectivas para investigações futuras para otimizar os métodos de propagação da espécie. / Eucalyptus cloeziana has importance for its wood technologic characteristics, mainly the durability, density and resistance. Moreover, this species has limitations on adventitious rooting of cuttings, having difficulties to obtain clonal seedlings and to advance in the improvement programs. In this perspective, the present work aimed to evaluate the E. cloeziana micropropagation by juvenile and mature explants as a technique for propagation this specie. Therefore, the work was divided into four basic studies. The first study was the establishment of the protocol to indirect organogenesis to E. cloeziana hypocotyls and cotyledons. In the second study evaluated the rescue of E. cloeziana adult matrices for epicormic shoots induction in crow branches. In the third study was definite a micropropagation protocol by axillary branching of E. cloeziana adult matrices. Finally, in the fourth study was evaluated the in vitro rejuvenation of E. cloeziana adult matrices to micropropagation by axillary branching and the micro-cutting technique of in vitro rejuvenated matrices to prove the in vitro culture viability to the propagation of this specie. The indirect organogenesis E. cloeziana was dependent of explant type and growth regulator and its concentration used in the different morphogenesis phases. The adventitious shoots were multiplicities and acclimatized with success to obtain E. cloeziana clonal seedlings. The vegetative rescue results of E. cloeziana adult matrices showed a higher induction epicormic shoots from branches collected in warmer and rain season. The medium diameter between 2.0 and 5.0 cm was considered the better to obtain higher epicormic shoots number in vegetative rescue. The micropropagation protocol of E. cloeziana adult matrices was realized with success using epicormic shoots, induced in the branches, like explants. The shoots in vitro multiplication was realized on WPM medium culture, supplemented with BA and NAA. The better growth regulators concentrations were different for each genotype. Treatments pulse with GA3 was not suitable to promote the elongation of shoots in vitro, which was obtained by the BA concentration reduction at 0.1 mg L-1. The in vitro shoots acclimatization and ex vitro rooting was performed in mini-incubators with success and it permit to obtain clonal seedlings from E. cloeziana adult matrices to form a clonal micro-garden. The shoots of E. cloeziana adult matrices showed different in vitro multiplication rates with specific-genotype responses to micropropagation. The micro-cutting technique results of E. cloeziana adult matrices provide evidence that occurred in vitro rejuvenation of these genotypes, during the micropropagation. Therefore, the nursery results showed that other factors, not only maturation, can be involved in the adventitious recalcitrance of E. cloeziana. In conclusion, the importance micropropagation like a biotechnological tool to propagation of E. cloeziana was proved and opened important perspectives for future investigations to optimize the propagation methods for this specie.

Objetivo:Comparar a eficácia dos meios de cultivo HTF (Human Tubal Fluid) e TCM 199 (Tissue Culture Medium) na maturação in vitro. Métodos:Estudo experimental controlado e randomizado no qual foram avaliadas as taxas de maturação oocitária, fertilização, clivagem e produção de embriões de boa qualidade em 23 ciclos não estimulados de maturação oocitária, com 119 oócitos coletados, de 13 mulheres com Síndrome dos Ovários Policísticos. Os oócitos de cada paciente foram transferidos randomicamente para cada um dos meios de cultivo sendo que, 61 (51%) foram colocados no meio TCM 199 e 58 (49%) no meio HTF. Os dois meios de cultivo receberam suplementação hormonal. Resultados:Diferenças significativas foram encontradas entre os meios de cultivo TCM 199 e HTF em relação à taxa de maturação oocitária (82% vs. 56.9%, p = 0.005), taxa de fertilização (70% vs. 39.4%, p = 0.007) e taxade produção de embriões de boa qualidade (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusão:O meio de cultivo HTF embora seja utilizado para manutenção de embriões em técnicas de fertilização assistida e em procedimentos de maturação in vitrocom ciclos estimulados, não é o meio mais apropriado paramaturação de oócitos obtidos de mulheres com Síndrome dos Ovários policísticosem ciclos não estimulados. / Objective:Compare oocytes human culture in human tubal fluid (HTF) and Tissue Culture Medium (TCM 199) invitromaturation cycles. Methods:Randomized controlled trial which oocyte maturation, fertilization, cleavage rates and embryo quality in 23 in vitromaturation cycles no stimulation were evaluated, resulting in 119 oocytes retrieved from 13 patients withpolycystic ovarian syndrome. The oocytes from each patient were assigned randomly to the two culture media, 61 (51%) to the TCM 199 and 58 (49%) to the HTF using the same hormonal supplementation. Results:Significant differences were observed between TCM 199 and HTF regarding maturation rate (82% vs. 56.9%, p = 0.005), fertilization rate (70% vs. 39.4%, p = 0.007) rates and embryo quality (81.3% vs. 41.7%, p= 0.023). Conclusion:The HTF medium, although widely employed for oocyte fertilization and embryo maintenance in IVF techniques, is not an appropriated medium to maturation oocytes obtained from PCOS patients innon - stimulated cycles.

Neste trabalho foi avaliada a possibilidade do emprego de caldo de cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) como matéria-prima para obtenção de 2,3-butanodiol por fermentação, utilizando a bactéria Klebsiella pneumoniae NRRL B199. A pesquisa compreendeu o teste de diferentes nutrientes para a composição de um meio de fermentação eficiente com o caldo de cana e experimentos em que a influência da concentração inicial de sacarose (S0) sobre o processo em regime descontínuo foi estudada. Ensaios realizados em frascos agitados, com S0 entre 140 e 150 g/L, mostraram que a fermentação de caldo de cana clarificado não suplementado com nutrientes não é viável. Por outro lado, a adição de 5,0 a 10,0 g/L de fosfato de amônio ao caldo levou a concentrações finais de 2,3-butanodiol de até 64 g/L e rendimentos, em relação ao máximo teórico, da ordem de 81% em cerca de 38 horas. Estes resultados se aproximam daqueles alcançados na fermentação do caldo enriquecido com vários nutrientes, usado como referência, na qual foram produzidos 66,7 g/L de diol com um rendimento de 85,6%. A utilização de concentrações de fosfato de amônio de até 4,0 g/L resultou em fermentações incompletas. A cinética da fermentação foi estudada com o caldo diluído a, aproximadamente, 180 g/L de sacarose e suplementado com 8,0 g/L de fosfato de amônio e, também, com o meio rico, em regime descontínuo em fermentador de bancada. Foram obtidos, nestes ensaios, concentrações de butanodiol de 71,7 e 71,1 g/L, rendimentos de 78,0 e 74,1 %, produtividades de 2,1 e 2,0 g/Lh e tempos de fermentação de 34,5 e 35,7 horas, respectivamente. A principal diferença foi observada na concentração de biomassa que atingiu 9,1 g/L, no meio com fosfato, e 11,8 g/L no meio rico. As máximas velocidades específicas de crescimento (µx, m), 0,61 e 0,45 h-1, observadas com oxigênio dissolvido acima de zero, indicam que o crescimento celular, no meio rico, foi inibido pela alta concentração de nutrientes. Na seqüência das fermentações, com concentrações nulas de oxigênio dissolvido, a produção de diol foi iniciada e as máximas velocidades específicas de formação de produto (µP,m), 0,53 h-1 com fosfato de amônio e 0,45 h-1 com o meio rico, foram atingidas, sugerindo que altas concentrações de nutrientes afetam, também, a formação de produto. Nos dois ensaios foi observada a ocorrência de uma fase estacionária de crescimento que, no caso do meio contendo fosfato de amônio, teve uma duração 12 horas mais longa devido a um insuficiente suprimento de oxigênio ou do esgotamento de algum nutriente. Neste ponto, foi verificada uma queda das velocidades específicas de formação de produto (µP). Com o caldo diluído a cerca de 20 g/L de sacarose e 8,0 g/L de fosfato de amônio, a fermentação transcorreu em um tempo muito longo (23,5 horas) para a baixa concentração de sacarose empregada. Com S0 semelhante e o meio rico, o tempo de processo foi de apenas 6,5 h, o que demonstra que, no primeiro caso, ocorreu uma diluição excessiva dos nutrientes naturalmente presentes no caldo. O estudo do efeito da concentração inicial de sacarose sobre a fermentação, conduzido em fermentador de bancada e com o meio rico em nutrientes, mostrou que este parâmetro influencia fortemente o crescimento celular e a produção de 2,3-butanodiol. O aumento de S0 levou a valores decrescentes dos fatores de conversão de substrato em células, enquanto os rendimentos em diol aumentaram com S0 até 152 g/L. Valores crescentes de S0 provocaram uma inibição do crescimento celular, evidenciada pela diminuição de µx,m de 0,91 a 0,45 h-1, com S0 entre 24 e 181 g/L. Valores aproximadamente constantes de µP,m (0,62 a 0,68 h-1) foram observados com S0 até 152 g/L, enquanto uma queda acentuada foi verificada com S0=181 g/L (µP,m=0,45 h-1). As máximas produtividades (3,2 g/Lh) foram obtidas com valores de S0 de 105 e 152 g/L. Os dados gerados neste trabalho permitem concluir que caldo de cana-de-açúcar é uma matéria-prima adequada para a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae. / The use of sugar cane (Saccharum officinarum) juice, as raw material for the fermentative production of 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae NRRL B199, was evaluated in this work. The research was focused on testing different nutrients to formulate an efficient fermentation medium with the juice and some experiments to study the effect of the initial sucrose concentration (S0) on the batch process. Shaker flasks experiments with S0 between 140 and 150 g/L have shown that the fermentation of sugar cane juice without added nutrients is not viable. On the other hand, the addition of 5.0 to 10.0 g/L ammonium phosphate to the juice led, after 38 hours, to final 2,3-butanediol concentrations of 64 g/L, with yields of 81% of the theoretical maximum. These results are similar to those found in the fermentation of a reference medium composed of juice enriched with several nutrients in which 66.7 g/L butanediol and a yield of 85.6% were obtained. Ammonium phosphate concentrations up to 4.0 g/L resulted in incomplete fermentations. The fermentation kinetics was studied in a laboratory scale fermentor, with the sugar cane juice diluted to ca. 180 g/L sucrose. Both ammonium phosphate (8.0 g/L) and reference media were tested. In these experiments, after process times close to 35 hours, butanediol concentrations of 71.7 and 71.1 g/L, yields of 78.0 and 74.1 % , and productivities of 2.1 and 2.0 g/Lh, respectively, were obtained. The most important difference was the final biomass concentration that reached 9.1 g/L with the ammonium phosphate medium and 11.8 g/L with the rich medium. The maximum specific growth rates (µx,m=0.61 and 0.45 h-1), measured with dissolved oxygen concentrations above zero, have indicated that cell growth in the rich medium was inhibited by high nutrient concentration. In the sequence, when the oxygen concentration was zero, butanediol production started and maximum specific production rates (µP,m of 0.53 h-1 with the ammonium phosphate medium and 0.45 h-1 with the rich medium were reached. These values suggest that nutrient concentration in the rich medium also affects product formation. ln both runs, a stationary growth phase was noticed. In the experiment with the ammonium phosphate medium, the stationary phase was 12 hours longer due to the insufficient oxygen supply rate or the shortage of some nutrient. At that moment, decreasing specific product formation rates (7#181;P) were observed. With the sugar cane juice diluted to approximately 20 g/L and 8.0 g/L ammonium phosphate, fermentation time was 23.5 hours, too long to such sucrose concentration. With similar S0 and the rich medium, fermentation time was reduced to 6.5 hours. That shows that, in the first case, natural nutrients of the juice were excessively diluted. The study on the effect of the initial sucrose concentration on the process, performed in a laboratory fermentor with the rich medium, has shown that this parameter strongly affects both cell growth and 2,3-butanediol production. Increasing S0 led to decreasing cell yields and, for S0 up to 152 g/L, diol yields increased. Cell growth inhibition was stronger as higher sucrose concentrations were used. This is evidenced by the values of µx,m that decreased from 0.91 to 0.45 h-1 as S0 was augmented from 24 to 181 g/L. Approximately constant µP,m (0.62 to 0.68 h-1) were observed with S0 up to 152 g/L. With S0=181 g/L, µP,m is reduced to 0.45 h-1 . The maximum productivities (3.2 g/Lh) were obtained with S0 between 105 and 152 g/L. From the results of this work, one can conclude that sugar cane juice is a suitable raw material for the production of 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae.

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O Eucalyptus cloeziana se destaca pelas propriedades tecnológicas da sua madeira, principalmente em razão da sua durabilidade, densidade e resistência. Entretanto, essa espécie apresenta limitações quanto ao enraizamento adventício de estacas, dificultando a obtenção de mudas clonais e o avanço nos programa de melhoramento da espécie. Nesta perspectiva, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a micropropagação de E. cloeziana a partir de materiais juvenis e adultos como uma técnica para a propagação da espécie. Para tanto, o trabalho foi dividido em quatro partes. No primeiro estudo, estabeleceu-se um protocolo de organogênese indireta de E. cloeziana a partir de hipocótilos e cotilédones. No segundo estudo avaliou-se o resgate de matrizes adultas de E. cloeziana através da indução de brotações epicórmicas em megaestacas. No terceiro estudo definiu-se um protocolo de micropropagação via proliferação de gemas axilares de matrizes adultas de E. cloeziana. Por último, no quarto estudo avaliou-se o rejuvenescimento in vitro de matrizes adultas de E. cloeziana por meio da micropropagação via proliferação de gemas axilares e a microestaquia, a partir das matrizes rejuvenescidas in vitro,para comprovar a viabilidade do cultivo in vitro como alternativa de propagação da espécie. A organogênese indireta de E. cloeziana mostrou-se possível e dependente do tipo de explante, dos reguladores de crescimento, suas concentrações e combinações utilizadas nas diferentes fases de morfogênese. As brotações adventícias foram micropropagadas e aclimatizadas com sucesso, obtendo-se mudas clonais de E. cloeziana. No resgate das matrizes adultas de E. cloeziana ocorreu maior indução de brotações epicórmicas para as megaestacas coletadas na época do ano com maior pluviosidade e temperatura. O diâmetro médio das megaestacas, compreendido entre 2,0 e 5,0 cm, correspondeu ao mais adequado para a obtenção de maior número de brotações epicórmicas no resgate das matrizes adultas de E. cloeziana. O protocolo de micropropagação das matrizes adultas de E. cloeziana foi estabelecido com sucesso, utilizando como explantes, brotações epicórmicas induzidas nas megaestacas. A multiplicação in vitro das microcepas foi realizada com êxito no meio de cultura WPM suplementado com BAP e ANA, cujas concentrações variaram entre os genótipos. Os tratamentos de \"pulse\" com GA3 não foi adequado para promover o alongamento in vitro das brotações, o qual foi obtido coma redução da concentração do BAP (0,1 mg L-1). A aclimatização e o enraizamento ex vitro das microestacas foi realizada com sucesso nos miniestufas, garantindo a obtenção de mudas clonais das matrizes adultas de E. cloeziana para a composição de um microjardim clonal. As microcepas das árvores matrizes de E. cloeziana apresentaram diferentes taxas de multiplicação in vitro, apresentando especificidades dos materiais genéticos à micropropagação. Os resultados da microestaquia das matrizes rejuvenescidas in vitro de E. cloeziana corroboraram as evidências de rejuvenescimento desses genótipos durante a micropropagação. Além disso, constatou-se que outros fatores, além da maturidade, podem estar atuando diretamente na recalcitrância do E. cloeziana ao enraizamento adventício. Dessa forma, comprovou-se a importância da micropropagação como uma ferramenta para a clonagem de E. cloeziana, abrindo perspectivas para investigações futuras para otimizar os métodos de propagação da espécie. / Eucalyptus cloeziana has importance for its wood technologic characteristics, mainly the durability, density and resistance. Moreover, this species has limitations on adventitious rooting of cuttings, having difficulties to obtain clonal seedlings and to advance in the improvement programs. In this perspective, the present work aimed to evaluate the E. cloeziana micropropagation by juvenile and mature explants as a technique for propagation this specie. Therefore, the work was divided into four basic studies. The first study was the establishment of the protocol to indirect organogenesis to E. cloeziana hypocotyls and cotyledons. In the second study evaluated the rescue of E. cloeziana adult matrices for epicormic shoots induction in crow branches. In the third study was definite a micropropagation protocol by axillary branching of E. cloeziana adult matrices. Finally, in the fourth study was evaluated the in vitro rejuvenation of E. cloeziana adult matrices to micropropagation by axillary branching and the micro-cutting technique of in vitro rejuvenated matrices to prove the in vitro culture viability to the propagation of this specie. The indirect organogenesis E. cloeziana was dependent of explant type and growth regulator and its concentration used in the different morphogenesis phases. The adventitious shoots were multiplicities and acclimatized with success to obtain E. cloeziana clonal seedlings. The vegetative rescue results of E. cloeziana adult matrices showed a higher induction epicormic shoots from branches collected in warmer and rain season. The medium diameter between 2.0 and 5.0 cm was considered the better to obtain higher epicormic shoots number in vegetative rescue. The micropropagation protocol of E. cloeziana adult matrices was realized with success using epicormic shoots, induced in the branches, like explants. The shoots in vitro multiplication was realized on WPM medium culture, supplemented with BA and NAA. The better growth regulators concentrations were different for each genotype. Treatments pulse with GA3 was not suitable to promote the elongation of shoots in vitro, which was obtained by the BA concentration reduction at 0.1 mg L-1. The in vitro shoots acclimatization and ex vitro rooting was performed in mini-incubators with success and it permit to obtain clonal seedlings from E. cloeziana adult matrices to form a clonal micro-garden. The shoots of E. cloeziana adult matrices showed different in vitro multiplication rates with specific-genotype responses to micropropagation. The micro-cutting technique results of E. cloeziana adult matrices provide evidence that occurred in vitro rejuvenation of these genotypes, during the micropropagation. Therefore, the nursery results showed that other factors, not only maturation, can be involved in the adventitious recalcitrance of E. cloeziana. In conclusion, the importance micropropagation like a biotechnological tool to propagation of E. cloeziana was proved and opened important perspectives for future investigations to optimize the propagation methods for this specie.

A hemofilia A é uma doença ligada ao cromossomo X causada pela deficiência do fator VIII da coagulação sanguínea (FVIII). O tratamento disponível consiste na terapia de reposição da proteína do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponíveis no mercado, 6 são produzidos em linhagens celulares de roedores. A expressão dessa proteína em sistemas celulares não-humanos pode gerar uma molécula com perfil de modificações diferente do endógeno, podendo levar a reações imunogênicas e geração de inibidores anti-FVIIIr. Em função disso, novas estratégias de produção têm sido avaliadas, como a utilização de células hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expressão da proteína de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem hepática SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos níveis de expressão do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspensão em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratégias para o estabelecimento de processos de produção em condições livres de soro e em suspensão: Estratégia 1 - adaptação para tais condições da linhagem já modificada geneticamente e Estratégia 2 - modificação gênica para a expressão da proteína já em células previamente adaptadas à tais condições. Para a estratégia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterização da cinética e produção do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas específicas máxima de crescimento (?max) de 0,064 e 0,0031h-1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptação foram empregados, entretanto, não foi possível obter sucesso na adaptação das linhagens recombinantes para condições livres de soro e em suspensão. Para a estratégia 2, as células SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de ?max de 0,0186h-1 e Xmax de 1,9x106cels/mL. Para as etapas de modificação gênica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a geração das células recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIII?B-Neo e pLVCMVFVIII?B-GFP. Para o primeiro, não foi possível gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possível obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromogênico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 é apropriada para a produção de altos níveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforços devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro específicos para a linhagem para possibilitar a produção eficiente do FVIIIr em suspensão em meios livre de soro. / Hemophilia A is a genetic X-linked disorder caused by the coagulation factor VIII (FVIII) deficiency. The current treatment is the replacement therapy with plasma derived FVIII (pdFVIII) or recombinant FVIII (rFVIII) products. Nowadays, of the seven products available in the market, six are produced in rodent expression systems, which can result in a rFVIII molecule with different post-translational modifications and may lead to immune responses to non-human epitopes. Therefore, new production strategies have been evaluated, as the use of more efficient hosts in terms of protein expression potential. Among potential cell lines, the hepatic SK-HEP-1 cell line features high levels of rFVIII production and potential for serum-free suspension culture. In face of the exposed above, the goal of this study was to evaluate rFVIII production in the SK-HEP-1 human cell line comparing two strategies for the establishment of production process in a suspension serum-free condition: strategy 1 - adaptation to these conditions of a genetic modified cell line; strategy 2 - genetic modification of an already adapted cell line to rFVIII protein expression. For strategy 1, two adherent rFVIII producer cell lines were established in serum containing medium, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1. Characterization of cell growth and rFVIII production showed a maximum specific growth rate (?max) of 0.064 and 0.00311h-1 with rFVIII production of 1.0 and 0.78UI/mL, respectively. Different adaptation protocols were used; however, it was not possible to adapt the recombinant cell lines to growth in suspension serum-free conditions. For strategy 2, the wildtype SK-HEP-1 cell line adapted growth in SFMII BSF medium, showed a ?max of 0.0186h-1 and a maximum cell concentration (Xmax) of 1.9x106cells/mL. For the genetic modification, it were employed the same lentiviral vectors used for the recombinant adherent cells generation, pLVmpsvFVIII?B-Neo and pLVCMVFVIII?B-GFP. For the first, no attempts were successful. For the second, it was possible to generate two rFVIII producer populations with 0.14 and 0.12IU/mL activity, measured by chromogenic assay. These results demonstrate that the SK-HEP-1 cell line is appropriate for the production of high levels of rFVIII. Nevertheless, efforts should be made in developing specific medium to support efficient rFVIII production in suspension and suspension serum-free conditions.

Infertility affects 15% of reproductive-aged couples. The milieu surrounding the growing embryo is of outmost importance, and should be optimised during in vitro fertilisation (IVF). Many biological processes, such as angiogenesis, coagulation, and immune processes need to be well regulated for a pregnancy to occur and progress normally. Histidine-rich glycoprotein (HRG) is a plasma protein that regulates components of these systems by building complexes with various ligands. A single nucleotide polymorphism (SNP) in HRG, denoted HRG C633T, seem to be of importance for IVF treatment outcomes. The aim of this thesis was to further investigate the proposed human fertility effects of the HRG C633T SNP. According to the findings of this thesis, the HRG C633T genotype is associated with primary recurrent miscarriage. Male HRG C633T genotype is associated with semen characteristics in infertile men, and pregnancy rates following IVF. However, the distribution of the HRG C633T SNP does not differ between infertile and fertile couples. We further examined the role of the region surrounding the HRG C633T SNP for regulation of endometrial angiogenesis and human embryo development. The region affects primary endometrial endothelial cell migration, proliferation and tube-formation in vitro but does not appear to affect human embryo development. No effect of the HRG peptide was noted on the secretome of human embryos. However, early embryos secrete proteins into the surrounding culture media and the level of secretion of VEGF-A, IL-6, EMMPRIN and PlGF is greater in embryos of higher developmental stages. In conclusion, the HRG C633T genotype appears to play a role only if infertility is established. The region surrounding HRG C633T SNP is of relevance in vitro for regulation of human endometrial endothelial cell angiogenesis. To predict which embryos to transfer in IVF, we have highlighted a number of proteins of interest for further investigation.