Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Le polyéthylène glycol (PEG) est un polymère reconnu comme généralement sécuritaire (GRAS) et son utilisation est très répandue dans plusieurs domaines, dont celui de la pharmaceutique. Ce polymère peut être conjugué à des protéines ou des vecteurs pharmaceutiques transportant des médicaments afin de prolonger le temps de circulation dans l'organisme. Bien que le PEG ait été considéré comme non immunogène, des études récentes montrent qu'environ 20 à 70 % de la population possèdent des anticorps capables de reconnaitre le polymère. Par un effet neutralisant, ces anticorps anti-PEG pourraient réduire l'efficacité et le temps de circulation de certains médicaments PEGylées. Ces travaux s'intéressent à comprendre les mécanismes derrière la réponse immunitaire anti-PEG des vecteurs pharmaceutiques et plus particulièrement des nanoparticules de polymère composé de PLGA-PEG. Notre hypothèse est que ces nanoparticules de polymère causent la production d'anticorps anti-PEG initier à l'aide de la cascade du complément. Lors de ces travaux, des anticorps anti-PEG étaient mesurés après sept jours, peu importe la voie d'administration des nanoparticules. L'isotype des anticorps dirigés contre le PEG mesuré est majoritairement des IgM. Les anticorps anti-PEG en circulation réduisent le temps de circulation de différentes architectures PEGylées, dont les nanoparticules et les liposomes. La présence des anticorps IgM anti-PEG altère les protéines retrouvées à la surface des nanoparticules. Des souris splénectomisées ont été utilisées dans plusieurs expériences afin d'investiguer le rôle de la rate dans la production des anticorps anti-PEG après l'administration de nanoparticules. Chez les souris qui ne possédaient pas de rate, la production des anticorps anti-PEG était abrogée lorsque les nanoparticules étaient administrées par voie intraveineuse. Par voie d'injection sous-cutanée, une petite quantité d'anticorps anti-PEG était mesurée après sept jours dans le plasma des souris splénectomisées. Ensuite, deux modèles de souris avec une cascade du complément abrogé (CVF) ou absence (C3[exposant -/-]) ont été utilisés pour investiguer le rôle de la cascade du complément sur la production des anticorps anti-PEG. La cascade du complément semble impliquée dans la production des anticorps anti-PEG lorsque les nanoparticules sont administrées par voie intraveineuse. Lors d'une injection sous-cutanée des nanoparticules, la concentration IgM anti-PEG mesurée après 7 jours est similaire entre le groupe témoin et le groupe ne possédant pas de cascade du complément active. Finalement, des études en cytométrie en Flux avec des nanoparticules fluorescente administrée à des souris avec et sans complément nous ont permis d'identifier l'importance des protéines du complément sur l'interaction entre les cellules immunitaires et les nanoparticules. Les protéines du complément à la surface des nanoparticules semblent favoriser leur interaction avec les lymphocytes B splénique. Les protéines du complément ne semblent pas changer l'interaction des nanoparticules avec les cellules B des ganglions lymphatiques après une administration sous-cutanée. Ces résultats suggèrent que le différent mécanisme est impliqué lors de la production des anticorps anti-PEG, selon la route d'administration des nanoparticules. Des études supplémentaires sont requises pour comprendre les effets de ces anticorps anti-PEG en clinique. / Polyethylene glycol (PEG) is a polymer recognized as generally safe (GRAS) and its use is widespread in several fields. This polymer can be conjugated to proteins or pharmaceutical carriers carrying drugs to prolong circulation time in the body. Although PEG has been considered as non-immunogenic, recent studies show that approximately 20-70% of the population have antibodies that can recognize the polymer. Through a neutralizing effect, these anti-PEG antibodies could reduce the effectiveness and circulation time of certain PEGylated drugs. This work focuses on understanding the mechanisms behind the anti-PEG immune response of pharmaceutical vectors and more particularly of polymer nanoparticles composed of PLGA-PEG. Our hypothesis is that these polymer nanoparticles cause the production of anti-PEG antibodies to initiate with the help of the complement cascade. During this work, anti-PEG antibodies were measured after 7 days, regardless of the route of administration of the nanoparticles. The isotype of the antibodies directed against the PEG was IgM. Anti-PEG antibodies in circulation reduce the circulation time of different PEGylated architectures including nanoparticles and liposomes. The presence of anti-PEG IgM antibodies alters the proteins found on the surface of the nanoparticles. In addition, anti-PEG antibodies promote the activation of the complement cascade which helps eliminate subsequent doses of nanoparticles. Splenectomized mice have been used in several experiments to investigate the role of the spleen in the production of anti-PEG antibodies after the administration of nanoparticles. In mice without a spleen, the production of anti-PEG antibodies was abrogated when the nanoparticles were administered intravenously. By subcutaneous injection, a small quantity of anti-PEG antibodies were measured after seven days in the plasma of splenectomized mice. Two mouse models with an abrogated complement cascade (CVF) or absence (C3[superscript -/-]) were used to investigate the role of the complement cascade on the production of anti-PEG antibodies. The complement cascade seems to be involved in the production of anti-PEG antibodies when the nanoparticles are administered intravenously. During a subcutaneous injection of the nanoparticles, the anti-PEG IgM concentration measured after 7 days is similar between the control group and the group without an active complement cascade. Finally, Flow cytometry studies with fluorescent nanoparticles administered to mice with and without complement allowed us to identify the importance of complement proteins on the interaction between immune cells and nanoparticles. Complement proteins on the surface of the nanoparticles appear to promote their interaction with splenic B lymphocytes. The complement deposited on the nanoparticles does not appear to direct their interaction with the B cells of the lymph nodes after subcutaneous administration. These results suggest that different mechanisms are involved in the production of anti-PEG antibodies, depending on the route of administration of the nanoparticles. Further studies are required to understand the effects of these anti-PEG antibodies in the clinic.

Les effluents industriels, agricoles et urbains, chargés en polluants divers, soumettent les écosystèmes marins côtiers à un risque écotoxicologique chronique. Depuis une vingtaine d'années, les effets toxiques des polluants sur le système immunitaire ont été étudiés chez tous les groupes écologiques, notamment chez les bivalves pour caractériser ce risque dans les écosystèmes aquatiques. Pour définir un cadre opérationnel de ces outils immunotoxicologiques, il a fallu d'abord étudier plusieurs questions méthodologiques. Ensuite, il convenait d'étudier l'impact des facteurs endogènes et environnementaux naturels sur le signal immunotoxique généré par un polluant. Dans le cadre d'une collaboration franco-québécoise, un suivi bisannuel, en France (Rade de Brest), chez la moule bleue, Mytilus edulis, et chez l'huître creuse, Crassostrea gigas, a permis de mettre en évidence le rôle critique du sexe et du cycle reproducteur sur les variations saisonnières des paramètres immunitaires, au détriment des paramètres naturels de la colonne d'eau. En parallèle, des séries d'expositions « in tubo » de moules bleues, au Québec, à deux saisons différentes a également mis en évidence le rôle critique du sexe et du cycle reproducteur dans la mesure du signal immunotoxique des xénobiotiques, mais surtout dans la sensibilité immunotoxique. En conclusion, cette recherche a permis de créer un cadre opérationnel d'utilisation des biomarqueurs immunotoxicologiques, pour l'évaluation du risque chimique dans les milieux marins côtiers. Mais ils ont également démontré l'importance capitale des facteurs confondants étudiés pour évaluer, au plus juste, le danger des substances chimiques.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La famille des facteurs de transcription lkaros, est composée des protéines lkaros, Helios, Aiolos et Eos. Elles sont exprimées pendant le développement et régulent la différenciation des lymphocytes B et T. Ces protéines présentent une forte homologie de leurs séquences nucléiques et protéiques et sont toutes impliquées dans l'apparition de leucémies lymphoblastiques T ou B. Ces facteurs présentent toutefois de très fortes divergences dans leurs profils d'expression, leurs fonctions et leurs gènes cibles. Ce travail à partir d'une lignée cellulaire T immature déficiente pour lkaros à permis d'étudier les différences fonctionnelles et moléculaires des membres de la famille. La réexpression d'lkaros, d'Aiolos et d'Helios permet la différenciation et la diminution de la prolifération de ces cellules. Cette expérience a montré que les différents membres de la famille avaient des capacités distinctes pour activer ou réprimer certains gènes cibles. Un échange des séquences des domaines de liaison à l'ADN de Aiolos et d'lkaros, a permis de montrer que la spécificité fonctionnelle est en partie déterminée par le domaine de liaison à l'ADN, mais aussi par les autres régions d'lkaros et d'Aiolos. / The lkaros transcription factor family is made of the proteins lkaros, Helios, Aiolos and Eos. They are expressed during the development and regulate the differentiation of lymphocytes B and T. These proteins present a strong homology between their nucleic and protein sequences and are involved the appearance of T or B lymphoblastic leukaemia. However these factors present strong differences in their profiles of expression, their functions and their target genes. An immature T cell line, deficient for lkaros, allows us to study the functional and molecular differences of members of the family. There-expression of lkaros, Aiolos and Helios allows the differentiation and the decrease of the proliferation of these cells. I also showed that the various members of the family had different capacities to activate or repress certain target genes. An exchange of the protein sequences coding for the DNA binding domain (DBD), shows that the functional specificity is partially determined by the DBD domain, but also by the other regions of lkaros and Aiolos.

La réponse immuno-inflammatoire au cours du choc septique associe une importante réponse inflammatoire initiale responsable de l'état de choc et le développement secondaire d'altérations du système immunitaire. Les polynucléaires neutrophiles (PNN) jouent un rôle central dans la réponse immunitaire. Des données récentes de la littérature décrivent également un rôle immunosuppresseur jusqu'alors méconnu pour ces cellules. Nous avons exploré leur possible implication dans la physiopathologie du choc septique.Le but de ce travail était l'exploration des altérations phénotypiques, fonctionnelles et transcriptomiques des PNN lors de la phase immunosuppressive du choc septique. Nos résultats montrent une diminution de la capacité de migration des PNN ainsi qu'une diminution de la production de composés bactéricides (myéloperoxydase, lactoferrine) alors que la réponse aux cytokines et la phagocytose n'apparaissent pas altérées. Le contenu en myéloperoxydase et la présence de PNN immatures CD10dimCD16dim étaient indépendamment associés à une mortalité plus élevée. De manière intéressante, CD177 était le gène le plus différentiellement exprimé entre les patients et les volontaires sains. CD177 et CD10 étaient inversement corrélés. Ainsi, la diminution du chimiotactisme, la perte de myéloperoxydase, la présence de cellules immatures et leurs liens avec la mortalité pourraient contribuer au contexte d'immunosuppression présent chez les patients septiques. Au final, les pistes d'exploration futures convergent vers la population de PNN immatures et le rôle spécifique du CD177 dans les états septiques sévères / Severe septic syndromes deeply impair innate and adaptive immunity and are responsible for sepsis-induced immunosuppression. While neutrophils represent the first line of defense against infection, little is known about their phenotype and functions few days after sepsis, when the immunosuppressive phase is maximal (i.e., between day 3 and 8). The objective of this study was thus to perform a global evaluation of neutrophil alterations in immunosuppressed septic patients based on phenotypic, functional and transcriptomic studies. Our results highlight a markedly altered neutrophil chemotaxis (functional and chemokine receptor expressions), oxidative burst, lactoferrin content and an increased number of circulating immature granulocytes (i.e., CD10dimCD16dim). In contrast, phagocytosis and activation capacities were conserved. It is interesting to note that a diminished myeloperoxidase expression appeared as the best predictor to identify a group of septic shock patients at high risk of death. Similarly, patients with lower proportions of CD10dimCD16dim granulocytes had a significant better survival compared with patients presenting a higher percentage. CD177 mRNA, coding for an activation molecule in chemotaxis but also known to be overexpressed in immature cells, had the highest fold change modulation between patients and controls. Considering the potential dual roles of CD177 neutrophil (i.e., maturation / chemotaxis), its participation in septic shock pathophysiology deserves further investigation. To conclude, circulating neutrophils present with phenotypic, functional and morphological alterations few days after sepsis onset. These dysfunctions may participate in the deleterious role of sepsis-induced immunosuppression. The present results open new perspectives in the mechanisms favoring nosocomial infections after septic shock. They deserve to be further investigated in a larger clinical study and in animal models recapitulating these alterations

La plupart des virus sont connus pour leur capacité à causer des maladies symptomatiques chez l’Homme et chez les autres animaux. Certains d’entre eux sont des grands virus à ADN nommés Virus à Grand ADN Nucléo-Cytoplasmique (NCLDV), rapportés comme infectant les cellules eucaryotiques. Au début du XXI ème siècle, quatre familles ont été définies par Iyer et al. comme ayant une origine commune (groupe monophylétique) : Asfarviridae, Phycodnaviridae, Irido-Ascoviridae et Poxviridae.En 2003, la description d’Acanthamoeba polyphaga mimivirus a cassé un paradigme dans le monde des virus. Par leur taille de particule (450nm), par leur longueur de génomes(supérieure à 1Mb) et leur contenu génique, leur découverte a changé la définition traditionnelle des virus (Lwoff). Depuis 2013 et notamment par les isolements successifs de Pandoravirus,Pithovirus et Mollivirus, ces virus ont été décrits comme possédant de nouvelles propriétés.Leur découverte a été rendue possible grâce à la méthode de co-culture utilisant des protistes, notamment des cellules du genre Acanthamoeba. Cette méthode a été de nombreuses fois modulée par différentes équipes. Dans notre cas, nous avons combiné différentes stratégies appliquées à notre co-culture : la co-culture a été couplée à la cytométrie en flux pour détecter la lyse des protistes. De plus, la cytométrie a été utilisée avec un marqueur à ADN dans le but d’identifier de façon putative le virus et de discriminer les différentes populations virales. Enfin,nous sommes capables de séparer ces populations en utilisant un appareil FACS trieur.L’ensemble de ces techniques a permis l’isolement de nouveaux virus. / Most viruses are known for their ability to cause symptomatic diseases in humans andother animals. Some of them are large DNA viruses named Nucleo-cytoplasmic Large DNAviruses (NCLDV), known for infecting eukaryotic cells. At the beginning of the 21st centuryfour families were defined by Iyer et al. as having a common origin (monophyletic group):Asfarviridae, Phycodnaviridae, Irido-Ascoviridae and Poxviridae.In 2003, the description of Acanthamoeba polyphaga Mimivirus broke this paradigmin the virus world. Because of their particles size (450 nm), their genome size (up to 1Mb),and their gene contents, their discovery changed the traditional definition of viruses (Lwoff).Since 2013 and the successive isolations of Pandoravirus, Pithovirus and Mollivirus; theseviruses have been characterized as possessing various novel properties.Their discoveries have been possible thanks to the co-culture method using protistnotably Acanthamoeba genus cells. This method went through multiple improvements and isemployed by different teams in different ways. In our case and in order to enhance thismethod we combined strategies applied in our co-culture. Indeed, this method consists inusing flow cytometry to detect lysis of protist cells (after all steps of co-culture enrichment).In addition, the flow cytometry was used with a DNA marker in order to identity viruses anddiscriminate viral populations. Then, we were able, using a FACS sorter device, to separatedifferent viral populations from our supernatants.Altogether these techniques have permitted the isolation of new viruses.

Ce travail suggère que l'apotose régule différentiellement la demi-vie des populations lymphocytaires T productrices de cytokines. Processus anti-inflammatoire physiologique, l'apoptose exerce principalement son contrôle négatif sur les cellules T productrices de TNFa. Lors des traitements anti-rétroviraux combinés, la réduction de l'apoptose lymphocytaire est associée à une polarisation pro-inflammatoire qui pourrait favoriser la constitution des anomalies métaboliques mais aussi la survenue des pathologies inflammatoires associées à la restauration immunitaire.

L'analyse d'image est une méthode utile pour la caractérisation objective des populations cellulaires tumorales dans les cancers du sein. La prise en compte d'un nombre plus important de ces cas analysés selon des protocoles et des méthodes standardises est nécessaire pour évaluer la signification pronostique des paramétrés nucléaires ou de la fréquence de certains types nucléaires.

L'objectif principal de cette thèse était d'étudier l'impact de pesticides sur les communautés naturelles de phytoplancton côtier et sur le naissain d'huître creuse, en microcosmes in situ. Les communautés microbiennes (<200 µm) ont été exposées à six pesticides (quatre herbicides, un insecticide et un fongicide) à 0.1, 1, 10 et 100 µg/L de substance active, lors de dix expérimentations in situ. Le contenu des microcosmes a été analysé par trois méthodes :<br />- la « Temporal Temperature Gradient gel Electrophoresis » (TTGE), ou gel d'éléctrophorèse avec gradient de température dans le temps, permettant d'obtenir les empreintes génétiques des communautés procaryotes (avec l'ADN codant pour l'ARN ribosomal 16S) et eucaryotes (avec l'ADN codant pour l'ARN ribosomal 18S) ;<br />- la cytométrie en flux, qui permet de discriminer certaines populations photosynthétiques en fonction, notamment, de leurs signaux d'autofluorescence ;<br />- la Chromatographie Liquide Haute Pression (HPLC), permettant d'obtenir les empreintes pigmentaires des communautés photosynthétiques.<br />Des observations microscopiques ont complété l'analyse de certaines expériences. Les principaux résultats obtenus suggèrent une meilleure sensibilité de la TTGE pour la détection d'effets sur la structure de l'ensemble des communautés eucaryotes ou procaryotes, comparée aux deux autres méthodes qui concernent plus spécifiquement les communautés photosynthétiques. <br />Parmi les six formulations commerciales testées à 0.1 µg/L, aucun effet n'est détecté. Par contre, quatre formulations sont susceptibles de représenter un danger pour les communautés microbiennes à partir de 1 µg/L : les herbicides Basamaïs (bentazone), Roundup (glyphosate), Frontier (diméthénamide), ainsi que l'insecticide Dursban 4 (chlorpyrifos).<br />L'herbicide Basamaïs et le fongicide Opus ont été testés sur le naissain d'huître creuse, seuls à 10 et 70 µg/L, et en mélange à 10 µg/L chacun, au cours d'une expérimentation in situ. Les résultats obtenus démontrent un effet synergique des deux pesticides en mélange à 10 µg/L : la croissance du naissain est réduite de moitié, alors qu'elle n'est pas affectée par les pesticides seuls à 10 µg/L. <br />Cette thèse permet d'illustrer les dangers potentiels représentés par certains pesticides en milieu côtier, en particulier par le Roundup dont les effets apparaissent pour des concentrations testées proches des concentrations environnementales. Les résultats obtenus sur le naissain posent la question des interactions entre molécules et donc de la pertinence des seuils de toxicité réglementaires pour les substances seules, alors même que ces seuils peuvent être différents lorsque des interactions se produisent dans l'environnement.

Candida albicans est une levure commensale du tube digestif humain mais aussi un opportuniste vrai. Il est à l'origine de candidoses superficielles et de candidoses profondes avec un taux de mortalité élevé (30 à 40% des cas). La transition saprophyte-pathogène s'opère à la suite d'une baisse des défenses immunitaires de l'hôte (locales ou générales), permettant la multiplication des levures. Les travaux développés dans le laboratoire depuis les années 90, ont montré que les glycannes pariétaux des levures sont des stimuli pour la cellule macrophagique. Le but de ce travail a été de déterminer l'implication des glycannes présents dans la paroi des levures dans l'induction et la régulation de la réponse immune. Le développement de la technique de cytométrie de flux appliquée aux levures, a permis d'examiner les glycannes pariétaux susceptibles d'interagir avec la cellule hôte au moment du contact avec les macrophages. Les expériences de stimulation ont montré l'activité stimulatrice des levures vis-à-vis de cellules macrophagiques. Les résultats ont indiqué que, dépendant des récepteurs macrophagiques et des glycannes exprimés, différentes réponses cellulaires sont observées. Ainsi, S. cerevisiae, levure non pathogène, induit une réponse de type pro-inflammatoire. Des réponses cytokiniques opposées sont observées avec C. albicans. Cette balance entre réponse pro- et anti-inflammatoire dépend de la charge de levure intéragissant avec les cellules macrophagiques. Les études portant sur la modulation de l'expression glycannique de surface lors de la phagocytose des levures par les macrophages indiquent que lorsque le ratio levure/macrophage est important, l'expression des β-1,2 oligomannosides est augmentée dans le phagosome, sans exposition des β-glucanes, conduisant à une réponse cellulaire de type anti-inflammatoire. Au contraire, quand la charge en levure est limitée, les β-glucanes sont exposés, conduisant à une réponse pro-inflammatoire. Ainsi, ces résultats indiquent qu'en fonction des associations moléculaires et des ligands glycaniques, une réponse pro- ou anti-inflammatoire est élaborée. Les interactions entre les différents glycannes de la paroi de C. albicans et les récepteurs spécifiques des cellules macrophagiques sont critiques dans l'orientation de la réponse immune de l'hôte et donc dans la pathogénèse de la levure et l'infection.