A formação de biofilmes é um fator preocupante para indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização de superfícies de contato e aumentar o risco de contaminação por patógeno em alimentos processados. L. monocytogenes é uma bactéria de ampla distribuição no ambiente e com capacidade de formar biofilmes e sobreviver por longos períodos em condições adversas. Esta bactéria pode causar doenças em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas manifestando-se por infecções do sistema nervoso central, abortos e nascimentos prematuros. Vários estudos têm demonstrado que algumas bactérias podem sofrer transição para o estado viável mas não cultivável em resposta ao estresse. Considerando-se a importância da garantia da segurança e qualidade dos alimentos, há necessidade de desenvolvimento e de padronização de técnicas rápidas para a quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em alimentos e biofilmes. Neste estudo foi avaliada a formação de biofilmes e viabilidade celular de Listeria monocytogenes em condições de estresse. Foram utilizadas técnicas de semeadura em placa e quantificação direta por microscopia de fluorescência com os corantes cloreto de 5-ciano-2,3-di-(p-tolil) tetrazólio (CTC) e 4,6-diamino-2- fenilindol (DAPI). Foram também realizados ensaios preliminares para padronização da Reação da Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR em tempo real) com amostras previamente tratadas com brometo de etídio monoazídico (EMA). Os resultados obtidos demonstraram que o método de semeadura em placa foi adequado somente para a enumeração de células viáveis de L. monocytogenes em biofilmes enquanto que o método de enumeração por microscopia de fluorescência com CTC-DAPI permitiu quantificar bactérias no estado viável e viável mas não cultivável. Também foi observado que a presença de bacteriocinas de L. sakei 1 e L. mensenteroides 11 causou a diminuição na viabilidade e formação de biofilmes por L. monocytogenes. Os resultados preliminares utilizando culturas puras de L. monocytogenes demonstraram que o tratamento com brometo de etídio monoazídico (EMA) antes da análise por PCR em tempo real reduziu a amplificação do DNA de células mortas em 1 log de UFC por mL. No entanto dependendo da concentração utilizada, pode ocorrer também a inibição da amplificação de células viáveis de L. monocytogenes. Os resultados do presente trabalho indicaram que a microscopia de fluorescência é comparável à placa para análise de células de L. monocytogenes não estressadas. Entretanto, para a quantificação de L. monocytogenes submetida a estresse, é desejável a utilização de corantes de viabilidade celular. O método de PCR em tempo real com pré-tratamento com EMA é promissor mas, ainda necessita de maior padronização para avaliação de sua aplicabilidade na determinação seletiva de células viáveis de L. monocytogenes. / Biofilm formation is of great concern for food industry because it may compromise sanitization of surfaces and increase contamination risk of processed foods by bacterial pathogens. L. monocytogenes is an ubiquitous bacterium which is able to form biofilms and to survive for long periods under adverse conditions. L. monocytogenes may cause disease in immunocomprommised people and pregnant women, manifesting as central nervous system infections, abortion and premature birth. Some bacteria can undergo transition to viable but non-cultivable state in response to stress and it is important to study techniques for rapid quantification of viable cells of L. monocytogenes in foods. In this study biofilm formation and cell viability of Listeria monocytogenes were studied in stress conditions by plate counting, direct quantification by fluorescence microscopy with double staining dyes 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)/4\'-6 diamino-2 phenylindole (DAPI). Preliminary experiments with real time polymerase chain reaction and treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) were also performed. The results showed that plate count method was suitable for enumeration only of viable cells of L. monocytogenes in biofilms since, fluorescence microscopy with CTC-DAPI yielded higher counts, probably due to the presence of viable but nonculturable cells. It was also observed that the presence of bacteriocins of L. sakei 1 and L. mensenteroides 11 decreased viability and formation of biofilm by L. monocytogenes. Results obtained with pure cultures of L. monocytogenes showed that the treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) before real time PCR detection, reduced DNA amplification of dead cells in 1 log CFU per mL, but depending on the concentration used, EMA also inhibited amplification of viable cells of L. monocytogenes. The results indicated that plate counting and fluorescence microscopy are equivalent for enumeration of non-stressed L. monocytogenes cells. However, the use of double staining with fluorescence microscopy is a more suitable method if stressed cells are present. The EMA-real time PCR is a promissing tool for rapid evaluation of viable L. monocytogenes, but it needs further standartization.

Hintergrund: Ein sehr häufig in der nuklearmedizinischen Diagnostik genutztes Radionuklid ist 99mTc. Es emittiert Gammastrahlung mit einer relativ niedrigen Energie (140 keV) und hat eine kurze Halbwertszeit von 6 h. Zusätzlich zur Gammastrahlung entstehen bei jedem Zerfall von 99mTc Auger-Elektronen. Diese niederenergetischen Elektronen, sehr kurzer Reichweite verfügen über einen hohen LET und erzeugen somit eine ausreichende Energiedeposition, um direkte DSB zu erzeugen. Bei Untersuchungen zu Chemotoxizität und Radiotoxizität mit Zellexperimenten gilt es eine Vielzahl an verschiedenen Schutzmechanismen, Reparaturmechanismen und Signalkaskaden in Zellen zu beachten, welche häufig noch nicht vollständig erforscht sind. Um das schädigende Potential von unterschiedlichen Substanzen und Strahlenqualitäten auf die DNA zu untersuchen, wurde ein zellfreies System gewählt. Ziel dieser Arbeit war es, neben den Strahlenqualitäten der Alpha-, Beta, Gamma- und Röntgenstrahlung die Auger-Elektronen des 99mTc auf ihr Potential zur Induktion von DNA-Strangbrüchen zu untersuchen. Hierfür stand die Substanz 99mTc-HYNIC-DAPI zur Verfügung, welche 99mTc an das Plasmid binden und somit in direkte DNA-Nähe bringen kann. Material und Methode: Alle Versuche wurden mit dem Plasmid pUC 19, einem künstlich hergestellten, bakteriellen Plasmid mit 2686 Basenpaaren, welches als nackte DNA ohne Proteine vorliegt, durchgeführt. Der Vergleich zwischen bestrahltem Plasmid in Ab- und Anwesenheit des Radikalfängers DMSO gibt Hinweise darauf, ob Strangbrüche direkt induziert oder nach Radikalbildung indirekt erzeugt werden. Bei radikalvermittelter Wirkung verhindert DMSO DNA-Strangbrüche und die ungeschädigte Supercoiled-Plasmid-Konformation bleibt erhalten. Nach Bestrahlung des Plasmids erfolgte der Nachweis von Strangbrüchen mittels Agarose-Gelelektrophorese. Bekommt ein Plasmid Einzel- oder Doppelstrangbrüche, so verändert sich seine Konformation zu einem ringförmigen/open circle (ESB) oder einem linearen Plasmid (DSB). Durch veränderte Laufeigenschaften im Agarosegel sind die verschiedenen Konformationen voneinander trennbar. Nach Anfärben der DNA mit dem Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid konnte das fluoreszierende Plasmid fotografiert und die Intensität der Konformationsbanden quantifiziert werden. Ergebnisse: Zuerst wurde die Reproduzierbarkeit der Methodik überprüft und festgestellt, dass eine Korrelation zwischen Plasmidmasse und Fluoreszenzintensität besteht. Anschließend wurde in Vorversuchen gezeigt, dass die Inkubationstemperaturen, pH-Werte und der Radikalfänger DMSO keinen Einfluss auf die Plasmidintegrität haben. Bei Bestrahlung mit Röntgenstrahlung, dem Beta-Strahler 188Re und dem nicht DNA-gebundenen Gamma-Strahler und Auger-Emitter 99mTc konnte mit steigender Dosis eine Zunahme an ESB festgestellt werden. Vergleichsproben mit DMSO zeigten keinen Anstieg von ESB, was auf eine radikalvermittelte 67 DNA-Schädigung mittels Reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) hinweist. Ab einer Energiedosis von ca. 80 Gy konnten nach Bestrahlung mit 188Re und 99mTc zusätzlich zu den ESB auch DSB nachgewiesen werden. DMSO konnte in den Vergleichsproben sowohl die ESB als auch die DSB erfolgreich verhindern. Bei einer sehr hohen Dosis ≥ 600 Gy zeigte DMSO Kapazitätsgrenzen und es konnten nicht mehr alle Strangbrüche verhindert werden. Die Bestrahlung mit dem Alpha-Strahler (hoher LET) 223Ra fügte, im Vergleich zu Strahlung mit niedrigem LET, dem Plasmid überproportional viele DSB zu. Einige dieser DSB konnten nicht durch DMSO verhindert werden, was auf einen direkten DNA-Schaden bzw. eine zu hohe Radikaldichte hinweist. Ein noch stärkerer direkter Effekt konnte beobachtet werden, wenn 99mTc über die Substanz 99mTc-HYNIC-DAPI an DNA gebunden wurde. Dabei konnten schon ab einer Energiedosis von 4 Gy DSB erzeugt werden, welche trotz Radikalfänger nicht verhindert werden konnten. Schlussfolgerung: Dieser bei 99mTc-HYNIC-DAPI beobachtete Effekt wird den Auger-Elektronen zugeschrieben. Aufgrund ihrer kurzen Reichweite und ihres hohen LET sind sie in der Lage direkte DSB zu erzeugen, wenn sie DNA-gebunden sind oder sich in geringem Abstand zur DNA befinden. Die Ergebnisse der Experimente weisen auf ein therapeutisches Potential von 99mTc hin. Weitere Untersuchungen müssen zeigen, ob eine Adressierung von 99mTc an die DNA im Zellkern einer intakten Zelle zu verwirklichen ist und ob DNA-gebundenes 99mTc durch die Energie der Auger-Elektronen den Zelltod herbeiführen kann. Im nächsten Schritt sollte die Erforschung von Trägersubstanzen erfolgen, welche es ermöglichen Auger-Emitter spezifisch an die DNA von Tumorzellen zu koppeln. / Introduction and aim of the study: A radionuclide commonly used in diagnostic nuclear medicine is 99mTc. It emits gamma rays with a relatively low energy (140 keV) and has a short half-time (6h). In addition to gamma rays, 99mTc radiates so called Auger-electrons with low energy, low range and high linear energy transfer. Due to the high-LET Auger-electrons have a sufficient energy deposition to induce direct double-strand breaks to the DNA. In these experiments we used plasmid DNA to evaluate damage induced to biological systems by different chemotoxical substances and radionuclides as well as external radiation. By using plasmids instead of cell cultures we avoid lots of unexplored signal pathways in cells and it is possible to quantify chemotoxical and radiation damage to the DNA. Materials and methods: The double-stranded plasmid pUC 19 with 2686 bp is used in all experiments. It is a synthetically produced bacterial plasmid without any proteins. To distinguish between directly and indirectly (radical induced) induced damage we used the radical scavenger DMSO. Indirectly induced damage via reactive oxygen species (ROS) can be prevented by DMSO. The quantification of supercoiled forms, single strand breaks (SSB) and double strand breaks (DSB) was measured by the method of agarose gel electrophoresis. After the electrophoresis, agarose gels are dyed in ethidium bromide and imaged with a ccd-camera using ultraviolet transillumination. The bands of the different plasmid forms were quantified through the FIJI computer program. Results: First of all a correlation between plasmid mass and fluorescence intensity was shown. In a pretrial no damaging effect to the plasmid from incubation temperature, pH-value and radical scavenger DMSO appeared. Afterwards we examined chemotoxical SnCl2, external x-rays, the alpha emitter 223Ra, the beta emitter 188Re, gamma- and Auger-emitter 99mTc and the DNA-bound 99mTc-HYNIC-DAPI. The radical scavenger DMSO was used to differentiate between indirect (radical induced) and direct DNA-damage. All different radiation qualities showed an increasing DNA-damage with increasing energy dose. For the low-LET radiation qualities like chemotoxical SnCl2, external x-rays, the beta emitter 188Re and not DNA-bound 99mTc, DMSO showed the quality to prevent the damage. After the deposition of an energy dose ≥ 600 Gy DMSO showed a limitation in his scavenger capacity. During radiation with high-LET beams like 223Ra or DNA-bound 99mTc-HYNIC-DAPI DMSO showed less or nearly no ability to prevent DNA-damage. A 4 Gy dose of 99mTc-HYNIC-DAPI was able to induce DSB into the plasmid. These DSB could not be prevented by DMSO. The lower ESB:DSB ratio for high-LET beams also displays that direct damage is more likely to create DSB than indirect damage. Conclusion: In conclusion we can say that DNA-bound 99mTc-HYNIC-DAPI was most appropriate to induce DSB via a direct effect. It was impossible to prevent this damage due to adding the 69 radical scavenger DMSO. We attribute this to low range, low-LET Auger-electrons and suppose that it may be possible to use DNA-bound 99mTc for therapeutic purpose. Further research has to show if 99mTc can be targeted to the DNA of intact cells and if suitable tracers can be found to safely target and kill tumor cells.

Structure of the karyotype of three species in ermine moths (Yponomeuta: Yponomeutidae, Lepidoptera) was investigated by means of several cytogenetic methods (DAPI staining, orcein staining, CGH and GISH with telomeric probe) focusing on their sex chromosomes. Additionally, the origin of the Z2 chromosome in the WZ1Z2/Z1Z1Z2Z2 sex chromosome system (specific for this family of butterflies) was tested using southern hybridization.

L‟étude porte sur la systématique de l‟endofaune microbienne des Oligochètes terricoles Megascolecidae et Glossoscolecidae de la région de Yaoundé et ses environs, avec un accent particulier sur l‟analyse morphologique et génétique des Ciliés Astomes présents dans leur tractus digestif. Une révision taxonomique de la famille des Radiophryidae de Puytorac 1972 est menée, avec la description de cinq espèces nouvelles de la sous-famille des Metaracoelophryinae de Puytorac, 1972. Elle permet de confirmer d‟une part, la présence des genres Paracoelophrya et Dicoelophrya dans le tube digestif des Oligochètes du genre Alma du Cameroun et de confirmer l‟homogénéité de ce groupe d‟autre part. La question de la parenté phylogénétique des Hoplitophryida est exposée. La diversité d‟organisation de l‟appareil nucléaire dans le genre Almophrya a été étudiée à travers des observations sur ses variations morphologiques après coloration des spécimens au Diamidino Phényl Indol (Johnson et al., 1982), au Feulgen ou au carbonate d‟argent ammoniacal (Fernandez Galiano, 1994). Une nouvelle espèce d‟Almophrya à vacuoles axiales est décrite, Almophrya nkoldaensis n. sp., imposant une révision des clés d‟identification des espèces au sein de ce genre. Bien plus, le processus de morphogenèse de bipartition chez trois espèces d‟Astomes a été étudié, montrant diverses variantes de cette division : à côté de la fission binaire classique chez Eudrilophrya complanata, la palintomie radiaire et distale chez Buchneriella eupolytoreuti n. sp. a été précisée. De plus, le processus de la conjugaison a été exploré chez Eudrilophrya simplex n.sp. L‟analyse des séquences de gènes RNA de la petite sous unité ribosomale (SSrRNA) chez Anoplophrya marylandensis Conklin, 1930 montre l‟appartenance de cette espèce d‟Astome à la Classe des Oligohymenophora (Affa‟a et al., 2004). Cependant, la séquence de gènes d‟une seule espèce est insuffisante pour établir avec certitude, les relations phylétiques dans un grand groupe. Par conséquent, nous avons obtenu les séquences de gènes SSrRNA de neuf espèces additionnelles distribuées dans six genres appartenant aux trois ordres de la sous-classe des Astomatia : Hoplitophryida Cheissin, 1930 em., de Puytorac, 1972 ; Anoplophryida Cépède, 1910 et Haptophryida Cépède, 1923. Dans le cadre de l‟analyse moléculaire, un nouveau genre de Clausilocolidae de Puytorac in Corliss, 1979 est proposé : Paraclausilocola nov. gen., avec deux espèces nouvelles : P. elongata n. sp. et P. constricta n. sp. Ce nouveau genre est représentatif de l‟ordre des Haptophryida. Le cladogramme obtenu montre une forte affinité des séquences des nouveaux Astomes étudiés avec celle d‟A. marylandensis Conklin, 1930. La branche de l‟arbre contenant les Astomes est précise et montre une distance génétique considérable avec les autres sous-classes des Oligohymenophorea. Cet arbre établit les Astomes comme un clade frère des Scuticociliés, confirmant l‟hypothèse selon laquelle les Astomes forment une sous-classe monophylétique appartenant à la classe des Oligohymenophora (de Puytorac, 1954 ; Affa‟a et al., 2004). Dans la sous-classe des Astomatia, nous observons deux branches bien distinctes : l‟une avec les genres Anoplophrya, Almophrya et Metaracoelophrya, la seconde avec les genres restants : Eudrilophrya, Metaradiophrya, Paraclausilocola et Njinella. Au regard de ce regroupement, les attributions ordinales et les assignations des genres aux familles dans les deux classifications actuelles, celle de de Puytorac (1994) et de Lynn (2008), ne semblent plus respectées.

Submitted by Jadson Francisco de Jesus SILVA (jadson@uefs.br) on 2018-09-14T21:35:37Z No. of bitstreams: 1 LARISSA EMANUELLE - CARACTERIZA??O CITOGEN?TICA E MOLECULAR DE ACESSOS DE MARACUJ? DA CAATINGA (P.pdf: 1500343 bytes, checksum: fe0bb966270a60a1929a285b717b71db (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T21:35:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LARISSA EMANUELLE - CARACTERIZA??O CITOGEN?TICA E MOLECULAR DE ACESSOS DE MARACUJ? DA CAATINGA (P.pdf: 1500343 bytes, checksum: fe0bb966270a60a1929a285b717b71db (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Passiflora cincinnata Mast. is a native species of Brazil with a wide geographic distribution, which can be exploited as a source of resistance to biotic and abiotic stresses, presenting good productivity, as well as high nutritional quality for human consumption, besides other uses. On the other hand, both molecular and cytogenetic characterization is an important step for the conservation and use of genotypes, considering the potential genetic diversity of the species. The objective of this work was to characterize the genetic diversity among the passion fruit of the caatinga (P. cincinnata), conserved in the active bank of passion fruit germplasm of Embrapa Semi?rido, using cytogenetic techniques of conventional analysis, double CMA3/DAPI staining and using molecular markers from type ISSR. The different ISSR molecular markers showed efficiency in detecting polymorphism, revealing intraspecific variability among the accessions. Diploid chromosome numbers 2n=18 were observed, being classified in the chromosomal group with basic number x=9. The double CMA/DAPI staining allowed the identification of four CMA positive bands, semi-reticulated interphase nuclei with presence of CMA+ blocks. The colorability of the pollen grains using acetic carmine and Alexander reactive allowed to estimate high pollen viability with values above 98% for both dyes analyzed, indicating the potential use of this species in breeding programs. / Passiflora cincinnata Mast. ? uma esp?cie nativa do Brasil com ampla distribui??o geogr?fica, que pode ser explorada como fonte de resist?ncia a estresses bi?ticos e abi?ticos, apresentando boa produtividade, bem como alta qualidade nutricional para a alimenta??o humana, al?m de outros usos. Por outro lado, a caracteriza??o tanto molecular como citogen?tica ? uma etapa importante para conserva??o e uso de gen?tipos, considerando a diversidade gen?tica potencial da esp?cie. O presente trabalho objetivou caracterizar a diversidade gen?tica entre acessos de maracuj? da caatinga (P. cincinnata) conservados no Banco Ativo de Germoplasma de maracuj? da Embrapa Semi?rido, utilizando t?cnicas citogen?ticas de an?lise convencional, dupla colora??o CMA3/DAPI e utilizando marcadores moleculares do tipo ISSR. Os diferentes marcadores moleculares ISSR mostraram efici?ncia na detec??o de polimorfismo, revelando variabilidade intraespec?fica entre os acessos. Foram observados n?meros cromoss?micos diploides 2n=18, sendo classificados no grupo cromoss?mico com n?mero b?sico x=9. A dupla colora??o CMA/DAPI, permitiu identificar quatro bandas CMA positivo, n?cleos interf?sicos semirreticulados com presen?a de blocos CMA+. A colorabilidade dos gr?os de p?len utilizando carmim ac?tico e reativo de Alexander permitiu estimar uma alta viabilidade pol?nica com valores acima de 98% para ambos os corantes analisados, indicando o uso potencial dessa esp?cie em programas de melhoramento.

Cryptosporidium parvum is of growing public health concern due to its ability to survive typical water treatment processes. In order to protect the public from infection, the Environmental Protection Agency developed Method 1623 for the detection of Cryptosporidium oocysts in environmental water samples. Execution of this method is time consuming, and the results do not provide an accurate estimation of viability. Therefore, current research is focused on creating a real-time PCR method for the accurate detection of viable Cryptosporidium parvum in environmental water samples. This thesis presents the development of a real-time PCR method, and the results obtained in its use on field samples. The assay was standardized using multiple dilution series in addition to positive and negative controls. Environmental water samples were tested using this method and Method 1623 for comparison. The results were compared statistically to determine the degree of correlation between methods. The data show that the real-time PCR method correlates well to Method 1623. In addition, the assay was determined to be more cost effective and less labor intensive than Method 1623. Although these early findings are promising, additional research and development are needed before the proposed assay can be used in industry.

Gelasine Herb. (Tigridieae: Iridaceae) é composto por sete espécies nativas da América do Sul, sendo três delas encontradas no Rio Grande do Sul (Brasil): G. coerulea (Vell.) Ravenna, G. elongata (Graham) Ravenna e G. uruguaiensis Ravenna. São plantas bulbosas de folhas plicadas, flores perfeitas azuis ou roxas e compostas por dois conjuntos de tépalas desiguais. Gelasine elongata e G. coerulea encontram-se na lista de espécies ameaçadas para o RS, sendo a primeira delas ameaçada e a segunda criticamente ameaçada. Apesar de seu atual estado de vulnerabilidade, Gelasine é um gênero ainda pouco estudado, não havendo nenhuma informação quanto à variabilidade e diversidade genética. Os dados citogenéticos são também ainda escassos. Assim, a presente dissertação tem por objetivo caracterizar as três espécies de Gelasine ocorrentes no sul do Brasil quanto a aspectos moleculares, citogenéticos, além de compreender suas relações. Para a caracterização da diversidade genética foram usadas duas populações de G. coerulea e duas de G. elongata; não foi possível a utilização de G. uruguaiensis em função do número restrito de indivíduos. As amostras de DNA foram obtidas a partir de folhas das espécies mencionadas e empregada a técnica de ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Foram testados 44 primers para ISSR, destes, 12 apresentaram um bom padrão de amplificação que em conjunto geraram 91 loci. A quantidade de bandas por primer variou em média de 7,5. Este trabalho resultou em dados inéditos para o gênero Gelasine quanto à variabilidade genética inter e intra-populacional. Os resultados indicam que a variação genética intrapopulacional é muito baixa e que a maior diversidade encontrada para estas espécies ocorreu entre as populações. Não foi verificada correlação significativa com a distância geográfica entre as populações. Tais resultados indicam que o sistema reprodutivo, o método de dispersão de sementes e a presença de descendência clonal oriunda da divisão dos bulbos subterrâneos são fatores de grande influência na diversidade. Para caracterização citogenética das espécies foi empregada coloração convencional e bandeamento CMA/DAPI, e realizadas medidas cromossômicas. Foi também estimado o tamanho do genoma por citometria de fluxo a partir de folhas frescas das três espécies. As análises citogenéticas se mostraram bastante eficientes para a diferenciação das três espécies de Gelasine investigadas. Gelasine coerulea e G. uruguaiensis apresentam o mesmo número cromossômico básico e somático (2n = 2x = 14), não sendo encontrados citótipos poliploides. Ambas têm cariótipos relativamente simétricos, porém se mostram bastante distintas quanto ao tamanho dos cromossomos e seu padrão de bandeamento, com uma grande variação na ocorrência e distribuição de sequências de DNA repetitivo (bandas CMA/DAPI). O conteúdo de DNA também permite a clara diferenciação dessas espécies, tendo G. coerulea 2C = 11,30 pg e G. uruguaiensis 2C = 16,88 pg. Gelasine elongata possui número cromossômico básico diferente das anteriores (2n = 2x = 12) e cariótipo claramente bimodal. Os cromossomos têm menor tamanho, o que, consequentemente reflete no menor tamanho de genoma (2C = 3,45 pg). Além disso, o padrão de bandas CMA/DAPI é notadamente mais simples que das outras duas espécies, onde o maior par de cromossomos (par I) exibe as únicas bandas CMA+ presentes na região da constrição secundária. Os dados obtidos para G. elongata apontam para uma maior semelhança dessa espécie com outras duas do gênero Eleuthenine (2n = 2x = 12), o que reforça os dados filogenéticos existentes, onde G. elongata está separada de G. coerulea e agrupada no mesmo ramo de Eleutherine. Não foi observado heteromorfismo cromossômico para Gelasine elongata e nem para as outras duas espécies investigadas, embora tal situação tenha sido reportada para aquela espécie. Os dados obtidos para Gelasine com o uso dos fluorocromos CMA e DAPI, bem como os demais parâmetros citogenéticos investigados permitiram a clara diferenciação entre as espécies. Associados a uma abordagem filogenética, tais resultados auxiliam a compreensão das relações entre essas espécies e sua evolução. / Gelasine Herb. (Tigridieae: Iridaceae) comprises seven native species from South America, three of them are found in Rio Grande do Sul (Brasil): G. coerulea (Vell.) Ravenna, G. elongata (Graham) Ravenna and G. uruguaiensis Ravenna. These species are bulbous plants with plicate leaves and blue or violet perfect flowers which are composed of two unequal groups of tepals. Gelasine elongata and G. coerulea are included in the list of endangered species from RS, the first one is considered endangered and the latter, critically endangered. Notwithstanding its current vulnerability status, Gelasine is still a poorly studied genus and genetic variability and diversity information concerning its species are lacking. Cytogenetic data are also scarce. Thus the present dissertation aims to characterize the three Gelasine species occurring in Southern Brazil regarding its molecular and cytogenetic aspects in addition to understand their relationships. To characterize their genetic diversity, two populations of G. coerulea and two of G. elongata were used; it was not possible to investigate G. uruguaiensis due to its restricted number of individuals. DNA samples were obtained from leaves of the aforementioned species and ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) technique was employed. Fourty-four ISSR primers were tested, 12 of these presented good amplification pattern which generated a total of 97 loci. The number of bands per primer had an average of 7.5. The present study resulted in novelty data for Gelasine concerning its inter and intrapopulation genetic variability. The results indicate a very low intrapopulation genetic variation and most of the diversity found in these species occurred among their populations. No significant correlation was verified between geographical distances of populations. Such results indicate that reproductive system, seed dispersal mechanisms and presence of clonal descendants generated from divisions of subterranean bulbs are factors that greatly influence in diversity. For cytogenetic characterization of the species, conventional staining and CMA/DAPI banding were employed and chromosome measurements were made. Also, genome size was estimated through flow cytometry using fresh leaves from the three species. Cytogenetic analyses were very efficient to differentiate all investigated species of Gelasine. Gelasine coerulea and G. uruguaiensis have the same basic and somatic chromosome number (2n = 2x = 14); polyploid cytotypes were not found. Both species display fairly symmetric karyotypes, however they are very distinct with respect to chromosome sizes and banding patterns, with a great variation in the occurrence and distribution of repetitive DNA sequences (CMA/DAPI bands). DNA content also allows clear differentiation of these species; G. coerulea has 2C = 11,30 pg and G. uruguaiensis has 2C = 16,88 pg. Gelasine elongata has a different base chromosome number than both former species (2n = 2x = 12) and a clearly bimodal karyotype. Its chromosomes are smaller which, consequently, reflects on the smaller genome size (2C = 3,45 pg). Furthermore, its CMA/DAPI band pattern is markedly simpler than the ones from the other two species, where the largest chromosome pair (pair I) contains the only CMA+ bands present in the secondary constriction region. Data obtained from G. elongata points out a larger resemblance between this species and two others belonging to Eleuthenine (2n = 2x = 12), which supports the phylogenetic data where G. elongata is separate from G. coerulea and groups with Eleutherine. Chromosome heteromorphism was not observed in Gelasine elongata nor in the two other investigated species, even though it had been reported for the first one. Data obtained from Gelasine with the use of CMA and DAPI fluorochromes, along with the other cytogenetic parameters investigated, allowed clear differentiation between species. Allied to a phylogenetic approach, these results can bring better understanding to the relations between these species and their evolution.

Gelasine Herb. (Tigridieae: Iridaceae) é composto por sete espécies nativas da América do Sul, sendo três delas encontradas no Rio Grande do Sul (Brasil): G. coerulea (Vell.) Ravenna, G. elongata (Graham) Ravenna e G. uruguaiensis Ravenna. São plantas bulbosas de folhas plicadas, flores perfeitas azuis ou roxas e compostas por dois conjuntos de tépalas desiguais. Gelasine elongata e G. coerulea encontram-se na lista de espécies ameaçadas para o RS, sendo a primeira delas ameaçada e a segunda criticamente ameaçada. Apesar de seu atual estado de vulnerabilidade, Gelasine é um gênero ainda pouco estudado, não havendo nenhuma informação quanto à variabilidade e diversidade genética. Os dados citogenéticos são também ainda escassos. Assim, a presente dissertação tem por objetivo caracterizar as três espécies de Gelasine ocorrentes no sul do Brasil quanto a aspectos moleculares, citogenéticos, além de compreender suas relações. Para a caracterização da diversidade genética foram usadas duas populações de G. coerulea e duas de G. elongata; não foi possível a utilização de G. uruguaiensis em função do número restrito de indivíduos. As amostras de DNA foram obtidas a partir de folhas das espécies mencionadas e empregada a técnica de ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Foram testados 44 primers para ISSR, destes, 12 apresentaram um bom padrão de amplificação que em conjunto geraram 91 loci. A quantidade de bandas por primer variou em média de 7,5. Este trabalho resultou em dados inéditos para o gênero Gelasine quanto à variabilidade genética inter e intra-populacional. Os resultados indicam que a variação genética intrapopulacional é muito baixa e que a maior diversidade encontrada para estas espécies ocorreu entre as populações. Não foi verificada correlação significativa com a distância geográfica entre as populações. Tais resultados indicam que o sistema reprodutivo, o método de dispersão de sementes e a presença de descendência clonal oriunda da divisão dos bulbos subterrâneos são fatores de grande influência na diversidade. Para caracterização citogenética das espécies foi empregada coloração convencional e bandeamento CMA/DAPI, e realizadas medidas cromossômicas. Foi também estimado o tamanho do genoma por citometria de fluxo a partir de folhas frescas das três espécies. As análises citogenéticas se mostraram bastante eficientes para a diferenciação das três espécies de Gelasine investigadas. Gelasine coerulea e G. uruguaiensis apresentam o mesmo número cromossômico básico e somático (2n = 2x = 14), não sendo encontrados citótipos poliploides. Ambas têm cariótipos relativamente simétricos, porém se mostram bastante distintas quanto ao tamanho dos cromossomos e seu padrão de bandeamento, com uma grande variação na ocorrência e distribuição de sequências de DNA repetitivo (bandas CMA/DAPI). O conteúdo de DNA também permite a clara diferenciação dessas espécies, tendo G. coerulea 2C = 11,30 pg e G. uruguaiensis 2C = 16,88 pg. Gelasine elongata possui número cromossômico básico diferente das anteriores (2n = 2x = 12) e cariótipo claramente bimodal. Os cromossomos têm menor tamanho, o que, consequentemente reflete no menor tamanho de genoma (2C = 3,45 pg). Além disso, o padrão de bandas CMA/DAPI é notadamente mais simples que das outras duas espécies, onde o maior par de cromossomos (par I) exibe as únicas bandas CMA+ presentes na região da constrição secundária. Os dados obtidos para G. elongata apontam para uma maior semelhança dessa espécie com outras duas do gênero Eleuthenine (2n = 2x = 12), o que reforça os dados filogenéticos existentes, onde G. elongata está separada de G. coerulea e agrupada no mesmo ramo de Eleutherine. Não foi observado heteromorfismo cromossômico para Gelasine elongata e nem para as outras duas espécies investigadas, embora tal situação tenha sido reportada para aquela espécie. Os dados obtidos para Gelasine com o uso dos fluorocromos CMA e DAPI, bem como os demais parâmetros citogenéticos investigados permitiram a clara diferenciação entre as espécies. Associados a uma abordagem filogenética, tais resultados auxiliam a compreensão das relações entre essas espécies e sua evolução. / Gelasine Herb. (Tigridieae: Iridaceae) comprises seven native species from South America, three of them are found in Rio Grande do Sul (Brasil): G. coerulea (Vell.) Ravenna, G. elongata (Graham) Ravenna and G. uruguaiensis Ravenna. These species are bulbous plants with plicate leaves and blue or violet perfect flowers which are composed of two unequal groups of tepals. Gelasine elongata and G. coerulea are included in the list of endangered species from RS, the first one is considered endangered and the latter, critically endangered. Notwithstanding its current vulnerability status, Gelasine is still a poorly studied genus and genetic variability and diversity information concerning its species are lacking. Cytogenetic data are also scarce. Thus the present dissertation aims to characterize the three Gelasine species occurring in Southern Brazil regarding its molecular and cytogenetic aspects in addition to understand their relationships. To characterize their genetic diversity, two populations of G. coerulea and two of G. elongata were used; it was not possible to investigate G. uruguaiensis due to its restricted number of individuals. DNA samples were obtained from leaves of the aforementioned species and ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) technique was employed. Fourty-four ISSR primers were tested, 12 of these presented good amplification pattern which generated a total of 97 loci. The number of bands per primer had an average of 7.5. The present study resulted in novelty data for Gelasine concerning its inter and intrapopulation genetic variability. The results indicate a very low intrapopulation genetic variation and most of the diversity found in these species occurred among their populations. No significant correlation was verified between geographical distances of populations. Such results indicate that reproductive system, seed dispersal mechanisms and presence of clonal descendants generated from divisions of subterranean bulbs are factors that greatly influence in diversity. For cytogenetic characterization of the species, conventional staining and CMA/DAPI banding were employed and chromosome measurements were made. Also, genome size was estimated through flow cytometry using fresh leaves from the three species. Cytogenetic analyses were very efficient to differentiate all investigated species of Gelasine. Gelasine coerulea and G. uruguaiensis have the same basic and somatic chromosome number (2n = 2x = 14); polyploid cytotypes were not found. Both species display fairly symmetric karyotypes, however they are very distinct with respect to chromosome sizes and banding patterns, with a great variation in the occurrence and distribution of repetitive DNA sequences (CMA/DAPI bands). DNA content also allows clear differentiation of these species; G. coerulea has 2C = 11,30 pg and G. uruguaiensis has 2C = 16,88 pg. Gelasine elongata has a different base chromosome number than both former species (2n = 2x = 12) and a clearly bimodal karyotype. Its chromosomes are smaller which, consequently, reflects on the smaller genome size (2C = 3,45 pg). Furthermore, its CMA/DAPI band pattern is markedly simpler than the ones from the other two species, where the largest chromosome pair (pair I) contains the only CMA+ bands present in the secondary constriction region. Data obtained from G. elongata points out a larger resemblance between this species and two others belonging to Eleuthenine (2n = 2x = 12), which supports the phylogenetic data where G. elongata is separate from G. coerulea and groups with Eleutherine. Chromosome heteromorphism was not observed in Gelasine elongata nor in the two other investigated species, even though it had been reported for the first one. Data obtained from Gelasine with the use of CMA and DAPI fluorochromes, along with the other cytogenetic parameters investigated, allowed clear differentiation between species. Allied to a phylogenetic approach, these results can bring better understanding to the relations between these species and their evolution.

Gelasine Herb. (Tigridieae: Iridaceae) é composto por sete espécies nativas da América do Sul, sendo três delas encontradas no Rio Grande do Sul (Brasil): G. coerulea (Vell.) Ravenna, G. elongata (Graham) Ravenna e G. uruguaiensis Ravenna. São plantas bulbosas de folhas plicadas, flores perfeitas azuis ou roxas e compostas por dois conjuntos de tépalas desiguais. Gelasine elongata e G. coerulea encontram-se na lista de espécies ameaçadas para o RS, sendo a primeira delas ameaçada e a segunda criticamente ameaçada. Apesar de seu atual estado de vulnerabilidade, Gelasine é um gênero ainda pouco estudado, não havendo nenhuma informação quanto à variabilidade e diversidade genética. Os dados citogenéticos são também ainda escassos. Assim, a presente dissertação tem por objetivo caracterizar as três espécies de Gelasine ocorrentes no sul do Brasil quanto a aspectos moleculares, citogenéticos, além de compreender suas relações. Para a caracterização da diversidade genética foram usadas duas populações de G. coerulea e duas de G. elongata; não foi possível a utilização de G. uruguaiensis em função do número restrito de indivíduos. As amostras de DNA foram obtidas a partir de folhas das espécies mencionadas e empregada a técnica de ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Foram testados 44 primers para ISSR, destes, 12 apresentaram um bom padrão de amplificação que em conjunto geraram 91 loci. A quantidade de bandas por primer variou em média de 7,5. Este trabalho resultou em dados inéditos para o gênero Gelasine quanto à variabilidade genética inter e intra-populacional. Os resultados indicam que a variação genética intrapopulacional é muito baixa e que a maior diversidade encontrada para estas espécies ocorreu entre as populações. Não foi verificada correlação significativa com a distância geográfica entre as populações. Tais resultados indicam que o sistema reprodutivo, o método de dispersão de sementes e a presença de descendência clonal oriunda da divisão dos bulbos subterrâneos são fatores de grande influência na diversidade. Para caracterização citogenética das espécies foi empregada coloração convencional e bandeamento CMA/DAPI, e realizadas medidas cromossômicas. Foi também estimado o tamanho do genoma por citometria de fluxo a partir de folhas frescas das três espécies. As análises citogenéticas se mostraram bastante eficientes para a diferenciação das três espécies de Gelasine investigadas. Gelasine coerulea e G. uruguaiensis apresentam o mesmo número cromossômico básico e somático (2n = 2x = 14), não sendo encontrados citótipos poliploides. Ambas têm cariótipos relativamente simétricos, porém se mostram bastante distintas quanto ao tamanho dos cromossomos e seu padrão de bandeamento, com uma grande variação na ocorrência e distribuição de sequências de DNA repetitivo (bandas CMA/DAPI). O conteúdo de DNA também permite a clara diferenciação dessas espécies, tendo G. coerulea 2C = 11,30 pg e G. uruguaiensis 2C = 16,88 pg. Gelasine elongata possui número cromossômico básico diferente das anteriores (2n = 2x = 12) e cariótipo claramente bimodal. Os cromossomos têm menor tamanho, o que, consequentemente reflete no menor tamanho de genoma (2C = 3,45 pg). Além disso, o padrão de bandas CMA/DAPI é notadamente mais simples que das outras duas espécies, onde o maior par de cromossomos (par I) exibe as únicas bandas CMA+ presentes na região da constrição secundária. Os dados obtidos para G. elongata apontam para uma maior semelhança dessa espécie com outras duas do gênero Eleuthenine (2n = 2x = 12), o que reforça os dados filogenéticos existentes, onde G. elongata está separada de G. coerulea e agrupada no mesmo ramo de Eleutherine. Não foi observado heteromorfismo cromossômico para Gelasine elongata e nem para as outras duas espécies investigadas, embora tal situação tenha sido reportada para aquela espécie. Os dados obtidos para Gelasine com o uso dos fluorocromos CMA e DAPI, bem como os demais parâmetros citogenéticos investigados permitiram a clara diferenciação entre as espécies. Associados a uma abordagem filogenética, tais resultados auxiliam a compreensão das relações entre essas espécies e sua evolução. / Gelasine Herb. (Tigridieae: Iridaceae) comprises seven native species from South America, three of them are found in Rio Grande do Sul (Brasil): G. coerulea (Vell.) Ravenna, G. elongata (Graham) Ravenna and G. uruguaiensis Ravenna. These species are bulbous plants with plicate leaves and blue or violet perfect flowers which are composed of two unequal groups of tepals. Gelasine elongata and G. coerulea are included in the list of endangered species from RS, the first one is considered endangered and the latter, critically endangered. Notwithstanding its current vulnerability status, Gelasine is still a poorly studied genus and genetic variability and diversity information concerning its species are lacking. Cytogenetic data are also scarce. Thus the present dissertation aims to characterize the three Gelasine species occurring in Southern Brazil regarding its molecular and cytogenetic aspects in addition to understand their relationships. To characterize their genetic diversity, two populations of G. coerulea and two of G. elongata were used; it was not possible to investigate G. uruguaiensis due to its restricted number of individuals. DNA samples were obtained from leaves of the aforementioned species and ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) technique was employed. Fourty-four ISSR primers were tested, 12 of these presented good amplification pattern which generated a total of 97 loci. The number of bands per primer had an average of 7.5. The present study resulted in novelty data for Gelasine concerning its inter and intrapopulation genetic variability. The results indicate a very low intrapopulation genetic variation and most of the diversity found in these species occurred among their populations. No significant correlation was verified between geographical distances of populations. Such results indicate that reproductive system, seed dispersal mechanisms and presence of clonal descendants generated from divisions of subterranean bulbs are factors that greatly influence in diversity. For cytogenetic characterization of the species, conventional staining and CMA/DAPI banding were employed and chromosome measurements were made. Also, genome size was estimated through flow cytometry using fresh leaves from the three species. Cytogenetic analyses were very efficient to differentiate all investigated species of Gelasine. Gelasine coerulea and G. uruguaiensis have the same basic and somatic chromosome number (2n = 2x = 14); polyploid cytotypes were not found. Both species display fairly symmetric karyotypes, however they are very distinct with respect to chromosome sizes and banding patterns, with a great variation in the occurrence and distribution of repetitive DNA sequences (CMA/DAPI bands). DNA content also allows clear differentiation of these species; G. coerulea has 2C = 11,30 pg and G. uruguaiensis has 2C = 16,88 pg. Gelasine elongata has a different base chromosome number than both former species (2n = 2x = 12) and a clearly bimodal karyotype. Its chromosomes are smaller which, consequently, reflects on the smaller genome size (2C = 3,45 pg). Furthermore, its CMA/DAPI band pattern is markedly simpler than the ones from the other two species, where the largest chromosome pair (pair I) contains the only CMA+ bands present in the secondary constriction region. Data obtained from G. elongata points out a larger resemblance between this species and two others belonging to Eleuthenine (2n = 2x = 12), which supports the phylogenetic data where G. elongata is separate from G. coerulea and groups with Eleutherine. Chromosome heteromorphism was not observed in Gelasine elongata nor in the two other investigated species, even though it had been reported for the first one. Data obtained from Gelasine with the use of CMA and DAPI fluorochromes, along with the other cytogenetic parameters investigated, allowed clear differentiation between species. Allied to a phylogenetic approach, these results can bring better understanding to the relations between these species and their evolution.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6476_1.pdf: 1582610 bytes, checksum: aa00383840fb284a301d9fddf9b8ce27 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Croton L. é considerado um dos maiores e mais diversificados gêneros dentre as angiospermas com cerca de 1300 espécies. Apesar de sua representação na composição da flora nordestina, não há nenhum estudo que vise investigar a diversidade genética no grupo. O presente estudo objetivou analisar características genéticas distintivas entre espécies do gênero com ênfase naquelas do nordeste brasileiro, incluindo marcadores moleculares e citogenéticos. As informações citogenéticas geradas sobre dez populações de seis espécies de Croton são inéditas. Estas pertencem a cinco seções (Argyroglossum, Astraea, Barhamia, Podostachys e Velamea. Todas as espécies apresentaram 2n=20, com exceção de C. lobatus com 2n=18, C. adenocalyx, com 2n=40. Foram observados cariótipos simétricos com cromossomos meta-submetacêntricos de tamanho similar. Constrições secundárias estão presentes em todas as espécies, com exceção de C. lundianus. A coloração com nitrato de prata em C. adenocalyx, C. heliotropiifolius e C. blanchetianus apresentou células com número máximo de quatro nucléolos ativos para a primeira espécie, enquanto nas demais o maior número chegou a dois. O bandeamento com DAPI/CMA3 revelou baixo conteúdo de heterocromatina na maioria das espécies estudadas, com apenas um par CMA3 +/DAPI-. Exceções foram Croton adenocalyx (dois pares CMA3 +/DAPI-) e C. lobatus, com marcações CMA3 +/DAPI0 nas regiões pericentroméricas de todos os cromossomos do complemento. A hibridização in situ fluorescente evidenciou quatro sítios de 45S em C. adenocalyx e dois em C. lundianus. Apesar de pertencerem a seções distintas, cinco das seis espécies aqui estudadas mostraram relativa conservação cariomorfológica, com exceção de C. lobatus. No presente trabalho também foi averiguado a eficiência dos marcadores DAF (DNA Amplification Fingerprinting) e ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) no acesso à variabilidade genética dos gêneros Croton e Chamaesyce, efetuando-se uma seleção de primers para aplicação em estudos filogenéticos e populacionais. Para tal, foram utilizados quatro indivíduos de três espécies de Croton L. (C. heliotropiifolius, C. blanchetianus e C. pedicellatus) e quatro de duas espécies de Chamaesyce (C. hirta e C. thymifolia). Considerando os 29 primers DAF aplicados para Croton, foram gerados 374 loci, onde 359 foram polimórficos. Já para Chamaesyce, dos 42 primers testados, 581 loci foram amplificados, sendo 494 polimórficos. A partir dos 17 primers ISSR testados para Croton, foram originados 327 loci, onde 317 apresentaram-se polimórficos. No que diz respeito ao gênero Chamaesyce, dos 15 oligonucleotídeos, 193 loci foram gerados, com 140 polimórficos. O elevado número de polimorfismos acessados evidenciou a eficiência das metodologias em inferir índices de variabilidade genética. Em todos os fenogramas gerados, os valores de bootstrap foram consistentes (acima de 80). Dados preliminares da aplicação de cinco primers de DAF e seis de ISSR em 40 acessos de 27 espécies de Croton, comparadas a representantes de Jatropha (3 spp.), usados como grupo-irmão, também são aqui disponibilizados. Foram gerados ao todo 394 marcadores polimórficos (208 para DAF e 186 para ISSR) usados para gerar uma árvore filogenética baseada em inferência Bayesiana onde muitas entidades taxonômicas apresentaram-se em posições politômicas, indicando a necessidade de agregação de dados adicionais para melhor embasamento da análise