A dengue foi objeto de estudo desta dissertação, devido ao elevado número de casos que ocorrem anualmente no Brasil, o que demonstra a importância de se conhecer mais as razões de sua incidência. A urbanização, industrialização e crescimento populacional acelerados do país, além das condições climáticas e nível de qualidade de vida, alteram as condições de saúde ambiental, o que favoreceu o aumento das ocorrências. A recéminstitucionalizada Região Metropolitana do Vale do Paraíba e Litoral Norte, que apresenta alta taxa de urbanização e níveis de desenvolvimento elevados, apresentou uma grande diversidade de ocorrências e incidência entre seus trinta e nove municípios. Este estudo analisou a distribuição dos casos dengue, considerando os níveis de atendimento do abastecimento de água, rede de esgoto e coleta de lixo na Região Metropolitana do Vale do Paraíba e Litoral Norte e o nível de inserção econômica das cidades, que revelou ser esta a provável causa do elevado número de casos em doze das trinta e nove cidades. A pesquisa desenvolveu-se a partir das notificações de dengue contidas no SINAN (Sistema de Informação de Agravos e Notificação), considerando notificações por ano do 1º sintoma e segundo o munícipio de residência. As informações a respeito da Região Metropolitana do Vale do Paraíba e Litoral Norte foram obtidas através das informações disponibilizadas e foram pesquisadas nos documentos desenvolvidos pela EMPLASA. Os dados socioambientais foram acessados no site da SEADE, com base nos censos de 2000 e 2010. Para calcular as taxas de incidências, foi utilizado o número estimado da população disponível no DATASUS, que tem como fonte os censos e projeções populacionais desenvolvidas pelo IBGE. Os resultados indicaram como provável causa da distribuição irregular da doença e seu elevado número de ocorrências em algumas cidades, o nível de inserção que ela apresenta no cenário regional, estadual e nacional. O estudo mostra a dificuldade de se estabelecer condicionantes quanto à dengue, indicando que há a necessidade de ampliar os dados a serem analisados, além de mudar a escala de regional para o local, visando desenvolver subsídios que possibilitem o planejamento de forma regionalizada . / The dengue fever was the subject of this study due to the numerous cases of the disease that occurs annually in Brazil, a fact that shows the urge to know more about the disease spreading reasons. The countrys fast urbanization, industrialization and population growth, besides the climatic conditions and welfare levels, changes the environmental and health conditions and has favored the increase of occurrences. The newly created Vale do Paraíba e Litoral Norte metropolitan area, a high urbanized and high developed region, showed a great diversity of occurrences and incidence between its thirty-nine municipalities. This study had analyzed the dengues cases distribution considering the elevated number of the disease subjects in twelve of the thirty-nine municipalities. This paper analyzed the distribution of the dengue fever considering the water supply, sewage treatment and waste collection levels in the metropolitan area and the level of economic relevance of its cities and revealed that the latter is the probable cause of the high number of the diseases incidence in the aforementioned cities. This research has been developed from notifications of the dengue disease based on SINAN (Sistema de Informação de Agravos e Notificação), considering the first symptom notifications per year and according the home city of the patient. The information related to the Vale do Paraíba e Litoral Norte metropolitan area were obtained from the documents developed and provided by EMPLASA. The socio-environmental data were accessed in the SEADEs website and based on the 2000 and 2010 census. In order to calculate the incidence taxes, the estimated population number provided by DATASUS had been used. This number is based on sources and population growth projections developed by IBGE. The results indicate that the probable cause of the diseases irregular distribution and its elevated number of occurrences in some cities was the level of the citys relevance and influence on its region or state. The study shows the difficulties of constraining dengue fever spreading, and indicates the need of widen the data to be analyzed and, furthermore, changing the data from regional to local scale, in order to develop subventions that will allow a region-organized planning.

Incidence of dengue fever (DF) has been estimated a 30 fold increase in the past 50 years. Clinical manifestations of DF range from a simple febrile illness with physical soreness to life-threatening dengue hemorrhagic fever (DHF). The need for a better classification of the severity in DEN infections has been proposed to clarify the immunopathogenesis for the prevention and management of serious DEN infections. We attempted to investigate whether different mechanisms involved in the varied manifestations of bleeding tendency and vascular leakage in DF. In a hospital-based study, we first compared clinical features as well as laboratory data including virus load, T helper (Th1/Th2) cytokines, and vascular leakage-related mediators between patients with DHF and DF. Moreover, we defined another class of patients associated with bleeding tendency but not fulfilled with DHF criteria, called DF w/B, for a further comparison. The virus load in blood was not significantly different among DF, DHF and DF w/B. DF patients had a higher Th1 cytokine, IFNr, expression (70.0 ¡Ó 10.7 vs. 33.1 ¡Ó 8.0 vs. 33.0 ¡Ó 7.1 pg/ml; DF vs. DF w/B, p = 0.009; DF vs. DHF, p = 0.002), and both DHF and DF w/B patients had a significantly higher IL-10 levels (14.3 ¡Ó 4.1 vs. 26.2 ¡Ó 3.3 vs. 26.0 ¡Ó 3.5 pg/ml; DF vs. DF w/B, p = 0.023; DF vs. DHF, p = 0.016) than DF patients. Both DHF and DF w/B patients also had a higher rate of secondary dengue infection (DF w/B vs. DHF vs. DF: 50.0%, 74.4% and 14.3%¡A p < 0.001). By contrast, DHF but not DF w/B patients had significantly higher vascular leakage-related mediators: sVCAM-1, PGE2 and TNF£\ levels than DF patients. Patients with DF w/B had a higher platelet counts (DF w/B vs. DHF: 66.0 ¡Ó 8.3 vs. 20.7 ¡Ó 2.1 x109/L, p < 0.001) but lower ALT levels than those with DHF (DF w/B vs. DHF: 56.3 ¡Ó 7.7 and 144.7 ¡Ó 20.5 IU/L). This study provides new insight to different immune mechanisms involved in patients with DF, DF w/B, and DHF. DF involves augmented Th1 reaction, and DF w/B involves altered Th2 reaction, but DHF involves both altered Th2 reaction and augmented vascular insult. Clarification of the immune mechanisms among DF, DFw/B and DHF will facilitate certain specific treatment and prevention of DF patients from varied bleeding tendency and vascular leakage manifestations.

Thesis (Ph.D.) - University of Queensland, 2003. / Includes bibliography.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-03-26T18:51:42Z No. of bitstreams: 1 nieli_rc_faria_ioc_mt_0004_2010.pdf: 2864802 bytes, checksum: c145add19e57c3ab4fb2c9dd01632d8e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-26T18:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 nieli_rc_faria_ioc_mt_0004_2010.pdf: 2864802 bytes, checksum: c145add19e57c3ab4fb2c9dd01632d8e (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz / A epidemiologia do dengue mudou dramaticamente nos últimos 50 anos, especialmente nas regiões tropicais do mundo. No Brasil, o dengue tem sido um problema de saúde pública desde a sua introdução nos anos 80. Estudos filogenéticos constituem uma ferramenta importante para monitor a introdução e a dispersão dos vírus, assim como predizer as potenciais conseqüências epidemiológicas destes eventos. Com o objetivo de realizar a caracterização molecular e análise filogenética de cepas de DENV-2 isoladas no país durante vinte anos de circulação viral, cepas isoladas de pacientes infectados e apresentando diferentes manifestações clínicas (n=34), representantes de seis estados do país (RJ, ES, BA, RN, CE e RS), do período compreendido entre 1990 e 2010 foram seqüenciadas. Em 25 cepas foi realizado o sequenciamento dos genes C/prM/M/E e em 9 foi realizado o sequenciamento completo do genoma (região codificante). A análise da similaridade entre os DENV-2 com cepas de referência identificou a formação de dois grupos epidemiologicamente distintos: um formado por cepas isoladas entre os anos de 1990 a 2003 e outro por cepas entre 2007 e 2010. Todas as cepas analisadas neste estudo possuem uma asparagina (N) em E390, previamente caracterizada como um provável determinante genético desencadeador de FHD detectado em cepas de origem asiática. Não foram observadas diferenças consistentes entre as seqüências dos genes codificantes das cepas dos diferentes casos clínicos de dengue, sugerindo que a gravidade da doença seja multifatorial e que, não se deve apenas as diferenças observadas no genoma viral. Os resultados obtidos referentes à caracterização do genoma completo dos DENV-2 de diferentes casos clínicos não apontaram diferenças consistentes que pudessem estar associadas a um quadro mais grave da doença. Sugere- se, porém, que a ocorrência de infecção secundária tenha sido um fator de risco ao desenvolvimento dos casos graves e fatais. A análise filogenética baseada no sequenciamento parcial ou completo do genoma caracterizou DENV-2 como pertencentes ao genótipo do Sudeste Asiático, porém com uma segregação em duas linhagens distintas sustentada por um “bootstrap” de 100%. A análise filogenética independente de cada gene sugeriu com um suporte de “bootstrap” de 100% que todos os genes estruturais (C, prM/M e E) e não–estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) podem ser utilizados para a genotipagem dos DENV-2. Contudo, a árvore filogenética baseada na análise de prM/M foi incapaz de discriminar corretamente a segregação do genótipo do Sudeste Asiático nas duas linhagens distintas. Ficou caracterizado que as cepas do período pré-emergência (1990-2003) pertencem ao genótipo do Sudeste Asiático, Linhagem I e as cepas isoladas após a re-emergência deste sorotipo em 2007, pertencem ao genótipo Sudeste Asiático, Linhagem II. O percentual de similaridade destas cepas com a cepa isolada na República Dominicana em 2001 combinado ao percentual de divergência com as cepas introduzidas no país na década de 90 sugere que estes vírus não sofreram uma evolução local, e sim uma introdução no país de uma linhagem viral distinta provavelmente importada do Caribe. / Dengue epidemiology has changed dramatically in the last 50 years, especially in the tropical regions of the world. In Brazil, dengue has been a major public health problem since its introduction in the 80`s. Phylogenetic studies constitute an valuable tool to monitor the introduction and spread of viruses as well as to predict the potential epidemiological consequences of such events. Aiming to perform the molecular characterization and phylogenetic analysis of DENV-2 during twenty years of viral activity in the country, viral strains isolated from patients presenting different disease manifestations (n=34), representing six states of the country (RJ, ES, BA, RN, CE e RS), from 1990 to 2010 were sequenced. Partial genome sequencing (genes C/prM/M/E) was performed in 25 DENV-2 strains and full-length genome sequencing (coding region) was performed in 9 strains. The percentage of similarity among the DENV-2 strains in this study and reference strains available in Genbank identified two groups epidemiologically distinct: one represented by strains isolated from 1990 to 2003 and one from strains isolated from 2007 to 2010. All DENV-2 strains analyzed in this study presented an aspargin (N) in E390, previously identified as a probable genetic marker of virulence observed in DHF strains from Asian origin. No consistent differences were observed on coding region from the different clinical manifestations analyzed, suggesting that if the disease severity has multifactorial, it is not only due to the differences observed on genome region viral. The results obtained by the DENV-2 full-length genome sequencing did not point out consistent differences related to a more severe disease either. However, it is suggested that secondary infections may be implicated as a risk factor for a more severe disease and fatal outcome. Phylogenetic analysis based on the partial or complete genome sequencing has characterized the brazilian DENV-2 from this study as belonging to the Southeast Asian genotype, however a distinction of two clades within this genotype has been identified and supported by a bootstrap of 100%. The phylogeny based on the analysis of individual genes suggested with a bootstrap of 100% that all structural (C, prM/M and E) and non- structural genes (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5) may be used for DENV-2 genotyping. However, the phylogenetic tree generated from the analysis of the prM/M gene was unable to correctly discriminate the two clades observed for the Southeast Asian genotype. It was established that strains circulating prior DENV-2 emergence (1990-2003) belong to Southeast Asian genotype, clade I and strains isoladed after DENV-2 emergence in 2007 belong to Southeast Asiant genotype, clade II. The percentage of identity of the latter with the Dominican Republic strain isolated in 2001 combined to the percentage of divergence with the strains first introduced in the country in the 90 ́s suggests that those viruses did not evolved locally but were due to a new viral clade introduction in the country from the Caribbean.

Made available in DSpace on 2012-09-05T18:24:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 388.pdf: 2459584 bytes, checksum: cf27467ca39f90bca04a338cb4889a15 (MD5) Previous issue date: 2008 / Com o passar dos anos, a organização social de cidades como o Rio de Janeiro se alterou devido ao empobrecimento e a uma fraca política de habitação enfrentados por um grande setor da população ocasionando o incessante surgimento e crescimento de favelas. Emdecorrência da falta de implementação de políticas sociais suficientes nas últimas décadas, o crescimento das populações pobres vem se dando não só nas áreas periféricas, mas tambémnos grandes centros urbanos, agravando ainda mais o programa de controle do dengue. A despeito dos esforços empreendidos para controlar essa endemia e buscar a participação efetiva da população na tarefa preventiva, as estratégias utilizadas nas ações deComunicação, Educação em Saúde e Mobilização Social são repetitivas, sazonais e padronizadas, desconsiderando aspectos sociais, culturais e históricos na elaboração deintervenções mais próximas à população.A teoria das representações sociais foi utilizada neste estudo com o intuito deaproximação do senso comum, das vulnerabilidades existentes, e também das formas de enfrentamento desenvolvidas por uma população de favela moradora do Parque OswaldoCruz, localizada no Complexo de Favelas de Manguinhos - Município do Rio de Janeiro, marcada por grandes desigualdades sociais, traduzidas pelas altas taxas de analfabetismo eelevado índice de pobreza, além de uma alta taxa de incidência de dengue ao longo das três grandes epidemias no Estado do Rio de Janeiro. Resultante deste trabalho, pode-se observar que o dengue não é considerado umproblema de saúde de alta prioridade para essa comunidade, tendo as doenças crônicodegenerativas um grau de importância maior por essas afetarem mais efetivamente a capacidade para o trabalho e representar um maior risco à vida. Entretanto, nota-se que,devido às epidemias passadas, e em particular a última ocorrida no ano de 2002, o dengue é uma grande preocupação entre os moradores da área visitada. / As representações da doença refletem a apreensão das informações sobre prevenção, mas não a compreensão da razão pela qual se deva praticá-las; percebe-se, inclusive, uma resistência quanto a leitura de folhetos, preferindo-se as informações veiculadas pela televisão. Uma representação importante em relação ao dengue observada neste estudo é o estigma da sujeira vinculado a pobreza, refletida em hábitos de higienização para a prevenção. As representações sociais apreendidas nesse grupo fizeram transparecer algumas vulnerabilidades vividas e refletidas nas ações de controle do dengue. Por exemplo, percebese que vulnerabilidade individual aumenta quando os comportamentos preventivos sãoorientados por uma lógica ineficaz ao controle do dengue, como a relacionada a higienização do ambiente (ter higiene, cuidar da casa, usar desinfetante, ferver água). As vulnerabilidades sociais mais evidentes são o semi- analfabetismo predominante e a pobreza. Além de evidentes, as vulnerabilidades enfrentadas pela população do Parque Oswaldo Cruz se fazem presentes nas representações do dengue, mostrando como a realidade interfere no imaginário social e vice-versa, contextualizando os riscos que o grupo de moradores corre em relação à infecção. Com base nos dados obtidos nesta pesquisa, sugere-se que as estratégias de intervenção para o combate ao dengue sejam redirecionadas e passem a ter em primeiro plano o objetivo de:- aumentar o grau de consciência dos indivíduos em relação aos possíveis danos decorrentes de uma não ação ou de uma ação orientada por uma lógica ineficaz e, com isso,- estimular o poder de transformação efetiva de comportamentos a partir dessa consciência.

Made available in DSpace on 2012-09-06T01:12:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 986.pdf: 1993932 bytes, checksum: a81e2de428f2ff79754c2d3a62cc952c (MD5) Previous issue date: 2008 / Algumas características particulares dos centros urbanos, como precariedade nadistribuição e freqüência dos serviços de abastecimento de água e coleta de lixo, podem levar determinados grupos sociais a adotarem hábitos de vida de modo a propiciar locais favoráveis a proliferação do vetor e conseqüente disseminação da dengue. Embora ocupeo primeiro lugar no ranking estadual de IDH, a cidade de Niterói vem sofrendo períodos epidêmicos/inter-epidêmicos de transmissão de dengue, com destaque para a Região Oceânica e, em especial, o bairro de Itaipu. Objetivo: Analisar os determinantessocioambientais de produção e reprodução da dengue na Região Oceânica de Niterói, enfocando as condições particulares de transmissão em sub-localidades específicas, emperíodo recente. Metodologia: Foram escolhidas quatro sub-localidades com semelhanças na incidência de dengue e padrões urbanísticos/sócio-econômicos diferentes. A escolha baseou-se na construção de um indicador composto de condições de vida por setor censitário, assim como pela construção de um mapa de Kernel com as respectivasincidências. As características sócio-espaciais de cada sub-localidade foram obtidas por meio de entrevistas com informantes-chave e observação sistemática. Foram pesquisadasainda informações sobre o processo histórico de ocupação e estruturação interna de Itaipu. Resultado: As condições de produção da doença ocorrem de forma diferenciadanas sub-localidades estudadas. O número significativo de terrenos baldios com lixo domiciliar, casas de veraneio com piscinas não tratadas e precariedade no abastecimentode água, foram características marcantes das áreas estudadas. Independente do padrão de habitação, todos os moradores realizam práticas de estocagem de água / Conclusão: A precariedade no abastecimento de água e a heterogeneidade sócio-espacial nas sublocalidades apontam para dois fatores distintos condicionantes para o risco de transmissão da doença. O primeiro referente à oferta limitada do serviço de abastecimento de água e escassez de recursos financeiros. O segundo relaciona-se a abundância de recursos que permite estocagem de água em reservatórios permanentes demaior capacidade de acúmulo. Os resultados sugerem que a vigilância da dengue deve incorporar indicadores quantitativos/qualitativos que reflitam as reais condições de reprodução da doença em nível local, em especial aqueles relacionados ao abastecimentode água.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 simone_costa_ioc_dout_2008.pdf: 34704570 bytes, checksum: e34eaf901d373dd2f63e3ffbecbb7e50 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue (DENV) consiste de quatro sorotipos antigenicamente relacionados: DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Apesar dos diversos esforços para o desenvolvimento de uma vacina contra dengue, ainda não há nenhuma comercialmente disponível. As proteínas não estruturais 1 e 3 (NS1 e NS3) são indicadas como antígenos promissores para o desenvolvimento de uma vacina contra DENV. Segundo alguns estudos, a proteína NS1 é capaz de induzir uma resposta protetora de anticorpos com atividade de fixação do complemento. A proteína NS3, que realiza reações enzimáticas essenciais para a replicação viral, parece ser imunogênica, contendo um predomínio de epítopos para linfócitos T CD4+ e CD8+. No presente trabalho nós avaliamos o potencial de vacinas de DNA baseadas nas proteínas NS1 e NS3 de DENV-2. Foram construídos cinco plasmídeos, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N e pcTPANS3C, contendo a seqüência que codifica o peptídeo sinal do ativador de plasminogênio de tecido humano (t-PA) fusionado ao gene NS3 inteiro ou partes destes. Todos estes plasmídeos mediaram a expressão das proteínas recombinantes in vitro em células eucarióticas Camundongos foram inoculados com estes plasmídeos e desafiados com DENV-2 por via intracerebral (i.c.). Nenhuma destas construções induziu níveis satisfatórios de proteção. Além dos plasmídeos com NS3, foram construídas quatro vacinas de DNA baseadas no gene NS1: 1 - pcENS1, que codifica a região C-terminal da proteína E fusionada à NS1, 2 - pcENS1ANC, similar ao pcENS1 com a adição da porção N-terminal da NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, que codifica o peptídeo sinal t-PA fusionado à NS1 e 4 - pcTPANS1ANC, semelhante ao pcTPANS1 com a adição da seqüência ANC. A proteína NS1 recombinante foi detectada nos extratos celulares e sobrenadante das culturas de células BHK transfectadas com pcTPANS1, pcENS1 e pcENS1ANC. Tais resultados indicam que as seqüências sinais t-PA e E direcionaram a NS1 para secreção. A proteína NS1 também foi observada associada à membrana plasmática de células transfectadas com pcENS1ANC, demonstrando a importância da seqüência ANC para o seu ancoramento. Todos os camundongos imunizados com pcTPANS1 ou pcENS1 produziram altos níveis de anticorpos, direcionados principalmente para epítopos conformacionais da NS1, enquanto que somente metade dos animais inoculados com pcENS1ANC apresentaram níveis detectáveis de anticorpos A resposta de anticorpos se mostrou duradoura (até 56 semanas após a primeira dose das vacinas), e os animais apresentaram uma rápida resposta secundária após um reforço de DNA. Camundongos imunizados com os plasmídeos pcTPANS1 e pcENS1 se mostraram protegidos contra desafios com DENV-2 por via i.c., sendo o pcTPANS1 levemente mais protetor. Estes dois plasmídeos ativaram a produção de diferentes subclasses de IgG específicas contra NS1. Não foi observada proteção interespecífica quando camundongos imunizados com pcTPANS1 foram desafiados por via i.c. com DENV-1. Os animais imunizados com o pcTPANS1 foram desafiados com DENV-2 por via intraperitoneal e também se mostraram protegidos. Neste modelo de desafio, foi observada uma diminuição dos efeitos histopatológicos do vírus no fígado dos animais vacinados. Resultados preliminares sugerem à lise de células infectadas com DENV-2, dependente do complemento, na presença dos anticorpos direcionados contra NS1 / Dengue virus (DENV) consists of four antigenically related serotypes: DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4. Although considerable research has been conducted towards the development of a DENV vaccine, no vaccine is yet commercially available. The non-structural proteins 1 and 3 (NS1 and NS3) have been identified as promising antigens for the development of vaccines against DENV. According to some reports, NS1 can elicit a protective antibody response with complement-fixing activities. NS3, a protein that carries out enzymatic reactions essential for viral replication, appears to be immunogenic, presenting a preponderance of the CD4+ and CD8+ T cell epitopes. In the present work we investigate the potential of DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 and NS3 proteins. We constructed five recombinant plasmids, pcTPANS3, pcTPANS3H, pcTPANS3P, pcTPANS3N and pcTPANS3C, which contain the sequence that codes the signal peptide derived from the human tissue plasminogen activator (t-PA) fused to the full or partial length of the DENV-2 NS3 gene. Results indicated that these plasmids promoted the expression of recombinant proteins in eukaryotic cells. Mice were inoculated with these plasmids and challenged by the intracerebral (i.c.) route with DENV-2. None of these constructs induced acceptable protection. Moreover, we constructed four DNA vaccines based on the DENV-2 NS1 gene: 1 - pcENS1, coding the C-terminal of the E protein fused to NS1, 2 - pcENS1ANC, similar to pcENS1 with the addition of the N-terminal of NS2A (ANC), 3 - pcTPANS1, coding the t-PA signal sequence fused to NS1 and 4 - pcTPANS1ANC, similar to pcTPANS1 with the addition of the ANC sequence. The recombinant NS1 protein was detected in cell extracts and culture supernatants from pcTPANS1-, pcENS1- and pcENS1ANC-transfected BHK cells. Such results indicated that the E and t-PA sequences targeted NS1 to secretion. NS1 was also observed in association with plasma membrane of pcENS1ANC-transfected cells, which demonstrated the importance of the ANC sequence for cell anchoring. High levels of antibodies, mainly recognizing surface-exposed conformational epitopes of NS1, were induced in all mice immunized with pcTPANS1 and pcENS1, while only half of pcENS1ANC-inoculated animals presented detectable antibody levels. Long-term antibody response was observed in pcTPANS1 and pcENS1 immunized animals (56 weeks after the first vaccine inoculation) and there was a rapid secondary response after a DNA booster. Protection was elicited in pcTPANS1- and pcENS1-immunized mice challenged with DENV- 2 by the i.c. route and the pcTPANS1 seemed to generate a slightly higher protection. Moreover, these two plasmids induced different NS1-specific IgG subclasses. No protection was displayed when pcTPANS1-immunized animals were i.c. challenged with DENV-1. Animals inoculated with pcTPANS1 were also protected when they were challenged with DENV-2 by the intraperitoneal route. Liver tissue from vaccinated animals presented a remarkable decrease of hepatic damages in this challenge mouse model. Preliminary results suggested the complement-mediated lyses of DENV-2 infected cells in the presence of the NS1-specific antibody.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_castro_ioc_dout_2012.pdf: 21978043 bytes, checksum: e9eba4cae64a400b5fd4d642dfb66bf2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-05-21 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O dengue tem se apresentado como um grave problema de saúde pública no Brasil, razão pela qual, vários estudos têm sido realizados com o intuito de esclarecer aspectos da epidemiologia dessa doença em diferentes localidades, com histórias distintas de circulação dos diferentes sorotipos dos vírus dengue (DENV). A implantação de um Programa de vigilância entomológica e virológica e, que desde 1986 visa detectar e monitorar a circulação dos sorotipos e genótipos DENV, resultou em distintas oportunidades, no isolamento de amostras de DENV de vetores e de casos humanos permitindo a caracterização molecular e a análise filogenética, fornecendo informações relevantes para a compreensão da interação vetor- vírus- humanos. O entendimento da variação genética no vírus quando este replica em mosquitos, e como essas variações atuam durante a transmissão entre humanos e mosquitos permanecem desconhecidos. Portanto, visando contribuir para um melhor conhecimento dos DENV e sua interação com o mosquito vetor, realizamos neste trabalho, a caracterização molecular e análise filogenética de DENV isolados de mosquitos naturalmente infectados e de casos humanos, provenientes de epidemias ocorridas entre 1986 e 2011 no Brasil. Foi demonstrado que os métodos moleculares foram fundamentais por facilitarem a rápida identificação dos vírus e consequentemente o monitoramento dos genótipos circulantes A RT-PCR para a triagem de DENV em vetores se mostrou uma ferramenta útil para a vigilância virológica, com taxas de detecção que variaram de 0,78% a 25% no período estudado. A análise filogenética dos DENV-1 isolados de mosquitos e humanos mostrou que o genótipo V (Américas/África) continua o mesmo circulante desde a sua introdução, porém foi demonstrada a co-circulação de duas novas linhagens (II e III) no período de 2009 a 2011. O sequenciamento do genoma completo de DENV-3 isolado a partir de Ae. aegypti naturalmente infectados no Rio de Janeiro (RJ), assim como a análise da região 3´NC de vírus isolados em mosquitos e humanos, caracterizou estes vírus como pertencentes ao GIII e revelou a presença de inserções e deleções na região 3´NC do genoma. As deleções observadas na região 3´NC resultaram em estruturas secundárias porém nem todas as cepas com inserções nesta região apresentaram estrutura similar substituições exclusivas à cepa de DENV-3 isolada em mosquito foram observadas no gene NS5, incluindo a substituição que resultou na formação de um códon de terminação. O teste comercial Simplexa\2122 Dengue Real Time RT-PCR, disponível recentemente, foi utilizado pela primeira vez para detecção dos DENV e se mostrou um método molecular alternativo para as vigilâncias entomológica e virológica. O RT-PCR em Tempo Real possibilitou, pela primeira vez, a quantificação de DENV-1 e DENV-4 em fêmeas individuais naturalmente infectadas (1,6 x 104 cópias/mL e 1,08 x 103 cópias/mL, respectivamente) Considerando-se o elevado índice de infestação por Ae. aegypti em todo o país, o estudo da caracterização dos DENV circulantes torna-se de grande importância no conhecimento da relação vírus-vetor pela análise da variabilidade genética, dispersão e persistência de genótipos durante a transmissão destes vírus / Dengue has been a major public health problem in Brazil with several studies performed aiming to elucidate the disease epidemiology in geographically distinct areas with different dengue viruses (DENV) circulation. The establishment of an entomological and virological program since 1986 with the objective of detecting and monitoring DENV serotypes and genotypes resulted in distinct opportunities in DENV isolation from vectors and human cases, allowing the molecular characterization and phylogenetic analysis, providing relevant information for the understanding of the vector-virus-humans interactions. The understanding of the virus genetic variability when it replicates on mosquitoes and how those variations act during the transmission between humans and mosquitoes is not fully understood. Therefore, aiming to contribute for a better understanding of DENV and its interactions with the mosquito vector, we performed in this study the molecular characterization and phylogenetic analysis of viruses isolated from naturally infected mosquitoes and human cases, from epidemics occurred between 1986 and 2011 in Brazil. It has been shown that the molecular techniques were essential for allowing the rapid identification of the viruses and consequently the monitoring of the circulating genotypes. The RT-PCR for DENV screening in vectors has shown to be a useful tool for the virological surveillance, with detection rates varying from 0.78% to 25% in the studied period. The phylogenetic analysis from DENV-1 isolated from mosquitoes and human cases showed that genptype V (America/Africa) is still the same genotype circulating since this serotype introduction, however it was demonstrated the co-circulation of two distinct new viral lineages (II and III) from 2009 to 2011. The complete genome sequencing of a DENV-3 isolated from naturally infected Ae. aegypti in Rio de Janeiro (RJ) and the analysis of the 3´UTR region from viruses isolated from mosquitoes and humans, has characterized those viruses as belonging to genotype III (GIII) and revealed the presence of insertions and deletions in the 3´UTR region of the genome. The deletions observed in the 3´UTR region resulted in similar secondary structures, however not all strains with insertions were similar in structure. Exclusive substitutions to the DENV-3 isolated from the mosquitoes were observed in NS5, including a substitution leading to a stop codon formation. The Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR commercial kit, recently available, was used for the first time for DENV detection and it has been shown to be an alternative molecular method for the entomological and virological surveillances, The Real Time RT-PCR has allowed, for the first time the DENV-1 and DENV-4 quantification in single Ae. aegypti naturally infected (1.6 x 104 copies/mL e 1.08 x 103 copies/mL, respectively). Considering the high Ae. aegypti infestation index in the country, the characterization of DENV circulating is very relevant for the understanding of the virus-vector relations by the analysis of the genetic variability, spread and persistence of genotypes during the transmission of those viruses.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 521.pdf: 1271118 bytes, checksum: 875497805ab7b1625a92ed477fad5b66 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Dengue é considerada a mais importante arbovirose, constituindo um grave problema de saúde pública no mundo. A doença é causada por um Flavivirus com quatro sorotipos (DENV-1, 2, 3 e 4) antigenicamente similares, mas imunologicamente distintos. A circulação simultânea desses sorotipos é apontada como um importante fator de risco para determinação dos casos graves da doença, pois aumenta a probabilidade de ocorrência de infecções secundárias e o surgimento de genótipos mais virulentos. Inquérito sorológico de base populacional conduzido na cidade do Recife, Pernambuco, entre 2005-2006, em 2.833 indivíduos com idades entre 05 e 64 anos, residentes em três áreas com condições sócio-econômicas distintas encontrou prevalência global superior a 80 por cento, indicando elevada transmissão da infecção no município. Esse estudo investigou a imunidade antidengue sorotipo específica em uma amostra aleatória de 324 participantes com sorologia positiva (IgG) de uma das áreas investigadas. Além disso, estimou-se a proporção de susceptíveis aos diferentes sorotipos na população, com base na extrapolação dos resultados da amostra. O teste de neutralização por redução do número de placas (PRNT) foi utilizado na sorotipagem. A freqüência de infecções monotípicas e multitípicas foram analisadas de acordo com grupo etário, sexo, dengue auto-referida e busca por atendimento. Observou-se elevada proporção de indivíduos imunes ao DENV-3 (35,6 por cento; IC: 86,7-96,6) e de infecções multitípicas (61,6 por cento), não tendo sido observado diferenças entre os grupos etários (p=0,395). Houve maior proporção de susceptíveis aos sorotipos DENV-1 (15 anos

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 antonio_goncalves_ioc_dout_2013.pdf: 2946820 bytes, checksum: 18a0b77b3b95468e0be2f5a0005d91c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue compreende quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV1-4) e até o momento não existe nenhuma vacina disponível comercialmente contra este patógeno. Alguns autores apontam a proteína NS1 de DENV como um antígeno protetor. Entretanto, ainda não se sabe ao certo o seu papel na replicação viral, bem como na indução de proteção ou patogênese. Nosso grupo vem trabalhando com as vacinas de DNA contra a dengue, testando-os em modelos murinos. Camundongos imunizados com uma vacina de DNA (pcTPANS1), que contém o gene NS1 de dengue 2 (DENV2), mostraram altos níveis de anticorpos anti-NS1 e quase 100 % de proteção quando desafiados com DENV2 (4 LD50). Este projeto tem por objetivo o mapeamento da resposta imune protetora gerada pela vacina pcTPANS1. Os resultados revelaram que 50 % dos animais que receberam o soro de outros camundongos, previamente imunizados com o plasmídeo pcTPANS1, sobreviveram à infecção após o desafio com DENV2 (4 LD50). Entretanto quando utilizamos um segundo estoque viral com 40 LD50, todos os animais apresentaram altas taxas de mortalidade e fortes sinais clínicos da infecção, com exceção do grupo de camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1. Posteriormente analisamos o papel da resposta imune celular na proteção. O ensaio de depleção in vivo mostrou que todos os animais vacinados e depletados de células CD4+ morreram após o desafio com DENV2, enquanto que 60 % dos animais depletados de CD8+ sobreviveram à infecção. Os ensaios de transferência adotiva de células T mostraram proteção somente no grupo de camundongos que receberam concomitantemente soro e linfócitos TCD4+ provenientes de animais imunizados com a vacina pcTPANS1 As células obtidas do baço de animais vacinados com o plasmídeo pcTPANS1 foram capazes de secretar IFN-\F067 após estímulo com o peptídeo 265AGPWHLGKL273, contido na proteína NS1 de DENV2 e descrito na literatura como específico para células TCD8+\F02E\F020Também avaliamos in vivo uma possível atividade citotóxica específica para este peptídeo. Nossos resultados mostraram que os camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1 promoveram a lise das células alvo pulsadas anteriormente com o peptídeo. Além disso, quando células alvos foram administradas 72 horas após o desafio com DENV2, houve um aumento significativo do percentual de lise. Em outro ensaio para avaliação de citotoxicidade in vivo, os animais foram imunizados com pcTPANS1 e submetidos ao tratamento para depleção de células CD4+ ou CD8+ Nossos resultados demonstraram que a atividade citotóxica específica para o peptídeo 265AGPWHLGKL273 é atribuída principalmente à população de células TCD8+, pois quando analisamos os resultados obtidos com animais imunizados e depletados de células TCD8- o percentual de lise foi reduzido para 37,9 %, corroborando os dados da literatura que descreve este peptídeo como específico para células TCD8+. Além disso, avaliamos a indução de possíveis danos gerados com a vacina pcTPANS1, tanto por análises histopatológicas do fígado quanto por dosagens dos níveis séricos de enzimas hepáticas, sem a detecção de qualquer alteração nos animais imunizados. De um modo geral, o conjunto de resultados obtidos nesse trabalho sugere que a proteção mediada pela vacina pcTPANS1 no nosso modelo experimental está relacionada principalmente com a resposta de células TCD4+ em associação com anticorpos anti-NS1, embora a vacina ative também uma resposta de células TCD8+ citotóxica / Dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV1 - 4) . Nowada ys, there is no commercially available vaccine against this pathogen. Some authors point out the NS1 protein fr om DENV as a protective antigen, h owever, its role in viral replication, as well as in the induction of protection or pathogenesis, remains still unclear. Our group has been working with DNA vaccines a gainst dengue testing them in murine models. Mice immunized with one DNA vaccine (pcTPANS1), which contains the NS1 gene from dengue 2 (DENV2), showed high levels of anti - NS1 antibodies and almost 100 % protection when challenged with DENV2 (4 LD 50 ). This project aims to map the protective immune response generated by the pcTPANS1. Results showed that 50 % of animals that received serum from other mice, previously immunized with the pcTPANS1, survived infection after challenge with DENV2 (4 LD 50 ). However when we used a second viral stock with 40 LD 50 , all animals showed high mortality rates and strong clinical signs of infection, except the mouse group immunized with the pcTPANS1 vaccine. Subsequently, we analyzed the role of the cellular immune response in protection. The in vivo depletion assay showed that all vaccinated and depleted from CD4 + cells died after challenge with DENV2, whereas 60 % of CD8 + depleted animals survived infection. The assays o f T cell adoptive transfer showed protection only in the mouse group receiving concomitantly serum and CD4 + T lymphocytes recovered from animals immunized with the pcTPANS1 vaccine . Splenocytes obtained from pcTPANS1 vaccinated animals were able to secrete IFN   after stimulation with the peptide 265 AGPWHLGKL 273 , present in NS1 protein from DENV2 and described as specific for CD8 + T cells  We also analyzed in vivo a possible cytotoxic activity specific for this peptide. Our results showed that mice immuniz ed with the pcTPANS1 vaccine promoted the lysis of target cells previously pulsed with the peptide. Besides, when target cells were given 72 hours after challenge with DENV2, there was a significant increase in the lysis percentage. In another assay for th e assessment of in vivo cytotoxicity, animals were immunized with pcTPANS1 and subjected to treatment for depletion of CD4 + or CD8 + cells. Our results showed that the cytotoxic activity specific for the peptide 265 AGPWHLGKL 273 is attributed mainly to the population of CD8 + T cells, because when we analyzed results obtained from animals immunized and depleted of CD8 Tcells, the lysis percentage was reduced to 37.9 %, corroborating data from literature which describes this peptide as specific for CD8 + T c ells. Moreover, we evaluated the induction of possible damages generated by the pcTPANS1 vaccine, either by histopathological analysis in the liver or by quantification of serum levels of hepatic enzymes, without detection of any alteration in immunized an imals. In general, results obtained in this work suggest that protection mediated by the pcTPANS1 vaccine in our experimental model is related mainly to the CD4 + T cells response in association with anti - NS1 antibodies, although the vaccine also activate s a CD8 + T cells cytotoxic response.