Résumé: Le muscle squelettique possède une excellente capacité à se regénérer notamment grâce à ses cellules progénitrices stromales (mrSC) et myogéniques (CPM). À la suite de certains traumas et pour des raisons encore méconnues, la qualité de sa régénération est compromise ce qui mène à l’apparition de structures aberrantes tel l’os mature, aussi appelée ossification hétérotopique (OH) post-traumatique. Notre laboratoire a montré dans un modèle murin que les mrSC sont pleinement impliquées dans cette pathologie. De plus, un facteur fortement ostéoinducteur, BMP9, ne cause l’OH que si, et seulement si, le muscle est endommagé. Ce modèle d’étude est unique puisqu’il présente les particularités physiopathologiques de l’OH post-traumatique, un dommage du muscle étant essentiel à la formation d’os. De plus, ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle prédominant du microenvironnement des cellules progénitrices dans le développement de cette pathologie. Nous avons donc émis l’HYPOTHÈSE selon laquelle le microenvironnement du muscle endommagé contient des facteurs qui peuvent influencer le phénotype de ses cellules progénitrices stromales et myogéniques favorisant ainsi le développement de l’OH. Nos résultats montrent que l’état hypoxique d’un muscle sévèrement endommagé augmente la prolifération et la différenciation ostéogénique des mrSC. De plus, l’hypoxie induit spécifiquement l’expression de BMP9 par les mrSC. L’impact de BMP9 a également été évalué sur la différenciation des CPM. Les résultats montrent qu’à des concentrations physiologiques, BMP9 inhibe le potentiel myogénique des CPM en faveur d’une différenciation ostéogénique, et cela tant dans la lignée myoblastique murine C2C12 que chez les CPM primaires humaines. En résumé, le muscle endommagé développant l’OH possède un microenvironement spécifique responsable du débalancement de la capacité régénérative de ses progéniteurs. Nos travaux montrent que ce microenvironnement cause un retard de la myogenèse et une ostéogenèse où participeront non seulement les mrSC mais également les CPM. L’identification et la compréhension des mécanismes régulant ces facteurs s’avèrent clé pour offrir aux cliniciens des outils de diagnostic mais également des alternatives ou des approches complémentaires aux traitements prophylaxiques actuels. / Abstract: Skeletal muscle has an extraordinary ability to regenerate due to its resident stromal cells (mrSCs) and myogenic progenitor cells (MPCs). Following certain traumas, the quality of the regeneration of skeletal muscle can be compromised for unknown reasons, leading to the appearance of aberrant structures such as mature bone, a process called posttraumatic heterotopic ossification (HO). Our laboratory developed a mouse model to show that mrSCs are fully involved in this pathology. We also showed that BMP9, a highly osteoinductive factor, causes HO if and only if the muscle is damaged. This model is unique in that it recapitulates the pathophysiological features of post-traumatic HO in which muscle damage is essential for bone formation. The model was also used to show that the progenitor cell microenvironment plays a predominant role in the development of this pathology. Based on these results, we HYPOTHESIZED that the microenvironment of the damaged muscle contains factors that can influence the phenotype of its progenitor cell populations, thus promoting the development of HO. Our results showed that the hypoxic state of a severely damaged muscle increases the proliferation and osteogenic differentiation of mrSCs and also specifically induces the expression of BMP9 by mrSCs. The impact of BMP9 on the differentiation of MPCs was also evaluated. At physiological concentrations, BMP9 inhibited the myogenic differentiation potential of murine myoblast C2C12 cells and primary human MPCs, and triggered their differentiation into an osteogenic lineage. In summary, we showed that damaged muscle that develops HO has a specific microenvironment that is responsible for the loss of the regenerative capacity of progenitor cells, leading to a delay in myogenesis, and that mrSCs and MPCs are both involved in osteogenesis. The identification and understanding of the mechanisms regulating these key factors could provide clinicians with valuable diagnostic tools as well as alternative and/or complementary approaches to current prophylactic treatments.

Le silicium poreux est un biomatériau prometteur pour l'ingénierie tissulaire car il est non toxique et biorésorbable. Des modifications de surface permettent de contrôler sa vitesse de dégradation et peuvent favoriser l'adhésion cellulaire. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) sont des cellules souches mésenchymateuses retrouvées dans la pulpe dentaire, à l'intérieur des dents, et constituent une source accessible de cellules souches. Regrouper les capacités de prolifération et différenciation des DPSC avec les propriétés morphologiques et biochimiques du pSi représente une approche intéressante pour des applications thérapeutiques de médecine régénératrice. Dans cette thèse, nous avons étudié le comportement de DPSC humaines sur des supports de pSi, avec des pores variant de quelques nanomètres à plusieurs centaines de nanomètres. Nous avons travaillé sur différentes fonctionnalisations chimiques afin d'optimiser l'adhésion cellulaire et de stabiliser le matériau : oxydation thermique, silanisation et hydrosilylation. L'adhésion, la prolifération et la différenciation osseuse ont été évaluées par microscopie à fluorescence, microscopie électronique à balayage, activité enzymatique, tests de prolifération (activité mitotique), immunofluorescence et spectroscopie FTIR. Le pSi avec des pores de 30 à 40 nm de diamètre s'est révélé être le plus approprié pour l'adhésion, la prolifération cellulaire et la différenciation ostéoblastique. De plus, la structure nanométrique et le relargage d'acide silicique par le pSi a démontré un effet positif sur l'induction osseuse et la formation d'une matrice minéralisée. Le pSi est donc apparu comme un matériau prometteur pour l'adhésion de cellules souches mésenchymateuses, que ce soit pour une transplantation immédiate in vivo ou pour expansion et différenciation in vitro. / Porous silicon (pSi) is a promising biomaterial for tissue engineering as it is both non-toxic and bioresorbable. Moreover, surface modification can offer control over the degradation rate of pSi and can also promote cell adhesion. Dental pulp stem cells (DPSC) are mesenchymal stem cells found within the teeth and constitute a readily source of stem cells. Coupling the good proliferation and differentiation capacities of DPSC with the textural and chemical properties of the pSi substrates provides an interesting approach for therapeutic use. In this thesis, the behavior of human DPSC is analyzed on pSi substrates presenting pore of various sizes, from few to hundreds nanometers. We investigated different chemical surface treatments, in order to enhance cell adhesion and stabilize the material: thermal oxidation, silanization and hydrosilylation. DPSC adhesion, proliferation and further osteodifferentiation were followed for up to 3 weeks by fluorescence microscopy, scanning electron microscopy (SEM), enzymatic activity assay, BrdU assay for mitotic activity, immunostaining and FTIR spectroscopy. Porous Silicon with pore size ranging from 30 to 40 nm was found to offer the best adhesion, the fastest growth rate for DPSC and the highest osteoinductive effect. Moreover, the pSi nanostructure and the release of silicic acid had a positive effect on precursor cells osteodifferentiation and mineralized matrix formation. Porous silicon appeared to be an appropriate biomaterial for mesenchymal stem cells adhesion and immediate in vivo transplantation, or for long term in vitro culture, for stem cells proliferation and differentiation.

La dysautonomie familiale (FD) est une neuropathie héréditaire provoquée par des mutations au sein du gène IKBKAP, la plus commune d'entre elles induisant un épissage alternatif de l'exon 20 au sein de du pré-ARNm de façon tissu-spécifique. L'épissage aberrant est particulièrement prononcé dans les tissus nerveux, conduisant à la dégénerescence progressive des neurones sensoriels et autonomes. La spécificité de la perte des cellules nerveuses dans la FD est mal comprise, par manque d'un modèle approprié. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'épissage des ARNm d'IKBKAP, nous avons utilisé un modèle original : les cellules souches olfactives ecto-mesenchymateuses (hOE-MSC) de patients FD. Les hOE-MSC sont pluripotentes et ont la capacité de se différencier en diverses lignées cellulaires, y compris les neurones et les cellules gliales.Nous avons confirmé la présence du transcrit exempt de l'exon 20 d'IKBKAP dans les hOE-MSC de FD et nous avons observé une expression significativement inférieure de la somme des transcrits IKBKAP chez ces patients, du fait de la dégradation d'une partie des isoforme aberrants. Cette réduction est correlée avec une réduction d'expression de la protéine traduite à partir du transcrit d’IKBKAP possèdant l’exon 20, IKAP/hELP1. Nous avons localisé IKAP/hELP1 dans différents compartiments cellulaires, y compris le noyau, ce qui soutient des rôles multiples de cette protéine. Nous avons confirmé que la kinétine, une cytokinine, améliorait le taux de transcrit incluant l'exon 20 et rétablissait des niveaux normaux d'IKAP/hELP1 dans les hOE-MSC de FD. Par ailleurs, nous avons pu modifier le rapport d'épissage d'IKBKAP en augmentant ou en réduisant le ratio WT (inclusion de l'exon 20) : MU (saut de l'exon 20) respectivement, en produisant des sphères flottantes, ou en engageant les cellules vers une différentiation neurale. Les sphères et les cellules différenciées ont été étudiées au niveau pan-génomique, ce qui a permis d'identifier le développement du système nerveux comme étant le processus le plus affecté chez les FD. De plus, nous soulignons le rôle de la kinétine comme un probable régulateur de facteurs d'épissage contribuant à la restauration d'un épissage correct d'IKBKAP.Les hOE-MSC isolées de patients FD représentent une nouvelle approche pour modéliser la pathologie et mieux comprendre l'expression génétique et les approches thérapeutiques possibles de la FD. En outre, elles offrent une application originale à la compréhension d'autres maladies génétiques neurologiques. / Familial dysautonomia (FD) is a hereditary neuropathy caused by mutations in the IKBKAP gene, the most common of which results in variable tissue-specific mRNA splicing with skipping of exon 20. Defective splicing is especially severe in nervous tissue, leading to incomplete development and progressive degeneration of sensory and autonomic neurons. The specificity of neuron loss in FD is poorly understood due to the lack of an appropriate model system. To better understand and modelize the molecular mechanisms of IKBKAP mRNA splicing, we collected human olfactory ecto-mesenchymal stem cells (hOE-MSCs) from FD patients. hOE-MSCs have a pluripotent ability to differentiate into various cell lineages, including neurons and glial cells.We confirmed IKBKAP mRNA alternative splicing in FD hOE-MSCs and observed a significant lower expression of both IKBKAP transcripts and IKAP/hELP1 protein in FD cells resulting from the degradation of the transcript isoform skipping exon 20. We localized IKAP/hELP1 in different cell compartments, including the nucleus, which supports multiple roles for that protein. Moreover, we showed that kinetin improved exon 20 inclusion and restores a normal level of IKAP/hELP1 in FD hOE-MSCs. Furthermore, we were able to modify the IKBKAP splicing ratio in FD hOE-MSCs, increasing or reducing the WT (exon 20 inclusion):MU (exon 20 skipping) ratio respectively, either by producing free-floating spheres, or by inducing cells into neural differentiation. Spheres forming cells and lineage neuroglial progenitors were investigated at the genome-wide level, and we confirmed that nervous system development was the most altered process in FD. More, we highlight kinetin role as a putative regulator of splicing factors which contribute to restore a correct splicing of IKBKAP.hOE-MSCs isolated from FD patients represent a new approach for modeling FD to better understand genetic expression and possible therapeutic approaches. This model could also be applied to other neurological genetic diseases.

La photosynthèse oxygénique peut être le lieu de formation des Formes Réactives de l’Oxygéne (FROs). Les FROs altèrent toutes les macromolécules de la cellule, générant ainsi un stress oxydant. Toute perturbation du métabolisme cellulaire peut conduire à ce type de stress. Les cyanobactérie sétant les premiers organismes à avoir émis de l’oxygène sur terre, elles ont du développer très tôt au cours de l’évolution des mécanismes de perception et de défense pour lutter contre ce stress. Nous nous sommes intéressés à l’étude des mécanismes qui permettent à la cyanobactérie filamentuse et diazotrophe Anabaena PCC 7120 de s’adapter à diverses conditions de stress et de carence : stress oxydant, carence en fer et en azote combiné. En réponse à une carence en azote combiné, elle différencie en 24 h des hétérocystes : cellules spécialisées dans la fixation de l’azote atmosphérique. Nous avons étudié la réponse transcriptomique globale de cette bactérie à la fois au stress oxydant et à la carence en fer et nous avons établit la connection existant entre ces deux stress. Nous avons pu identifier le régulateur transcriptionnel pleiotrope impliqué dans la perception et la signalisation du stress peroxyde et nous en avons élucidé le mécanisme d’action. Nous avons également étudié une Ser/Thr kinase qui joue un rôle important à la fois dans la réponse au stress oxydant et à la carence en azote combiné. Notre étude a montré que cette kinase pourrait être le lien moléculaire entre ces deux conditions, puisque une cible potentielle de cette kinase semble être la protéine HetR qui est le régulateur clé du processus de différenciation cellulaire. / Oxygenic photosynthesis may generate Reactive forms of Oxygéne (ROS). These reactive oxygen species can damage all the macromolecules of the cell, inducing oxidative stress. Any disruption of cellular metabolism can lead to oxidant damage. Cyanobacteria were the first organisms producing oxygen on Earth, they therefore had to develop very early during evolution the mechanisms of perception and defence to cope with this tstress. We are interested in studying the mechanisms that allow the diazotrophic filamentous cyanobacterium Anabaena PCC 7120 to adapt to various conditions of stress and stravations: oxidative stress, iron and combined nitrogen starvations. Anabaena PCC 7120 is a simple model for the study of cell differentiation. In response to combined nitrogen stravation it can differentiate heterocysts, cell specialized in molecular nitrogen fixation. We studied the global transcriptomic response of this bacterium to both oxidative stress and iron deficiency and we establish the crosstalk between these two stresses. We were able to identify the global transcriptional regulator involved in the perception and in the signaling of a peroxide stress. Its mechanism of action was elucidated. We also studied a Ser / Thr kinase that plays an important role both in the response to oxidative stress and combined nitrogen stravation. Our study showed that this kinase may be the molecular link between these two conditions, as a potential target of this kinase appears to be the HetR protein which is the key regulator of cellular differentiation process.

L'incidence des maladies cardiovasculaires d'origine athéromateuse constitue un problème majeur en santé publique et malgré le développement de techniques curatives endovasculaires, la chirurgie demeure nécessaire chez de nombreux patients. La faible disponibilité des vaisseaux naturels, autologues ou non, et les limites mécaniques et biologiques des substituts artificiels pour le remplacement des vaisseaux de petit calibre, imposent le recours à une nouvelle science : l'ingénierie vasculaire. Ce concept a émergé et évolué depuis quelques années. Il pourrait permettre de proposer de nouveaux types de substituts vasculaires synthétiques et/ou biologiques, en particulier grâce à l'utilisation de cellules souches, ouvrant d'intéressantes perspectives dans le domaine de l'ingénierie vasculaire. Le but de ce travail a été d'obtenir de manière fiable et reproductible des cellules à phénotype endothélial mature à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSMs) issus de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical et de la moelle osseuse (MO). Cependant, la différenciation de ces cellules nécessite une fonctionnalisation de la surface de culture, et notre groupe a démontré l'avantage des films multicouches de polyélectrolytes, constitués de PAH (hydrochlorure de poly(allylamine)) et de PSS (poly(styrène sulfonate)), sur l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaire. Les cellules ont été cultivées sur films (PAH-PSS)4 ou sur collagène de type I (témoin), en présence de facteurs de croissance angiogéniques. La différenciation en cellules endothéliales (CEs) a été suivie par l'expression des marqueurs endothéliaux (PCR et western blot), et la fonctionnalité par leur capacité à incorporer les lipoprotéines acétylées (Ac-LDLs) ainsi que la capacité à produire du monoxyde d'azote et à exprimé le facteur von Willebrand (vWF). Après 14 jours de stimulation, seules les CSM-GWs étaient différenciées en CEs fonctionnelles démontrant l'intérêt de combiner l'utilisation des CSM-GWs et des films (PAH-PSS)4 dans le domaine de l'ingénierie vasculaire / The incidence of cardiovascular disease remains a major public health problem. Despite the development of endovascular therapies, surgical treatment is necessary for many patients. The low availability of natural vessels, autologous or not, and the mechanical and biological limits of artificial substitutes, led to the use of a new domain: vascular engineering. In recent years, the concept has emerged and evolved. He could afford to offer new types of synthetic vascular substitutes and / or biological, in particular through the use of stem cells, offering interesting perspectives in the field of vascular engineering. The purpose of this study was to obtain a reliable and reproducible protocol to generate functional endothelial cells (ECs) from mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the umbilical cord Wharton's jelly (WJ) and bone marrow (BM). Nevertheless, their differentiation into vascular cells needs a culture surface functionalization; our group demonstrated the potential use of polyelectrolyte multilayer made of poly(allylamine hydrochloride): PAH, and poly(styrene sulfonate): PSS, in promoting cells adhesion, proliferation and differentiation. Cells were cultured on (PAH-PSS)4 films or collagen type I (used as control), in the presence of angiogenic growth factors. Cells differentiation into EC was followed through the expression of endothelial markers (PCR and western blot); cell functionality was checked through their ability to incorporate acetylated LDL (Low Density Lipoprotein), to produce NO (Nitric oxide) and to express the von Willebrand factor (vWF). After 14 days of stimulation, only WJ-MSCs were able to generate functional ECs demonstrating the potential of combining WJ-MSCs and (PAH-PSS)4 films in vascular tissue engineering field

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des outils puissants pour explorer la genèse des différents tissus de l’organisme, notamment le tissu hématopoïétique. Dans le but d’obtenir des types cellulaires cliniquement utiles, la majorité des travaux se sont concentrés sur l’obtention des cellules hématopoïétiques terminales, notamment des cellules lymphoïdes (lymphocytes B, lymphocyte T et cellules NK), à partir des cellules souches pluripotentes humaines. En revanche, le rendement des cellules hématopoïétiques obtenues dans ce modèle reste faible. D’autre part, les étapes précoces de l’hématopoïèse, notamment l’identification de la cellule souche hématopoïétique (CSH), des progéniteurs myéloïdes et lymphoïdes à partir des cellules souches pluripotentes, sont encore très peu définies. Nous nous sommes intéressés aux étapes précoces de la lymphopoïèse dans le modèle des CSEh. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle de l’homéoprotéine HOXB4 dans l’expansion des progéniteurs NK dérivés des CSEh. Nous avons montré que l’exposition des cellules des corps embryonnaires (EB pour Embryoid Body), dérivées de la différenciation des CSEh, à la lignée MS-5/SP-HOXB4, une lignée modifiée qui exprime constitutivement HOXB4, induit une expansion des progéniteurs NK dérivées des CSEh. De plus, les cellules NK qui en dérivent sont matures et fonctionnelles, de part leur activité cytolytique vis-à-vis d’une lignée érythro-leucémique (K562). Outre l’effet de HOXB4 sur l’expansion des progéniteurs NK, cette étude a permis de démontrer en particulier le rôle de la lignée stromale MS-5 dans l’induction de la spécification lymphoïde à partir des CSEh. Dans un deuxième temps, nous avons analysé plus précisément les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine à partir des CSEh. En effet, nous avons montré, au cours de la première partie, que la coculture des cellules dérivées des EB avec MS-5 induit l’expression en surface du CD45RA, un marqueur de spécification lymphoïde, au sein des progéniteurs hématopoïétiques CD34+. Ainsi, sur la base de ces données et des données antérieurs concernant les étapes précoces de la lymphopoïèse humaine fœtale et adulte, nous avons identifié et caractérisé in vitro à partir des CSEh deux populations originales de progéniteurs lymphoïdes précoces multipotents (MELP pour Myeloid Early Lymphoid Progenitor): La progéniteur CD34+CD45RA+CD7+ dont le potentiel de différenciation est biaisé vers le lignage T et NK ; et le progéniteur CD34+CD45RA+CD7- a un potentiel de différenciation biaisé vers les lymphocytes B. Cette étude a un intérêt dans la compréhension du processus de la lymphopoïèse humaine dans le modèle des cellules souches pluripotentes. En perspective, ces données pourraient avoir également un intérêt dans la modélisation de maladie de défauts génétiques de développement du système lymphoïde. / Human embryonic stem cells (hESC) are powerful tools to explore tissue genesis of the organism, especially hematopoietic tissue. In order to obtain cellular types clinically useful, the majority of works have been focalised on final output of hematopoietic cells, especially lymphoid cells (lymphocyte B, lymphocyte T and NK cells), from human pluripotent stem cells. However, the obtained hematopoietic cells yield is very poor. In the other hand, initial steps of hematopoiesis, especially the identification of the hematopoietic stem cell, myeloid and lymphoid progenitors, from pluripotent stem cells, are poorly defined. We were interested to early steps of lymphopoisis in the hESC model. Initially, we studied the role of HOXB4 homeprotein on CSEh-derived NK progenitor. We showed that exposure of embryoid body (EB), derived from hESC, to the modified line that express constitutively HOXB4 “MS-5/SP-HOXB4”, induce hESC-derived NK progenitor expansion. Furthermore, the derived NK cells are mature and fonctionnal, by cytolytic activity on erythro-leucemic line K562. Furthermore the effect of HOXB4 on NK progenitor expansion, this study demonstrated, particularly the role of MS-5 line on the lymphoid specification from hESC.Secondly, we analysed more precisely the early steps of human lymphopoiesis from hESC. We showed, in the first part, that MS-5 coculture of the EB-derived cells induce surface expression of CD45RA (marker of lymphoid specification) on hematopoietic progenitor CD34+. Thus, on the basis of these data and previous data concerning the initial steps of fetal and adult lymphopoiesis, we identified and characterized in vitro from hESC, two populations of multipotent early lymphoid progenitor (MELP): the CD34+CD45RA+CD7+ progenitor whose the differentiation potential is biased to T and NK lineage, and the CD34+CD45RA+CD7- progenitor has differentiation potential biased to B lineage. This study is essential in understanding of normal and pathological lymphopoisis process in pluripotent stem cells model. Additionally, this study paves the way for the modeling of genetic disorders of lymphoid system.

L'ingénierie tissulaire consiste à assembler de façon intelligente des cellules et des matériaux biocompatibles dans le but de créer des tissus artificiels. Pour la construction de tissus en laboratoire, il est indispensable d'élaborer des matériaux qui miment cet environnement. Dans ce cadre, la collaboration entre les scientifiques de différents domaines (matériaux, chimie, biologie, biochimie) s'avère nécessaire. L'ingénierie du muscle squelettique est prometteuse pour remplacer le tissu musculaire endommagé et pour le traitement des maladies du muscle, mais aussi pour les essais pharmaceutiques. Dans ce but, les matériaux avec les propriétés mécaniques et chimiques contrôlées sont requis -- pour l'amplification et la différenciation in vitro de cellules souches musculaires, mais aussi pour l'étude de la myogenèse sur des microenvironnements contrôlés 2D et dans les matrices 3D. Dans ce travail, nous avons utilisé la technique d'assemblage couche par couche (LbL, layer-by-layer) pour deux buts. Le premier a été de développer de nouveaux films biomimétiques possédant des propriétés biochimiques et mécaniques parfaitement contrôlées, pour étudier les interrelations entre ces deux paramètres sur les processus cellulaires. En plus, nous avons associé ces films biomimetiques aux substrats avec la topographie contrôlée, afin de guider la formation du tissu. Dans un second temps, nous avons utilisé la technique LbL pour organiser les cellules en structures 3D. Nous avons ainsi crée des microtissus d'épaisseur contrôlée, qui pourraient être utilisés en tant que modèles de tissus artificiels pour les applications thérapeutiques ou pour les évaluations de médicament en industrie pharmaceutique. / Tissue engineering approach consists in combining cells, engineering and biomaterials to improve the biological functions of damaged tissues or to replace them. Production of “artificial tissues” is still challenging and requires collaboration of scientists from different domains like cell biology, chemistry, materials and polymer science. Skeletal muscle tissue engineering holds promise for the replacement of muscle due to an injury and for the treatment of muscle diseases, such as muscle dystrophies or paralysis, but is also required for pharmaceutical assays. To this end, materials with tunable mechanical and biochemical properties for myoblast expansion and differentiation in vitro, as well as for the studies of myogenesis on controlled 2D microenvironments or in 3D scaffolds, are crucially needed. In this work, we use layer-by-layer (LbL) assemblies for two goals. The first consisted in the development of multifunctional biomimetic thin films for the control of skeletal muscle cell fate on 2D substrates. We use LbL films made of polypeptides, which can be stiffened by chemical cross-linking and can be specifically functionalized by grafting of biomimetic peptides onto their surface. In addition, we combined the peptide-grafted films with substrate microtopography. Such approach is promising for the development or multifunctional materials that combine the different stimuli present in in vivo ECM, among them physical and biochemical cues, but also microtopography. In the second part, we use LbL assemblies for the construction of 3D skeletal muscle microtissues. This allows to rapidly build 3D muscle tissues and is promising for the in vitro construction of physiologically relevant skeletal muscle tissue models.

Le diabète de type 1 (DT1) est caractérisé par des niveaux élevés de glucose en raison de la destruction des cellules ß pancréatiques sécrétrices d'insuline. Cependant, les thérapies actuelles de remplacement des cellules bêta du pancréas impliquant la transplantation d'îlots pancréatiques sont techniquement difficiles et limitées par la disponibilité de don d'organes. Bien que les cellules souches embryonnaires et les cellules souches pluripotentes induites soient intensément étudiées, aucune de ces deux sources de cellules souches ne peut être utilisée directement sans le risque de développement de tumeurs. Les cellules souches dérivées du muscle squelettique (MDSC) sont une source de cellules alternative intéressante car elles sont multi-potentes et peuvent donc se différencier vers plusieurs lignages cellulaires tels que des cellules cardiaques à battement autonome “pacemaker-like” et des cellules neuronales. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse qu'elles pourraient se différencier en lignées de type pancréatique. Les objectifs de cette étude étaient donc d'étudier le potentiel des MDSC (1) à se différencier in vitro en cellules beta pancréatiques exprimant l'insuline et (2) à se différentier in vivo dans le pancréas et ainsi réduire l'hyperglycémie chez la souris modèle d'un diabète de type 1. Dans cette étude, les MDSC de muscle de souris ont été isolées via une série de passages des cellules les moins adhérentes en culture. Les cellules souches ainsi isolées peuvent adhérer sur une couche de cellules de types fibroblastes ou sur une matrice extra-cellulaire de type laminine pour ensuite se différentier in vitro ou bien être utilisées comme cellules souches MDSC non-adhérentes et non différentiées pour les études in vivo. In vitro, les MDSC peuvent se différencier spontanément en agrégats de cellules formant des îlots et exprimant des marqueurs de cellules bêta identifiés par immunofluorescence et analyse “PCR transcription inverse”. Ceci a été confirmé par immuno-analyse montrant l'expression des protéines nécessaires à la fonction des cellules ß, comme Nkx6.1, MafA et Glut2. Les MDSC différenciées en aggrégats cellulaires de type îlots pancréatiques montrent une sécrétion d'insuline en réponse au glucose in vitro. Cependant, dans des modèles murins de DT1 induit par la streptozotocine, l'injection intra-péritonéale des MDSC n'a pas permis de rétablir chez les souris diabétiques une normoglycémie du glucose sanguin en dépit d'un engreffement des MDSC dans les tissus pancréatiques. Ces données montrent que les MDSC peuvent constituer une source de cellules souches alternative intéressante pour le traitement du diabète. / Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by high and poorly controlled glucose levels due to the destruction of insulin-secreting pancreatic ß-cells. However, current ß-cell replacement therapies, involving pancreas and pancreatic islet transplantation are technically demanding and limited by donor availability. While embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells are intensely investigated, neither can be used due to safety issues. Skeletal muscle-derived stem cells (MDSC) are an attractive alternative cell source as they have the potential to undergo multilineage differentiation into beating pacemaker-like cells and neuronal cells. Hence, it is hypothesised that they can differentiate into pancreatic lineages. This led to the goals of this study, which were (1) to investigate the potential of MDSC to differentiate into mature insulin expressing cells in vitro and (2) to reduce hyperglycemia in mouse model type 1 diabetes. In this study, MDSC were isolated from mouse via a serial pre-plating based on the adhesive characteristics of cultured cells, in which the cells of interest adhered to plates at a later time for in vitro differentiation, while the non-adherence undifferentiated MDSC were used for in vivo study. The MDSC were found to spontaneously differentiate into islet-like aggregates and expressed ß-cell markers in vitro, as determined by immunofluorescence and reverse transcription PCR analyses. This was further confirmed by immunoblotting analysis showing expression of proteins required for ß-cell function, such as Nkx6.1, MafA and Glut2. The differentiation of MDSC into islet-like clusters demonstrated glucose responsiveness in vitro. In streptozotocin-induced T1D mouse models, intraperitoneal injection of the undifferentiated MDSC did not restore the blood glucose levels of the diabetic mice to normoglycemia despite successful engraftment of MDSC into the pancreatic tissues. Taken together, these data show that MDSC may serve as an alternative source of stem cells for the treatment of diabetes.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les phosphates de calcium tels que le β-TCP sont utilisés depuis des décennies comme substitut osseux synthétique. Leurs bonnes propriétés chimiques et leur comportement analogue au tissu osseux in vivo et in vitro peuvent être améliorés par la technique de mise en forme employée. Il est aujourd'hui largement admis qu'une architecture poreuse optimisée aura un impact positif sur la bioactivité du matériau. Cette étude vise à étudier les liens existant entre une structure macroporeuse en β-TCP et la prolifération et différenciation cellulaire. Le β-TCP est fabriqué par précipitation aqueuse. Les paramètres de synthèse sont optimisés afin d'avoir un produit répondant aux normes ISO 13175 et 13779. Trois méthodes de mise en forme ont été choisies pour leur aptitude à générer une macroporosité originale. L'imprégnation d'une structure polymérique par une suspension génère un réseau de pores sphériques (PS), la stéréolithographie génère des pores cubiques interconnectés (3D) et la congélation orientée produit un réseau de pores tubulaires ellipsoïdaux parallèles au sens de la congélation (CO). Deux tendances émergent des cultures de cellules souches mésenchymateuses humaines: PS et 3D favorisent la prolifération alors que CO favorise la pénétration cellulaire et l'activité de la phosphatase alcaline. Cette dernière est favorisée par le β-TCP et cette aptitude est améliorée par la congélation orientée. Cela pourrait s'expliquer par l'état d'avancement de la différenciation cellulaire: les cellules sur les échantillons CO semblent être à un stade de différenciation plus avancé. Des essais complémentaires sur l'expression de gènes clés sont en cours pour vérifier cette hypothèse. / Calcium phosphates such as β-TCP have been used for decades as synthetic bone substitutes. Its good chemical properties and its similar behavior to that of the bone in vivo and in vitro can be enhanced by the chosen shaping method. It is nowadays largely accepted that an optimized porous architecture will have a positive impact on the material's bioactivity. This study aims at studying the links between a porous architecture and cell proliferation and differentiation. β-TCP was manufactured by aqueous precipitation. Synthesis parameters were optimized in order to get a product complying with ISO 13779 and 13175 requirements. Three shaping methods were chosen for their ability to generate original structures. The impregnation of a polymeric scaffold yields a network of interconnected spherical pores (PS), stereolithography yields a network of interconnected cubical pores (3D) and ice templating yields a network of parallel ellipsoidal channel-like structure (CO). Two different trends emerged from the human mesenchymal stem cell culture: PS and 3D favored cell proliferation whereas CO promoted cell penetration and alkaline phosphatase activity. The latter is stimulated by β-TCP and this ability is enhanced by freeze casting. This could be explained by the state of cell differentiation: cells on CO samples seem to be far more differentiated than the other ones. However the study of key genes expression is needed to confirm this hypothesis.