Le cancer colorectal (CCR) reste encore aujourd'hui une cause majeure de mortalité dans le monde, avec une incidence annuelle d'environ 1 million de cas et une mortalité d'environ 700 000 personnes. La stratégie de dépistage du CCR se base sur la détection de sang occulte dans les selles par le test iFOBT. Malgré une spécificité acceptable, la sensibilité de détection reste toujours insuffisante dans une population asymptomatique (27% de sensibilité pour un adénome, 65% pour un CCR). Aujourd'hui, il existe un réel besoin de trouver de nouveaux biomarqueurs spécifiques du CCR ainsi que de développer des tests de diagnostic faciles à mettre en oeuvre dans les laboratoires de biologie médicale. Les progrès récents de l'analyse protéomique à haut débit permettent aujourd'hui d'identifier et de quantifier un nombre toujours plus grand de protéines. C'est pourquoi, nous avons développé des stratégies en protéomique quantitative pour la recherche et la validation de biomarqueurs du cancer colorectal. L'approche iTRAQ et Label-free ont permis l'identification d'environ 800 protéines et la quantification de 214 protéines. Nous avons entrepris avec succès, la validation de 4 protéines par des tests ELISA et de nouvelles technologie en protéomique quantitative ciblée (LC-SRM). Au Final, nous proposons un test multiplex de 3 protéines qui permettra d'affirmer ou d'infirmer les résultats obtenus par le test iFOBT. L'ajout du test pourrait réduire de manière significative le nombre de coloscopies inutiles, potentiellement dangereuses pour les patients et onéreuses pour les autorités de santé. / Colorectal cancer (CRC) remains a major cause of cancer mortality throughout the world with an annual incidence of approximately 1 million cases and an annual mortality around 700 000. CRC outcome is highly dependent upon the stage of detection. The 5-year survival rate of patients with metastases is less than 20% while patients with localized adenomatous polyps have an excellent outcome with 90% survival rate. Current screening methods of CRC include the iFOBT and colonoscopy. The iFOBT has an acceptable 95% specificity but always an unsatisfactory sensitivity of detection in the asymptomatic population (27% sensitivity for adenoma, 65% for carcinoma). That is why, there is a real need to find new biomarkers and develop new diagnostic test, specific and easy to implement in clinical research. Recent advances in the analysis of biological fluids by high throughput mass spectrometry allow us now to identify and quantify a large number of proteins. Due to these improvements of proteomic strategies, it seems to be a promising way to find new potential proteins markers in the CRC disease. The quantitative iTRAQ & Label-free approaches allowed the identification of 800 proteins and the quantification of 200 proteins. Therefore, we have successfully validated four proteins by targeted proteomics using mass spectrometry (LC-SRM) and ELISA assays. Finally, we suggest a multiplex test of 3 proteins which confirm or contradict the FOBT outcome. The addition of the test could significantly reduce the number of unnecessary colonoscopies which are potentially dangerous for patients and expensive for public health authorities.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4434.pdf: 2956570 bytes, checksum: f54aa91fcb424a121affb3c9674f546e (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aim of this work was to perform differential proteomic analysis of the periplasmic protein profiles of the genome strains A, B and C of Xanthomonas spp, which differ in pathogenicity and host range of citrus. The strain Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the most virulent and infects all types of citrus, while the strain B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) is less virulent and the strain C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) has a unique citrus-host. The comparative proteomic analysis of Xau-B and Xau-C in relation to Xac can reveal genes and proteins involved in pathogenicity and host range of citrus, respectively. The strains A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) and C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) were grown in XAM-1, which is known to be a pathogenicity-inducing medium for Xac, and in a non-inducing pathogenicity (Nutrient Broth, NB). Proteins from both types (grown in triplicate using both media), were separated by bidimensional electrophoresis (2DPAGE) and the gels were stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 and documented. A comparative analysis of the protein profiles of Xac and Xau-B, and Xac and Xau-C, grown in the same culture medium, was performed using ImageMaster Platinum software (GE Healthcare). Statistical analysis (ANOVA) revealed a large number of periplasmic proteins that presented type-specific or differential expression between the two bacteria. For the comparison between Xac and Xau-B we used the twodimensional Xau-B gels of periplasmic proteins obtained by Carnielli (2011). The differential spots between Xac and Xau-C, Xac and Xau-B that showed a significant differential expression (p <0.05) were isolated from gels and identified by ESI-QUADTOF mass spectrometry (LNBio, Campinas-SP), employing Xac, Xau-B and Xau-C databases. Several differentially expressed proteins between strains were identified for the different conditions studied, showing that some of them were strain-specific (approximately 10) while others were expressed in all strains, differing only in intensity. Those proteins potentially related to pathogenicity and citrus host were quantified using the software Scaffold v. 3.0, for the mass spectrometry data.The results showed that Xac, Xau-B, and Xau-C had remarkable differences between the periplasm protein profiles for both conditions, even under conditions of no induction of pathogenicity. The proteomics approach showed that even though the strains showed a different pattern of protein expression, the sequences of genes related to the differential proteins are present in all strains. Based on the proteomic analysis, proteins that showed remarkable differential expression between the genome strainswere selected, and its expression was evaluated by Western blot in periplasmic fraction of the bacteria. The data obtained in the the comparative proteomic analysis for the superoxide dismutase corroborated most quantitative results generated by the software Scaffold. This work showed that the proteomic analysis, combined with quantitative analysis tools, is an important tool that comes to complement genomic investigations designed to differentiate the species of Xanthomonas spp. / O presente trabalho teve por objetivo a análise proteômica comparativa da fração periplasmática das estirpes-genoma A, B e C de Xanthomonas spp, as quais diferem em patogenicidade e gama de citros hospedeiros. A estirpe A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) é a mais virulenta e infecta todos os tipos de citros, enquanto que a estirpe B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) é menos virulenta e a estirpe C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) possui um único hospedeiro cítrico. Estas estirpes foram cultivadas em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN). Após a extração de proteínas da fração periplasmática em triplicata, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. A análise proteômica comparativa de Xau-B e Xau-C relativamente à Xac pode nos levar a genes e proteínas envolvidas com patogenicidade e espectro de hospedeiro cítrico, respectivamente. Assim, Xac e Xau-C foram cultivadas em triplicata em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN), sendo as células coletadas ao final da fase exponencial de crescimento, segundo curvas previamente realizadas. Após a extração de proteínas periplasmáticas, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. Uma análise estatística das diferenças observadas nas intensidades dos spots nos géis 2D foi realizada entre Xau-C e Xac e entre Xau-B e Xac (nos mesmos meios de cultura) utilizando o software Image Master 2D-Platinum (GE Healthcare). Para esta última comparação foram utilizados os géis bidimensionais de proteínas periplasmáticas de Xau-B obtidos por Carnielli (2011). As proteínas diferenciais entre Xac e Xau-C e entre Xac e Xau-B que apresentaram uma expressão diferencial significativa (p<0,05) foram isoladas a partir dos géis e identificadas por espectrometria de massas (LNBio, Campinas-SP) após pesquisa em banco de proteínas anotadas a partir do genoma de cada uma das linhagens. Inúmeras proteínas diferencialmente expressas entre as linhagens foram identificadas para as diferentes condições estudadas, demonstrando que algumas foram estirpe-específicas (10 aproximadamente) enquanto outras foram expressas em todas as linhagens, diferindo na sua intensidade. Aquelas proteínas que indicaram alguma potencialidade em relação à patogenicidade e hospedeiro cítrico foram quantificadas com o uso do software Scaffold v. 3,0, a partir de dados provenientes da espectrometria de massas. Os resultados obtidos demonstram que Xac, Xau-B e Xau-C apresentam perfis proteicos marcadamente diferentes na fração de periplasma, mesmo em condições de não indução da patogenicidade. A abordagem proteômica evidenciou que embora as estirpes apresentem um padrão de expressão protéica muito distinto na fração rica em proteínas periplasmáticas, as sequências dos genes relacionados às proteínas diferenciais (superóxido dismutase e fosfoglicomutase) estão presentes em todas as estirpes. Com base na análise proteômica, foram selecionadas proteínas que apresentaram expressão diferencial acentuada entre as linhagens-genomas, nas condições estudadas, sendo sua expressão avaliada por Western blot contra extrato protéico periplasmático das três linhagens- genomas, após cultivo das mesmas em meio CN e XAM-1 Os dados obtidos para a superoxido dismutase corroboraram a maioria dos resultados quantitativos gerados pelo software Scaffold. Este trabalho evidenciou que a análise proteômica, aliada às ferramentas de análises quantitativas, é um recurso que vem complementar as investigações genômicas destinadas a diferenciar as diferentes espécies de Xanthomonas spp. Sob os aspectos biotecnológicos a busca e identificação de proteínas biomarcadoras, em especial aquelas relacionadas com patogenicidade e especificidade à hospedeiro, são importantes alvos para produção de drogas no combate ao cancro cítrico.