Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3102_1.pdf: 1259276 bytes, checksum: c0878ec8ef24a46259582227748106b4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A protease alcalina extraída do ceco pilórico do pirarucu (Arapaima gigas) foi purificada em quatro etapas: tratamento térmico, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em coluna Sephadex® G-75 e cromatografia de afinidade em coluna benzamidina-agarose. Após as etapas de purificação aplicou-se uma amostra da proteina obtida em gel de eletroforese e verificou-se a presença de única banda que apresentou peso molecular aproximado de 28,0 kDa. Desta forma, após purificação, avaliaram-se as propriedades físico-químicas e cinéticas da enzima e o efeito de íons metálicos e de inibidores de proteases na atividade proteolítica da mesma, utilizando-se benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BApNA) como substrato. O pH e a temperatura ótima de reação encontrada foram 9,0 e 65°C, respectivamente. A enzima mostrou-se estável, após 30 min de incubação, em ampla faixa de pH alcalino (pH 6,0 a 11,5). Após 30 minutos de incubação a 60ºC, foi detectada uma perda de 10% da atividade tríptica. Os valores encontrados para os parâmetros cinéticos (Km, Kcat e Kcat/Km) foram: 0,47 ± 0,042 mM, 1,33 s-1 and 2,82 s-1 · mM-1, respectivamente, usando BApNA como substrato. A atividade tríptica mostrou-se sensível a alguns íons metálicos. A atividade tríptica foi inibida, em ordem crescente, pelos íons: Mn2+ > Ca2+ > Li+ > Cd2+ > Cu2+ > Fe2+ > Hg2+ > Zn2+ > Al3+ > Pb2+. Por outro lado, os íons K+, Mg2+ e Ba2+ não promoveram nenhum efeito na atividade da protease. A enzima foi fortemente inibida por inibidores de tripsina. Os ensaios com substrato específico e inibidores de tripsina forneceram evidências de que esta enzima é provavelmente uma tripsina-símile e suas características sugerem um forte potencial para ser utilizada em processos e produtos industriais

Quimotripsinas (EC 3.4.21.1) são serina proteinases que possuem 245 resíduos de aminoácidos arranjados em dois domínios duplo β-barril, sendo que o sítio ativo está localizado entre esses dois domínios. O estudo da especificidade das endopeptidases foi facilitado pelo conceito de sítio de ligação do substrato, que corresponde ao sítio ativo daquelas enzimas. Porém, sobre as quimotripsinas de insetos, praticamente não existe informação a respeito da especificidade dos diferentes subsítios dessas enzimas. O estudo da especificidade dos subsítios das quimotripsinas dos insetos Periplaneta americana, Tenebrio molitor e Diatraea saccharalis apresentaram maior eficiência de hidrólise sobre substratos que apresentam um resíduo Tyr em P1, embora as razões Phe/Tyr para os diferentes insetos sejam bastante variadas. Estas diferenças indicam diferentes especificidades para as quimotripsinas de insetos em P1. No entanto, estas diferenças parecem não seguir a posição ocupada pelo inseto na escala evolutiva e são menos evidentes do que as verificadas para as tripsinas dos mesmos insetos, onde há troca de especificidade primária. A quimotripsina de Periplaneta americana como a de Diatraea saccharalis preferencialmente clivam substratos com Pro em P2. Porém, o mesmo não acontece com a quimotripsina de Tenebrio molitor, que apresentou maior kcat/Km para o peptídeo com Ala em P2, essa preferência pode estar relacionada à conformação da Pro que difere dos demais resíduos por ser um iminoácido. Porém, as três quimotripsinas estudadas apresentaram maior kcat/Km para o peptídeo Ile em P3 indicando que esse subsítio possui um papel fundamental na discriminação dessas enzimas por substratos com resíduos de aminoácidos específicos nessa posição. As quimotripsinas de Periplaneta americana e Diatraea saccharalis apresentaram maior kcat/Km pelo peptídeo com Ser em P1\', evidenciando que a presença de um grupo hidroxila na cadeia lateral da Ser e o baixo volume da cadeia lateral do resíduo, torna o subsítio dessas enzimas mais seletivo que a quimotripsina de Tenebrio molitor que apresentou maior kcat/Km pelo peptídeo com Ala. Dessa forma, esse estudo colabora para um melhor conhecimento da especificidade dos subsítios das endopeptidases digestivas de insetos pode dar diretrizes para a purificação ou síntese de inibidores mais eficazes com ação direta nas enzimas digestivas de insetos e serem utilizados na produção de plantas transgênicas ou utilizados como bioinseticidas. / Chymotrypsins (EC 3.4.21.1) are serine proteases with 245 amino acids disposed in two double ?-barrel domains, being the active site locate between these two domains. The specificity study of endopeptidases was facilitated by the substrate binding site concept that is the active site of these enzymes. However there is not much information about the subsites specificity of insect chymotrypsins. The specificity study of insects chymotrypsins subsites of Periplaneta americana, Tenebrio molitor and Diatraea saccharalis showed higher substrate hydrolysis efficiency with Tyr in P1, however the Phe/Tyr proportion for different insects are varied. These differences have shown different specificities for insect chymotrypsins in P1. Meanwhile, this difference does not follow the position occupied by insects in evolutive scale, and it is less clear than those showed by the same insect trypsins were there is primary specificity cross. Like Diatraea saccharalis, the Periplaneta americana chymotrypsin breaks the substrate with Pro in P2. Nevertheless the same does not happen to Tenebrio molitor chymotrypsin with the higher kcat/Km for the peptide with Ala in P2, this preference may be related to the different conformation of Pro. The three studied chymotrypsins showed higher kcat/Km for the peptide with Ile in P3, what indicates that this subsite has a key role on these enzymes discrimination for substrates with specific amino acids in this position. The Periplaneta americana and Diatraea saccharalis chymotrypsins presented higher kcat/Km for the peptide with Ser in P1` evidencing that the hydroxyl group side chain presence in Ser and low side chain volume made this subsite more selective than Tenebrio molitor chymotrypsin with higher kcat/Km by Ala peptide. This study collaborates to a best knowledge about the subsite specificities of the insect digestive endopeptidases and the best inhibitors for purification or synthesis with direct action in insect digestive enzymes and to be utilized for transgenic plants or bio-insecticides production.

O mosquito Aedes aegypti é vetor de doenças como a febre amarela, dengue, chinkungunya e zika. O sistema digestório é responsável pela digestão e absorção de nutrientes, é também uma interface com o ambiente externo sendo a porta de entrada de organismos infecciosos. A presença de duas lipases digestivas foi confirmada por qPCR, uma na fase larval (L-Aa7051) e outra na fase adulta (L-Aa7055). Estas enzimas foram agrupadas na família das lipases neutras e apresentam alterações em resíduos envolvidos na especificidade, domínio tampa e alça β9. A L-Aa7055 recombinante foi expressa heterologamente em Escherichia coli na porção insolúvel, com atividade após a renaturação. Observamos que a expressão da lipase L-Aa7055 sofre uma redução de 30% na infecção Plasmodium gallinaceum, não sendo afetada pelo vírus dengue sorotipo 2 (DENV2). A digestão de lipídeos é importante na fase larval, com altos níveis de transcrito. Um estudo mais aprofundado ainda será necessário para compreender completamente o papel das lipases no processo infeccioso. / The Aedes aegypti borne diseases yellow fever, dengue fever, chinkungunya and zica are important public healthy problems. The digestion and absorption of nutrients are performed in the digestive system, which is also an external environment interface that allows the infection by pathogenic microorganisms. The presence of two digestive lipases were identified by qPCR, L-Aa7051 in the larval phase and L-Aa7055 in the adult female. The lipase sequences were grouped in the neutral family, and exhibit alterations in residues involved in specificity, lid domain and β9 loop. The recombinant L-Aa7055 was expressed in the insoluble fraction, and show activity after a renaturation process. We notice that the expression levels of L-Aa7055 are reduced by 30% in the Plasmodium gallinaceum infection and were not affected by serotype 2 dengue virus (DENV2). The lipid digestion is important in the larval phase, with higher transcript levels. New studies will be necessary to the complete understanding of lipase contribution in the infectious process.

O mosquito Aedes aegypti é vetor de doenças como a febre amarela, dengue, chinkungunya e zika. O sistema digestório é responsável pela digestão e absorção de nutrientes, é também uma interface com o ambiente externo sendo a porta de entrada de organismos infecciosos. A presença de duas lipases digestivas foi confirmada por qPCR, uma na fase larval (L-Aa7051) e outra na fase adulta (L-Aa7055). Estas enzimas foram agrupadas na família das lipases neutras e apresentam alterações em resíduos envolvidos na especificidade, domínio tampa e alça β9. A L-Aa7055 recombinante foi expressa heterologamente em Escherichia coli na porção insolúvel, com atividade após a renaturação. Observamos que a expressão da lipase L-Aa7055 sofre uma redução de 30% na infecção Plasmodium gallinaceum, não sendo afetada pelo vírus dengue sorotipo 2 (DENV2). A digestão de lipídeos é importante na fase larval, com altos níveis de transcrito. Um estudo mais aprofundado ainda será necessário para compreender completamente o papel das lipases no processo infeccioso. / The Aedes aegypti borne diseases yellow fever, dengue fever, chinkungunya and zica are important public healthy problems. The digestion and absorption of nutrients are performed in the digestive system, which is also an external environment interface that allows the infection by pathogenic microorganisms. The presence of two digestive lipases were identified by qPCR, L-Aa7051 in the larval phase and L-Aa7055 in the adult female. The lipase sequences were grouped in the neutral family, and exhibit alterations in residues involved in specificity, lid domain and β9 loop. The recombinant L-Aa7055 was expressed in the insoluble fraction, and show activity after a renaturation process. We notice that the expression levels of L-Aa7055 are reduced by 30% in the Plasmodium gallinaceum infection and were not affected by serotype 2 dengue virus (DENV2). The lipid digestion is important in the larval phase, with higher transcript levels. New studies will be necessary to the complete understanding of lipase contribution in the infectious process.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3514510 bytes, checksum: 25d1dc8edd8426770340b8188e8a7bec (MD5) Previous issue date: 2007-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work evaluated ultrastrucural alterations in the midgut of Brontocoris tabidus Signoret (Heteroptera: Pentatomidae) caused by the starvig or feeding in differents periods, this condition can occur in its natural enviroment, being those important factors for the understanding the evolution of the alimentary habit of that predator. Adults of the B. tabidus received differents treatments (starvation or feeding with plant and prey) and their midgut were dissected and divided in anterior, medium and posterior, which were processed and analyzed in light and trasmission eletronic microscope. The epitelium of the midgut of B. tabidus is formed by digestive and regenerative cells. The anterior portion of the midgut of B. tabidus starved or feeding on eucalyptus leaves, didn t present glycogen storage. Brontocoris tabidus fed on plant have multivesicular bodies in this region and spherocrystals after six hour the feeding with prey. The microvilli of the medium midgut of B. tabidus are longer than ones of the anterior and posterior midgut. The posterior midgut differs of the other two parts, for presenting great amount the mitochondria, rough endoplasmatic reticule and double membrane vesicules in the apical region six hours after feeding. The anterior, medium and posterior regions of the midgut of B. tabidus synthesize digestive enzimes, absorb eletrolytes and nutrients, stored and excrete substances. / Este trabalho avaliou alterações ultra-estruturais no intestino médio de Brontocoris tabidus Signoret (Heteroptera: Pentatomidae) causado pelo jejum ou alimentação em diferentes períodos, condição esta que pode ocorrer em seu ambiente natural, sendo esses fatores importantes para o entendimento da evolução do hábito alimentar desse predador. Adultos de B. tabidus receberam diferentes tratamentos (jejum ou alimentado com planta e presa) e seu intestino médio foi dissecado e dividido em anterior, mediano e posterior, as quais foram processadas e analisadas em microscópio de luz e eletrônico de transmissão. O epitélio do intestino médio de B. tabidus é formado por células digestivas e regenerativas. A porção anterior do intestino médio de B. tabidus em jejum ou alimentado com folhas de eucalipto, não apresentou reservas de glicogênio. B. tabidus alimentado com planta apresentou corpos multivesiculares nessa região e esferocristais seis horas após a alimentação com presa. As microvilosidades do intestino médio mediano de B. tabidus são mais longas que as da região anterior e posterior. O intestino médio posterior difere das outras duas partes, por apresentar grande quantidade de mitocôndrias, retículo endoplasmático rugoso e vesículas de dupla membrana na região apical após seis horas de alimentação. As regiões anterior, mediana e posterior do intestino médio de B. tabidus sintetizam enzimas digestivas, absorvem eletrólitos, nutrientes, estocam e excretam substâncias.

Resumo: Neste trabalho foi avaliado o uso de enzimas exógenas: amilase com endo-β-glucanase (AG) e fitase (Fi) em dietas para cachara (Pseudoplatystoma reticulatum). Foram realizados ensaios de digestibilidade de nutrientes de dietas contendo quatro diferentes níveis destas enzimas, em esquema fatorial 4x4. Este estudo mostrou que a adição das enzimas alteraram os valores dos coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes e de absorção dos minerais. No entanto as alterações foram dependentes dos níveis utilizados, e houve interações entre os níveis das enzimas estudadas. Após, foi realizado um ensaio de desempenho com 70 dias de duração, no qual foi avaliado o efeito da ausência de enzimas ou adição de 150 mg de AG kg-1; 2.500 UF kg-1; 100 mg de AG kg-1 com 1.500 UF kg-1 em duas dietas (com 30 ou 60% da proteína de origem animal). Neste experimento, além do desempenho produtivo dos peixes, foram observadas alterações na produção endógena das enzimas digestivas; alterações histológicas do trato gastrintestinal, pâncreas e fígado; alterações na composição da carcaça; e na retenção de fósforo, cálcio e magnésio nos ossos. O sinergismo observado entre as enzimas estudadas sugere que o uso destas enzimas pode melhorar o aproveitamento das dietas para peixes carnívoros, aumentando a energia disponível, mas isto vai depender do balanceamento adequado da dieta em que são empregadas. As alterações das enzimas digestivas e histológicas observadas mostraram que as adições das enzimas exógenas avaliadas exerceram um papel importante na nutrição do cachara, no aumento do aproveitamento da proteína e dos carboidratos / Abstract: This work evaluated the exogenous enzymes amylase with endo-β-glucanase (AG) and phytase (Fi) in Barred sorubim (Pseudoplatystoma reticulatum) diets. Apparent nutrients digestibility assays were done with four different enzyme levels, in a 4x4 factorial scheme. This study showed that the enzymes addition changed the nutrients apparent digestibility coefficients and the minerals absorption. However, the alterations were dependents on the levels used, and there were interactions between the evaluated enzymes levels. After, a 70 days long performance assay was done, in which was evaluated the absence or presence of 150 mg of AG.kg-1; 2,500 UF.kg-1; 100 mg of AG.kg-1 + 1,500 UF.kg-1 enzymes in two diets (30 or 60% of animal-protein). In this experiment, fish performance and alterations in the endogenous production of the digestive enzymes; histologic changes in the gastrointestinal tract, pancreas, and liver; carcass composition changes; phosphorus, calcium, and magnesium retention in the bone were observed. The synergism observed among the enzymes evaluated suggests that its use can improve the diets profit to carnivore fishes, increasing the available energy, depending on the adequate balance in each diet though. The digestive and histologic enzymes alterations observed showed that the addition of the exogenous enzymes evaluated played an important role in the Barred sorubim nutrition, in the protein and carbohydrates profit improving / Orientador: Dalton José Carneiro / Coorientador: João Martins Pizauro Júnior / Banca: Wilson Massamitu Furuya / Banca: Antonio Carlos de Laurentiz / Banca: Elisabeth Criscuolo Urbinati / Banca: Marta Verardino De Stefani / Doutor

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29 / O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3º e 4º instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4º instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4º instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada. / Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-18Bitstream added on 2014-06-13T19:04:37Z : No. of bitstreams: 1 stech_mr_dr_jabo.pdf: 1806594 bytes, checksum: c5ec84ba98becc882b11fe47213ba597 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho foi avaliado o uso de enzimas exógenas: amilase com endo-β-glucanase (AG) e fitase (Fi) em dietas para cachara (Pseudoplatystoma reticulatum). Foram realizados ensaios de digestibilidade de nutrientes de dietas contendo quatro diferentes níveis destas enzimas, em esquema fatorial 4x4. Este estudo mostrou que a adição das enzimas alteraram os valores dos coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes e de absorção dos minerais. No entanto as alterações foram dependentes dos níveis utilizados, e houve interações entre os níveis das enzimas estudadas. Após, foi realizado um ensaio de desempenho com 70 dias de duração, no qual foi avaliado o efeito da ausência de enzimas ou adição de 150 mg de AG kg-1; 2.500 UF kg-1; 100 mg de AG kg-1 com 1.500 UF kg-1 em duas dietas (com 30 ou 60% da proteína de origem animal). Neste experimento, além do desempenho produtivo dos peixes, foram observadas alterações na produção endógena das enzimas digestivas; alterações histológicas do trato gastrintestinal, pâncreas e fígado; alterações na composição da carcaça; e na retenção de fósforo, cálcio e magnésio nos ossos. O sinergismo observado entre as enzimas estudadas sugere que o uso destas enzimas pode melhorar o aproveitamento das dietas para peixes carnívoros, aumentando a energia disponível, mas isto vai depender do balanceamento adequado da dieta em que são empregadas. As alterações das enzimas digestivas e histológicas observadas mostraram que as adições das enzimas exógenas avaliadas exerceram um papel importante na nutrição do cachara, no aumento do aproveitamento da proteína e dos carboidratos / This work evaluated the exogenous enzymes amylase with endo-β-glucanase (AG) and phytase (Fi) in Barred sorubim (Pseudoplatystoma reticulatum) diets. Apparent nutrients digestibility assays were done with four different enzyme levels, in a 4x4 factorial scheme. This study showed that the enzymes addition changed the nutrients apparent digestibility coefficients and the minerals absorption. However, the alterations were dependents on the levels used, and there were interactions between the evaluated enzymes levels. After, a 70 days long performance assay was done, in which was evaluated the absence or presence of 150 mg of AG.kg-1; 2,500 UF.kg-1; 100 mg of AG.kg-1 + 1,500 UF.kg-1 enzymes in two diets (30 or 60% of animal-protein). In this experiment, fish performance and alterations in the endogenous production of the digestive enzymes; histologic changes in the gastrointestinal tract, pancreas, and liver; carcass composition changes; phosphorus, calcium, and magnesium retention in the bone were observed. The synergism observed among the enzymes evaluated suggests that its use can improve the diets profit to carnivore fishes, increasing the available energy, depending on the adequate balance in each diet though. The digestive and histologic enzymes alterations observed showed that the addition of the exogenous enzymes evaluated played an important role in the Barred sorubim nutrition, in the protein and carbohydrates profit improving

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-03-16T15:01:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) CAROLINA KROPNICZKI GOUVEIA - DISSERTAÇÃO.pdf: 1168935 bytes, checksum: ec9fc0cb4665cb4641bd7162f5449c56 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-16T15:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) CAROLINA KROPNICZKI GOUVEIA - DISSERTAÇÃO.pdf: 1168935 bytes, checksum: ec9fc0cb4665cb4641bd7162f5449c56 (MD5) Previous issue date: 2012 / A produção de camarões marinhos na região Nordeste do Brasil vem crescendo principalmente pela introdução da espécie Litopenaeus vannamei. Adicionadas à dieta ou diretamente na água, as bactérias probióticas têm sido utilizadas para controle biológico e aumento da digestibilidade alimentar e do sistema imune dos animais, elevando a lucratividade dos empreendimentos dedicados à carcinicultura. A influência de enzimas exógenas de bactérias na digestão dos camarões não está bem elucidada e ainda existe uma grande lacuna no que diz respeito a aspectos nutricionais tanto dos microrganismos, quanto dos animais cultivados. Dessa forma, objetivou-se avaliar as atividades proteolítica e amilolítica de cepas bacterianas isoladas do hepatopâncreas e estômago do L. vannamei e identificar as bactérias produtoras destas enzimas pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. Para estudo do ambiente em tanques heterotróficos experimentais utilizando dois probióticos comerciais (HP1 e HP2) e em tanques controles heterotrófico (Het) e autotrófico (Aut), amostras de água foram tomadas ao final do experimento para contagem de bactérias heterotróficas, autotróficas e víbrios por plaqueamento em meios específicos. As médias de população bacteriana foram submetidas à análise de variância (ANOVA) complementada pelo teste de Tukey (p<0,05). Dos órgãos das amostras de camarão (n=3) foram retirados os materiais internos para isolamento das cepas bacterianas e seleção in vitro pela capacidade de produção de enzimas digestivas. Uma cepa de Bacillus subtilis (ATCC 6633) foi utilizada como testemunha na identificação utilizando os inicializadores universais para o domínio bactéria fD1 (Forward) e rD1 (Reverse). A população de bactérias heterotróficas foi mais representativa quando comparada às de autotróficas e víbrios, e o experimento Het atingiu a maior média (1,91x107 UFC/mL). As menores cargas de víbrios foram encontradas nos tanques experimentais HP1 e HP2 com médias de 2,46x104 e 2,00x104 UFC/mL, respectivamente. De 64 cepas isoladas, 11 possuíram índices enzimáticos satisfatórios (IE ≥ 2,0) para a produção de protease e amilase. Os amplicons após sequenciamento do DNA apresentaram tamanho maior que 1,4Kb e homologia com o GenBank e RDP, identificando bactérias como Bacillus subtilis e Shewanella algae. O incremento da população heterotrófica está relacionado à adição de melaço como fonte de carbono no sistema de cultivo e nos experimentos com os probióticos comerciais, a carga vibrionácea foi reduzida. A técnica de sequenciamento do gene 16S rRNA utilizando os primers fD1 e rD1 foi eficiente na caracterização bacteriana a nível de espécie e até subespécie, revelando a presença de bactérias com potencial para utilização como probiótico. / The marine shrimps cash crop in the Northeast region of Brazil is raising due to the introduction of Litopenaus vannamei. The probiotics bacteria added in the diet or directly in the water have been used for biological control and augmentations in the alimental digestibility and in the immune system, increasing the profits of enterprises related to carciniculture. The influence of bacterial exogenic enzymes on shrimp digestion is not clear and still has a gap concerning the nutrition aspects of shrimps and microorganisms. Therefore, this study had as objective the evaluations of proteolytic and amylolytic activities of bacterial strains isolated from hepatopancreas and stomach of L. vannamei and identify the bacteria responsible for enzymes production by sequencing the 16S rRNA gene. For environmental study in heterotrophic tanks using two commercial probiotics (HP1 e HP2) and in heterotrophic (Het) and autotrophic (Aut) control tanks, water samples were collected at the end of the experiment in order to count the autotrophic and heterotrophic bacteria and vibrio by plating in specific media. The means of bacterial population were submitted to variance analysis (ANOVA) and complemented by Tukey’s test (p<0.05). Internal materials were extracted from shrimp organs samples (n=3) in order to isolate the bacterial strains and “in vitro” selection due to its capacity to produce digestive enzymes. One strain of Bacillus subtilis (ATCC 6633) was used as witness on the identification using the universal primers fD1 (Forward) e rD1 (Reverse). The population of heterotrophic bacteria was more representative compared with autotrophic and vibrio population and the Het experiment presented the greatest mean (1,91x107 CFU.mL-1). The minor loads of vibrio were found in the experimental tanks HP1 and HP2 with means 2,46x104 e 2,00x104 CFU.mL-1 respectively. From sixty four strains, only eleven showed satisfactory enzymatic index (EI ≥ 2.0) to protease and amylase production. The amplicons after the DNA sequencing showed sizes bigger than 1,4Kb and homology with GenBank e RDP, identifying bacteria as Bacillus subtilis and Shewanella algae. The increment of heterotrophic population is related with the addition of molasses as carbon source in the crop system and the vibrio load were reduced in the experiments with commercial probiotics. The sequencing technique of 16S rRNA gene using fD1 and rD1 were efficient in the characterization of bacteria at the level of species and even at the level of subspecies, revealing the presence of bacteria with potential use as probiotic.

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-07-08T17:05:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Bernardo do Rego Belmonte_Mestrado.pdf: 1797925 bytes, checksum: 7816587bf6318d594398ab8d0d619d73 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T17:05:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Bernardo do Rego Belmonte_Mestrado.pdf: 1797925 bytes, checksum: 7816587bf6318d594398ab8d0d619d73 (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / FACEPE / Lectinas são proteínas que apresentam atividade inseticida, sendo capazes de interferir na alimentação, desenvolvimento, reprodução e sobrevivência de insetos. Sitophilus zeamais, conhecido como gorgulho-do-milho, destaca-se como uma das principais pragas de grãos armazenados no Brasil e causa danos aos grãos de milho, trigo, sorgo e arroz. Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão) é uma árvore, madeira de lei, amplamente distribuída no Brasil. O presente trabalho avaliou os efeitos deletérios de extratos e lectinas isoladas da entrecasca (MuBL) e do cerne (MuHL) de M. urundeuva sobre o gorgulho-do-milho. Para determinação da atividade inseticida, a amostra foi incorporada a discos de farinha de trigo que serviram como dieta para os insetos durante 7 dias. As faixas de concentração testadas foram: 4 a 20 mg do extrato da entrecasca por g de farinha de trigo, 14 a 70 mg/g (extrato do cerne), 0,6 a 3,0 mg/g (MuBL) e 1,4 a 7,0 mg/g (MuHL). Após o término do bioensaio, foi avaliada a taxa de mortalidade e os seguintes parâmetros nutricionais: índice de deterrência alimentar (IDA), taxa de consumo relativo (TCR), taxa de ganho relativo de biomassa (TGB) e eficiência na conversão do alimento ingerido (ECAI). Em seguida, foram realizados ensaios com o extrato da entrecasca, extrato do cerne, MuBL e MuHL em concentrações de 20 mg/g, 70 mg/g, 3 mg/g e 7 mg/g, respectivamente, e após 7 dias, extratos de intestino dos insetos foram obtidos e avaliados quanto às atividades de protease, celulases (endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase), fosfatases (ácida e alcalina) e α-amilase. As dietas contendo os extratos de entrecasca e do cerne não induziram mortalidade dos insetos em um período de 7 dias de experimento, bem como não exerceram efeito deterrente sobre os insetos. Contudo, ambos os extratos interferiram nos parâmetros nutricionais dos insetos. Em todos os tratamentos com os extratos houve redução da biomassa corporal, uma vez que os valores de TGB foram negativos. Os valores de ECAI também foram negativos, variando de -3% a -70%. Com relação à TCR, os valores não foram significativamente diferentes (p > 0,05) que no controle, corroborando com a ausência de efeito deterrente. A comparação entre as concentrações testadas e os valores obtidos para os parâmetros nutricionais revela que o extrato da casca foi mais efetivo que o extrato do cerne. MuBL não induziu mortalidade em 7 dias, mas afetou a incorporação da dieta pelos insetos, como evidenciado pelos valores negativos de TGB e ECAI. Os valores de TCR foram maiores que no grupo controle, indicando a ausência de efeito deterrente. MuHL apresentou efeito deterrente variando de 44,82% (fraca) a 89,65% (forte) de acordo com a concentração e afetou fortemente a nutrição dos insetos, com valores de ECAI chegando a -360%. Uma vez que todas as amostras testadas apresentaram efeitos antinutricionais, as atividades de enzimas digestivas em insetos do grupo controle e que ingeriram os extratos e as lectinas foram avaliadas. A ingestão do extrato da entrecasca não resultou em alteração significativa (p > 0,05) das atividades de protease, fosfatase ácida, fosfatase alcalina e β-glicosidase. Já as atividades de endoglucanase, exoglucanase e α-amilase foram maiores em relação ao controle. Os insetos que ingeriram o extrato do cerne apresentaram atividades de protease, endoglucanase, exoglucanase e α-amilase menores em comparação ao controle enquanto a atividade de fosfatase ácida foi maior. No tratamento com MuBL, as atividades de fosfatase ácida e α-amilase foram menores em relação ao controle. Por outro lado, as atividades de protease, endoglucanase e exoglucanase foram maiores. No tratamento com MuHL, as atividades de fosfatase alcalina, fosfatase ácida e exoglucanase foram menores em relação ao controle. Em conclusão, extratos e lectinas de entrecasca e cerne de M. urundeuva exerceram efeitos antinutricionais sobre adultos de S. zeamais, apresentando potencial para uso no controle dos danos causados por esse inseto-praga. / Lectins are proteins with insecticidal activity able to interfere with the feeding, development, reproduction and survival of insects. Sitophilus zeamais, known as maize weevil, stands out as one of the main stored grain pests in Brazil and causes damage to maize, wheat, sorghum and rice. Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão) is a hardwood tree broadly distributed in Brazil. The present work evaluated the deleterious effects of extracts and lectins isolated from the bark (MuBL) and heartwood (MuHL) of M. urundeuva against the maize weevil. For determination of insecticidal activity, the sample was incorporated into wheat flour disks that served as diet for the insects during 7 days. The concentration ranges tested were: 4–20 mg of bark extract per gram of wheat flour, 14–70 mg/g (heartwood extract), 0.6-3.0 mg/g (MuBL) and 1.4-7.0 mg/g (MuHL). After the end of bioassay, it was evaluated the mortality rate and the following nutritional parameters: feeding deterrence index (FDI), relative consumption rate (RCR), relative biomass gain rate (BGR) and efficiency in conversion of ingested food (ECIF). Next, it was performed assays with the bark extract, heartwood extract, MuBL and MuHL at concentrations of 20 mg/g, 70 mg/g, 3 mg/g and 7 mg/g, respectively, and after 7 days, extracts from insects gut were obtained and evaluated for the activities of protease, cellulases (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase), phosphatases (acid and alkaline) and α-amylase. The diets containing the bark and heartwood extracts did not induce mortality of the insects in a period of 7 days of assay as well as did not exert deterrent effect on the insects. However, both extracts interfered with the nutritional parameters of the insects. In all treatments with the extracts, there was a reduction of body biomass since the values of BGR were negative. The values of ECIF were also negative, ranging from -3% to -70%. Concerning RCR, the values were not significantly (p > 0.05) from control, corroborating the absence of deterrent effect. The comparison between the tested concentrations and the values obtained for the nutritional parameters reveal that the bark extract was more effective than the heartwood extract. MuBL did not induce mortality in 7 days but affected the incorporation of the diet by the insects, as evidenced by the negative values of BGR and ECIF. The RCR values were higher than in control group indicating the absence of deterrent effect. MuHL showed deterrent effect ranging from 44.82% (weak) to 89.65% (strong) according to the concentration and affected strongly the insect nutrition, with ECIF values reaching -360%. Since all the tested samples showed antinutritional effects, the activities of digestive enzymes from insects of control group and that ingested the extracts and lectins were evaluated. The ingestion of bark extract did not result in significant alteration (p > 0.05) of the activities of protease, acid and alkaline phosphatases and β-glucosidase. However, the activities of endoglucanase, exoglucanase and α-amylase were higher concerning control. The insects that ingested the heartwood extract showed protease, endoglucanase, exoglucanase and α-amylase activities lower than in control while the activity of acid phosphatase was higher. In treatment with MuBL, the acid phosphatase and α-amylase activities were lower than in control. On the other hand, the activities of protease, endoglucanase and exoglucanase were higher. In the treatment with MuHL, the activities of alkaline and acid phosphatases and of exoglucanase were lower than in control. In conclusion, the extracts and lectins from bark and heartwood of M. urundeuva exerted antinutritional effects on S. zeamais adults, showing potential for use in control of the damages caused by this insect pest.