Made available in DSpace on 2016-08-17T14:53:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simone Melo.pdf: 2880047 bytes, checksum: c872dc02c29d736c1cca896ec5a17ea2 (MD5) Previous issue date: 2007-05-02 / In this work, we develop a medical information system to support medical diagnosis based on an approach oriented to models, in which the system allows sharing of information between physically scattered specialists. The development of a medical information system is done using MDA (Model Drive Architecture) in which the PIM (Platform Independent Model) is created with UML (Unified Modeling Language), and the PSMs (Platform Specific Model) is done according to Web Services Platforms. To implement this system, we devised meta model s for the Web Services, JWSDP (Java Web Services Developement Pack) and WSOracle. Thus, we provide definitions of transformation of UML for the Web Services, JWSDP and WSOracle. The development of the system puts in evidence the process of transformation of PIM for PSM used in MDA. / Neste trabalho, desenvolvemos um sistema de informação médica de auxílio no diagnóstico médico, baseado em uma abordagem orientada a modelos, no qual o sistema permite o compartilhamento de informações entre especialistas fisicamente dispersos. O desenvolvimento do sistema de informação médica foi feito usando MDA (Arquitetura Dirigida a Modelo) em que o PIM (Modelo Independente da Plataforma) foi feito conforme a UML (Linguagem de Modelagem Unificada), e os PSMs (Modelos Específico da Plataforma) conforme as Plataformas dos Web Services. Para implementar este sistema de informação médica, provemos metamodelos para os Web Services, JWSDP (Java Web Services Developer Pack) e WSOracle. Assim, provemos definições de transformação de UML para os Web Services, JWSDP e WSOracle. O desenvolvimento do sistema coloca em evidência o processo de transformação de PIM para PSM, utilizado em MDA.

[ES] Las bacterias resistentes a múltiples antibióticos, como el Enterococo resistente a vancomicina (ERV), son un problema creciente en los pacientes hospitalizados, por lo que se necesita estrategias alternativas para combatir estos patógenos. Las infecciones causadas por ERV suelen comenzar con la colonización del tracto intestinal, un paso crucial que se afectado por la presencia de la microbiota. Sin embargo, los antibióticos alteran la microbiota y esto promueve la colonización de ERV. Una vez que el patógeno ha colonizado el intestino, alcanza niveles muy altos pudiendo diseminar a otros órganos y pacientes. A pesar de su importancia, se sabe muy poco sobre los genes que codifica para colonizar el intestino y sobre el mecanismo por el cual la microbiota suprime su colonización intestinal, siendo los dos objetivos principales. En primer lugar hemos utilizado una metodología previamente descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generación de una librería de mutantes por transposición junto a secuenciación masiva, con el fin de identificar los genes codificados por ERV necesarios para la colonización del intestino en ratones. Además, hemos realizado análisis metatranscriptómicos para identificar aquellos genes más expresados. El análisis ha identificado genes cuya interrupción reduce significativamente la colonización intestinal en el intestino grueso. Los genes que más afectaron a la colonización codifican proteínas relacionadas con la absorción o el transporte de diversos nutrientes como los carbohidratos (subunidad EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la familia LacI, ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa) o iones (proteína transportadora dependiente de ATP (ABC) y proteínas del grupo [Fe-S]). El papel de estos genes en la colonización se ha confirmado mediante experimentos de mutagénesis directa y de competición con la cepa salvaje. Además, estos genes afectan a la colonización intestinal con diferentes antibióticos (clindamicina y vancomicina). Para identificar el mecanismo molecular por el cual cada gen afecta a la colonización, hemos realizado experimentos in vitro y ex vivo además del análisis transcriptómico. Los experimentos in vitro confirman que las proteínas del grupo [Fe-S] están involucradas en el transporte iones de hierro, principalmente Fe3+. Por otra parte, los genes de la subunidad EIIAB del transportador de manosa y del ácido N-acetilmurámico 6-fosfato eterasa son necesarios para la utilización de la manosa y el ácido N-acetilmurámico, respectivamente, azúcares que suelen estar presentes en el intestino. También confirmamos que el regulador transcripcional de la familia LacI es un represor que afecta a proteínas transportadoras ABC, probablemente implicadas en la absorción de carbohidratos. Además, algunos de estos genes están codificados principalmente por cepas clínicas de E. faecium y en menor medida por cepas comensales. En segundo lugar, estudiamos los mecanismos de protección de un consorcio de cinco bacterias comensales, que anteriormente se había demostrado que disminuían la colonización intestinal por ERV en ratones. Mediante transcriptómica, metabolómica y los ensayos in vivo observamos que el consorcio bacteriano inhibe el crecimiento de ERV mediante la reducción de nutrientes, concretamente fructosa. Por último, el análisis ARN-Seq in vivo de cada aislado en combinación con los ensayos ex vivo e in vivo demostraron que una sola bacteria (Olsenella sp.) proporciona protección. En conjunto, los resultados obtenidos han identificado la función de genes específicos requeridos por ERV para colonizar el intestino. Además, hemos identificado un mecanismo mediante el cual la microbiota confiere protección. Estos resultados podrían conducir a nuevos enfoques terapéuticos para prevenir las infecciones causadas por este patógeno multiresistente a los antibióticos. / [CA] Els bacteris resistents a múltiples antibiòtics, com el Enterococo resistent a vancomicina (ERV), són un problema creixent en els pacients hospitalitzats, que són resistents a la majoria d'antibiòtics disponibles per la qual cosa es necessita estratègies alternatives per a combatre aquests patògens. Les infeccions causades per ERV solen començar amb la colonització del tracte intestinal, un pas crucial que es veu afectat per la presència de la microbiota. No obstant això, els antibiòtics alteren la microbiota i això promou la colonització de ERV. Una vegada que el patogen ha colonitzat l'intestí, aconsegueix nivells molt alts podent disseminar a altres òrgans i pacients. Malgrat la seua importància, se sap molt poc sobre els gens que codifica ERV per a colonitzar l'intestí i sobre el mecanisme pel qual la microbiota suprimeix la seua colonització intestinal. En primer lloc hem utilitzat una metodologia prèviament descrita (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), basada en la generació d'una llibreria de mutants per transposició junt amb seqüenciació massiva, amb la finalitat d'identificar els gens codificats per ERV necessaris per a la colonització de l'intestí en ratolins. A més a més, hem realitzat anàlisi metatranscriptòmics per a identificar aquells gens més expressats. L'anàlisi ha identificat gens quina interrupció redueix significativament la colonització intestinal en l'intestí gros. Els gens que més van afectar la colonització codifiquen proteïnes relacionades amb l'absorció o el transport de diversos nutrients com els carbohidrats (subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa, el regulador transcripcional de la família LacI, àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa) o ions (proteïna transportadora dependent d'ATP (ABC) i proteïnes del grup [Fe-S]). El paper d'aquests gens en la colonització s'ha confirmat mitjançant experiments de mutagènesis directa i de competició amb el cep salvatge. A més, aquests gens afecten la colonització intestinal amb diferents antibiòtics (clindamicina i vancomicina). Per a identificar el mecanisme molecular pel qual cada gen afecta a la colonització, hem realitzat experiments in vitro i ex viu a més de l'anàlisi transcriptòmic. Els experiments in vitro confirmen que les proteïnes del grup [Fe-S] estan involucrades en el transport d'ions de ferro, principalment Fe3+. D'altra banda, els gens de la subunitat EIIAB del transportador PTS de manosa i de l'àcid N-acetilmuràmic 6-fosfat eterasa són necessaris per a la utilització de la manosa i l'àcid N-acetilmuràmic, respectivament, sucres que solen estar presents en l'intestí. També confirmem que el regulador transcripcional de la família LacI és un repressor que afecta proteïnes transportadores ABC, probablement implicades en l'absorció de carbohidrats. A més a més, alguns d'aquests gens estan codificats principalment per ceps clínics de E. faecium i en menor mesura per ceps comensals. En segon lloc, estudiem els mecanismes de protecció d'un consorci de cinc bacteris comensals, que adès s'havia demostrat que disminuïen la colonització intestinal per ERV en ratolins. Amb l'ús de transcriptòmica, metabolòmica i els assajos in vivo observem que el consorci bacterià inhibeix el creixement de ERV mitjançant la reducció de nutrients, concretament fructosa. Finalment, l'anàlisi ARN-Seq in vivo de cada aïllat en combinació amb els assajos ex viu i in vivo van demostrar que un sol bacteri (Olsenella sp.) proporciona protecció. En conjunt, els resultats obtinguts han identificat la funció de gens específics requerits per ERV per a colonitzar l'intestí. A més, hem identificat un mecanisme mitjançant el qual la microbiota confereix protecció. Aquests resultats podrien conduir a nous enfocaments terapèutics per a previndre les infeccions causades per aquest patogen multiresistent als antibiòtics. / [EN] Multidrug-resistant bacteria, such as vancomycin-resistant-Enterococcus (VRE), are an increasing problem in hospitalized patients. Some VRE strains can be resistant to most available antibiotics, thus, alternative strategies to antibiotics are urgently needed to combat these challenging pathogens. Infections caused by VRE frequently start by colonization of the intestinal tract, a crucial step that is impaired by the presence of the intestinal microbiota. Administration of antibiotics disrupts the microbiota, which promotes VRE intestinal colonization. Once VRE has colonized the gut, it reaches very high levels, which promotes its dissemination to other organs and its transfer to other patients. Despite the relevance of VRE gut colonization, very little is known about the genes encoded by this pathogen to colonize the gut and about the mechanisms by which the microbiota suppresses VRE gut colonization. In this thesis, we have utilized a previously described methodology (Zhang et al., 2017, BMC Genomics), based on the generation of a transposon mutant library coupled with high-throughput sequencing, in order to identify VRE encoded genes required for colonization of the mouse intestinal tract. In addition, we have performed metatranscriptomic analysis in mice to identify VRE genes specifically expressed in the gut. Our analysis has identified genes whose disruption significantly reduces VRE gut colonization in the large intestine. The genes that most affected VRE gut colonization encoded for proteins related to the uptake or transport of diverse nutrients such as carbohydrates (PTS mannose transporter subunit EIIAB, LacI family DNA-binding transcriptional regulator, N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase) or ions (phosphate ABC transporter ATP-binding protein and proteins from [Fe-S] cluster). The role of these genes in gut colonization has been confirmed through targeted mutagenesis and competition experiments against a wild type strain. Moreover, these genes affect gut colonization under different antibiotic treatments (clindamycin and vancomycin). To elucidate the mechanism by which each gene influences gut colonization, we have performed in vitro and ex vivo experiments besides transcriptomic analysis. In vitro experiments confirm that proteins from [Fe-S] cluster are involved in the transport of different forms of iron ions, mostly Fe3+. On the other hand, the PTS mannose transporter subunit EIIAB and N-acetylmuramic acid 6-phosphate etherase genes are required for the utilization of mannose and N-acetyl-muramic acid, respectively, sugars that are usually present in the intestinal environment. We have also confirmed that LacI family DNA-binding transcriptional regulator is a repressor that affects the expression of genes encoding for an ABC transporter probably involved in the uptake of carbohydrates. Furthermore, we have confirmed that some of these genes are encoded mainly by E. faecium clinical strains but not or to a lower extent by commensal strains. Secondly, we studied the mechanisms of protection of a consortium of five commensals bacteria, previously shown to restrict VRE gut colonization in mice. Functional transcriptomics in combination with targeted metabolomics and in vivo assays performed in this thesis indicated that the bacterial consortium inhibits VRE growth through nutrient depletion, specifically by reducing the levels of fructose. Finally, in vivo RNA-Seq analysis of each bacterial isolate of the consortium in combination with ex vivo and in vivo assays demonstrated that a single bacterium (Olsenella sp.) could recapitulate the protective effect. Altogether, the results obtained have identified the function of specific genes required by VRE to colonize the gut. In addition, we have identified a specific mechanism by which the microbiota confers protection against VRE colonization. These results could lead to novel therapeutic approaches to prevent infections caused by this pathogen. / Flor Duro, A. (2021). Characterization of Genes and Functions Required by Multidrug-resistant Enterococci to Colonize the Intestine [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/166494 / TESIS

Tesis por compendio / [ES] Enmarcada en la línea de investigación de nuestro laboratorio sobre señalización por nitrógeno principalmente en la cianobacteria Synechococcus elongatus PCC7942, con esfuerzos centrados en las proteínas PII y PipX y su red de señalización, esta Tesis amplía el espectro de moléculas investigadas en relación con dicha red. Estudia y caracteriza el miembro no canónico de la superfamilia de la proteína PII denominado CutA, generalmente anotado como de protección frente a metales divalentes, altamente conservado en todos los dominios de la vida (incluidos animales y el ser humano). En ella examinamos la posible protección frente a metales provista por CutA en dos bacterias muy distantes, Escherichia coli y Synechococcus elongatus, usando knockouts para ambas del gen que codifica para CutA. Ni los estudios de complementación en E. coli del gen silvestre ni los observacionales de sensibilidad a metales en S. elongatus han dado soporte a la función anotada para CutA, a pesar de que demostramos mediante seguimiento turbidimétrico que el Cu2+ hace agregar a la proteína CutA pura de S. elongatus (producida recombinantemente) y por tanto se une a ella, aunque con una afinidad baja por comparación con las concentraciones tóxicas de este metal para dicha cianobacteria. Buscando profundizar en el conocimiento de CutA, hemos determinado a muy alta resolución mediante difracción de rayos X la estructura de esta proteína de S. elongatus, sin evidenciar complejo alguno con cobre, pero demostrando que los tres bolsillos intersubunidades en el homotrímero de CutA son capaces de transportar moléculas orgánicas (en nuestro caso Bis-Tris). Estos resultados apoyan una posible función de CutA basada en la unión a estos bolsillos de biomoléculas neutras o positivamente cargadas y capaces de formar varios puentes de hidrógeno con las paredes de potencial negativo y fuerte carácter polar de estos bolsillos. También hemos estudiado la proteína PipY de S. elongatus, identificada recientemente como pareja funcional de la antes mencionada PipX, determinando sus propiedades espectroscópicas, unión de piridoxal fosfato (PLP) y resolviendo su estructura mediante difracción de rayos X. Probamos que PipY es monomérica y que tiene PLP unido. Su estructura no apoya que sea un enzima, siendo aparentemente apropiada para ejercer una posible función en la homeostasis de PLP. Dado que muy recientemente se ha descrito una epilepsia genética humana dependiente de vitamina B6 debida a mutaciones en el gen humano ortólogo de pipY, PROSC (ahora llamado PLPBP; codifica la proteína PLPHP), usamos inicialmente PipY de S. elongatus y luego PROSC humana como banco de pruebas de la patogenicidad de las mutaciones que se han asociado a esta epilepsia, utilizando para ello mutagénesis dirigida y producción de las formas silvestre y mutantes de estas proteínas, comparando sus propiedades. Estos estudios han demostrado la patogenicidad y establecido mecanismos para la misma para cada una de las mutaciones de cambio de sentido de PROSC descritas hasta ahora en esta epilepsia. Nuestros estudios han representado un importante avance en la comprensión de las proteínas de tipo PipY y de la epilepsia asociada a la forma humana de las mismas. / [CA] Emmarcada en la línia d'investigació del nostre laboratori de senyalització per nitrogen principalment en el cianobacteri Synechococcus elongatus PCC7942, amb esforços centrats en les proteïnes PII i PipX i la seua xarxa de senyalització, esta Tesi amplia l'espectre de molècules investigades en relació amb la dita xarxa. Estudia i caracteritza el membre no canònic de la superfamília de la proteïna PII denominat CutA, generalment anotat com de protecció a metalls divalents, altament conservat en tots els dominis de la vida (inclosos animals i l'ésser humà). En ella examinem la possible protecció front a metalls proveïda per CutaA en dos bacteris molt distants, Escherichia coli i Synechococcus elongatus, usant knockouts del gen que codifica CutA per a ambdues. Ni els estudis de complementació en E. coli del gen silvestre ni els observacionals de sensibilitat a metalls en S. elongatus han donat suport a la funció anotada per CutA, tot i que vam demostrar mitjançant seguiment turbidimétric que el Cu2 + fa agregar a la proteïna CutA pura de S. elongatus (produïda de forma recombinant) i per tant s'uneix a ella, encara que amb una afinitat baixa per comparació amb les concentracions tòxiques d'aquest metall per a aquest cianobacteri. Buscant aprofundir en el coneixement de CutA, hem determinat a molt alta resolució mitjançant difracció de raigs X l'estructura d'aquesta proteïna de S. elongatus, sense evidenciar cap complex amb coure, però demostrant que les tres cavitats formades entre les subunitats del homotrimer de CutA són capaços de transportar molècules orgàniques (en el nostre cas Bis-Tris). Aquests resultats donen suport a una possible funció de CutA basada en la unió a aquestes cavitats de biomolècules neutres o positivament carregades i capaços de formar diversos ponts d'hidrogen amb les parets de potencial negatiu i fort caràcter polar d'aquestes cavitats. També hem estudiat la proteïna PipY de S. elongatus, identificada recentment com a parella funcional de l'abans esmentada PipX, determinant les seves propietats espectroscòpiques, unió de piridoxal fosfat (PLP) i resolent la seva estructura mitjançant difracció de raigs X. Vam provar que PipY és monomèrica i que té PLP unit. La seva estructura no recolza que sigui un enzim, sent aparentment apropiada per a exercir una possible funció en l'homeòstasi de PLP. Atès que molt recentment s'ha descrit una epilèpsia genètica humana dependent de vitamina B6 deguda a mutacions en el gen humà ortòleg de pipY, PROSC (ara anomenat PLPBP; codifica la proteïna PLPHP), fem servir inicialment PipY de S. elongatus i després PROSC humana com banc de proves de la patogenicitat de les mutacions que s'han associat a aquesta epilèpsia, utilitzant mutagènesi dirigida i produint les formes silvestre i mutants d'aquestes proteïnes, comparant les seves propietats. Aquests estudis han demostrat la patogenicitat i establert mecanismes per a la mateixa per a cadascuna de les mutacions de canvi de sentit de PROSC descrites fins ara en aquesta epilèpsia. Els nostres estudis han representat un important avanç en la comprensió de les proteïnes de tipus PipY i de l'epilèpsia associada a la forma humana de les mateixes. / [EN] In the context of research of our laboratory on nitrogen signaling mainly in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC7942, with efforts focused on the PII and PipX proteins and their signaling network, this Thesis extends the spectrum of molecules investigated in relation to such network. It studies and characterizes the non-canonical member of the PII protein superfamily named CutA, a highly conserved protein in all domains of life (including animals and humans) which is generally annotated as protecting against divalent metals. We examine the possible protection provided by CutA against metals, using knockouts for the CutA-encoding gene of two phylogenetically distant bacteria, Escherichia coli and Synechococcus elongatus PCC7942. Neither complementation studies in E. coli by the wild-type gene, nor observational studies of sensitivity to metals in the S. elongatus knockout have supported the function annotated for CutA, although we show by turbidimetric monitoring that Cu2+ causes aggregation of pure S. elongatus CutA (produced recombinantly) and therefore binds to it, although with a low affinity by comparison with the concentrations of this metal that are toxic for this cyanobacterium. Aiming at getting further insight into CutA, we have determined at very high resolution, by X-ray diffraction, the structure of this protein of S. elongatus, failing to observe Cu2+ bound in this structure, but showing that the three pockets formed at intersubunit boundaries in the CutA homotrimer are capable of transporting organic molecules (in our case Bis-Tris) without inducing conformational changes in the protein. This finding supports a possible function of CutA based on the binding to these pockets of neutral or positively charged biomolecules capable of forming several hydrogen bonds with the pocket walls, which are endowed with negative potential and have a strong polar character. We have also studied the PipY protein of S. elongatus, recently identified as a functional partner of the aforementioned PipX, determining its spectroscopic properties, binding of pyridoxal phosphate (PLP) and solving its structure by X-ray diffraction. We prove that PipY is monomeric and has PLP attached. Its structure does not favor an enzymatic role of PipY, being more appropriate for exerting a possible function in the homeostasis of PLP. Given the very recent description of a human vitamin B6-dependent genetic epilepsy associated to mutations in the human orthologue of the pipY gene, PROSC (now called PLPBP, encoding the PROSC protein, now named PLPHP), we used first S. elongatus PipY and afterwards and more extensively human PROSC to test by site-directed mutagenesis the pathogenicity of the mutations that have been associated with this epilepsy. These studies have demonstrated the pathogenicity and established mechanisms for this pathogenicity for each of the missense mutations reported thus far in patients with PROSC-associated epilepsy. Our studies represent an important advance in the understanding of PipY-like proteins and of epilepsy associated with the human form thereof. / Para la realización de esta Tesis, Lorena Tremiño Agulló ha disfrutado de una Beca de Formación de Personal Investigador (FPI) (BES-2012-058304) otorgado por el Ministerio de Economía, Industria y Competitividad. El trabajo se ha llevado a cabo en el grupo 739 del CIBERER-Instituto de Salud Carlos III (IP, V. Rubio) y se ha enmarcado dentro de los proyectos: -“Luz estructural sobre señalización y regulación por nitrógeno y sobre biosíntesis de arginina/urea, sus errores congénitos, y su conexión con biología del envejecimiento”, (BFU2011-30407) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal,V. Rubio). -“Una mirada molecular al control de la detoxificación de amonio y a sus patologías y errores congénitos, y a la señalización por amonio. En busca del papel de la proteína CutA”, (BFU2014-58229) del Ministerio de Economía y Competitividad del Gobierno de España (Investigador principal, V. Rubio). -"BioMeder. Genes, proteínas y rutas de señalización en enfermedades raras" (PrometeoII/2014/029) de la Conselleria d'Educació de la Generalitat Valenciana (investigadores, P. Sanz, A. Marina y V. Rubio). / Tremiño Agulló, L. (2019). Bases estructurales de la señalización y regulación por nitrógeno y procesos asociados [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/117999 / TESIS / Compendio

A via de Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é responsável pelo reparo das lesões causadas pela luz ultravioleta (UV) e de outras lesões capazes de distorcer a dupla hélice, bloqueando a replicação e a transcrição. Os pacientes que apresentam as síndromes recessivas raras Xeroderma Pigmentosum (XP), tricotiodistrofia (TTD) e síndrome de Cockayne (CS) possuem mutações em algum dos 11 genes relacionados ao NER e à transcrição basal. Mutações na proteína XPD levam ao surgimento de diferentes fenótipos: XP, TTD, XP/CS ou COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), uma forma rara de CS. Os pacientes XP apresentam alta incidência de câncer de pele, o que não ocorre com os pacientes TTD e CS, além de poderem apresentar perda neuronal progressiva, enquanto todos os CS e TTD apresentam uma diminuição na mielinização do cérebro. As neuropatologias são provavelmente associadas a problemas no reparo de danos endógenos no DNA das células nervosas. Diversos trabalhos mostraram o envolvimento do NER no reparo desses danos, os quais pensava-se serem reparados apenas por outro mecanismo, o Reparo por Excisão de Base. Neste trabalho mostramos que fibroblastos de pacientes XP-D, XP-D/CS e TTD, portadores de mutações em XPD, são sensíveis ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com azul de metileno fotoativado, apresentando bloqueio prolongado no ciclo celular e permanência da sinalização de danos ao DNA. A complementação das diferentes linhagens com o gene XPD/ERCC2 foi capaz de restaurar a sobrevivência celular. Foram detectadas diferenças importantes na capacidade de reparo/retomada da transcrição após danos gerados por estresse oxidativo em DNA plasmidial, além da ativação de vias diferentes de morte celular: fibroblastos XP-D apresentam maior capacidade de reparo e apresentam morte por apoptose após estresse oxidativo, enquanto os fibroblastos XP-D/CS e TTD apresentam menor capacidade de reparo ativação de mais de uma via de morte celular (apoptose e necrose), diferenças que podem estar ligadas ao fenótipo dos pacientes. Mutações no gene codificante para a DNA polimerase n, POLH, estão associadas à forma variante de XP (XP-V). Pol n é uma polimerase especializada na síntese translesão (TLS) de fotoprodutos, além de estar implicada na TLS de outros tipos de lesões como bases oxidadas, e em vias não relacionadas à TLS como a hipermutação somática e à replicação de regiões de DNA com arquiteturas não-canônicas. Neste trabalho mostramos que os fibroblastos de pacientes XP-V apresentam sensibilidade ao estresse oxidativo. Mostramos uma indução da proteína pol n em fibroblastos primários após danos genotóxicos, associada ao aumento da capacidade de lidar com a parada na forquilha de replicação, possibilitando a continuidade da replicação do DNA e ao aumento da sobrevivência celular. Mostramos uma diferença na estabilidade genômica nos genes das imunoglobulinas dos pacientes XP-V idosos em comparação com os pacientes jovens e controles de idade pareada, mostrando que a ausência dessa polimerase pode estar ligada ao aumento da instabilidade genômica nesses genes / The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is responsible for the repair of UV photoproducts and other bulky lesions that block both replication and transcription. Patients with the rare recessive disorders Xeroderma Pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne Syndrome (CS) carry mutations in one of the 11 NER genes, linked to repair and basal transcription. Mutations in XPD lead to different phenotypes: XP, TTD, XP/CS or COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), a rare form of CS. XP patients have high incidence of skin cancer, which does not occur in TTD or CS patients, although ther may present neurodegeneration, while all CS and TTD patients have neurodevelopmental symptoms linked to dysmielynation. The pathology of these neurological diseases is probably associated with deficient repair of DNA lesions in nervous cells, generated by endogenous processes. Many groups including ours have demonstrated the involvement of NER in the repair of these lesions, previously thought to be exclusively repaired by Base Excision Repair. In this work we show high sensitivity of both primary and transformed XP-D, XP-D/CS and TTD human fibroblasts in response to oxidative stress generated by photoactivated methylene blue, with prolonged cell cycle arrest and DNA damage signaling. The complementation of the three different cell lines with the XPD/ERCC2 gene was able to restore cell survival. We detected important differences in repair capacity/transcription resumption after damage generated by oxidative stress in plasmid DNA, besides the activation of different cell death pathways: XP-D cells have higher repair capacity and die by apoptosis, while XP-D/CS and TTD cells have little repair capacity and activate more than one death pathway (apoptosis and necrosis). We believe these differences can be related to the patients\' phenotypes. Mutations in DNA polymerase n coding gene, POLH, are associated with the variant form of XP (XP-V). Pol n is a translesion synthesis (TLS) polymerase specialized in the TLS past CPD photoproducts, besides other lesions like oxidized bases, and in other processes like somatic hypermutation and DNA replication in structured regions. In this work we show XP-V human fibroblasts are sensitive to oxidative stress. We detected an induction of pol n after genotoxic stress in primary cells, associated with increased ability to deal with the stalled replication fork, and consequently to DNA replication restart and cell survival. In addition, we detected a difference in genomic stability in immunoglobulin genes in aged XP-V patients in comparison to both young patients and age-matched controls, showing the absence of this polymerase may be linked to increased genomic instability in these genes

Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas α-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da α-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da α-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As α-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da α-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The α-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri α-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the α-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic α-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced α-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of α-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.

Mapeamento dos subsítios de α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. Citri envolvidos na interação com o substrato A família das enzimas α-amilases é um modelo experimental interessante para o estudo das interações entre os aminoácidos e seus ligantes, já que estas enzimas apresentam especificidade variável, são frequentemente alvos de estudos por mutagênese e há estruturas cristalinas disponíveis para alguns membros da família. A proposta deste trabalho foi o mapear subsítios da α-amilase de Xanthomonas axonopodis pv. citri (AXA) envolvidos na interação com substratos, através de comparações estruturais, mutagêneses sítio-dirigidas, análises de parâmetros cinéticos sobre amido e do padrão de clivagem sobre p-nitrofenil malto-oligossacarideos (PNPG7, PNPG5, PNPG4). Foi criado um modelo estrutural para AXA a partir da estrutura tridimensional da α-amilase de Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). O modelo de AXA foi sobreposto na estrutura da α-amilase pancreática de porco (Qian et al., 1994) e 11 resíduos foram selecionados e mutados para alanina. As α-amilases recombinantes mutantes e selvagem foram secretadas pela levedura Pichia pastoris GS115, apresentando uma massa molecular aparente de 45 kDa. Todos os mutantes analisados reduziram em maior ou menor grau a atividade catalítica da enzima sobre amido e p-nitrofenil maltooligossacarideos. Mutações dos resíduos H88, F136, D196, E223, D295 e N299, deletaram a atividade enzimática, indicando que suas cadeias laterais são essenciais para o desempenho catalítico da enzima. As análises cinéticas e estruturais sugerem fortemente que D196, E223 e D295 são os resíduos catalíticos. Substituições das cadeias laterais de C157, H200, G227, T230 e H294 reduziram a eficiência catalítica (kcat/Km) da α-amilase sobre o substrato amido para, respectivamente, 28%, 41%, 84%, 81% e 51%. As mutações em G227 e T230 foram menos importantes para a atividade da enzima e afinidade pelo amido, entretanto, estes resíduos mostraram-se importantes para a estabilização de complexos com substratos curtos (pNPG4). Os resultados indicam que o sítio ativo de AXA é formado por, no mínimo, seis subsítios. As interações dos anéis de glicose com os subsítios +2 e -2 são favorecidas em relação às interações nos subsítios -3 e +3, respectivamente, e a interação do anel de glicose no subsítio -3 é favorecida em relação à interação no subsítio +3. A enzima selvagem diva preferencialmente a terceira ligação glicosídica de p-nitrofenil maltooligossacarideos. Como produtos de hidrólise a enzima libera maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose e glicose. / The α-amylase family is an interesting group for structure/function relationship investigation, as this family exhibits a variable deavage patterm, several crystal structures are available, and its members were studied by mutagenesis. The aim of this study was the mapping of Xanthomonas axonopodis pv. Citri α-amylase (AXA) subsites involved in substrate binding, using structural comparison, site-directed mutagenesis and lcinetics analyses. A structural model for AXA was created from the three-dimensional structure of the α-amylase from Alteromonas haloplanctis (Aghajari et al., 1998). This model was superimposed on the structure ofthe pig pancreatic α-amylase, PPA (Qian et. al., 1994), and 11 residues were selected and changed to alanine. Wild type and mutant AXA were secreted by Pichia pastoris strain GS115 cells and showed apparent molecular mass of 45 kDa. All mutants have reduced α-amylase activity on starch and 4-nitrophenyl maltooligosaccharides (pNPG7, PNPG5 and PNPG4) at different levels. Mutation of residues H88, F136, D196, E223, D295 and N299 indicate their essential role by complete loss of activity. Kinetic and structural analyses strongly suggested that D196, E223 and D295 are the catalytic residues. The substitution of the side chain of C157, H200, G227, T230 and H294 reduced the catalytic efficiency (kcat/Km) of α-amylase on starch to respectively 28%, 41%, 84%, 81% and 51%. Although G227 and T230 were not much important for activity and binding on starch, these residues were important for stabilization of complexes with short substrates (PNPG4). The results indicate that AXA\'s active site is composed of at least six sugar binding subsites. The binding of the glucoses at subsites +2 and -2 are favored against binding at subsites -3 and +3, respectively. The binding of glucose at subsite -3 is favored against binding at subsite +3. The wild type enzyme primarily hydrolyzes the third glucosidic bond in PNPG7, PNPG5 and PNPG4 and the products of hydrolysis were maltopentaose, maltotetraose, maltotriose, maltose and glucose.

Made available in DSpace on 2014-07-29T14:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 wilane_mestrado.pdf: 4461079 bytes, checksum: da62fa9aebf506f095f41942a579aecc (MD5) Previous issue date: 2010-04-16 / Building and maintaining a Graphical User Interface (GUI) for Enterprise Information Systems usually requires much Software Engineering staff time and effort. This paper describes a model-driven approach to create dynamically and manage these GUIs. In this approach, the Software Engineer designs conceptual models of the information system using object-oriented meta-models. A set of predefined mapping rules is applied to automatically transform and refine the conceptual models in order to generate, in runtime, the look and feel of the GUI, without source code creation. This improves the software usability, assuring consistency and homogeneity of the GUI, increases the productivity of the software engineering staff and simplifies maintenance. In our experiments we have observed an average productivity fifteen times higher than traditional methods of GUI development. / Construir e manter uma Interface Gráfica com Usuário (GUI) para Sistemas de Informação (SI) demanda muito tempo e esforço da equipe de Engenharia de Software. Esta dissertação descreve uma abordagem dirigida por modelos para criar dinamicamente e gerenciar essas interfaces. Nessa abordagem, o Engenheiro de Software projeta um modelo conceitual do sistema de informação usando um meta-modelo orientado a objetos. Um conjunto de regras de mapeamento predefinidas é aplicado para refinar e transformar o modelo conceitual do SI, gerando, em tempo de execução, a sua interface gráfica, com aparência e comportamentos específicos. Esse mecanismo melhora a usabilidade do software, assegurando consistência e homogeneidade das GUIs, aumenta a produtividade da equipe de Engenharia de Software e simplifica a manutenção do SI. Nos experimentos realizados foi observada uma média de produtividade quinze vezes maior do que os métodos tradicionais no desenvolvimento de GUIs.

A via de Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é responsável pelo reparo das lesões causadas pela luz ultravioleta (UV) e de outras lesões capazes de distorcer a dupla hélice, bloqueando a replicação e a transcrição. Os pacientes que apresentam as síndromes recessivas raras Xeroderma Pigmentosum (XP), tricotiodistrofia (TTD) e síndrome de Cockayne (CS) possuem mutações em algum dos 11 genes relacionados ao NER e à transcrição basal. Mutações na proteína XPD levam ao surgimento de diferentes fenótipos: XP, TTD, XP/CS ou COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), uma forma rara de CS. Os pacientes XP apresentam alta incidência de câncer de pele, o que não ocorre com os pacientes TTD e CS, além de poderem apresentar perda neuronal progressiva, enquanto todos os CS e TTD apresentam uma diminuição na mielinização do cérebro. As neuropatologias são provavelmente associadas a problemas no reparo de danos endógenos no DNA das células nervosas. Diversos trabalhos mostraram o envolvimento do NER no reparo desses danos, os quais pensava-se serem reparados apenas por outro mecanismo, o Reparo por Excisão de Base. Neste trabalho mostramos que fibroblastos de pacientes XP-D, XP-D/CS e TTD, portadores de mutações em XPD, são sensíveis ao estresse oxidativo induzido pelo tratamento com azul de metileno fotoativado, apresentando bloqueio prolongado no ciclo celular e permanência da sinalização de danos ao DNA. A complementação das diferentes linhagens com o gene XPD/ERCC2 foi capaz de restaurar a sobrevivência celular. Foram detectadas diferenças importantes na capacidade de reparo/retomada da transcrição após danos gerados por estresse oxidativo em DNA plasmidial, além da ativação de vias diferentes de morte celular: fibroblastos XP-D apresentam maior capacidade de reparo e apresentam morte por apoptose após estresse oxidativo, enquanto os fibroblastos XP-D/CS e TTD apresentam menor capacidade de reparo ativação de mais de uma via de morte celular (apoptose e necrose), diferenças que podem estar ligadas ao fenótipo dos pacientes. Mutações no gene codificante para a DNA polimerase n, POLH, estão associadas à forma variante de XP (XP-V). Pol n é uma polimerase especializada na síntese translesão (TLS) de fotoprodutos, além de estar implicada na TLS de outros tipos de lesões como bases oxidadas, e em vias não relacionadas à TLS como a hipermutação somática e à replicação de regiões de DNA com arquiteturas não-canônicas. Neste trabalho mostramos que os fibroblastos de pacientes XP-V apresentam sensibilidade ao estresse oxidativo. Mostramos uma indução da proteína pol n em fibroblastos primários após danos genotóxicos, associada ao aumento da capacidade de lidar com a parada na forquilha de replicação, possibilitando a continuidade da replicação do DNA e ao aumento da sobrevivência celular. Mostramos uma diferença na estabilidade genômica nos genes das imunoglobulinas dos pacientes XP-V idosos em comparação com os pacientes jovens e controles de idade pareada, mostrando que a ausência dessa polimerase pode estar ligada ao aumento da instabilidade genômica nesses genes / The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is responsible for the repair of UV photoproducts and other bulky lesions that block both replication and transcription. Patients with the rare recessive disorders Xeroderma Pigmentosum (XP), trichothiodystrophy (TTD) and Cockayne Syndrome (CS) carry mutations in one of the 11 NER genes, linked to repair and basal transcription. Mutations in XPD lead to different phenotypes: XP, TTD, XP/CS or COFS (Cerebro-Oculo-Facio-Skeletal Syndrome), a rare form of CS. XP patients have high incidence of skin cancer, which does not occur in TTD or CS patients, although ther may present neurodegeneration, while all CS and TTD patients have neurodevelopmental symptoms linked to dysmielynation. The pathology of these neurological diseases is probably associated with deficient repair of DNA lesions in nervous cells, generated by endogenous processes. Many groups including ours have demonstrated the involvement of NER in the repair of these lesions, previously thought to be exclusively repaired by Base Excision Repair. In this work we show high sensitivity of both primary and transformed XP-D, XP-D/CS and TTD human fibroblasts in response to oxidative stress generated by photoactivated methylene blue, with prolonged cell cycle arrest and DNA damage signaling. The complementation of the three different cell lines with the XPD/ERCC2 gene was able to restore cell survival. We detected important differences in repair capacity/transcription resumption after damage generated by oxidative stress in plasmid DNA, besides the activation of different cell death pathways: XP-D cells have higher repair capacity and die by apoptosis, while XP-D/CS and TTD cells have little repair capacity and activate more than one death pathway (apoptosis and necrosis). We believe these differences can be related to the patients\' phenotypes. Mutations in DNA polymerase n coding gene, POLH, are associated with the variant form of XP (XP-V). Pol n is a translesion synthesis (TLS) polymerase specialized in the TLS past CPD photoproducts, besides other lesions like oxidized bases, and in other processes like somatic hypermutation and DNA replication in structured regions. In this work we show XP-V human fibroblasts are sensitive to oxidative stress. We detected an induction of pol n after genotoxic stress in primary cells, associated with increased ability to deal with the stalled replication fork, and consequently to DNA replication restart and cell survival. In addition, we detected a difference in genomic stability in immunoglobulin genes in aged XP-V patients in comparison to both young patients and age-matched controls, showing the absence of this polymerase may be linked to increased genomic instability in these genes

[EN] Carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1), a 1462-residue mitochondrial enzyme, catalyzes the entry of ammonia into the urea cycle, which converts ammonia, the neurotoxic waste product of protein catabolism, into barely toxic urea. The urea cycle inborn error and rare disease CPS1 deficiency (CPS1D) is inherited with mendelian autosomal recessive inheritance, being due to CPS1 gene mutations (>200 mutations reported), and causing life-threatening hyperammonemia. We have produced recombinantly human CPS1 (hCPS1) in a baculovirus/insect cell expression system, isolating the enzyme in active and highly purified form, in massive amounts. This has allowed enzyme crystallization for structural studies by X-ray diffraction (an off-shoot of the present studies). This hCPS1 production system allows site-directed mutagenesis and enzyme characterization as catalyst (activity, kinetics) and as protein (stability, aggregation state, domain composition). We have revealed previously unexplored traits of hCPS1 such as its domain composition, the ability of glycerol to replace the natural and essential CPS1 activator N-acetyl-L-glutamate (NAG), and the hCPS1 protection (chemical chaperoning) by NAG and by its pharmacological analog N-carbamyl-L-glutamate (NCG). We have exploited this system to explore the effects on the activity, kinetic parameters and stability/folding of the enzyme, and to test the disease-causing nature, of mutations identified in patients with CPS1 deficiency (CPS1D). These results, supplemented with those obtained with other non-clinical mutations, have provided novel information on the functions of three non-catalytic domains of CPS1. We have introduced three CPS1D-associated mutations and one trivial polymorphism in the glutaminase-like domain of CPS1, supporting a stabilizing and an activity-enhancing function of this non-catalytic domain. Two mutations introduced into the bicarbonate phosphorylation domain have shed light on bicarbonate binding and have directly confirmed the importance of this domain for NAG binding to the distant (in the sequence) C-terminal CPS1 domain. The introduction of 18 CPS1D-associated missense mutations mapping in a clinically highly eloquent central non-catalytic domain have proven the disease-causing nature of most of these mutations while showing that in most of the cases they trigger enzyme misfolding and/or destabilization. These results, by proving an important role of this domain in the structural integration of the multidomain CPS1 protein, have led us to call this domain the Integrating Domain. Finally, we have examined the effects of eight CPS1D-associated mutations, of one trivial polymorphism and of five non-clinical mutations, all of them mapping in the C-terminal domain of the enzyme where NAG binds, whereas we have re-analyzed prior results with another four clinical and five non-clinical mutations affecting this domain. We have largely confirmed the pathogenic nature of the clinical mutations, predominantly because of decreased activity, in many cases due to hampered NAG binding. A few mutations had substantial negative effects on CPS1 stability/folding. Our analysis reveals that NAG activation begins with a movement of the final part of the ß4-¿4 loop of the NAG site. Transmission of the activating signal to the phosphorylation domains involves helix ¿4 from this domain and is possibly transmitted by the mutually homologous loops 1313-1332 and 778-787 (figures are residue numbers) belonging, respectively, to the carbamate and bicarbonate phosphorylation domains. These two homologous loops are called from here on Signal Transmission Loops. / [ES] La carbamil fosfato sintetasa 1 (CPS1), una enzima mitocondrial, cataliza la entrada del amonio en el ciclo de la urea, que convierte esta neurotoxina derivada del catabolismo de las proteínas en urea, mucho menos tóxica. El déficit de CPS1 (CPS1D) es un error innato del ciclo de la urea, una enfermedad rara autosómica recesiva, que se debe a mutaciones en el gen CPS1 (>200 mutaciones descritas) y que cursa con hiperamonemia. Hemos producido CPS1 humana recombinante (hCPS1) en un sistema de expresión de células de insecto y baculovirus, y la hemos aislado en forma activa, muy pura y en cantidad elevada. Este sistema de producción de hCPS1 permite la realización de mutagénesis dirigida y la caracterización de la enzima como catalizador (actividad, cinética) y como proteína (estabilidad, estado de agregación y composición de dominios). Hemos revelado características de la hCPS1 antes no exploradas como es la composición de dominios, la capacidad que tiene el glicerol para reemplazar al activador natural y esencial de la CPS1, N-acetil-L-glutamato (NAG), y la protección de la hCPS1 por NAG y por su análogo farmacológico N-carbamil-L-glutamato (NCG) (chaperonas químicas). Hemos utilizado este sistema para explorar los efectos en actividad, parámetros cinéticos y estabilidad/plegamiento de la enzima, y para comprobar la naturaleza patogénica de mutaciones identificadas en pacientes con CPS1D. Estos resultados, junto con los obtenidos con otras mutaciones no clínicas, han aportado información novedosa sobre tres de los dominios no catalíticos de CPS1. Las observaciones realizadas tras introducir en el dominio de tipo glutaminasa de la enzima tres mutaciones asociadas a CPS1D y un polimorfismo trivial, apoyan la contribución de este dominio no catalítico a la estabilidad y a aumentar la actividad de la enzima. Dos mutaciones introducidas en el dominio de fosforilación de bicarbonato han arrojado luz sobre el modo de unión del bicarbonato (un sustrato). Los resultados de estas mutaciones también han confirmado la contribución de este dominio para la unión de NAG, cuyo sitio de unión se encuentra en el dominio C-terminal de CPS1, bastante alejado (en la secuencia) del dominio de fosforilación de bicarbonato. Además, hemos introducido 18 mutaciones de cambio de sentido asociadas a CPS1D, las cuales están localizadas en un dominio no catalítico, central y de elevada elocuencia clínica. Estos resultados han demostrado la naturaleza patogénica de estas mutaciones, ya que en la mayoría de los casos estas mutaciones producen un mal plegamiento o/y desestabilización de la enzima. Debido a que estos resultados han puesto de manifiesto el importante papel de este dominio en la integración estructural de la proteína multidominio CPS1, lo hemos llamado Dominio Integrador. Finalmente, hemos examinado los efectos de 8 mutaciones asociadas a CPS1D, de un polimorfismo trivial y de 5 mutaciones no clínicas, todas localizadas en el dominio C-terminal de la enzima, donde se une NAG. Además, hemos reanalizado resultados anteriores con otras 4 mutaciones clínicas y 5 no clínicas afectando a este dominio. Hemos confirmado el carácter patogénico de las mutaciones clínicas, las cuales predominantemente causan una disminución en la actividad enzimática, en muchos casos debida a que la unión de NAG se encuentra obstaculizada. Unas pocas mutaciones mostraron efectos negativos en la estabilidad/plegamiento de CPS1. Nuestros análisis revelan que la activación por el NAG empieza con un movimiento de la parte final del bucle ß4-¿4 del sitio de NAG. La transmisión de la señal activadora a los dominios de fosforilación implica a la hélice ¿4 de este dominio y posiblemente se transmite a través de los bucles homólogos 1313-1332 y 778-787 (numeración de residuos) pertenecientes, respectivamente, a los dominios de fosforilación de carbamato y bicarbonato. Por ello, hemos llamado a ambos bucles Bucles de / [CAT] La carbamil fosfat sintetasa 1 (CPS1), un enzim mitocondrial, catalitza l'entrada d'amoni en el cicle de la urea, que convertix l'amoni, producte neurotòxic del catabolisme de les proteïnes, en urea, una molècula molt poc tòxica. El dèficit de CPS1 (CPS1D) és un error innat del cicle de la urea, una malaltia rara autosòmica recessiva, que es deu a mutacions en el gen CPS1 (>200 mutacions descrites) i que cursa amb hiperamonièmia. Hem produït CPS1 humana recombinant (hCPS1) en un sistema d'expressió de cèl·lules d'insecte i baculovirus, i l'hem aïllada en forma activa, molt pura i en gran quantitat. Això ha permés la cristal·lització de l'enzim per a estudis estructurals amb difracció de raios-X (treball no inclòs en esta tesi Aquest sistema de producció de hCPS1 permet la realització de mutagènesi dirigida i la caracterització de l'enzim com a catalitzador (activitat, cinètica) i com a proteïna (estabilitat, estat d'agregació i composició de dominis). Hem revelat característiques de la hCPS1 no explorades abans com és la composició de dominis, la capacitat que té el glicerol per a reemplaçar l'activador natural i essencial de CPS1, N-acetil-L-glutamat (NAG), i la protecció de la hCPS1 per NAG i pel seu anàleg farmacològic N-carbamil-L-glutamat (NCG) (xaperones químiques) . Hem utilitzat aquest sistema per a explorar els efectes en l'activitat, els paràmetres cinètics i l'estabilitat/plegament de l'enzim, i per a comprovar la naturalesa patogènica de mutacions identificades en pacients amb CPS1D. Aquestos resultats, junt amb els obtinguts amb altres mutacions no clíniques, han aportat informació nova sobre tres dels dominis no catalítics de la CPS1. Les observacions, després d'introduir tres mutacions associades a CPS1D i un polimorfisme trivial en el domini tipus glutaminasa de CPS1, recolzen la contribució d'aquest domini no catalític a l'estabilitat i a l'optimització de l'activitat enzimàtica. Dues mutacions introduïdes en el domini de fosforilació de bicarbonat han esclarit el mode d'unió de bicarbonat. Els resultats d'aquestes mutacions també han confirmat la contribució d'aquest domini per a la unió de NAG, el lloc d'unió de la qual es troba en el domini C-terminal de CPS1, prou allunyat (en la seqüència) del domini de fosforilació de bicarbonat. A més, hem introduït 18 mutacions de canvi de sentit associades a CPS1D, les quals estan localitzades en un domini no catalític, central i d'elevada eloqüència clínica. Aquestos resultats han demostrat la naturalesa patogènica d'aquestes mutacions, ja que, en la majoria dels casos produïxen un mal plegament o/i desestabilització de l'enzim. Pel fet que aquestos resultats han posat de manifest l'important paper d'aquest domini en la integració estructural de la proteïna multidomini CPS1, l'hem anomenat Domini Integrador. Finalment, hem examinat els efectes de huit mutacions associades a CPS1D, un polimorfisme trivial i cinc mutacions no clíniques, totes elles localitzades en el domini C-terminal de l'enzim, on s'unix NAG. A més, hem reanalitzat resultats anteriors amb altres quatre mutacions clíniques i cinc no clíniques que afecten aquest domini. Hem confirmat el caràcter patogènic de les mutacions clíniques, les quals predominantment causen una disminució en l'activitat enzimàtica, en molts casos pel fet que la unió de NAG es troba obstaculitzada. Unes poques mutacions van mostrar efectes negatius substancials en l'estabilitat/plegament de CPS1. Les nostres anàlisis revelen que l'activació de NAG comença amb un moviment de la part final del bucle ß4-¿4 del lloc de NAG. La transmissió del senyal activadora als dominis de fosforilació involucra l'hèlix ¿4 d'aquest domini i es transmet, possiblement, a través dels bucles homòlegs 1313-1332 i 778-787 (numeració dels residus), pertanyents, respectivament, als dominis de fosforilació de carbamato i bicarbonat. Per això, hem anomenat a ambd / Díez Fernández, C. (2015). USING RECOMBINANT HUMAN CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE 1 (CPS1) FOR STUDYING THIS ENZYME'S FUNCTION, REGULATION, PATHOLOGY AND STRUCTURE [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52855 / TESIS

[ES] Entre los grandes desafíos actuales de las aplicaciones Web podemos citar la portabilidad, adaptabilidad y evolución. Estos desafíos se dan tanto en el ambiente en que operan así como en su desarrollo, ya que a menudo requieren de diferentes lenguajes, frameworks, herramientas, entornos, plataformas, etc. El Desarrollo Dirigido por Modelos (MDD) y en particular, la Arquitectura Dirigida por Modelos (MDA) contemplan estos desafíos proponiendo distintos niveles de abstracción para las diferentes fases de modelado, partiendo de modelos más orientados al problema, que no deberían contemplar aspectos de implementación (CIM, PIM), hasta llegar a los modelos más orientados a la solución planteada (PSM, ISM). Sin embargo, encarar adecuadamente este tema puede depender del grado de independencia que adquieren los modelos. Este trabajo de Tesis presenta un método que considera el problema de la evolución y portabilidad hacia diferentes entornos o arquitecturas en el diseño y desarrollo de aplicaciones Web. La propuesta se denomina MoWebA (del inglés, Model Oriented Web Approach). Durante el desarrollo de la tesis, hemos identificado una serie de aspectos que podrían tener un impacto positivo sobre los problemas de portabilidad y adaptabilidad que son: i) incorporación de un modelo específico de la arquitectura ASM (del inglés, Architecture Specific Model), que permita la portabilidad de los PIMs con respecto a la arquitectura (por ejemplo, RIA, SOA, Mobile); ii) clara separación de la capa de presentación con respecto a las capas navegacionales y de comportamiento; iii) definición de la estructura navegacional de acuerdo a un mecanismo orientado al comportamiento, que prevenga la modificación del diseño navegacional causada por cambios en la implementación; iv) uso de estándares para facilitar la independencia de las herramientas. Se ha llevado a cabo una revisión del estado de la literatura teniendo en cuenta los fundamentos de la Ingeniería Dirigida por Modelos MDE (Model Driven Engineering), las propuestas metodológicas para el desarrollo de Aplicaciones Web, las tendencias actuales, analizando en forma especial de qué manera las propuestas Web las contemplan, y las evidencias empíricas tanto en la academia como en la Industria. Presentamos así la propuesta MoWebA a partir de una serie de consideraciones sobre las aplicaciones Web que han sido identificadas durante el proceso de revisión del estado del arte. Posteriormente, detallamos cada una de las etapas del proceso de modelado, incluyendo los diagramas y notaciones propuestos, sus definiciones a través de sus metamodelos y ejemplos de uso. Seguidamente, presentamos el proceso de transformación adoptado por MoWebA, con los mecanismos de transformación Modelo-A-Modelo y Modelo-A-Código. Hemos dedicado un importante esfuerzo en la validación de la propuesta. Se realizó una primera validación, adoptando los modelos de MoWebA y en algunos casos generando aplicaciones para diferentes dominios. Con estas primeras experiencias de validación hemos podido identificar fortalezas y debilidades de la propuesta PIM de MoWebA, además de determinar en qué grado la misma cubre las necesidades de diferentes dominios. Como segunda experiencia, hemos realizado una validación preliminar con un grupo de estudiantes de último año de la carrera de Ingeniería Informática de la Universidad Católica "Nuestra Señora de la Asunción" (Paraguay), que consistió en la definición de ASM para tres arquitecturas diferentes. Finalmente, como tercera experiencia de validación, hemos llevado a cabo un Caso de Estudio que consistió en la definición de tres extensiones para MoWebA. Dicha validación fue desarrollada como parte de un proyecto de investigación liderado por la Universidad Católica "Nuestra Señora de la Asunción". La experiencia ha permitido analizar el grado de adaptabilidad de MoWebA y automatización en las transformacinoes PIM-ASM, así como el grado de independiencia del PIM. / [CA] Entre els grans desafiaments actuals de les aplicacions Web podem citar la portabilitat, adaptabilitat i evolució. El Desenvolupament Dirigit per Models (MDD) contemple aquests desafiaments proposant diferents nivells d'abstracció per a les diferents fases de modelatge. No obstant això, encarar adequadament aquest tema pot dependre del grau d'independència que adquireixen els models. Aquest treball de Tesi presenta un mètode que considera el problema de l'evolució i la portabilitat, en diferents entorns o arquitectures, per al disseny i desenvolupament d'aplicacions Web. La proposta s'anomena MoWebA (Model Oriented Web Approach). Durant el desenvolupament de la tesi hem identificat una sèrie d'aspectes que podrien tenir un impacte positiu sobre els problemes de portabilitat i adaptabilitat. Aquestos són: i) la incorporació d'un model específic d'arquitectura ASM (Architecture Specific Model), que permet la portabilitat dels models PIM respecte a l'arquitectura (per exemple, RIA, SOA, Mobile); ii) la clara separació de la capa de presentació respecte a les capes navegacionals i de comportament; iii) la definició de l'estructura navegacional d'acord amb un mecanisme orientat al comportament, que restringisca la modificació del disseny navegacional causada per canvis en la implementació; i per últim, iv) l'ús d'estàndards per tal de facilitar la independència de les eines. S'ha realitzat una revisió de l'estat de la literatura considerant els fonaments de l'Enginyeria Dirigida per Models MDE (Model Driven Engineering), les propostes metodològiques per al desenvolupament d'Aplicacions Web, les tendències actuals (analitzant de forma especial la manera en que les propostes Web les consideren), i les evidències empíriques tant en l'acadèmia com en la Indústria. Presentem així la proposta MoWebA a partir d'una sèrie de consideracions sobre les aplicacions Web que són identificades durant el procés de revisió de l'estat de l'art. Posteriorment, detallem cadascuna de les etapes del procés de modelatge, incloent els diagrames i les notacions proposades, les seues definicions (a través dels seus metamodels), i alguns exemples d'ús. Seguidament, presentem el procés de transformació adoptat per MoWebA, emprant mecanismes de transformació Model-a-Model i Model-a-Codi. Hem dedicat un esforç considerable en la validació de la proposta. Es realitzà una primera validació adoptant els models de MoWebA, i en alguns casos es generaren aplicacions per a diferents dominis. Aquestes experiències van ser realitzades per modeladors amb poca experiència, així com també per modeladors i desenvolupadors experimentats. Les experiències van ser desenvolupades en ambients tant acadèmics com industrials. Amb aquestes primeres experiències de validació s'identificaren fortaleses i febleses de la proposta PIM de MoWebA. També permeteren determinar fins quin grau la proposta respon a les necessitats dels diferents dominis. Com a segona experiència es realitzà una validació preliminar amb un grup d'estudiants d'últim curs de la carrera d'Enginyeria Informàtica de la Universitat Catòlica "Nuestra Señora de la Asunción" (Paraguai), que va consistir en la definició del model d'arquitectura ASM per a tres arquitectures diferents. Amb aquesta segona experiència de validació s'aconseguí valorar com de factible és d'adaptar la proposta a altres arquitectures. Finalment, com a tercera experiència de validació, es dugué a terme un Cas d'Estudi que va consistir en la definició de tres extensions per a MoWebA. L'experiència permeté analitzar el grau d'adaptabilitat i d'automatització en les transformacions PIM-ASM que s'obté amb MoWebA, així com el grau de independència del PIM amb respecte als altres models. Durant aquesta validació, s'han realitzat a més experiències de satisfacció d'usuaris amb un grup de modeladors i desenvolupadors. / [EN] Some of the major challenges facing Web applications today are those of portability, adaptability and evolution, not only in the environment in which they run, but also in the way in which they must be developed, often requiring different languages, frameworks, tools, environments, platforms, etc. MDD and MDA take into account these issues. However, to achieve portability, adaptability and evolution depends to some extent on the degree of independence that the models adopt. This Thesis presents a method that take into account the problem of evolution and portability towards different environments. The approach is called MoWebA (Model Oriented Web Approach). Some key aspects of MoWebA that could have a positive impact in the portability and adaptability are:i) incorporation of an Architecture Specific Model (ASM) as a new modeling layer, in order to keep the portability of the Platform Independent Model (PIM) regarding the different architectures (e.g., RIA, SOA, Mobile); ii) clear separation of the presentation layer with regard to the navigation and behavior layers; iii) definition of the navigational structure according to a function-oriented approach, which prevents the modification of the navigation design caused by implementation changes; iv) and use of standards in order to facilitate the independence from the tools. We justify MoWebA by highlighting a series of concerns for Web applications development. We present an overview of the method including the dimensions and the diagrams that we propose. Subsequently, we present each step in the modeling process, including the diagrams and notation, its definition (metamodels) and examples of use. Afterwards, we present the transformation process adopted by MoWebA, which includes model-to-model and model-to-code transformations. We have devoted special attention to the validation of the approach. As a first validation, MoWebA has been used for modelling and generating different types of applications by both novice and experienced modellers and developers. These experiences were done in academic and industrial contexts. The experiences have allowed to identify strengths and weaknesses of the PIM proposal, and to verify that the proposed notation covers the needs of different domains. Next, we present a preliminary validation of the ASM proposal, considering an experience of different ASM definitions made by a group of computer science students at the Catholic University "Nuestra Señora de la Asunción" (Paraguay). This preliminary validation has allowed us to determine how feasible is to adapt the proposal to other architectures. The analysis of the validation sought to answer the following questions: Can the same PIM model be used for different architectures?; Is it possible to specify clear limits between platform independent models (PIM) and architectural specific models (ASM)?; How does an architectural specific model facilitate the transformation rules definition?. Finally, we present a Case Study to validate the extensions of MoWebA to three different architectures. The experience was structured taking into account the framework of Runeson et al. This experience have allowed to carry out three complete extensions. In such extensions we could analysed the grade of adaptability of MoWebA and of automation PIM-ASM, as well as the grade of independence of the PIM metamodel. We have also conducted some user's satisfaction experiences with modelers and developers. / González Toñánez, M. (2022). A Navigational Role-Centric Model Oriented Web Approach MoWebA [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181470 / TESIS