Nesse trabalho, o docking e a dinâmica molecular foram utilizados como métodos de investigação das formas de interação entre um oligonucleotídeo de B-DNA e duas novas Bases de Tröger fluorescentes, com o propósito de verificar sua potencialidade como sondas biológicas. Para o docking molecular foi utilizado o protocolo descrito por Ricci et. al. (2009), que demonstrou ser um método promissor para reconhecer os modos de ligação e descrever a interação entre as Bases de Tröger e os oligonucleotídeos. Os complexos obtidos a partir dos docking foram utilizados como ponto de partida para as simulações de dinâmica molecular usando o programa GROMACS e o campo de força AMBER03, como descrito por Ricci et. al. (2010). A análise dos resultados das simulações mostraram a possibilidade, de que as Bases de Tröger podem interagir de maneiras diferentes com o oligonucleotídeo com preferência pela interação com sulco menor desse receptor. Durante todas as simulações os ligantes mantiveram-se com uma forte interação com o oligonucleotídeo, sem causar a desnaturação do mesmo. Globalmente, os resultados sugerem que as Bases de Tröger podem interagir com o sulco menor do oligonucleotídeo mas também são capazes de interagir como intercaladores. Devido as fortes interações, e també as propriedades fotofísicas (das Bases de Tröger propostas nesse trabalho), essas moléculas podem atuar como possíveis sondas biológicas. / In this work, docking and molecular dynamics simulations were used to ingestigate the interaction between a B-DNA oligonucleotide and two fluorescent Tröger´s bases, in order to verify their potential use as biological probes. For dockings was used protocol described by Ricci et. al. (2009), which proved to be a promising method to recognize the binding modes and describe the interaction between this class of compounds and the oligonucleotide. The complexes obtained from dockings were used as starting point for molecular dynamics simulations using GROMACS and the AMBER03 Force Field, as described by Ricci et. al. (2010). The analyzes of the simulation results showed the possibility that the Tröger Bases can interact in different ways with the oligonucleotide, with some preference for this receptor´s minor groove. During all simulations the ligands have maintained a strong interaction with the oligonucleotide, without causing denaturation of the same. Overall, the results suggest that Tröger´s Bases may interact with the minor groove of olinucleotide but are also able to interact as an intercalator, depending upon the substituents present. Due to the strong interactions, and also the peculiar photophysical properties, this class of molecules may act as a potential DNA probe.

Neglected diseases constitute a major public health problem worldwide, quantifying a total of 1 billion people suffering from some kind of infection of bacterial, viral or parasitic origin. Among them, we can highlight Chagas disease, caused by the parasite Trypanosoma cruzi, which affects more than 8 million people around the world. In order to discover new active compounds against T. cruzi, developed herein the synthesis of new prototypes of thiophene-2- thioureic and 2-iminothiazolidine rationally designed with potential antichagasic activity, biological evaluation and study docking. Initially, the start material was the polysubstituted thiophene derivatives synthesized via Gewald reaction, which were converted into thioureic derivatives and then cyclized with five different electrophiles, generating thiophene-2- iminothiazolidine derivatives. The intermediates and final compounds were synthesized in yields between 40 and 98%, and characterized by NMR. For docking study was initially performed by minimizing the energy of the ligands by ArgusLab® software, using AM1, and applying the software AutoDock Tools® and AutoDock Vina®, using the Gasteiger method. All compounds were evaluated in the anti-T. cruzi assays, in vitro, and the most active serie was selected for the cytotoxicity assay (MTT) in J774 cell line. It was possible to determine the enzymes involved in the probable mechanisms of action for the ligands. It has been observed that in 50% of cases, TcDHFR enzyme is the main target of the new compounds, in amastigotes. The pharmacological tests in amastigotes and trypomastigotes, line of C2C12 and MK2 cells was established as validation for the theoretical studies. The compound 3d probably develops its mechanism of action by inhibition of the enzyme TcTS (IC50= 10.3 µM) in trypomastigotes of the parasite. Since the compound 7c possibly acts by inhibition of the enzyme TcDHFR (IC50= 9.2 µM) in amastigotes. In additional, it was proposed that the compound 7b carries out its activity by inhibition of the enzyme TcDHFR (IC50 = 5.0 µM). Finally, it was observed that the most active compounds obtained in this study were more effective than the benznidazole, gold standard drug used in pharmacotherapy clinical of the Chagas disease, additionally has a low cytotoxicity (CC50> 100 µM). / As doenças negligenciadas configuram um grande problema de saúde pública mundial, quantificando um total de 1 bilhão de pessoas acometidas por algum tipo de infecção de origem bacteriana, viral ou parasitária. Dentre elas, podemos destacar a Doença de Chagas, causada pelo parasito Trypanosoma cruzi, a qual acomete mais de 8 milhões de pessoas em todo o mundo. No intuito de se descobrir novos compostos ativos capazes de combater o T. cruzi de maneira eficaz, desenvolvemos neste trabalho a síntese de novos protótipos de fármacos tiofeno-2-tioureicos e 2-iminotiazolidínicos racionalmente planejados com potencial atividade antichagásica, avaliação biológica e estudo de docking. Para a síntese dos compostos planejados, partiu-se de derivados tiofenos polissubstituídos, sintetizados via reação de Gewald, os quais foram convertidos em derivados tioureicos e, em seguida, ciclizados com cinco diferentes di-eletrófilos, gerando derivados tiofeno-2- iminotiazolidínicos. Os intermediários e compostos finais foram sintetizados com rendimentos entre 40 e 98%, e caracterizados por RMN. Para o estudo de docking, inicialmente foi realizada a minimização das energias dos ligantes pelo software ArgusLab®, usando o método AM1, e aplicando os softwares AutoDock Tools® e AutoDock Vina®, empregando o método de Gasteiger. Todos os compostos foram submetidos à avaliação in vitro de suas atividades anti-T. cruzi, e a série mais ativa foi selecionada para ensaio de citotoxicidade (MTT) em células da linhagem J774. Foi possível determinar as enzimas envolvidas nos prováveis mecanismos de ação para os ligantes. Foi observado que, em 50% dos casos, a enzima TcDHFR é o principal alvo dos novos composto, em formas amastigotas. Os ensaios farmacológicos em formas amastigotas e tripomastigotas, linhagem de células C2C12 e MK2 funcionaram como métodos de validação dos estudos teóricos. O composto 3d, provavelmente desenvolve seu mecanismo de ação através da inibição da enzima TcTS (IC50= 10.3 µM), em formas tripomastigotas do parasito. Já o composto 7c,possivelmente atua por meio da inibição da enzima TcDHFR (IC50= 9.2 µM) em formas amastigotas. Em adicional, foi proposto que o composto 7b desenvolve sua atividade através da inibição da enzima TcDHFR (IC50= 5.0 µM). Por fim, foi verificado que os compostos mais ativos obtidos neste trabalho se mostraram mais eficientes do que o fármaco benznidazol, padrão-ouro utilizado na clínica farmacológica da doença de Chagas, além destes apresentarem baixa citotoxicidade (CC50> 100 µM).

As plantas medicinais são consideradas importantes fontes de compostos biologicamente ativos. Para muitas doenças crônicas, como as neurodegenerações, substâncias que apresentam atividades simultâneas em mais de um alvo relacionado à etiopatologia dessas desordens, constituem potenciais agentes terapêuticos. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram a avaliação química e biológica de três espécies de samambaias de ocorrência no sul do Brasil: Blechnum binervatum, B. brasiliense e B. occidentale. O isolamento bioguiado foi utilizado para a identificação da(s) substância(s) com potencial atividade em modelos in vitro e in silico relacionados às desordens neurodegenerativas. A avaliação dos extratos e frações permitiu destacar a fração acetato de etila de B. brasiliense como a mais ativa na estabilização de radicais hidroxila (CI50: 12,5 μg/mL) e na inibição da lipoperoxidação (CI50: 10,4 μg/mL), sendo uma das mais ativas frente ao óxido nítrico (CI50: 55,6 μg/mL). Adicionalmente, na inibição da isoforma A da enzima monoamina oxidase (MAO), esta fração foi a que apresentou menor valor de CI50 (28,6 μg/mL). As frações diclorometano também apresentaram bons resultados na inibição da MAO-A, sendo algumas ativas igualmente como antioxidantes. Frente à MAO-B, os extratos e frações das três espécies vegetais demonstraram menores efeitos e foram inativos frente às enzimas acetil e butiril colinesterase, não demonstrando toxicidade em células polimorfonucleares (PMN) de ratos Wistar, na concentração de 1 mg/mL. Utilizando células-tronco cultivadas, os extratos e frações selecionadas, nas concentrações de 100 a 500 μg/mL, não afetaram a viabilidade celular e não apresentaram efeitos tóxicos. Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas, permitiram a identificação de isômeros dos ácidos cafeoil quínico e cafeoil chiquímico nos extratos das três espécies estudadas. B. binervatum apresentou, ainda, ácido cafeico glicosilado, ácido isosalvianólico A e ácido rosmarínico sulfatado. Ácido salvianólico F foi identificado em B. binervatum e B. occidentale, bem como isômeros do ácido brainico. Ácido rosmarínico foi caracterizado em B. binervatum e B. brasiliense. Quercetina 3-O-glicosídeo e vicenina-2 também foram identificadas. As análises por cromatografia gasosa, acoplada à espectrometria de massas demonstraram que o diterpeno neofitadieno foi o composto majoritário nas frações diclorometano de Blechunm e nas frações hexano de B. occidentale e B. binervatum. Para a fração hexano de B. brasiliense, β-sitosterol foi o principal componente. A partir da fração acetato de etila de B. brasiliense foi isolado o ácido rosmarínico, o qual se mostrou ativo nos ensaios de atividade antioxidante, na inibição da catecol-O-metil transferase (CI50: 26,7 μM) e da MAO-A (CI50: 50,1 μM), sendo proposto mecanismo reversível de inibição desta enzima. Nos estudos de docking foram verificadas as interações moleculares entre o composto e as enzimas MAO-A e COMT, por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas nos sítios ativos enzimáticos. O composto não apresentou efeitos tóxicos em células PMN de roedores, nas concentrações de 0,5 e 5 mM. Os ácidos rosmarínico e clorogênico isolados do extrato de B. binervatum não influenciaram na viabilidade celular e não induziram efeito tóxico sobre células-tronco (100 a 500 μM), sendo que o ácido rosmarínico foi capaz, ainda, de induzir proliferação celular. Capacidade protetora contra danos celulares causados por H2O2 (1400 μM) foi observada para ambas as substâncias, nas concentrações de 10-100 μM, sendo os resultados corroborados pelas imagens de microscopia celular. O ácido rosmarínico apresentou melhores respostas quando comparado ao ácido clorogênico, sendo mais efetivo na inibição dos danos por H2O2. O conjunto dos resultados obtidos ressalta a importância dos estudos associados químico-biológico de espécies vegetais e aponta para as potencialidades de samambaias como fontes de produtos bioativos, capazes de atuar sobre múltiplos alvos enzimáticos e não-enzimáticos relacionados a doenças neurodegenerativas. / Medicinal plants are considered important sources of biologically active compounds. For many chronic diseases, such as neurodegenerations, substances that present simultaneous activities in more than one target related to the etiopathology of these disorders are considered potential therapeutic agents. In this context, the aims of the study were the chemical and biological evaluation of three fern species, occurring in south Brazil: Blechnum binervatum, B. brasiliense and B. occidentale. The bioguided isolation was employed to identify compound(s) with potential activities at in vitro and in silico models associated to neurodegenerative disorders. The biological evaluation of extracts and fractions allowed to highlight the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, which was the most active in the stabilization of hydroxyl radicals (IC50: 12.5 μg/mL) and on lipoperoxidation inhibition (IC50: 10.4 μg/mL), being one of the most active sample against nitric oxide (IC50: 55.6 μg/mL). Furthermore, on the inhibition of isoform A from monoamine oxidase (MAO), this fraction showed the lowest IC50 value (28.6 μg/mL). The dichloromethane fractions also presented good results in the MAO-A inhibition, being some of them active as antioxidants, too. Against MAO-B, extracts and fractions of the three species demonstrated reduced effects and all samples were inactive in the acetyl and butyryl cholinesterase inhibition, showing no toxic effects to polymorphonuclear cells (PMN) from Wistar rats, at 1 mg/mL. Using cultured stem cells, the selected extracts and fractions at 100 to 500 μg/mL did not affect cell viability and absence of cytotoxic effects was observed. The chemical analysis by high performance liquid chromatography, coupled to photodiode array detector and mass spectrometry, allowed the identification of caffeoyl quinic acid and caffeoyl shikimic acid isomers in the three studied fern species. B. binervatum presented also glycosilated caffeic acid, isosalvianolic acid A and sulphated rosmarinic acid. Salvianolic acid F was identified in B. binervatum and B. occidentale, as well as, brainic acid isomers. Rosmarinic acid was characterized in B. binervatum and B. brasiliense. Quercetin 3-O-glycoside and vicenin-2 were also found. Analysis by gas chromatography with mass spectrometry showed the diterpene neophytadiene was the major compound in dichloromethane fractions of Blechunm and in hexane fractions of B. occidentale and B. binervatum. For the hexane fraction from B. brasiliense, β-sitosterol was majority. From the ethyl acetate fraction of B. brasiliense was isolated rosmarinic acid, which was shown to be active in antioxidant assays, in the inhibition of catechol-O-methyltransferase (IC50: 26.7 μM) and MAO-A (IC50: 50.1 μM), being suggested a reversible inhibition mechanism against this enzyme. In docking studies were observed molecular interactions between the compound and MAO-A and COMT enzymes, via hydrogen bonds and hydrophobic interactions in enzyme active sites. The compound did not induce toxic effects to rodent PMN cells, at concentrations of 0.5 and 5 mM. The rosmarinic and chlorogenic acids, isolated from B. binervatum extract, did not influence cell viability and did not induce toxicity to stem cells (100 to 500 μM), the rosmarinic acid was also capable to induce cell proliferation. Protective ability against H2O2-induced cell damage (1400 μM) was observed for both substances at concentrations of 10-100 μM, and the results were supported by cellular microscopy images. Rosmarinic acid presented better responses compared with chlorogenic acid, being powerful inhibitor against H2O2-induced damage. The overall results highlights the importance of associated chemical-biological studies of plant species and points at the potential of ferns as sources of bioactive compounds, capable of modulating multiple enzymatic and non-enzymatic targets related to neurodegenerative diseases.

Neste trabalho foi realizado o estudo por docagem e simulação de dinâmica molecular de doze derivados benzazólicos fluorescentes por ESIPT, interagindo com o dodecâmero de Dickerson-Drew na forma B-DNA. Estes doze ligantes foram divididos em dois grupos (A e B), sendo o primeiro grupo composto por derivados do 2-(2’-hidroxifenil)-benzoxazol e o segundo grupo composto por três derivados do 2-(4’-amino-2’-hidroxifenil)-benzazóis, alternando entre N, S e O no anel azólico, mais três bases de Tröger derivadas dos mesmos. Na análise da docagem molecular do grupo A, os derivados com grupamento –NH2 no anel fenólico apresentaram energias de interação mais favoráveis com o DNA, verificando um favorecimento ainda maior, para os ligantes que continham –NO2 como substituinte no anel benzoxazólico. Na análise da docagem molecular para grupo B, as bases de Tröger (4ac) apresentaram interações significativamente mais favoráveis, quando comparados com seus respectivos precursores (3ac). Na análise da DM, tanto o grupo A, quanto o B, apresentaram a formação de complexos estáveis. O grupo A apresentou uma indução a alterações estruturais mínimas no DNA, sendo as maiores alterações a abertura do Rise quando os ligantes estavam intercalados, acompanhado pelo desenrolamento do parâmetro Twist. Nas interações de sulco menor, o ligante 2a foi o que formou o complexo mais estável com o DNA. Na análise da DM do grupo B, as bases de Tröger apresentaram uma preferência maior por interações do tipo intercalação que seus precursores, sendo os primeiros, os quais induziram o oligonucleotídeo a maiores alterações estruturais. Durante todas as simulações os ligantes mantiveram-se com uma forte interação com o oligonucleotídeo, sem causar a desnaturação do mesmo. Devido às interações estáveis, e também as propriedades fotofísicas peculiares dos ligantes estudados, esta classe de moléculas pode atuar como possíveis sondas biológicas. / In this work we carried out a study by docking and molecular dynamics simulations of twelve ESIPT-fluorescent benzazoles, interacting with the Dickerson-Drew dodecamer in the canonical B-DNA form. These twelve ligands were divided into two groups (A and B), with the first group consisting of derivatives of 2-(2’-hydroxphenyl)-benzoxazole and the second group consisting of three derivatives of 2-(4’-amino-2’-hydroxyphenyl)-benzazoles, alternating between N, S and O in the azole ring and three Tröger bases derived from them. In the analysis of the molecular docking of group A, the derivatives with group –NH2 in the phenolic ring presented more favorable interaction energies with the DNA, and the score was even more favorable for the ligands which contained –NO2 as substituent in the benzoxazolic ring. In the analysis of the molecular docking for group B, the Tröger bases (4ac) presented significantly more favorable interactions, when compared with their respective precursors (3ac). In the analysis of the DM, both groups A and B formed stable complexes. Group A induced only slight structural distortions in the DNA, being the largest modifications the increase of the Rise parameter when the ligands were intercalated, accompanied by the unwinding of Twist parameter. Regarding minor groove interactions, the ligand 2a formed the most stable complex with the DNA. In the analysis of the DM both groups A and B, the Tröger bases presented a greater preference for intercalation interactions than their precursors and the Tröger bases induced the largest structural changes to the oligonucleotide. During all the simulations the ligands maintained a strong interaction with the oligonucleotide, without causing the denaturation of the same. Due to the stable interactions, and also the peculiar photophysical properties of the ligands studied, this class of molecules can act as possible biological probes.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2694.pdf: 3100677 bytes, checksum: e539b70bd59d8ae168c5b5d00b544881 (MD5) Previous issue date: 2009-06-05 / Universidade Federal de Sao Carlos / Theoretical methods in computational chemistry were used to study the gGAPDH enzyme from Trypanosoma cruzi. This protozoan is responsible by the Chagas diseases. Molecular dynamics simulations were performed to obtain the time evolution of the gGAPDH enzyme in the holo (with the cofactor NAD+) and apo (without the cofactor) forms in aqueous solution. The calculations were performed in the NpT ensemble with T = 300K e p = 1bar. In these simulations little conformational changes were observed in both holo and apo forms of the enzyme along 20.0 ns simulation time. Docking calculations were carried out to fit some drugs in enzyme active site using the ensemble docking methodology. Therefore, multiple enzyme conformations of both holo and apo forms were obtained at time intervals of 2.0 ns along the molecular dynamics simulation. This procedure was used to take in into account the flexibility of the enzyme. The results from these calculations indicate that the best way to develop a drug molecule is to consider both enzyme forms (holo and apo forms). In this way, one drug will inhibit the apo form and other, the holo form. To characterize the enzymatic mechanism, the glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) was placed in the active site (via docking calculations) of the holo form conformation obtained in the end of the 20.0 ns trajectory. A 1.0 ns molecular dynamic simulation was performed in the (gGAPDH-NAD+-G3P) system. Quantum chemical calculations were performed to study reactive process in the enzyme catalytic site. A convenient model was built using about 698 atoms carefully chosen to represent the active site and its surroundings. The calculations were performed using a combination of MOZYME and the usual SCF procedure implemented in the MOPAC2009 program. The calculations were performed at the PM6 level. One of the reaction mechanisms proposed in the literature was characterized xix calculating the energy profile along the reaction path to transfer a proton from Cys166 to His194. Using a second structure obtained from molecular dynamics, a new mechanism for the gGAPDH enzyme was proposed and characterized by a similar MOPAC2009 calculation. In this mechanism, the hydroxyl group of the G3P acts as a bridge to transfer the proton from the Cys166 to His194 residue. / Métodos de química computacional foram utilizados para estudar a enzima gGAPDH do Trypanosoma cruzi, protozoário responsável pela doença de Chagas. Simulações por dinâmica molecular foram realizados para obter a evolução temporal da enzima gGAPDH na forma holo (com o cofator NAD+) e apo (sem o cofator) em solução. Os cálculos foram efetuados no ensemble NpT a T = 300K e p = 1bar. Nessas simulações ficaram evidenciadas pequenas mudanças conformacionais entre as formas holo e apo no tempo de simulação de 20,0 ns. Para posicionar ou encaixar algumas moléculas candidatas a fármacos no sítio ativo da enzima, cálculos de docking foram realizados utilizando a metodologia de ensemble docking, utilizando múltiplas conformações obtidas a cada intervalo de 2,0 ns de simulação da enzima na forma holo e apo. Essa metodologia foi adotada para levar em consideração a flexibilidade da enzima. Os resultados desses cálculos mostraram que a melhor estratégia para elaborar compostos candidatos a fármacos é considerar as duas formas da enzima (holo e apo). Com esta estratégia, um composto inibiria a forma apo e outro, a forma holo. Para caracterizar o mecanismo enzimático, o gliceraldeído 3-fosfato (G3P) foi colocado no sítio ativo (via cálculos de docking) da enzima gGAPDH na forma holo, a qual foi obtida a 20,0 ns de simulação. Nesse sistema (gGAPDHNAD+- G3P), foi realizado 1,0 ns de simulação por dinâmica molecular para a relaxação e equilibração do sistema. Ao longo dessa simulação, duas estruturas foram escolhidas para a realização de cálculos de química quântica relacionados com a atividade enzimática. Em uma dessas estruturas, um dos mecanismos propostos na literatura foi caracterizado a partir da coordenada de reação de transferência do próton da Cys166 para a His194. Estes cálculos foram efetuados utilizando um procedimento que combina a utilização da metodologia xvii MOZYME com o cálculo SCF usual implementado no programa MOPAC2009. Nestes cálculos, a parametrização PM6 foi utilizada. A partir de uma segunda estrutura obtida da dinâmica molecular, um novo mecanismo para a enzima gGAPDH foi proposto e caracterizado via cálculos quânticos. Nesse mecanismo, o grupo hidroxila da G3P age como uma ponte para a transferência do próton da Cys166 para a His194.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5168.pdf: 8720586 bytes, checksum: 0dc0ddbacccaf3e2f1fcfb515b343484 (MD5) Previous issue date: 2013-03-28 / Universidade Federal de Minas Gerais / Cathepsins are lysosomal cysteine proteases responsible for protein turnover in our organism. In non-lysosomal environment they are related to a number of diseases such as cancer, Alzheimer, autoimmune diseases and osteoporosis. Tellurium compounds have proved to be promising therapeutic agents against these diseases due to inhibition of the proteases through the formation of a Te S covalent bond with the sulfur of a catalytic cysteine. In this work the crystal and molecular structures of compounds (ptol)Te[C(H)=C(Cl)Ph]X2 (X = Cl, Br, I), butyldiiodo[(1Z)-(2- iodopent-1-en-yl)-4- tellane and their docking in Catepsine B are described. The results showed that these compounds, whose activity has not been measured, should have an inhibitory activity very similar to that of a known compound with a close structure. Moreover, it is shown that the substitution of a phenyl group for an aliphatic one should not have any influence on the activity of these kind of compounds. Also the structures of a series of dipnones were determined which were used as basis for the molecular modeling of others that could not be crystallized and for the docking studies in catepsins B, K, L and S. The results allowed establishing a model that explains their different inhibitory activities. / As catepsinas são cisteíno proteases lisossômicas presentes no nosso organismo. Quando em ambiente não lisossômico, estão relacionadas a uma série de doenças como câncer, Alzheimer, doenças autoimunes e osteoporose. Neste contexto, compostos de telúrio têm sido promissores agentes terapêuticos contra estas doenças por apresentarem ação inibitória das catepsinas. Isso ocorre devido à formação de uma ligação covalente entre telúrio e o enxofre da cisteína catalítica. Neste trabalho são descritas as estruturas cristalinas e moleculares dos compostos (ptol)Te[C(H)=C(Cl)Ph]X2 (X = Cl, Br, I), butildiiodo[(1Z)-(2-iodopent-1-em-1-il) 4- telano, e o docking destes compostos em Catepsina B. Os resultados mostram que estes compostos, cujas atividades não foram medidas, poderão apresentar atividades inibitórias semelhantes à de um composto de estrutura similar e com atividade conhecida. Mais ainda, foi mostrado que a substituição de um grupo fenila por um grupo alifático não deverá ter influência na atividade deste tipo de compostos. Foram também determinadas as estruturas cristalinas e moleculares de três dipnonas. Estas estruturas serviram de base para a modelagem das estruturas de outros compostos que não puderam ser cristalizados e para a realização de docking nas catepsinas B, K, L, e S. Foi então estabelecido um modelo para explicar as diferentes atividades inibitórias dos compostos de telúrio.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2240.pdf: 3981938 bytes, checksum: ce9575f4d9edde7a78432d592db4dd5a (MD5) Previous issue date: 2009-02-10 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is composed of 4 chapters. In Chapter 1 is a description of the problems addressed here, starting with the characteristics of the protein, its biological and social importance, and the interactions responsible for both its structure and the formation of ligand-protein complexes, there is also a brief description of Te(IV) compounds followed by the presentation of the grounds of the experimental methods used, namely crystallography and docking. In Chapter 2 the objectives of this work are presented. Chapter 3 includes the experimental procedures that were used to determine the crystal and molecular structures, the modeling of the compounds that did not have crystallographic structure, as well as the molecular docking. In Chapter 4 are described and discussed the results. The crystal structures of the telluroxetanes (3E)-2-chloro-3-(chloromethylidene)-2-(4- methoxyphenyl)-1-oxa-2 λ4- telluraspiro[3.6]decane (1) and of (3E)-2-chloro-3-(chloromethylidene)-2-(4- methoxyphenyl)-1-oxa-2 λ4- telluraspiro[3.5]nonane (2) show that the coordination polyhedron around the atom of Te is a pseudo-pentagonal bipyramid. The supramolecular synthon is different in the two cases, in spite that the Te atom makes a secondary interaction with a halide, in both cases. The docking results for all tellurium compounds have shown that these ligands form complexes with Cathepsin B through the formation of a covalent bond between the Te and S of Cys29 of the enzyme. The differences in the values of scores from the docking and the number of interactions are due, mainly, the size of the carbon chain. Finally the conclusions and outlook can be found. / Este trabalho é composto de 4 capítulos. No capítulo 1 encontra-se uma descrição dos problemas abordados aqui, começando com as características da proteína, a sua importância biológica e social, as interações responsáveis tanto pela sua estrutura como pela formação de complexos proteína-ligante; também há uma breve descrição dos compostos de telúrio seguido da apresentação dos fundamentos dos métodos experimentais utilizados, ou seja, cristalografia e docking. No capítulo 2, os objetivos deste trabalho são apresentados. O Capítulo 3 inclui os procedimentos experimentais que foram utilizados para determinar as estruturas cristalinas e moleculares, a modelagem dos compostos que não têm estrutura cristalográficas, bem como do docking molecular. No capítulo 4 são descritos e discutidos os resultados. As estruturas cristalinas das telurooxetanas (3E)-2-cloro-3-(cloromethilidene)-2-(4-metoxifenil)-1-oxa-2λ4- telluraspiro [3,6]decano (1) e de (3E)-2-cloro-3-(clorometilidene)-2 λ4- 4- telluraspiro[3,5]nonano (2), mostram que o poliedro de coordenação ao redor do átomo de Te é uma pseudo-bipirâmide pentagonal. O synthon supramolecular é diferente nos dois casos, apesar de o átomo Te, em ambos os casos, realizar uma interação secundária com um haleto. Os resultados de docking para todos os compostos de telúrio estudados monstraram que estes formam complexos com a catepsina B através da formação de uma ligação covalente entre o Te e S da Cys29 da enzima. As diferenças nos valores dos escores de docking e no número de interações são devidos, principalmente, o tamanho da cadeia de carbono. Finalmente as conclusões e as perspectivas podem ser encontrados.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-01-16Bitstream added on 2014-06-13T19:55:49Z : No. of bitstreams: 1 sabbag_mp_me_sjrp.pdf: 582990 bytes, checksum: a674199278bb87518fc43d93309aefd1 (MD5) / As infecções respiratórias agudas (IRAs) constituem a principal causa de mortalidade infantil no mundo, e o Vírus Respiratório Sincicial Humano (hRSV – Human Respiratory Syncytial Virus) é um dos principais agentes etiológicos das IRAs. Este vírus pertencente à família Paramyxoviridae, é envelopado, de simetria helicoidal, cujo genoma é RNA de fita simples não segmentada. A infectividade do vírus está relacionada com suas proteínas de membrana e dentre elas a glicoproteína G, que é responsável pela ligação do vírus à célula hospedeira e conseqüente instalação da infecção. Esta glicoproteína exerce um importante papel como antígeno de reconhecimento, sendo alvo para identificação do RSV através de anticorpos. Existem evidências de que esta proteína se liga a receptores glicosilados na célula hospedeira, porém ainda não foi descrito um receptor para a proteína G na célula. Para elucidar estes mecanismos de interação, foram realizados estudos experimentais e teóricos desta proteína. Os domínios solúveis da região N-terminal (1 a 38 aa) e C-terminal (67 a 298 aa), com 231 aminoácidos da glicoproteína G do hRSV foram clonados e a região N-terminal foi expressa em bactéria BL21 pLysS. Em paralelo, foi realizada a caracterização teórica desta proteína, e foram avaliados os possíveis sítios de interação da mesma com glicosaminoglicanos (heparina). Foram obtidos dois modelos teóricos para a proteína G do hRSV, bem como dois modelos de interação com heparina, determinando portanto, um possível sítio de ocorrência de interação. O conhecimento da estrutura da proteína G é de grande importância para elucidar a composição da estrutura e os mecanismos de interação com potenciais ligantes e deste modo, em um passo posterior, propor mecanismos de reconhecimento celular pelo hRSV, através de glicosaminoglicanos / Acute Respiratory Infections (ARI) are the leading cause of infant mortality in the world, and the Human Respiratory Syncytial Virus (hRSV) is one of the main agents of ARI. This virus belongs to Paramyxoviridae family, has a lipidic envelope, helical symmetry and its genome is a single-stranded RNA. The viral infectivity is related to its membrane proteins and among them the G glycoprotein, which is responsible for binding the virus to the host cell and consequent infection. This glycoprotein plays an important role as antigen recognition, being the target for hRSV identification through antibodies. There are evidences that this protein binds to host cell glycosylated receptors, but it has not been described a receptor for G protein in the cell yet. To elucidate these interaction mechanisms and understand the process of viral infectivity, we performed experimental and theoretical studies of this protein. The soluble domains of the N-terminal (1-38 aa) and C-terminal regions (67-298 aa), with 231 amino acids of the hRSV G glycoprotein have been cloned and the N-terminal region was expressed in BL21 pLysS bacteria. In a later trial these peptides will be purified and biophysical tests will be done. It was also performed a theoretical characterization of this protein, to assess the possible interaction sites with glycosaminoglycan (heparin). It were obtained two theoretical models for the hRSV G protein as well as two interaction models with heparin, in order to determine a possible site of occurrence of interaction. Knowledge of G protein structure is of great importance to elucidate the mechanism of viral infectivity and interaction mechanisms with potential ligants, and the results obtained in this work will allow us, in a later step, to propose mechanisms of cellular recognition by hRSV through glycosaminoglycans

As plantas medicinais são consideradas importantes fontes de compostos biologicamente ativos. Para muitas doenças crônicas, como as neurodegenerações, substâncias que apresentam atividades simultâneas em mais de um alvo relacionado à etiopatologia dessas desordens, constituem potenciais agentes terapêuticos. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram a avaliação química e biológica de três espécies de samambaias de ocorrência no sul do Brasil: Blechnum binervatum, B. brasiliense e B. occidentale. O isolamento bioguiado foi utilizado para a identificação da(s) substância(s) com potencial atividade em modelos in vitro e in silico relacionados às desordens neurodegenerativas. A avaliação dos extratos e frações permitiu destacar a fração acetato de etila de B. brasiliense como a mais ativa na estabilização de radicais hidroxila (CI50: 12,5 μg/mL) e na inibição da lipoperoxidação (CI50: 10,4 μg/mL), sendo uma das mais ativas frente ao óxido nítrico (CI50: 55,6 μg/mL). Adicionalmente, na inibição da isoforma A da enzima monoamina oxidase (MAO), esta fração foi a que apresentou menor valor de CI50 (28,6 μg/mL). As frações diclorometano também apresentaram bons resultados na inibição da MAO-A, sendo algumas ativas igualmente como antioxidantes. Frente à MAO-B, os extratos e frações das três espécies vegetais demonstraram menores efeitos e foram inativos frente às enzimas acetil e butiril colinesterase, não demonstrando toxicidade em células polimorfonucleares (PMN) de ratos Wistar, na concentração de 1 mg/mL. Utilizando células-tronco cultivadas, os extratos e frações selecionadas, nas concentrações de 100 a 500 μg/mL, não afetaram a viabilidade celular e não apresentaram efeitos tóxicos. Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas, permitiram a identificação de isômeros dos ácidos cafeoil quínico e cafeoil chiquímico nos extratos das três espécies estudadas. B. binervatum apresentou, ainda, ácido cafeico glicosilado, ácido isosalvianólico A e ácido rosmarínico sulfatado. Ácido salvianólico F foi identificado em B. binervatum e B. occidentale, bem como isômeros do ácido brainico. Ácido rosmarínico foi caracterizado em B. binervatum e B. brasiliense. Quercetina 3-O-glicosídeo e vicenina-2 também foram identificadas. As análises por cromatografia gasosa, acoplada à espectrometria de massas demonstraram que o diterpeno neofitadieno foi o composto majoritário nas frações diclorometano de Blechunm e nas frações hexano de B. occidentale e B. binervatum. Para a fração hexano de B. brasiliense, β-sitosterol foi o principal componente. A partir da fração acetato de etila de B. brasiliense foi isolado o ácido rosmarínico, o qual se mostrou ativo nos ensaios de atividade antioxidante, na inibição da catecol-O-metil transferase (CI50: 26,7 μM) e da MAO-A (CI50: 50,1 μM), sendo proposto mecanismo reversível de inibição desta enzima. Nos estudos de docking foram verificadas as interações moleculares entre o composto e as enzimas MAO-A e COMT, por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas nos sítios ativos enzimáticos. O composto não apresentou efeitos tóxicos em células PMN de roedores, nas concentrações de 0,5 e 5 mM. Os ácidos rosmarínico e clorogênico isolados do extrato de B. binervatum não influenciaram na viabilidade celular e não induziram efeito tóxico sobre células-tronco (100 a 500 μM), sendo que o ácido rosmarínico foi capaz, ainda, de induzir proliferação celular. Capacidade protetora contra danos celulares causados por H2O2 (1400 μM) foi observada para ambas as substâncias, nas concentrações de 10-100 μM, sendo os resultados corroborados pelas imagens de microscopia celular. O ácido rosmarínico apresentou melhores respostas quando comparado ao ácido clorogênico, sendo mais efetivo na inibição dos danos por H2O2. O conjunto dos resultados obtidos ressalta a importância dos estudos associados químico-biológico de espécies vegetais e aponta para as potencialidades de samambaias como fontes de produtos bioativos, capazes de atuar sobre múltiplos alvos enzimáticos e não-enzimáticos relacionados a doenças neurodegenerativas. / Medicinal plants are considered important sources of biologically active compounds. For many chronic diseases, such as neurodegenerations, substances that present simultaneous activities in more than one target related to the etiopathology of these disorders are considered potential therapeutic agents. In this context, the aims of the study were the chemical and biological evaluation of three fern species, occurring in south Brazil: Blechnum binervatum, B. brasiliense and B. occidentale. The bioguided isolation was employed to identify compound(s) with potential activities at in vitro and in silico models associated to neurodegenerative disorders. The biological evaluation of extracts and fractions allowed to highlight the ethyl acetate fraction of B. brasiliense, which was the most active in the stabilization of hydroxyl radicals (IC50: 12.5 μg/mL) and on lipoperoxidation inhibition (IC50: 10.4 μg/mL), being one of the most active sample against nitric oxide (IC50: 55.6 μg/mL). Furthermore, on the inhibition of isoform A from monoamine oxidase (MAO), this fraction showed the lowest IC50 value (28.6 μg/mL). The dichloromethane fractions also presented good results in the MAO-A inhibition, being some of them active as antioxidants, too. Against MAO-B, extracts and fractions of the three species demonstrated reduced effects and all samples were inactive in the acetyl and butyryl cholinesterase inhibition, showing no toxic effects to polymorphonuclear cells (PMN) from Wistar rats, at 1 mg/mL. Using cultured stem cells, the selected extracts and fractions at 100 to 500 μg/mL did not affect cell viability and absence of cytotoxic effects was observed. The chemical analysis by high performance liquid chromatography, coupled to photodiode array detector and mass spectrometry, allowed the identification of caffeoyl quinic acid and caffeoyl shikimic acid isomers in the three studied fern species. B. binervatum presented also glycosilated caffeic acid, isosalvianolic acid A and sulphated rosmarinic acid. Salvianolic acid F was identified in B. binervatum and B. occidentale, as well as, brainic acid isomers. Rosmarinic acid was characterized in B. binervatum and B. brasiliense. Quercetin 3-O-glycoside and vicenin-2 were also found. Analysis by gas chromatography with mass spectrometry showed the diterpene neophytadiene was the major compound in dichloromethane fractions of Blechunm and in hexane fractions of B. occidentale and B. binervatum. For the hexane fraction from B. brasiliense, β-sitosterol was majority. From the ethyl acetate fraction of B. brasiliense was isolated rosmarinic acid, which was shown to be active in antioxidant assays, in the inhibition of catechol-O-methyltransferase (IC50: 26.7 μM) and MAO-A (IC50: 50.1 μM), being suggested a reversible inhibition mechanism against this enzyme. In docking studies were observed molecular interactions between the compound and MAO-A and COMT enzymes, via hydrogen bonds and hydrophobic interactions in enzyme active sites. The compound did not induce toxic effects to rodent PMN cells, at concentrations of 0.5 and 5 mM. The rosmarinic and chlorogenic acids, isolated from B. binervatum extract, did not influence cell viability and did not induce toxicity to stem cells (100 to 500 μM), the rosmarinic acid was also capable to induce cell proliferation. Protective ability against H2O2-induced cell damage (1400 μM) was observed for both substances at concentrations of 10-100 μM, and the results were supported by cellular microscopy images. Rosmarinic acid presented better responses compared with chlorogenic acid, being powerful inhibitor against H2O2-induced damage. The overall results highlights the importance of associated chemical-biological studies of plant species and points at the potential of ferns as sources of bioactive compounds, capable of modulating multiple enzymatic and non-enzymatic targets related to neurodegenerative diseases.

Nesse trabalho, o docking e a dinâmica molecular foram utilizados como métodos de investigação das formas de interação entre um oligonucleotídeo de B-DNA e duas novas Bases de Tröger fluorescentes, com o propósito de verificar sua potencialidade como sondas biológicas. Para o docking molecular foi utilizado o protocolo descrito por Ricci et. al. (2009), que demonstrou ser um método promissor para reconhecer os modos de ligação e descrever a interação entre as Bases de Tröger e os oligonucleotídeos. Os complexos obtidos a partir dos docking foram utilizados como ponto de partida para as simulações de dinâmica molecular usando o programa GROMACS e o campo de força AMBER03, como descrito por Ricci et. al. (2010). A análise dos resultados das simulações mostraram a possibilidade, de que as Bases de Tröger podem interagir de maneiras diferentes com o oligonucleotídeo com preferência pela interação com sulco menor desse receptor. Durante todas as simulações os ligantes mantiveram-se com uma forte interação com o oligonucleotídeo, sem causar a desnaturação do mesmo. Globalmente, os resultados sugerem que as Bases de Tröger podem interagir com o sulco menor do oligonucleotídeo mas também são capazes de interagir como intercaladores. Devido as fortes interações, e també as propriedades fotofísicas (das Bases de Tröger propostas nesse trabalho), essas moléculas podem atuar como possíveis sondas biológicas. / In this work, docking and molecular dynamics simulations were used to ingestigate the interaction between a B-DNA oligonucleotide and two fluorescent Tröger´s bases, in order to verify their potential use as biological probes. For dockings was used protocol described by Ricci et. al. (2009), which proved to be a promising method to recognize the binding modes and describe the interaction between this class of compounds and the oligonucleotide. The complexes obtained from dockings were used as starting point for molecular dynamics simulations using GROMACS and the AMBER03 Force Field, as described by Ricci et. al. (2010). The analyzes of the simulation results showed the possibility that the Tröger Bases can interact in different ways with the oligonucleotide, with some preference for this receptor´s minor groove. During all simulations the ligands have maintained a strong interaction with the oligonucleotide, without causing denaturation of the same. Overall, the results suggest that Tröger´s Bases may interact with the minor groove of olinucleotide but are also able to interact as an intercalator, depending upon the substituents present. Due to the strong interactions, and also the peculiar photophysical properties, this class of molecules may act as a potential DNA probe.